KR102139806B1

KR102139806B1 - 변이형 LysE를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법

Info

Publication number: KR102139806B1
Application number: KR1020200017559A
Authority: KR
Inventors: 장재원; 심지현; 박상민; 배현원; 변효정; 신용욱; 이한형; 임보람; 정무영; 최윤정
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2020-02-13
Filing date: 2020-02-13
Publication date: 2020-07-30
Also published as: AR121142A1; CN113544141A; JP2023512499A; WO2021162459A1; JP7422237B2; BR112022015945A2; US20230072150A1; AU2021221374A1; ZA202207846B; EP4105229A1; MX2022009929A; CN113544141B; AU2021221374B2

Abstract

변이형 LysE를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법이 제공된다. 상기 변이형 LysE는 야생형과 비교하여 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 향상시키는 것일 수 있다.

Description

변이형 LysE를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법{Microorganism Comprising Mutated LysE and Method of L-Amino Acid Production Using the Same}

코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며, 주로 코리네박테리움 균주를 이용한 발효에 의해 생성되고 있다.

코리네박테리움 속 균주를 이용한 L-아미노산의 제조방법을 개선하기 위하여 많은 시도가 행해지고 있다. 그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 특정 유전자를 파괴시키거나 감쇠 발현시킴으로써 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있다. 또한, 각각의 L-아미노산 생합성에 관련된 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 분석하여 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하기 위한 연구가 진행되어 왔다. 또한, 다른 박테리아 유래의 외래 유전자를 도입하는 시도도 있다.

이와 같은 노력에도, L-아미노산과 같은 유용 물질의 생산능을 향상시키는 기술의 개발은 여전히 요구되고 있다.

일 예는 변이형 라이신 배출자를 제공한다. 예컨대, 상기 변이형 라이신 배출자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴(Asn, N)이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 L-아미노산 (예, L-라이신, L-아르기닌, 이들의 조합 등) 배출자 기능을 갖는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

다른 예는 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 미생물을 제공한다. 상기 재조합 미생물은 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖거나, 비변형 미생물과 비교하여 증가된 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 미생물 또는 L-아미노산 생산 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산 방법을 제공한다.

상기 L-아미노산은 L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 미생물은 코리네박테리움 속 또는 에세리키아 속 미생물일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 일 예는 코리네박테리움 속 미생물의 라이신 생산능에 대한 유전자 변이의 영향을 확인하고, 이를 이용한 균주 개량과 관련된 기술을 제공한다. 일반적으로 라이신 생산능 증가를 위해서는 균주가 가지는 라이신 생산 수율을 향상시키거나, 시간당 라이신 생산량 (생산성)을 증가시키는 방법이 있다. 그 일환으로, 생합성을 거쳐 생성된 라이신을 배출하는 기능을 갖는 막 단백질인 L-라이신 배출자 단백질을 개량하여 라이신 생산 수율 및/또는 생산성을 향상시킬 수 있음을 제안한다. 본 명세서에서 제공되는 일 예는 상기 L-라이신 배출자 단백질 및/또는 이를 암호화하는 lysE 유전자를 개량하여 L-아미노산 (예, L-라이신, L-아르기닌, 이들의 조합 등)의 배출능이 향상된 균주를 개발하는 것과 관련된 기술을 제공한다.

이하, 보다 상세히 설명한다.

본 명세서에서, 라이신 배출자 (Lysine exporter protein; LysE)는 막통과 단백질 중 하나로, 세포 내에서 생합성된 산물, 예컨대, L-라이신과 같은 L-아미노산을 세포 외로 배출하는 작용을 하는 단백질을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 라이신 배출자 단백질은 코리네박테리움 속 균주, 예컨대, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 라이신 배출자 단백질은 서열번호 1로 표현되는 것일 수 있다.

상기 변이형 라이신 배출자는 앞서 설명한 라이신 배출자에 아미노산 치환 돌연변이가 유도된 폴리펩타이드일 수 있다. 일 예에서, 상기 변이형 라이신 배출자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산으로 치환된 것 (e.g., 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 표현되는 것)일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 변이형 라이신 배출자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 글루탐산(E), 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 시스테인(C), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W), 아스파르트산(D), 글루타민(Q), 히스티딘(H), 라이신(K), 또는 아르기닌(R)으로 치환된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 변이형 라이신 배출자는 서열번호 3으로 표현되는 폴리펩타이드(65번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 글루탐산(E)으로 치환)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같이 변이가 유도된 폴리펩타이드는 L-아미노산 (예, L-라이신, L-아르기닌, 이들의 조합 등) 배출자 기능을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "L-아미노산 생산 미생물"은 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖는 미생물에 앞서 설명된 바와 같은 라이신 배출자 변이가 도입됨으로써 상기 미생물이 증가된 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖는 경우 및/또는 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖지 않는 미생물에 상기한 라이신 배출자 변이가 도입됨으로써 상기 미생물이 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 갖게 되는 경우를 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "미생물"은 단세포 박테리아를 포괄하는 것으로, "세포"와 혼용될 수 있다.

일 예에서, 상기 미생물은 L-아미노산 (예컨대, L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합) 배출능 및/또는 생산능을 갖는 모든 미생물에서 선택된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 숙주 미생물은 자연적으로 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지는 미생물 또는 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 없거나 현저히 적은 모균주에 변이가 도입되어 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지는 미생물일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 미생물은 자연적으로 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지는 미생물 또는 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 없거나 현저히 적은 모균주에 변이가 도입되어 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능을 가지는 모든 코리네박테리움 속 (the genus　Corynebacterium) 미생물, 에세리키아 속 미생물들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium 　 glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium 　 thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium 　 efficiens) 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더욱 구체적으로는, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium 　 glutamicum)일 수 있다. 상기 에세리키아 속 균주는 대장균 (Escherichia coli)일 수 있다.

일 예에서, 라이신 배출자 변이가 도입된 L-아미노산 생산 미생물은, 동종의 비변형 미생물과 비교하여, L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 증가된 것일 수 있다. 상기 비변형 미생물은 라이신 배출자 변이가 도입되지 않은 동종의 미생물 또는 도입되기 전의 미생물을 의미할 수 있다.

본 명세서에서, 라이신 배출자 변이가 도입되기 전의 미생물을 상기 라이신 배출자 변이가 도입되어 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 증가되거나 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 부여된 "L-아미노산 생산 미생물"과 구별하기 위하여, 상기 라이신 배출자 변이가 도입되기 전의 미생물을 숙주 미생물로 표현할 수 있다.

본 명세서에서, "라이신 배출자 변이의 도입"은 숙주 미생물에 앞서 설명한 변이형 라이신 배출자가 도입되는 모든 조작을 의미할 수 있다.

상기 "라이신 배출자 변이가 도입된 L-아미노산 생산 미생물"은 (1) 앞서 설명한 변이형 라이신 배출자, 예컨대, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, (2) 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 (3) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하여, L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 증가되거나 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능이 부여된 미생물일 수 있다.

상기 변이형 라이신 배출자, 예컨대, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물은,

(i) 유전체(genome)에 더하여, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 재조합 벡터를 추가로 포함하거나, 및/또는

(ii) 내재의 라이신 배출자 암호화 유전자 (예컨대, LysE 유전자)로서 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 의미할 수 있다.

상기 (ii) "내재의 라이신 배출자 암호화 유전자 (예컨대, LysE 유전자)로서 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함한다" 함은 (a) 상기 폴리뉴클레오타이드가 내재의 라이신 배출자 암호화 유전자 (예컨대, LysE 유전자)를 대체하여 포함(삽입)되거나, 및/또는 (b) 내재의 라이신 배출자 암호화 유전자 (예컨대, LysE 유전자)가 유전자 교정 (gene editing) 기술에 의하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열 (즉, 변이형 라이신 배출자의 암호화 핵산 서열)을 가지도록 변이되는 것을 의미하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 라이신 배출자 또는 이를 암호화하는 유전자는 숙주 미생물 유래(내재)의 것 또는 이와 다른 미생물 유래(외래)의 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 L-아미노산 생산 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 글루탐산(E), 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 시스테인(C), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W), 아스파르트산(D), 글루타민(Q), 히스티딘(H), 라이신(K), 및 아르기닌(R)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 L-아미노산 생산 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 글루탐산 (E)으로 치환된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물, 예컨대, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium 　 glutamicum)일 수 있다. 예컨대, 상기 L-아미노산 생산 미생물은 기탁번호 KCCM12641P인 것일 수 있다.

본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 표현된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 이들의 본래의 기능 또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 통상적인 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및/또는 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis) 등에 의하여 변형된 것을 포함할 수 있다. 일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이를 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 본래의 기능은, 라이신 배출자 기능 (아미노산 서열의 경우), 또는 상기 라이신 배출자 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 기능 (핵산 서열의 경우)일 수 있고, 상기 목적하는 기능은 미생물의 L-아미노산 (예컨대, L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합) 배출능 및/또는 생산능을 증가시키거나 부여하는 기능을 의미할 수 있다.

본 명세서에 기재된 핵산 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질(라이신 배출자)을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열 및/또는 기능을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "상동성"은 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율(%)로 표시될 수 있다. 핵산 서열에 대한 상동성의 경우, 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST(참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

일 예에서, 본 명세서에 제공되는 특정 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 특정 핵산 서열 또는 이와 실질적으로 동등한 핵산 서열뿐만 아니라, 상기 특정 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 구체적으로, 상기 상보성을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절 가능한 Tm 값, 예컨대, 55℃ 내지 65℃(예, 55℃, 60℃, 63℃ 또는 65℃)의 Tm 값에서 혼성화하고, 후술하는 조건에서 분석할 수 있다: 이러한 조건은 공지의 문헌에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 높은 상보성을 갖는 유전자끼리 혼성화하고, 그보다 낮은 상보성을 갖는 유전자끼리는 혼성화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1x SSC(saline-sodium citrate buffer), 및 0.1%(w/v) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate); 60℃, 0.1x SSC, 및 0.1% SDS; 또는 68℃ 0.1x SSC, 및 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세척하는 조건을 등을 열거할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 혼성화에는 두 개의 뉴클레오타이드가 상보적 서열을 가질 것을 요구되거나, 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 허용될 수 있다. 상기 용어 "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오타이드 염기 간의 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, DNA의 경우, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고, 이는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "형질전환"은 표적 단백질(라이신 배출자)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주 미생물의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 발현조절 요소가 목적 단백질(라이신 배출자)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 (예, 전사 개시)를 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 예컨대, 통상적인 부위-특이적 DNA 절단 및 연결에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 미생물에 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 미생물에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전법, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 삽입 또는 숙주 세포 내재 유전자 (예컨대, LysE 유전자)가 변이형 라이신 배출자를 암호화하도록 하는 변이 도입은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease system; 예컨대, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, 리보핵산 융합단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 변이형 라이신 배출자, 예컨대, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴(Asn, N)이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, 이의 암호화 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입(형질전환)시키는 단계를 포함하는, 상기 미생물의 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능 증가 방법 또는 상기 미생물에 L-아미노산 배출능 및/또는 생산능 부여 방법을 제공한다.

상기 변형 라이신 배출자, 폴리뉴클레오타이드, 및 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 미생물 내로 형질전환된 후, 숙주 미생물의 게놈(유전체)과 무관하게 발현되거나, 숙주 미생물의 게놈 내에 통합될 수 있다.

본 명세서에서 사용가능한 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 통상 사용되는 모든 벡터들 중에서 선택될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터로서, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는　pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용 가능한 벡터는 공지된 발현 벡터 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입용 벡터일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 벡터는 상기 염색체 내 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들 중에서 선택되어 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

다른 예는 상기한 L-아미노산 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

　상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-아미노산 (예, L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합)은　배지　중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

상기 배양에 사용 가능한 배지는 미생물 배양에 통상적으로 사용되는 배지들 중에서 선택될 수 있다. 일 예에서, 상기 배지는 탄소 공급원으로 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올), 유기산 (예: 아세트산) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한,　상기 배지는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산, 및/또는 비타민 등과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

상기 L-아미노산(예, L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합)을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지, 배양액, 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 회수하는 단계는 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화, HPLC 등에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다. 상기 L-아미노산 (예, L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합)을 회수하는 방법은, 그 이전, 동시, 또는 그 이후에, 정제단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

라이신 생산 균주의 내재적 lysE 유전자에 변이를 도입함으로써, 상기 라이신 생산 균주의 L-아미노산 (예, L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합) 생산능을 향상시킬 수 있다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1: 변이형 lysE 유전자 ORF 내 변이 도입용 벡터 라이브러리 제작

L-라이신 배출자의 배출능이 향상된 효소를 탐색하고자 lysE 변이형 유전자를 획득하기 위한 목적으로 아래의 방법으로 라이브러리를 제작하였다.

GenemorphII Random Mutagenesis Kit (Stratagene)을 사용하여, lysE 유전자 (711 bp; 서열번호 2)를 포함하는 DNA 단편의 kb 당 0-4.5개의 변이를 도입하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (WT)의 염색체를 주형으로 하고, 하기 표 1의 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 Error-prone PCR을 수행하였다. WT 균주(ATCC13032)의 염색체 (500 ng), 프라이머 (각각 125 ng), Mutazyme II reaction buffer (1x), dNTP mix (40 mM), 및 Mutazyme II DNA polymerase (2.5U)을 포함하는 반응액을 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 1분 변성, 56℃ 1분 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 이러한 과정으로 확보된 유전자 단편을, 제한효소 BamHI-HF (NEB)를 37℃에서 1시간 반응 및 37℃에서 CIP (NEB) 효소 30분 처리 후 취득한 pECCG117 벡터(대한민국 등록특허 제0057684호)와 연결하고, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신 (25 mg/l)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.

형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후, 플라스미드를 획득하고, 염기서열을 분석한 결과, 0.5 mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 최종적으로 약 10,000 개의 형질전환된 대장균 콜로니를 취하여 plasmid prep kit (QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 추출하였으며, 이를 p117-lysE(mt) 라이브러리로 명명하였다. 또한 스크리닝에서 대조구로 사용하기 위해 pECCG117 벡터에 야생형 lysE가 도입된 벡터를 제작하였다. 서열번호 5 및 6을 사용하여 PCR을 수행하여 야생형 lysE 유전자 단편을 준비하고, 상기와 같은 방법으로 p117-lysE(WT) 벡터를 제작하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 1분 변성, 56℃ 1분 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다.

상기 사용된 프라이머의 핵산서열을 하기의 표 1에 정리하였다:

프라이머	서열 (5' -> 3')
서열번호 5	CGGGATCCATGGTGATCATGGAAATCTTCATTAC
서열번호 6	AAGGATCCCTAACCCATCAACATCAGTTTG

실시예 2: 벡터 라이브러리 도입 균주 제작 및 스크리닝

야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에서 lysE 유전자가 결손된 균주를 제작하기 위하여, lysE 유전자를 결손하기 위한 벡터를 제작하였다. 구체적으로, lysE 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들(각 600bp)이 pDZ 벡터(대한민국특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태의 재조합 벡터를 제작하였다. lysE 유전자의 염기서열 (서열번호 2)에 근거하여 프라이머 서열번호 7 및 8 및 이들로부터 각각 600 bp 떨어진 위치에서 프라이머 서열번호 9 및 10을 각각 합성하였다 (표 2 참조).

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 서열번호 7 및 9의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여, lysE 유전자의 5' 말단 유전자 단편을 준비하였다. 동일한 방법으로, 서열번호 8 및 10의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여, lysE 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편을 준비하였다. 상기 PCR은 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 1분 변성, 56℃ 1분 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하여 진행하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다.

한편, 제한효소 XbaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터(대한민국특허 제2009-0094433호)와 상기 PCR을 통하여 증폭하여 준비된 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 7 및 8을 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하고, 이를 pDZ-ΔlysE라 명명하였다.

상기 사용된 프라이머의 핵산서열을 하기의 표 2에 정리하였다:

프라이머	서열 (5' -> 3')
서열번호 7	GTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCTGGAAAGGCTCTTTACG
서열번호 8	GCCTGCAGGTCGACTCTAGATCTAGTTTCCCATCAACCATGT
서열번호 9	AAGTACTTCCATAGGTCACGTTTTCGCGGGTTTTGGAATC
서열번호 10	GATTCCAAAACCCGCGAAAACGTGACCTATGGAAGTACTT

상기 제작된 벡터 pDZ-ΔlysE를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기펄스법(Van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotecnol. 52:541-545, 1999)으로 형질전환하여 상동염색체 재조합에 의해 lysE 유전자가 결손된 균주를 제작하였다. 이와 같이 lysE 유전자가 결손된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 13032::ΔlysE라고 명명하였다.

상기 13032::ΔlysE를 대상으로 실시예 1에서 제작된 p117-lysE(mt) 라이브러리를 전기펄스법으로 형질전환하고, 카나마이신 (25 mg/l)이 포함된 복합평판배지에 도말하여 약 1000 개의 콜로니를 확보하였다. 대조구를 제작하기 위해 13032::ΔlysE에 p117-lysE(WT) 벡터를 같은 방법으로 형질전환하여 콜로니를 확보하였다.

<복합평판배지 (pH 7.0)>

포도당 10 g, 펩톤 10 g, Beef extract 5 g, 효모추출물 5 g, Brain Heart Infusion 18.5 g, NaCl 2.5 g, 요소 2 g, Sorbitol 91 g, 한천 20 g (증류수 1 리터 기준)

상기 확보된 대조구인 13032::ΔlysE_p117(lysE(WT))과 13032::ΔlysE_p117(lysE(mt)) 라이브러리들을 각각 400ul 종배지가 포함된 96-Deep Well Plate-Dome (Bioneer) 에 접종하고, plate shaking incubator (TAITEC)에서 32℃, 12000rpm 조건으로 약 12hr 동안 배양하였다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8g, MgSO4·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

배양된 약 1000개의 콜로니를 L-라이신 염산염 100g/L가 포함된 복합평판배지에 연속희석하여 MIC (minimum inhibitory concentration) test 하였을 때 비교대상 균주 대비 유의미하게 MIC 값이 높아진 9개의 콜로니를 획득할 수 있었다. 각 콜로니를 2차 스크리닝하였다. 각 콜로니를 400ul 종배지가 포함된 96-Deep Well Plate-Dome (Bioneer) 에 접종하고, plate shaking incubator (TAITEC)에서 32℃, 12000rpm 조건으로 약 12hr 동안 배양하였다. 또한 2차 스크리닝 단계에서는 최종적으로 배양된 콜로니의 초기 OD(optical density)값을 동일하게 맞추어 L-라이신 염산염 100g/L가 포함된 복합평판배지에 연속희석하여 MIC test를 진행하였다. 이를 통해 야생형 lysE 유전자가 도입된 비교대상균주 대비해서 월등히 MIC 값이 높아진 1종에 대해 13032::lysE(mt)로 명명하고 추가 실험을 진행하였다.

실시예 3: 변이형 lysE 유전자 염기서열 확인

실시예 2에서 선별된 균주 13032::lysE(mt)에 삽입된 유전자의 서열을 확인하기 위하여, 표 3의 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 유전자 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 실시예 1과 동일하게 진행하였으며, 증폭된 DNA 단편을 GeneAll Expin GEL SV kit (Seoul, KOREA)를 이용하여 획득하고 염기서열 분석을 진행하였다.

상기 사용된 프라이머의 핵산서열을 하기의 표 3에 정리하였다:

프라이머	서열 (5' -> 3')
서열번호 11	CCTTCGAAGCTGCCTTCATC
서열번호 12	CTGGACAACAGCCTTGATTC

증폭된 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 13032::lysE(mt) 균주는, lysE 유전자 ORF 개시코돈으로부터 하위 193~195번째 염기서열이 기존 AAT에서 GAA로 바뀌어 야생형 아미노산 서열(서열번호 1)의 N 말단에서부터 65번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타메이트로 치환된 형태의 L-라이신 배출자 변이체를 암화화하는 변이형 lysE 유전자를 포함함을 확인하였다.

실시예 4: 변이형 lysE 유전자 도입 벡터 제작 및 균주 제작

실시예 3에서 확인한 변이인 N65E을 도입하기 위하여 재조합 벡터를 아래와 같은 방법으로 제작하였다. 먼저, WT 균주(ATCC13032)로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 lysE 유전자(서열번호 2)의 193~195번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 600bp 떨어진 위치의 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 XbaI 인식 부위를 삽입한 표 4의 서열번호 13 및 14의 프라이머를 합성하였다. 또한 이들로부터 각각 600 bp 떨어진 위치에서 염기 치환변이들을 도입하기 위한 프라이머 서열번호 15 및 16을 합성하였다.

상기 사용된 프라이머의 핵산서열을 하기의 표 4에 정리하였다:

프라이머	서열 (5' -> 3')
서열번호 13	GTACCCGGGGATCCTCTAGAGCTCCACCCCAAGAAGCT
서열번호 14	GCCTGCAGGTCGACTCTAGACGAGTTGGAGGCGATCG
서열번호 15	AGCACGATCGGCGCGGCTTCGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 16	GCGTTGATCTTTTGTCCGAAGCCGCGCCGATCGTG

구체적으로, lysE 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들이 (각 600bp) pDZ 벡터(대한민국 특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태의 제조합 벡터를 제작하였다. WT 균주의 염색체를 주형으로 프라이머 서열번호 13 및 15를 이용하여 PCR을 수행하여, lysE 유전자의 5' 말단 유전자 단편을 준비하였다. PCR은 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 1분 변성, 56℃ 1분 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하여 진행하였다. 동일한 방법으로 서열번호 14 및 16을 이용하여 PCR을 수행하여 lysE 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편을 준비하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 XbaI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 13 및 14를 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-lysE(N65E)로 명명하였다.

제작된 벡터를 라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주(대한민국 등록특허 제10-0159812호)에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 lysE 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 KCCM11016P::lysE(N65E)라고 명명하였다.

실시예 5: lysE ( N65E ) 변이주에 대한 L- 라이신 생산능 분석

상기 실시예 4에서 제작된 균주 KCCM11016P::lysE(N65E)와 모균주 KCCM11016P(N65)를 아래와 같은 방법으로 배양하여 OD, 라이신 생산 수율 및 당소모 속도를 측정하였다. 먼저, 종배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 72 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같으며, 배양 결과는 표 5와 같다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 90 g, (NH₄)₂SO₄ 30 g, 대두 단백질 20 g, 사탕무 유래 당밀 20g, KH₂PO₄ 1.1 g, MgSO₄·7H₂O 1.2 g, 바이오틴 2 mg, 티아민 염산염 10 mg, 칼슘-판토텐산 10 mg, 니코틴아미드 30 mg ㎍, MnSO₄ 20 mg, FeSO₄ 20mg, ZnSO₄ 1 mg, CuSO₄ 1 mg, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준).

모균주 및 lysE(N65E) 변이주 OD(562nm), 라이신 생산능, 당 소모속도 측정

균주	24hr OD	Final OD	LYS 생산 수율(%)	당 소모속도(g/hr)
KCCM11016P	36.7	96.5	19.9	1.99
KCCM11016P::lysE(N65E)	31.0	87.9	22.3	1.96

lysE 변이 도입주인 KCCM11016P::lysE(N65E)균주는 모균주 KCCM11016P 대비 당 소모속도가 유사하면서 OD가 소폭 감소하고 라이신 생산 수율이 약 12.1% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 최종적으로 실시예 2에서 확인된 lysE(N65E)의 변이가 L-라이신 배출자의 배출능을 향상시키는 변이로 확인되었다. 이와 같이 라이신 생산능 증가를 보인 KCCM11016P::lysE(N65E) 균주 ('Corynebacterium 　 glutamicum CM03-1012'라 명명)를 2019년12월13일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제동에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여 KCCM12641P의 기탁번호를 부여받았다.

실시예 6: lysE 유전자가 65번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타메이트 외 다른 아미노산으로 치환된 서열을 암호화하는 균주 제작

서열번호 1의 아미노산 서열에서 65번째 아미노산의 위치의, 야생형이 가지는 아스파라긴 및 실시예 5에서 그 효과가 검증된 글투타메이트를 제외한 다른 아미노산으로의 치환을 시도하였다. 이와 같은 18종의 이종성 아미노산 치환 변이를 암호화하는 염기 치환변이들을 도입하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 각각의 재조합 벡터를 제작하였다.

WT 균주(ATCC13032)로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 lysE 유전자의 193~195번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 600bp 떨어진 위치의 5' 단편 및 3' 단편에 염기 치환변이들을 도입하기 위한 프라이머 서열번호 17 내지 52를 합성하였다 (표 6). 구체적으로, lysE 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들(각 600bp)이 pDZ 벡터(대한민국 특허 제2009-0094433호)에 연결된 형태의 재조합 벡터를 제작하였다. WT 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 13 및 17의 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여, lysE 유전자의 5' 말단에 위치하는 유전자 단편을 준비하였다. PCR은 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 1분 변성, 56℃ 1분 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하여 진행하였다. 동일한 방법으로 서열번호 14 및 18을 이용하여 PCR을 수행하여, lysE 유전자의 3' 말단에 위치하는 유전자 단편을 준비하였다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다.

한편 제한효소 XbaI으로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 프라이머 서열번호 13 및 14을 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드는 pDZ-lysE(N65G)로 명명하였다. 동일한 방법으로 프라이머 서열번호 13 및 19, 14 및 20를 이용하여 pDZ-lysE(N65A), 프라이머 서열번호 13 및 21, 14 및 22를 이용하여 pDZ-lysE(N65V), 프라이머 서열번호 13 및 23, 14 및 24를 이용하여 pDZ-lysE(N65L), 프라이머 서열번호 13 및 25, 14 및 26을 이용하여 pDZ-lysE(N65I), 프라이머 서열번호 13 및 27, 14 및 28을 이용하여 pDZ-lysE(N65F), 프라이머 서열번호 13 및 29, 14 및 30을 이용하여 pDZ-lysE(N65P), 프라이머 서열번호 13 및 31, 14 및 32를 이용하여 pDZ-lysE(N65M), 프라이머 서열번호 13 및 33, 14 및 34를 이용하여 pDZ-lysE(N65W), 프라이머 서열번호 13 및 35, 14 및 36을 이용하여 pDZ-lysE(N65S), 프라이머 서열번호 13 및 37, 14 및 38을 이용하여 pDZ-lysE(N65T), 프라이머 서열번호 13 및 39, 14 및 40을 이용하여 pDZ-lysE(N65Q) 프라이머 서열번호 13 및 41, 14 및 42를 이용하여 pDZ-lysE(N65Y), 프라이머 서열번호 13 및 43, 14 및 44를 이용하여 pDZ-lysE(N65C), 프라이머 서열번호 13 및 45, 14 및 46을 이용하여 pDZ-lysE(N65D), 프라이머 서열번호 13 및 47, 14 및 48을 이용하여 pDZ-lysE(N65H), 프라이머 서열번호 13 및 49, 14 및 50을 이용하여 pDZ-lysE(N65K), 및 프라이머 서열번호 13 및 51, 14 및 52를 이용하여 pDZ-lysE(N65R)을 제작하였다.

상기 사용된 프라이머들의 핵산서열을 표 6에 정리하였다:

프라이머	서열 (5' -> 3')
서열번호 17	AGCACGATCGGCGCGGCGCCGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 18	GCGTTGATCTTTTGTCCGGCGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 19	AGCACGATCGGCGCGGCAGCGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 20	GCGTTGATCTTTTGTCCGCTGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 21	AGCACGATCGGCGCGGCGACGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 22	GCGTTGATCTTTTGTCCGTCGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 23	AGCACGATCGGCGCGGCCAGGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 24	GCGTTGATCTTTTGTCCCTGGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 25	AGCACGATCGGCGCGGCGATGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 26	GCGTTGATCTTTTGTCCATCGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 27	AGCACGATCGGCGCGGCGAAGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 28	GCGTTGATCTTTTGTCCTTCGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 29	AGCACGATCGGCGCGGCTGGGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 30	GCGTTGATCTTTTGTCCCCAGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 31	AGCACGATCGGCGCGGCCATGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 32	GCGTTGATCTTTTGTCCATGGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 33	AGCACGATCGGCGCGGCCCAGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 34	GCGTTGATCTTTTGTCCTGGGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 35	AGCACGATCGGCGCGGCGGAGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 36	GCGTTGATCTTTTGTCCTCCGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 37	AGCACGATCGGCGCGGCGGTGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 38	GCGTTGATCTTTTGTCCACCGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 39	AGCACGATCGGCGCGGCCTGGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 40	GCGTTGATCTTTTGTCCCAGGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 41	AGCACGATCGGCGCGGCGTAGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 42	GCGTTGATCTTTTGTCCTACGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 43	AGCACGATCGGCGCGGCGCAGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 44	GCGTTGATCTTTTGTCCTGCGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 45	AGCACGATCGGCGCGGCGTCGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 46	GCGTTGATCTTTTGTCCGACGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 47	AGCACGATCGGCGCGGCGTGGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 48	GCGTTGATCTTTTGTCCCACGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 49	AGCACGATCGGCGCGGCCTTGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 50	GCGTTGATCTTTTGTCCAAGGCCGCGCCGATCGTG
서열번호 51	AGCACGATCGGCGCGGCGCGGGACAAAAGATCAACGCCC
서열번호 52	GCGTTGATCTTTTGTCCCGCGCCGCGCCGATCGTG

각각 제작된 벡터를 라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주(대한민국 등록특허 제10-0159812호)에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 lysE 유전자에 이종성 염기치환변이들이 도입된 균주 18종은 KCCM11016P::lysE(N65G), KCCM11016P::lysE(N65A), KCCM11016P:: lysE(N65V), KCCM11016P:: lysE(N65L), KCCM11016P:: lysE(N65I), KCCM11016P:: lysE(N65F), KCCM11016P:: lysE(N65VP), KCCM11016P:: lysE(N65M), KCCM11016P:: lysE(N65W), KCCM11016P:: lysE(N65S), KCCM11016P:: lysE(N65T), KCCM11016P:: lysE(N65Q), KCCM11016P:: lysE(N65Y), KCCM11016P:: lysE(N65C), KCCM11016P:: lysE(N65D), KCCM11016P:: lysE(N65H), KCCM11016P:: lysE(N65K), 및 KCCM11016P:: lysE(N65R)로 각각 명명하였다.

실시예 7: lysE 변이주에 대한 L- 라이신 생산능 분석

모균주 KCCM11016P(N65), 실시예 4에서 제작된 KCCM11016P::lysE(N65E) 균주 및 실시예6에서 제작된 18종의 균주를 실시예 5와 같은 방법으로 배양하여, OD, 라이신 생산 수율 및 당소모 속도를 측정하여, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

모균주 및 lysE 변이주 OD(562nm), 라이신 생산능, 당 소모속도 측정

균주	24hr OD	Final OD	LYS 생산 수율(%)	당 소모속도(g/hr)
KCCM11016P	36.5	96.8	19.8	2.00
KCCM11016P::lysE(N65E)	29.8	88.0	22.9	1.97
KCCM11016P::lysE(N65G)	31.0	82.2	21.8	2.04
KCCM11016P::lysE(N65A)	30.3	88.4	23.3	2.04
KCCM11016P::lysE(N65V)	29.5	84.2	23.9	2.08
KCCM11016P::lysE(N65L)	30.3	85.2	23.3	1.90
KCCM11016P::lysE(N65I)	31.1	83.9	22.8	2.01
KCCM11016P::lysE(N65F)	30.8	84.5	23.1	2.05
KCCM11016P::lysE(N65P)	29.9	84.6	22.4	2.01
KCCM11016P::lysE(N65M)	31.0	87.0	21.3	2.07
KCCM11016P::lysE(N65W)	30.8	86.1	22.5	2.00
KCCM11016P::lysE(N65S)	35.3	93.6	21.7	1.99
KCCM11016P::lysE(N65T)	34.9	92.4	21.4	1.96
KCCM11016P::lysE(N65Q)	32.8	97.0	21.2	2.08
KCCM11016P::lysE(N65Y)	31.5	96.5	21.8	2.01
KCCM11016P::lysE(N65C)	32.0	95.8	22.0	1.99
KCCM11016P::lysE(N65D)	31.2	90.4	22.9	2.05
KCCM11016P::lysE(N65H)	32.1	83.8	23.6	1.95
KCCM11016P::lysE(N65K)	29.4	86.4	23.7	2.06
KCCM11016P::lysE(N65R)	31.8	86.0	24.1	2.02

실시예 5에서 선별된 lysE 변이 도입주인 KCCM11016P::lysE(N65E) 균주는 모균주 KCCM11016P 대비 당 소모속도가 유사하면서 OD가 소폭 감소하고 라이신 생산 수율이 약 15.7% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 추가적으로 평가된 실시예 6에서 제작된 18종의 균주는 KCCM11016P 대비 당 소모속도가 유사하면서 OD가 유사하거나 소폭 감소하고 라이신 생산 수율 감소 없이 최대 약 21.7% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 lysE 유전자 65번째 아스파라긴의 위치가 L-라이신 배출능 향상에 중요한 역할을 하는 것으로 해석되어진다.

실시예 8: 선별된 lysE 변이주 L- 라이신 생산능 분석

L-라이신을 생산하는 다른 균주에서도 상기의 lysE 유전자 변이체에 대한 효과를 확인하기 위해 L-라이신을 생산하는 다른 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(N65) (대한민국등록특허 제10-0924065호)에 실시예 3에서 선별된 lysE(N65E) 변이 외에 아미노산 특성 별로 3종 변이를 추가하여, 총 4종 변이를 도입하였다. 실시예 4 (pDZ-lysE(N65E))와 실시예6 (pDZ-lysE(N65K), pDZ-lysE(N65Q), 및 pDZ-lysE(N65L))에서 제작된 총 4종의 벡터를 전기펄스법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P 균주에 도입하여 KCCM10770P::lysE(N65E), KCCM10770P::lysE(N65K), KCCM10770P::lysE(N65Q), 및 KCCM10770P::lysE(N65L)의 총 4종의 균주를 제작하였다. 이들 균주 4종 및 모균주 KCCM10770P를 실시예 5와 같은 방법으로 배양하여 OD, 라이신 생산 수율 및 당소모 속도를 측정하여 하기 표 8에 나타내었다.

균주	24hr OD	Final OD	LYS 생산 수율(%)	당 소모속도(g/hr)
KCCM10770P	68.6	58.6	7.8	3.27
KCCM10770P::lysE(N65E)	99.3	116.8	20.3	3.24
KCCM10770P::lysE(N65K)	87.0	69.0	9.2	3.26
KCCM10770P::lysE(N65Q)	82.4	69.2	8.4	3.39
KCCM10770P::lysE(N65L)	79.2	67.1	8.1	3.38

표 8의 결과와 같이, 라이신 생산 균주 KCCM10770P (모 균주)에서 실시예 5에서 선별된 서열번호 1의 65번째 아미노산이 글루탐산으로 치환된 변이를 도입한 경우, 모 균주 대비 당 소모속도가 유사하고 OD가 증가하면서 라이신 생산 수율이 약 160.3% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 추가적으로 도입한 3종의 변이 역시 모 균주 대비 당 소모속도가 유사하고 OD가 증가하면서 라이신 생산 수율이 약 3.8% 내지 17.9% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 모균주에 따라 OD의 변화량과 라이신 생산 수율의 증가폭은 다르지만 실시예 7에서 확인하였듯이 lysE 유전자 65번째 아스파라긴의 위치가 L-라이신 배출능 향상에 중요한 역할을 하는 것으로 해석되어진다.

실시예 9: 선별된 lysE 변이주 L-아르기닌 생산능 분석

상기 변이형 L-라이신 배출자의 L-아르기닌에 대한 배출능을 확인하기 위해 실시예 4에서 제작된 pDZ-lysE(N65E) 벡터를 L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P(N65) 균주(대한민국 특허등록번호 0791659)에 전기펄스법으로 형질전환하였다. 이와 같이 lysE 유전자에 이종성 염기치환변이가 도입된 균주를 KCCM10741P::lysE(N65E)라고 명명하였다. 모균주 KCCM10741P 및 제작된 KCCM10741P::lysE(N65E) 균주를 아래와 같은 방법으로 배양하여 OD, 아르기닌 생산 수율 및 당소모 속도를 측정하였다. 먼저, 종배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 72 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같으며, 배양 결과는 표 9와 같다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1 ㎎, 칼슘-판토텐산 2 ㎎, 니코틴아미드 2 ㎎ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 60 g, 황산암모늄 30 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 2 g, CSL(옥수수 침지액) 15 g, NaCl 10 g, 효모 추출물 5 g, 바이오틴 100 mg (증류수 1리터 기준).

모균주 및 lysE(N65E) 변이주 OD(562nm), 아르기닌 생산능, 당 소모속도 측정

균주	24hr OD	Final OD	ARG 생산 수율(%)	당소모속도(g/hr)
KCCM10741P	32.2	76.5	5.1%	0.89
KCCM10741P::lysE(N65E)	31.8	77.8	5.7%	0.88

표9의 결과와 같이, lysE 변이 도입주인 KCCM10741P::lysE(N65E)균주는 모균주 KCCM10741P 대비 OD 및 당 소모속도가 유사하고 L-아르기닌 생산능이 약 11.8% 증가함을 확인하였다. 이로써 lysE(N65E)의 변이가 L-라이신 뿐만 아니라 L-아르기닌의 배출능을 향상시키는 변이로 확인되었다.

이상, 본 명세서에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 다양한 요소들의 가능한 모든 조합이 본 명세서에서 제안되는 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 명세서의 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없으며, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 본 명세서에 기재된 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있는 한, 이러한 등가물은 본 명세서에서 제안되는 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

한국미생물보존센터

KCCM12641P

20191213

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganism Comprising Mutated LysE and Method of L-Amino Acid Production Using the Same <130> DPP20194166KR <160> 52 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lysE protein <400> 1 Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly 20 25 30 Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser 35 40 45 Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser 50 55 60 Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn 85 90 95 Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro 100 105 110 Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn 115 120 125 Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys 130 135 140 Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp 165 170 175 Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile 180 185 190 Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val 210 215 220 Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly 225 230 235 <210> 2 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysE gene <400> 2 atggtgatca tggaaatctt cattacaggt ctgcttttgg gggccagtct tttactgtcc 60 atcggaccgc agaatgtact ggtgattaaa caaggaatta agcgcgaagg actcattgcg 120 gttcttctcg tgtgtttaat ttctgacgtc tttttgttca tcgccggcac cttgggcgtt 180 gatcttttgt ccaatgccgc gccgatcgtg ctcgatatta tgcgctgggg tggcatcgct 240 tacctgttat ggtttgccgt catggcagcg aaagacgcca tgacaaacaa ggtggaagcg 300 ccacagatca ttgaagaaac agaaccaacc gtgcccgatg acacgccttt gggcggttcg 360 gcggtggcca ctgacacgcg caaccgggtg cgggtggagg tgagcgtcga taagcagcgg 420 gtttgggtaa agcccatgtt gatggcaatc gtgctgacct ggttgaaccc gaatgcgtat 480 ttggacgcgt ttgtgtttat cggcggcgtc ggcgcgcaat acggcgacac cggacggtgg 540 attttcgccg ctggcgcgtt cgcggcaagc ctgatctggt tcccgctggt gggtttcggc 600 gcagcagcat tgtcacgccc gctgtccagc cccaaggtgt ggcgctggat caacgtcgtc 660 gtggcagttg tgatgaccgc attggccatc aaactgatgt tgatgggtta g 711 <210> 3 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lysE protein mutant (N65E) <400> 3 Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly 20 25 30 Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser 35 40 45 Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser 50 55 60 Glu Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn 85 90 95 Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro 100 105 110 Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn 115 120 125 Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys 130 135 140 Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp 165 170 175 Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile 180 185 190 Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val 210 215 220 Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly 225 230 235 <210> 4 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysE gene mutant encoding lysE protein mutant (N65E) <400> 4 atggtgatca tggaaatctt cattacaggt ctgcttttgg gggccagtct tttactgtcc 60 atcggaccgc agaatgtact ggtgattaaa caaggaatta agcgcgaagg actcattgcg 120 gttcttctcg tgtgtttaat ttctgacgtc tttttgttca tcgccggcac cttgggcgtt 180 gatcttttgt ccgaagccgc gccgatcgtg ctcgatatta tgcgctgggg tggcatcgct 240 tacctgttat ggtttgccgt catggcagcg aaagacgcca tgacaaacaa ggtggaagcg 300 ccacagatca ttgaagaaac agaaccaacc gtgcccgatg acacgccttt gggcggttcg 360 gcggtggcca ctgacacgcg caaccgggtg cgggtggagg tgagcgtcga taagcagcgg 420 gtttgggtaa agcccatgtt gatggcaatc gtgctgacct ggttgaaccc gaatgcgtat 480 ttggacgcgt ttgtgtttat cggcggcgtc ggcgcgcaat acggcgacac cggacggtgg 540 attttcgccg ctggcgcgtt cgcggcaagc ctgatctggt tcccgctggt gggtttcggc 600 gcagcagcat tgtcacgccc gctgtccagc cccaaggtgt ggcgctggat caacgtcgtc 660 gtggcagttg tgatgaccgc attggccatc aaactgatgt tgatgggtta g 711 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgggatccat ggtgatcatg gaaatcttca ttac 34 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aaggatccct aacccatcaa catcagtttg 30 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtacccgggg atcctctaga gtctggaaag gctctttacg 40 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcctgcaggt cgactctaga tctagtttcc catcaaccat gt 42 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aagtacttcc ataggtcacg ttttcgcggg ttttggaatc 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gattccaaaa cccgcgaaaa cgtgacctat ggaagtactt 40 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ccttcgaagc tgccttcatc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctggacaaca gccttgattc 20 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtacccgggg atcctctaga gctccacccc aagaagct 38 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcctgcaggt cgactctaga cgagttggag gcgatcg 37 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 agcacgatcg gcgcggcttc ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcgttgatct tttgtccgaa gccgcgccga tcgtg 35 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 agcacgatcg gcgcggcgcc ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcgttgatct tttgtccggc gccgcgccga tcgtg 35 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 agcacgatcg gcgcggcagc ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcgttgatct tttgtccgct gccgcgccga tcgtg 35 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 agcacgatcg gcgcggcgac ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcgttgatct tttgtccgtc gccgcgccga tcgtg 35 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 agcacgatcg gcgcggccag ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gcgttgatct tttgtccctg gccgcgccga tcgtg 35 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 agcacgatcg gcgcggcgat ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gcgttgatct tttgtccatc gccgcgccga tcgtg 35 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 agcacgatcg gcgcggcgaa ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gcgttgatct tttgtccttc gccgcgccga tcgtg 35 <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 agcacgatcg gcgcggctgg ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gcgttgatct tttgtcccca gccgcgccga tcgtg 35 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 agcacgatcg gcgcggccat ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gcgttgatct tttgtccatg gccgcgccga tcgtg 35 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 agcacgatcg gcgcggccca ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gcgttgatct tttgtcctgg gccgcgccga tcgtg 35 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 agcacgatcg gcgcggcgga ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gcgttgatct tttgtcctcc gccgcgccga tcgtg 35 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 agcacgatcg gcgcggcggt ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gcgttgatct tttgtccacc gccgcgccga tcgtg 35 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 agcacgatcg gcgcggcctg ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 40 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gcgttgatct tttgtcccag gccgcgccga tcgtg 35 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 agcacgatcg gcgcggcgta ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 42 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gcgttgatct tttgtcctac gccgcgccga tcgtg 35 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 agcacgatcg gcgcggcgca ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 44 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gcgttgatct tttgtcctgc gccgcgccga tcgtg 35 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 agcacgatcg gcgcggcgtc ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 46 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gcgttgatct tttgtccgac gccgcgccga tcgtg 35 <210> 47 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 agcacgatcg gcgcggcgtg ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 48 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gcgttgatct tttgtcccac gccgcgccga tcgtg 35 <210> 49 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 agcacgatcg gcgcggcctt ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 50 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gcgttgatct tttgtccaag gccgcgccga tcgtg 35 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 agcacgatcg gcgcggcgcg ggacaaaaga tcaacgccc 39 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gcgttgatct tttgtcccgc gccgcgccga tcgtg 35

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 아스파라긴(Asn, N)이 다른 아미노산으로 치환된, 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 65번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 글루탐산(E), 글라이신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 시스테인(C), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W), 아스파르트산(D), 글루타민(Q), 히스티딘(H), 라이신(K), 또는 아르기닌(R)으로 치환된, 폴리펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, L-아미노산 배출자의 기능을 가지고,
상기 L-아미노산은 L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합인,
폴리펩타이드.
제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
제4항에 있어서, 서열번호 4의 핵산서열로 표현되는, 폴리뉴클레오타이드.
제4항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 재조합 벡터.
L-아미노산 생산 미생물로서,
제1항의 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하고,
상기 L-아미노산은 L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합인,
L-아미노산 생산 미생물.
제7항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 L-아미노산 배출자의 기능을 가지고,
상기 L-아미노산은 L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합인,
L-아미노산 생산 미생물.
삭제
제7항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 또는 에세리키아 속 미생물인, L-아미노산 생산 미생물.
제7항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 대장균인, L-아미노산 생산 미생물.
제7항, 제8항, 제10항, 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
비변형 미생물과 비교하여 L-아미노산 배출능 또는 생산능이 증가되고,
상기 L-아미노산은 L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합인,
L-아미노산 생산 미생물.
제7항, 제8항, 제10항, 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신인, L-아미노산 생산 미생물.
제7항, 제8항, 제10항, 및 제11항 중 어느 한 항의 L-아미노산 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및
상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-아미노산을 회수하는 단계
를 포함하고,
상기 L-아미노산은 L-라이신, L-아르기닌, 또는 이들의 조합인,
L-아미노산의 생산 방법.
제14항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신인, L-아미노산의 생산 방법.