JP4821321B2 - 腸内細菌科の細菌を用いたｌ−ヒスチジンの製造法 - Google Patents

Description

本発明は、バイオテクノロジーに関し、詳しくは発酵による、Ｌ−ヒスチジンなどのＬ−アミノ酸の製造法に関する。本発明は、さらに、エシェリヒア・コリに由来する遺伝子に関る。同遺伝子は、Ｌ−ヒスチジン生産能の改善に有用である。

従来、Ｌ−アミノ酸は、自然界から得られた微生物株、またはＬ−アミノ酸生産能が向上するように改変されたそれらの変異株を利用する発酵法により、工業的に製造されてきた。

Ｌ−アミノ酸生産能を向上させる多くの技術（例えば、組換えＤＮＡによる微生物の形質転換による）が開示されてきた（例えば、米国特許第４，２７８，７６５号を参照）。これらの技術は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増加させること、および／または、産生されたＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害から標的酵素を脱感作させることによる（例えば、特開昭５６−１８５９６（１９８１）、ＷＯ９５／１６０４２、または米国特許第５，６６１，０１２号および第６，０４０，１６０号を参照）。

ｔａｌＢ遺伝子は、非酸化的ペントースリン酸回路の酵素であるトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ、又は、Ｄ−セドヘプツロース−７ホスフェート：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートジヒドロキシアセトン転位酵素）［ＥＣ ２．２．１．２］をコードする（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ Ｇ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，Ｏｃｔ １７７：２０，５９３０−６）。トランスアルドラーゼは、解糖産物からのリボース−５−ホスフェートの生合成における鍵酵素である。同酵素は、フルクトース−６−ホスフェート由来のジヒドロアセトン部分のエリスロース−４−ホスフェートへの可逆的転位を触媒し、セドヘプツロース−７−ホスフェートを生成し、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを放出する。次いで、セドヘプツロース−７−ホスフェートおよびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートは、トランスケトラーゼ活性により２分子のペントース−５−ホスフェートに転換される。

先に、トランスアルドラーゼ活性を増加させることが、芳香族代謝からの物質、特にＬ−フェニルアラニンのような芳香族アミノ酸の微生物生産に有用であることが報告されている（米国特許第６，３１６，２３２）。

最近、ｔａｌＢ遺伝子を含む、大きな群の遺伝子の１または複数の遺伝子が弱化、特に除去された腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の微生物の発酵によるＬ−スレオニンの製造がなし遂げられるということが、理論のみによって提案されている（ＷＯ０３００８６００Ａ２）。一方、反対に、少なくともｔａｌＢ遺伝子の発現が強化、特に過剰発現された腸内細菌科の微生物の発酵によるＬ−スレオニンの製造が開示されている（ＷＯ０３００８６１１Ａ２）。

しかし、今までに、腸内細菌科の菌株を用いたＬ−ヒスチジン生産を向上させるためにｔａｌＢ遺伝子を増幅することを記載した報告はない。

本発明の目的は、Ｌ−ヒスチジン生産能が増強されたＬ−ヒスチジン生産株を開発することである。また、本発明の目的は、それらの株を用いてＬ−ヒスチジンを生産する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された、腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、エシェリヒア属に属する前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が、トランスアルドラーゼ遺伝子の発現量の増加により増強した前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が、トランスアルドラーゼ遺伝子のコピー数の増加により、または、該遺伝子の発現が増強するように該遺伝子の発現制御配列が改変されたことにより増加した前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌をトランスアルドラーゼ遺伝子を有するマルチコピーベクターで形質転換することにより前記コピー数が増加した前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記トランスアルドラーゼ遺伝子がエシェリヒア属細菌に由来するものである前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記トランスアルドラーゼ遺伝子は、
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質、からなる群から選ばれるタンパク質をコードする前記細菌を提供することである。
（８）前記トランスアルドラーゼ遺伝子は、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜９５４のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１〜９５４のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなる群から選ばれる、前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記ストリンジェントな条件は、６０℃、かつ１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件である、前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌を培地に培養し、該培養液中に蓄積したＬ−ヒスチジンを回収することとを含む、Ｌ−ヒスチジンの製造法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌は、ヒスチジン生合成遺伝子の発現が増強された、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌であって、同トランスアルドラーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記相同性が９０％以上である細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌であって、同トランスアルドラーゼは、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜９５４のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１〜９５４のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなる群から選ばれるヌクレオチド配列によってコードされる細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ヒスチジン生合成遺伝子の発現が増強された前記細菌を提供することである。

前記目的は、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ、Ｄ−セドヘプツロース−７−ホスフェート：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートジヒドロキシアセトン転位酵素［ＥＣ ２．２．１．２］）（同酵素は標的Ｌ−アミノ酸の生合成経路に関与しないが、追加的コピーがＬ−ヒスチジン生産株の細胞中に導入されると、Ｌ−ヒスチジン生産を向上させ得る）をコードするｔａｌＢ遺伝子を同定することにより達成された。こうして本発明は完成された。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌であり、同細菌中で本発明のタンパク質の活性を増強することによって同細菌のＬ−ヒスチジン産生が向上している。具体的には、本発明の細菌は、エシェリヒア属に属するＬ−ヒスチジン生産菌であり、同細菌中で本発明のタンパク質、すなわちトランスアルドラーゼの活性を増強することによって同細菌のＬ−ヒスチジン産生が向上している。より具体的には、本発明の細菌は、ｔａｌＢ遺伝子を含む染色体またはプラスミドＤＮＡを保持し、かつ、ｔａｌＢ遺伝子の過剰発現によってＬ−ヒスチジン生産能が増強されている。

「Ｌ−ヒスチジン生産菌」は、本発明の細菌を培地で培養したときに、培地中にＬ−ヒスチジンを蓄積する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−ヒスチジン生産能は、育種により付与または増強されてもよい。ここで使用される用語「Ｌ−ヒスチジン生産菌」はまた、野生株または親株よりも多い量のＬ−ヒスチジンを培地中に生成、蓄積し得る細菌を意味し、好ましくは、微生物が、０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量のＬ−ヒスチジンを培地中に生成、蓄積し得ることを意味する。

腸内細菌科には、エシェリヒア属、エルヴィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、およびセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する細菌が含まれる。エシェリヒア属が好適である。

用語「エシェリヒア属に属する細菌」は、微生物学の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属として分類される細菌を意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属する微生物にはエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれるが、これには限定されない。

用語「トランスアルドラーゼ活性」は、フルクトース−６−ホスフェート由来のジヒドロアセトン部分のエリスロース−４−ホスフェートへの可逆的転位の反応を触媒し、セドヘプツロース−７−ホスフェートを形成し、そしてグリセルアルデヒド−３−ホスフェートを放出する活性を意味する。トランスアルドラーゼの活性は、例えば、ＧＡ．Ｓｐｒｅｎｇｅｒ，Ｕ．Ｓｃｈｏｒｋｅｎ，Ｇ．Ｓｐｒｅｎｇｅｒ ＆ Ｈ．Ｓａｈｍ（エシェリヒア・コリＫ−１２のトランスアルドラーゼＢ：その遺伝子であるｔａｌＢのクローニング、および組換え株からの同酵素の特性決定（ＴｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅＢ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２：ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｔｓ ｇｅｎｅ，ｔａｌＢ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ）．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：２０：５９３０−６）により記載される方法により測定され得る。

用語「トランスアルドラーゼ活性を増強するように改変された」は、細胞あたりの活性が非改変株、例えば、野生株のものよりも高くなるように改変されていることを意味する。例えば、細胞あたりのトランスアルドラーゼ分子数が増加した細胞、トランスアルドラーゼ分子あたりの比活性が増加した細胞などが含まれる。さらに、比較の対象となる野生株は、例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２が含まれる。トランスアルドラーゼの細胞内活性の増強の結果として、培地中のＬ−ヒスチジン蓄積量が増加する。

細菌細胞内のトランスアルドラーゼ活性の増強は、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の発現の増強により達成され得る。腸内細菌科の細菌由来のトランスアルドラーゼ遺伝子、及び／又はコリネ型細菌等の他の細菌由来の遺伝子が使用され得る。エシェリヒア属に属する細菌由来の遺伝子が好ましい。

エシェリヒア・コリのトランスアルドラーゼをコードする遺伝子（ＥＣ番号２．２．１．２）として、ｔａｌＢ遺伝子が既に報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１２８００２の配列中ヌクレオチド番号８２３８〜９１９１）。したがって、ｔａｌＢ遺伝子は、同遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて調製されたプライマーを利用したＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション；Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）を参照）により得られ得る。同様にして、他の微生物のトランスアルドラーゼをコードする遺伝子を取得し得る。

エシェリヒア・コリ由来のｔａｌＢ遺伝子には、以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）をコードするＤＮＡが含まれる。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質。

本発明のタンパク質をコードするＤＮＡには、それらのタンパク質の活性が失われない限り、タンパク質（Ａ）の１または複数の位置での１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含む可能性のあるタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。「複数」のアミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置または種類よって異なるが、タンパク質（Ａ）に対して好ましくは２〜３０、より好ましくは２〜２０、特に好ましくは２〜１０である。これは以下の理由による。いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、そしてそのようなアミノ酸における差異はタンパク質の三次元構造およびその活性に大きくは影響しないからである。したがって、タンパク質（Ｂ）は、トランスアルドラーゼの全アミノ酸残基に対して３０〜５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上、より好ましくは７０〜９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつトランスアルドラーゼ活性を有するものであり得る。

ＤＮＡの相同性の度合いを評価するには、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索、およびＣｒｕｓｔａｌＷ等の公知の計算法が使用され得る。

ＢＬＡＳＴ（基本局所配列比較検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ））は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘプログラムに用いられている発見的（ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ）検索アルゴリズムである。これらのプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ．Ｓａｍｕｅｌ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌの統計的方法を用いて、有意度をそれらの発見によるものとする（「一般的スコアリングスキームを使用することによる分子配列の特徴の統計的有意度を評価する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅｓ）」．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：２２６４−５８；「分子配列における複数のハイスコア断片のための応用および統計（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：５８７３−７）。ＦＡＳＴＡ検索法は、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎにより記載される（「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡでの迅速かつ高感度な配列比較（Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＦＡＳＴＰ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０ １８３：６３−９８）。ＣｌｕｓｔａｌＷ法は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ． ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．により記載される（「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティ、および重さマトリクス選択を通じた進化的多重配列比較の感度の改善（ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４，２２：４６７３−４６８０）。
上記のようなトランスアルドラーゼの改変は、トランスアルドラーゼ活性が維持されるような保存的変異である。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも１残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。トランスアルドラーゼタンパク質の元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、Ａｌａからｓｅｒ又はｔｈｒへの置換、ａｒｇからｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換、ａｓｎからｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ又はａｓｐへの置換、ａｓｐからａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換、ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｇｌｎからａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換、ｇｌｕからａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換、ｇｌｙからｐｒｏへの置換、ｈｉｓからａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ又はｔｙｒへの置換、ｉｌｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｅｕからｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｙｓからａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ又はａｒｇへの置換、ｍｅｔからｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｐｈｅからｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換、ｓｅｒからｔｈｒ又はａｌａへの置換、ｔｈｒからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｔｒｐからｐｈｅ又はｔｙｒへの置換、ｔｙｒからｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換、及び、ｖａｌからｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換が挙げられる。
上記のようなトランスアルドラーゼの改変は、公知のトランスアルドラーゼの構造に関する知見（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００２；３５４：１９７−２０１、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１ Ａｐｒ；２６８（８）：２４０８−１５、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ｄｅｃ １８；４４１（２）：２４７−５０、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９７ Ｊａｎ；６（１）：１１９−２４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９９６ Ｊｕｎ １５；４（６）：７１５−２４）を参考にすることができる。

（Ａ）に定義されるタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１または複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、または付加されるように部位特異的突然変異法を使用して、（Ａ）に定義されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を改変することにより、得ることができる。そのような改変ＤＮＡは、変異を発生させる試薬および条件での処理を用いる従来法により得られ得る。そのような処理として、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミンでの処理、またはＤＮＡを保持する細菌のＵＶ照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたは亜硝酸などの試薬での処理が挙げられる。

本発明のタンパク質コードするＤＮＡは、自然の多様性によりエシェリヒア属細菌の他の菌株で見い出される変異体（バリアント）を含む。そのような変異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｔａｌＢ遺伝子または同遺伝子の一部分とハイブリダイズし、かつトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得られ得る。用語「ストリンジェントな条件」には、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、かつ、非特異的ハイブリッドが形成されないような条件を含む。例えば、ストリンジェントな条件には、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件が含まれる。あるいは、ストリンジェントな条件には、サザンンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄の条件、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、を含む。変異体をコードし、かつｔａｌＢ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡのプローブとして、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列もまた使用され得る。そのようなプローブは、プライマーとして配列番号１のヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチド、および鋳型として配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントを使用するＰＣＲにより調製されてもよい。長さが約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションにおける洗浄条件は、例えば、５０℃、２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳであり得る。

タンパク質をコードするＤＮＡでの細菌の形質転換は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させるか、細菌細胞でのタンパク質の活性を向上させる従来法によって、ＤＮＡを細菌細胞中に導入することを意味する。

本発明の細菌はまた、（Ａ）または（Ｂ）に定義されるタンパク質をコードするＤＮＡでの同細菌の形質転換により、または同細菌の染色体上の上記ＤＮＡの発現制御配列の改変により、本発明のタンパク質の活性が向上しているものを含む。

本発明の細菌の改変に使用されるＤＮＡは、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードしてもよい。より具体的には、ＤＮＡはｔａｌＢ遺伝子であり得る。ｔａｌＢ遺伝子は、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に基づくプライマーを使用するＰＣＲにより取得され得る。

遺伝子発現を向上させる方法には、遺伝子コピー数の増加が含まれる。エシェリヒア属細菌中で機能し得るベクター中に遺伝子を導入すると、遺伝子のコピー数が増加する。好ましくはマルチコピーベクターが使用され、マルチコピーベクターには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ^＋、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、ｐＥＴ２２ｂなどが含まれる。また、遺伝子発現の向上は、例えば、相同組換えなどの方法により、遺伝子の複数コピーを細菌染色体中に導入することにより達成され得る。

あるいは、遺伝子発現の向上は、本来のプロモーターの代わりにより強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを配置することにより達成され得る。プロモーターの強さは、ＲＮＡ合成開始の作用の頻度により定められる。プロモーターの強さの評価法および強力なプロモーターの例は、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ，Ｕ．，Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｗ．，Ｇｅｎｔｚ，Ｒ．，Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．により記載される（エシェリヒア・コリのプロモーター：ｉｎ ｖｉｖｏ強度の階層は交代構造を示す（Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）。ＥＭＢＯ Ｊ．１９８６，５，２９８７−２９９４）。例えば、Ｐ_Ｒプロモーターは強力な構成型プロモーターとして既知である。他の既知の強力なプロモーターは、λファージの、Ｐ_Ｌプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーターなどである。

翻訳の向上は、本来のシャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列（ＳＤ配列）の代わりに、より効果的なＳＤ配列を本発明のＤＮＡ中に導入することにより達成され得る。ＳＤ配列は、リボソームの１６Ｓ ＲＮＡと相互作用するｍＲＮＡの開始コドンの上流領域である（Ｓｈｉｎｅ Ｊ．ａｎｄ Ｄａｌｇａｒｎｏ Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７４，７１，４，１３４２−６）。

強力なプロモーターを使用することは、遺伝子コピーの増加と組合せてもよい。

染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化およびライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択などの方法は、当業者に既知の通常の方法であってもよい。それらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．，「分子クローニングの実験室手引き、第三版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）などに記載されている。

本発明の細菌は、上記のＤＮＡを本来的にＬ−ヒスチジン生産能を有する細菌に導入することにより得られ得る。あるいは、本発明の細菌は、既にＤＮＡを保持する細菌にＬ−ヒスチジン生産能を付与することにより得られ得る。

本発明のタンパク質の活性を向上させる親株には、Ｌ−ヒスチジン生産能を有するエシェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリ２４株（ＶＫＰＭ Ｂ−５９４５、ロシア特許第２００３６７７号）、エシェリヒア・コリ８０株（ＶＫＰＭ、ロシア特許第２１１９５３６号）、エシェリヒア・コリＮＲＲＬ Ｂ−１２１１６〜Ｂ１２１２１株（米国特許第４３８８４０５号）、エシェリヒア・コリＨ−９３４２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７５）およびＨ−９３４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７６）（米国特許第６３４４３４７号）、エシェリヒア・コリＨ−９３４１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７４）（欧州特許出願第１０８５０８７Ａ２号）、エシェリヒア・コリＡＩ８０／ｐＦＭ２０１株（米国特許第６２５８５５４号）などのエシェリヒア属に属するＬ−ヒスチジン生産株が含まれる。

Ｌ−ヒスチジン生産菌は、Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子の発現が増強するようにさらに改変されていることが望ましい。Ｌ−ヒスチジン生合成に有効な遺伝子には、ｈｉｓＧ遺伝子およびｈｉｓＢＨＡＦＩオペロンの遺伝子が挙げられる。Ｌ−ヒスチジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｈｉｓＧ遺伝子が好ましい（ロシア特許第２００３６７７号および第２１１９５３６号）。

本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養して培地中にＬ−ヒスチジンを産生させ、同培地からＬ−ヒスチジンを回収する工程を含む、Ｌ−ヒスチジンの製造法を含む。

本発明において、培養、培地からのＬ−ヒスチジンの回収および精製等は、従来の微生物を用いたアミノ酸の発酵生産法によって行ってもよい。
培養に使用される培地は、培地が、炭素源および窒素源およびミネラル類、及び必要に応じて微生物が生育に必要とする適当量の栄養を含む限り、合成培地であっても天然培地であってもよい。
炭素源には、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物、および種々の有機酸が含まれる。使用する微生物の同化の様式によっては、エタノールおよびグリセロール等のアルコールを使用してもよい。
窒素源としては、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、および発酵微生物の消化物のような天然の窒素源が使用される。
ミネラル類としては、リン酸２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウムなどが使用される。必要に応じて、さらなる栄養が培地に添加され得る。例えば、微生物が生育にプロリンを必要とする場合（プロリン栄養要求性）、培養のため十分量のプロリンが培地に添加され得る。

培養は、好ましくは、振盪培養、通気を伴う撹拌培養のような好気的条件下、２０℃〜４２℃、好ましくは３７℃〜４０℃の温度で行われる。培養のｐＨは、通常５〜９の間であり、好ましくは６．５〜７．２の間である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、および緩衝液で調節され得る。通常、１日〜５日間の培養で、培地に目的のＬ−アミノ酸が蓄積する。

培養後、細胞のような固体は、遠心分離または膜濾過により培養液から除去することができ、次いで目的のＬ−アミノ酸がイオン交換、濃縮、および結晶法により回収および精製され得る。

以下、本発明を、実施例を参照してより具体的に説明する。本実施例においては、特記しない限り、アミノ酸はＬ−体である。

〔実施例１〕エシェリヒア・コリからのｔａｌＢ遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリＫ−１２株の全ヌクレオチド配列は、既に決定されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４５３−１４７４，１９９７）。報告されたヌクレオチド配列に基づいて、配列番号３（プライマー１）および配列番号４（プライマー２）に示すプライマーを合成した。プライマー１は、ｔａｌＢ遺伝子の開始コドンの７４〜５４ｂｐ上流の配列であり、５’末端に導入された制限酵素ＢｇｌＩＩ認識部位を持つ。プライマー２は、ｔａｌＢ遺伝子の終止コドンの８２〜１０４ｂｐ下流の配列と相補的な配列であり、５’末端に導入された制限酵素Ｘｂａｌ認識部位を持つ。

ＰＣＲ用の鋳型として使用するエシェリヒア・コリＫ１２の染色体ＤＮＡを、常法により調製した。ＰＣＲを、以下の条件下で、アプライドバイオシステムズＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００を用いて行った。９５℃で５分間の初期ＤＮＡ変性、次いで９５℃で３０秒間の変性、５６℃で６０秒のアニーリング、および７２℃で１２０秒の伸長を３０サイクル、最後にＴａｑポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を使用して７２℃で７分間の重合化。得られた、プロモーターを持たないｔａｌＢ遺伝子を含むＰＣＲフラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで処理し、予め同じ酵素で処理したベクターｐＭＷ１１９−Ｐ_Ｒ中のＰ_Ｒプロモーター下に挿入した。ベクターｐＭＷ１１９−Ｐ_Ｒは、ファージλからのＰ_Ｒプロモーターを市販のベクターｐＭＷ１１９に挿入することにより構築した。このようにして、プラスミドｐＭＷ−Ｐ_Ｒ−ｔａｌＢを得た。

〔実施例２〕ヒスチジン産生におけるｔａｌＢ遺伝子の発現の向上の効果
ヒスチジン産生エシェリヒア・コリ８０株を、プラスミドｐＭＷ−Ｐ_Ｒ−ｔａｌＢによる形質転換の親株として使用した。８０株は、ロシア特許第２１１９５３６号に記載されており、１９９９年１０月１５日に、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Ｒｕｓｓｉａ，１１７５４５，Ｍｏｓｃｏｗ，１ Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ，１）に、ＶＫＰＭ Ｂ−７２７０の受託番号で寄託され、２００４年７月１２日にブダペスト条約に基づき国際寄託に移管されている。

８０株および８０／ｐＭＷ−Ｐ_Ｒ−ｔａｌＢ株の両方の株を、１ｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬ−ブロス中で、２９℃で６時間培養した。次いで、得られた培養物０．１ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管中の発酵培地２ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて２９℃で６５時間培養した（３５０ｒｐｍ）。培養後、培地に蓄積したヒスチジンの量を、ペーパークロマトグラフィーで決定した。ペーパーは、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）の移動相で展開した。ニンヒドリン（０．５％）のアセトン溶液を可視化試薬として使用した。
〔発酵培地の成分（ｐＨ６．０）（ｇ／Ｌ）〕
グルコース １００．０
豆濃 ０．２（ＴＮとして）
（大豆加水分解物）
Ｌ−プロリン １．０
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ２５．０
ＫＨ_２ＰＯ_４ ２．０
ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ １．０
ＦｅＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ_４ ０．０１
チアミン ０．００１
ベタイン ２．０
ＣａＣＯ_３ ６０．０
ストレプトマイシン １．０

得られたデータを表１に示す。

ｔａｌＢ遺伝子の発現の向上によって、エシェリヒア・コリ８０株のヒスチジン生産能が改善されたことが、表１からわかる

本発明により、発酵法によるＬ−ヒスチジンの生産性を向上させることができる。

Claims (10)

1. トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された、腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌を培地に培養し、該培養液中に蓄積したＬ−ヒスチジンを回収する工程を含む、Ｌ−ヒスチジンを製造する方法。
2. 前記Ｌ−ヒスチジン生産菌が、エシェリヒア属に属する細菌である、請求項１に記載の方法。
3. トランスアルドラーゼ活性が、トランスアルドラーゼ遺伝子の発現量の増加により増強した請求項１に記載の方法。
4. トランスアルドラーゼ活性が、トランスアルドラーゼ遺伝子のコピー数の増加により、または、該遺伝子の発現が増強するように該遺伝子の発現制御配列が改変されたことにより増加した、請求項３に記載の方法。
5. 前記Ｌ−ヒスチジン生産菌が、トランスアルドラーゼ遺伝子を有するマルチコピーベクターで形質転換することにより前記コピー数が増加した細菌である、請求項４に記載の方法。
6. 前記トランスアルドラーゼ遺伝子が、エシェリヒア属細菌に由来するものである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記トランスアルドラーゼ遺伝子が、
   （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
   （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質、からなる群から選ばれるタンパク質をコードする請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記トランスアルドラーゼ遺伝子が、
   （ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜９５４のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、及び
   （ｂ）配列番号１のヌクレオチド１〜９５４のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列と６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなる群から選ばれる、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記トランスアルドラーゼ遺伝子が、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれるタンパク質をコードする請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記Ｌ−ヒスチジン生産菌が、さらにヒスチジン生合成遺伝子の発現が増強された細菌である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、該ヒスチジン生合成遺伝子がｈｉｓＧ遺伝子及びｈｉｓＢＨＡＦＩオペロンの遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である、方法。