ES2367782T3

ES2367782T3 - Procedimiento para producir l-histidina utilizando bacterias de la familia enterobacteriáceas.

Info

Publication number: ES2367782T3
Application number: ES04747680T
Authority: ES
Inventors: Elena Vitalievna Klyachko; Rustam Saidovich Shakulov; Yuri Ivanovich Kozlov
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-07-16
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2011-11-08
Anticipated expiration: 2024-07-16
Also published as: EP1647593A4; JPWO2005007848A1; JP4821321B2; RU2276687C2; EP1647593B1; US7300786B2; EP1647593A1; WO2005007848A1; US7399618B2; US20070184532A1; US20050054061A1; RU2003121600A

Abstract

Bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas, en la que la bacteria ha sido modificada de manera que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en la que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: (A) una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y (B) la proteína de (A) que comprende deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que presenta una actividad enzimática transaldolásica, en la que dicha bacteria presenta una expresión aumentada de por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes hisG, hisB, hisH, hisA, hisF y hisI.

Description

Campo técnico

La presente invención se refiere a la biotecnología, y especialmente a un procedimiento para producir, mediante fermentación, un L-amino ácido tal como la L-histidina. La presente invención se refiere además a un gen derivado de una bacteria Escherichia coli. El gen resulta útil para mejorar la producción de L-histidina.

Antecedentes de la técnica

Convencionalmente, los L-aminoácidos se han obtenido industrialmente mediante fermentación, utilizando cepas de microorganismos obtenidos a partir de fuentes naturales, o mutantes de los mismos, modificados para aumentar la productividad de los L-aminoácidos.

Se ha informado de muchas técnicas con respecto al aumento de la producción de los L-aminoácidos, por ejemplo, mediante la transformación del microorganismo mediante ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente US nº 4.278.765). Estas técnicas están basadas en el aumento de las actividades de las enzimas implicadas en la biosíntesis de los aminoácidos y/o en las enzimas de desensibilización de las dianas a partir de la inhibición retroactiva por el L-aminoácido producido (véase, por ejemplo, la solicitud japonesa abierta al público nº 56-18596 (1981), WO 95/16042 o las patentes US nº 5.661.012 y nº 6.040.160).

El gen talB codifica la transaldolasa (TAL, D-sedoheptulosa-7-fosfato: D-gliceraldehído-3-fosfatodihidroxiacetonatransferasa) [EC 2.2.1.2], una enzima del ciclo no oxidativo de las pentosas fosfato (Sprenger G.A. et al, J. Bacteriol., 1995, Oct 177:20, 5930-6). La transaldolasa constituye una enzima clave en la biosíntesis de la ribosa-5-fosfato a partir de los productos de la glicólisis. La enzima cataliza la transferencia reversible de una fracción dihidroacetónica derivada de la fructosa-6-fosfatasa a la eritrosa-4-fosfato, formando seduheptulosa-7fosfato y liberando gliceraldehído-3-fosfato. Entonces, la seduheptulosa-7-fosfato y el gliceraldehído-3-fosfato se convierten en dos moléculas de pentosa-5-fosfato mediante la actividad de la transcetolasa.

Anteriormente, se ha informado de que el aumento de la actividad de la transaldolasa es útil para la producción microbiana de sustancias a partir del metabolismo aromático, en particular los aminoácidos aromáticos tales como la L-fenilalanina (patente US nº 6.316.232).

Recientemente, se ha sugerido, basándose únicamente en la teoría, que puede llevarse a cabo la preparación de L-treonina mediante la fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas con lo cual uno o más genes de un amplio grupo de genes, que incluyen el gen talB, se atenúan, y en particular, se eliminan (WO03008600A2). Al mismo tiempo, y en abierta contradicción con esto, se dio a conocer en WO03/008611A2 la preparación de L-treonina mediante fermentación de microorganismos de la familia de las Enterobacteriáceas, en la cual se aumenta, y se sobreexpresa en particular, la expresión de, por lo menos, el gen talB.

En Lu J-L et al: "Metabolic engineering and control analysis for production of aromatics: Role of transaldolase", Biotechnology and Bioengineering, vol. 53, nº 2, 1997, páginas 132-138, se da a conocer la utilización de una bacteria que sobreexpresa talB para la producción de aminoácidos aromáticos.

Sin embargo, hasta la fecha, no han existido informes que describan la amplificación del gen talB con el propósito de aumentar la producción de L-histidina utilizando cepas de la familia Enterobacteriáceas.

Exposición de la invención

Un objetivo de la presente invención consiste en desarrollar una cepa del microorganismo productor de L-histidina, que muestre un aumento de la producción de L-histidina. Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir L-histidina, utilizando dicha cepa.

La presente invención proporciona lo siguiente:

(1) Una bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas, en la que la bacteria se ha modificado, de forma que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada, aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa, o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por:

(A): una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y

(B): la proteína de (A) que incluye deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en

la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que posee actividad enzimática transaldolásica,

en la que dicha bacteria muestra un aumento de la expresión de por lo menos un gen, seleccionado de entre el grupo constituido por los genes hisG, hisB, hisH, hisA, hisF y hisI.

(2) Una bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas, en la que la bacteria se ha modificado, de forma que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada, aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa, o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en la que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por:

(B): la proteína de (A) que incluye deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que posee actividad enzimática transaldolásica;

en la que dicha bacteria muestra un aumento de la expresión de un gen de la ATP fosforibosiltransferasa de

Escherichia coli.

(3): La bacteria según (2), en la que dicho gen de la ATP fosforibosiltransferasa es desensibilizado a la inhibición retroactiva por la L-histidina.

(4): Un procedimiento para producir L-histidina, que comprende el cultivo de una bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas en un medio de cultivo, y la recuperación a partir del medio de cultivo de la Lhistidina acumulada, en el que la bacteria se ha modificado, de modo que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada, aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa, o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en el que dicho gen de la transaldolasa codifique una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por:

(B): la proteína de (A) que incluye deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que posee actividad enzimática transaldolásica.

(5): El procedimiento según (4), en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína que posee una identidad del 95% o más con la secuencia aminoácida de SEC. ID. nº:2, y posee actividad enzimática transaldolásica.

(6): El procedimiento según (4), en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2.

(7): El procedimiento según (4), en el que dicho gen de la transaldolasa comprende una secuencia nucleotídica de los nucleótidos 1 a 954 en SEC ID nº:1.

(8): El procedimiento según cualquiera de (4) a (7), en el que dicha bacteria pertenece al género Escherichia.

(9): El procedimiento según (8), en el que dicha bacteria es la Escherichia coli.

(10): El procedimiento según cualquiera de (4) a (9), en el que el número de copias del gen de la transaldolasa aumenta mediante la transformación de dicha bacteria con un vector multicopia que alberga dicho gen de la transaldolasa.

(11): El procedimiento según cualquiera de (4) a (10), en el que dicha bacteria posee una expresión aumentada de por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes hisG, hisB, hisH, hisA, hisF y hisI.

(12): El procedimiento según cualquiera de (4) a (10), en el que dicha bacteria posee una expresión aumentada de un gen de la ATP fosforibosiltransferasa de la Escherichia coli.

(13): El procedimiento según (12), en el que dicho gen de la ATP fosforibosiltransferasa es desensibilizado a la inhibición retroactiva mediante la L-histidina.

Formas de realización preferidas de la invención

Los objetivos mencionados anteriormente se alcanzaron identificando el gen talB que codifica la transaldolasa (TAL, D-sedoheptulosa-7-fosfato:D-gliceraldehído-3-fosfato-dihidroxiacetonatransferasa) [EC 2.2.1.2], que no está implicada en la vía biosintética del L-aminoácido diana, pero que puede aumentar la producción de L-histidina cuando copias adicionales se introducen en las células de la cepa productora respectiva. De este modo, se ha llevado a cabo la presente invención.

La presente invención se explicará con mayor detalle a continuación.

La bacteria de la presente invención es una bacteria de la familia Enterobacteriáceas que produce L-histidina, en la que la producción de L-histidina mediante la bacteria se realiza mediante el aumento en la bacteria de una actividad de la proteína de la presente invención. Específicamente, la bacteria de la presente invención es un bacteria que produce L-histidina, que pertenece al género Escherichia, en la que la producción de L-histidina por la bacteria se realiza aumentando en la bacteria una actividad de la proteína de la presente invención, especialmente transaldolasa. Más específicamente, la bacteria de la presente invención contiene ADN cromosómico o plasmídico que incluye el gen talB, y que muestra un aumento de la capacidad para producir L-histidina mediante la sobreexpresión del gen talB.

La expresión "Bacteria productora de L-histidina" hace referencia a una bacteria, que posee capacidad para provocar la acumulación de L-histidina en un medio, cuando la bacteria de la presente invención se cultiva en el medio. La capacidad para producir L-histidina puede provocarse o aumentarse mediante la cría. El término "bacteria productora de L-histidina" tal como se utiliza en la presente memoria, puede también significar una bacteria que puede producir y acumular en un medio de cultivo la L-histidina en una cantidad superior a en una cepa parental o de tipo salvaje, significando preferentemente el microorganismo que puede producir y provocar la acumulación en un medio de una cantidad no inferior a 0,5 g/l, más preferentemente no inferior a 1,0 g/l de L-histidina.

La familia de las Enterobacteriáceas incluye bacterias que pertenecen a los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefiere al género Escherichia.

La frase "una bacteria que pertenece al género Escherichia" se refiere a que la bacteria se clasifica como el género Escherichia según la clasificación conocida por el experto en la materia microbiológica. Un microorganismo que pertenece al género Escherichia tal como se utiliza en la presente invención comprende de manera no limitativa la Escherichia coli (E. coli).

La expresión "actividad transaldolásica" se refiere a una actividad para catalizar la reacción de transferencia reversible de una fracción dihidroacetónica derivada de la fructosa-6-fosfato a la eritrosa-4-fosfato, formando la sedoheptulosa-7-fosfato y liberando el gliceraldehído-3-fosfato. La actividad de la transaldolasa puede medirse mediante el procedimiento descrito por, por ejemplo, GA. Sprenger, U. Schorken, G. Sprenger & H. Sahm ("Transaldolase B of Escherichia coli K-12: cloning of its gene, talB, and characterization of the enzyme from recombinant strains. J. Bacteriol., 1995, 177:20: 5930-6).

La frase "modificada para aumentar una actividad de la transaldolasa" se refiere a que la bacteria se ha modificado de forma que la actividad por célula es superior a la de una cepa no modificada, por ejemplo, de una cepa salvaje. Por ejemplo, se incluyen células en las que aumenta el número de moléculas de transaldolasa por célula, células en las que aumenta la actividad específica por molécula de transaldolasa, y así sucesivamente. Además, la cepa salvaje que puede servir como un objeto para comparación incluye, por ejemplo, la Escherichia coli K-12. Como resultado del aumento de la actividad intracelular de la transaldolasa, aumenta la acumulación de L-histidina en el medio.

El aumento de la actividad transaldolásica en una célula bacteriana puede obtenerse aumentando la expresión de un gen que codifique la transaldolasa. Pueden utilizarse genes que codifiquen la transaldolasa derivados de bacterias de la familia Enterobacteriáceas y/o genes derivados de otras bacterias, tales como bacterias corineformes. Resultan preferidos los genes derivados de bacterias que pertenecen al género Escherichia.

Como gen que codifica la transaldolasa de la Escherichia coli (número EC 2.2.1.2), ya se ha informado del gen talB, (nucleótidos nº 8238 a nº 9191 en la secuencia de GenBank, número de registro NC_000913.1, gi:16128002). Por tanto, el gen talB puede obtenerse mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa; haciendo referencia a White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), utilizando cebadores basados en la secuencia nucleotídica del gen. Los genes que codifican la transaldolasa de otros organismos, pueden obtenerse de forma similar.

Un ejemplo del gen talB derivado de la Escherichia coli, incluye un ADN que codifica la proteína (A) o (B) siguiente:

(B): una proteína que comprende la secuencia aminoácida que incluye deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de uno a varios aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que posee actividad transaldolásica.

El ADN que codifica las proteínas de la presente invención incluye un ADN que codifica la proteína que presenta posiblemente deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de uno o varios aminoácidos en una o más posiciones de la proteína (A), siempre que no conduzca a la pérdida de la actividad proteica. El número de "varios" aminoácidos difiere, dependiendo de la posición de los residuos de aminoácidos en la estructura tridimensional de la proteína, y del tipo de aminoácidos. Sin embargo, significa entre 2 y 30 para la proteína (A). Esto es así, debido a que algunos aminoácidos presentan, entre ellos, una alta homología, y la diferencia en un aminoácido no afecta de forma acusada a la estructura tridimensional de la proteína y a su actividad. Por tanto, la proteína (B) puede consistir en una que muestre una homología no inferior a entre 30 y 50%, preferentemente no inferior a entre 50 y 70%, más preferentemente no inferior a entre 70 y 90%, y muy preferentemente no inferior a 95% con respecto a la secuencia aminoácida completa de la transaldolasa, y que presente la actividad de la transaldolasa.

Para evaluar el grado de homología, pueden utilizarse procedimientos de cálculo conocidos, tales como la investigación BLAST, la investigación FASTA y Crustal W. BLAST (Herramienta de investigación de la alineación local básica) es el algoritmo heurístico de investigación que se utiliza por los programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, y tblastx; estos programas atribuyen significado a sus hallazgos, utilizando los métodos estadísticos de Karlin, Samuel y Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes"). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7). El método FASTA de investigación se describe por W. R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA "), Methods in Enzymology 1990 183:63-98). El método Clustal W es descrito por Thompson J.D., Higgins D.G. y Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res.1994, 22:4673-4680).

Los cambios a la transaldolasa tales como los que se han descrito anteriormente, son típicamente conservadores, de forma que se mantiene la actividad transaldolásica. Los cambios sustitutivos incluyen aquéllos en los que un residuo, por lo menos, en la secuencia aminoácida, se elimina, insertándose un residuo distinto en su lugar. Los ejemplos de aminoácidos que pueden sustituirse por un aminoácido original en una proteína transaldolásica y que se consideran como sustituciones conservadoras incluyen: Ala, que se sustituye con ser o thr; arg, que se sustituye con gln, his, o lys; asn, que se sustituye con glu, gln, lys. his, asp; asp que se sustituye con asn, glu, o gln; cys que se sustituye con ser o ala; gln, que se sustituye con asn, glu, lys, his, asp o arg; glu que se sustituye con asn, gln, lys o asp; gly que se sustituye con pro; his que se sustituye con asn, lys, gln, arg, tyr; ile que se sustituye con leu, met, val, phe; leu que se sustituye con ile, met, val, phe; lys que se sustituye con asn, glu, gln, his, arg; met que se sustituye con ile, leu, val, phe; phe que se sustituye con trp, tyr, met, ile o leu;ser que se sustituye con thr, ala; thr que se sustituye con ser o ala; trp que se sustituye con phe, tyr; tyr que se sustituye con his, phe, o trp; y val que se sustituye con met, ile, leu.

La modificación a una transferasa tal como se ha descrito anteriormente puede llevarse a cabo teniendo en cuenta los hallazgos sobre las transaldolasas conocidas, por ejemplo, Methods Enzymol., 2002; 354:197-201; Eur. J. Biochem., abril 2001; 268(8):2408-15; FEBS Lett., 18 diciembre 1998; 441(2):247-50; Protein Sci. enero 1997; 6(1):119-24 y, Structure, 15 junio 1996; 4(6):715-24.

Puede obtenerse el ADN que codifica sustancialmente la misma proteína que la proteína definida en (A). Por ejemplo, mediante la modificación de la secuencia nucleotídica que codifica la proteína definida en (A), utilizando la mutagénesis dirigida puntualmente, de forma que uno o más residuos de aminoácidos serán suprimidos, sustituidos, insertados o añadidos. Dicho ADN modificado puede obtenerse mediante procedimientos convencionales utilizando el tratamiento con reactivos y condiciones que generen mutaciones. Dicho tratamiento incluye el del ADN que codifica las proteínas de la presente invención con hidroxilamina o el tratamiento de la bacteria que contiene el ADN con irradiación UV o un reactivo tal como la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina o el ácido nitroso.

El ADN que codifica proteínas de la presente invención incluye variantes que pueden encontrarse en distintas cepas de bacterias que pertenecen al género Escherichia, debido a la diversidad natural. El ADN que codifica dichas variantes puede obtenerse aislando el ADN que se hibrida al gen talB o a una parte suya, bajo condiciones rigurosas, y que codifica la proteína que posee una actividad transaldolásica. El término "condiciones rigurosas" puede incluir condiciones bajo las cuales se forma un denominado híbrido específico, no formándose un híbrido no específico. Por ejemplo, las condiciones rigurosas incluyen condiciones bajo las cuales los ADN que presentan una alta homología, por ejemplo, ADN que, entre ellos, presentan una homología no inferior a 70%, preferentemente no inferior a 80%, más preferentemente no inferior a 90%, todavía más preferentemente no inferior a 95%, pueden hibridarse. Alternativamente, las condiciones rigurosas pueden incluir condiciones que son condiciones típicas de lavado para la hibridación Southern, por ejemplo, 60ºC, 1 x SSC, SDS al 0,1%, preferentemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1%. Como sonda para el ADN que codifica las variantes y se hibrida con el gen talB, puede utilizarse asimismo una secuencia parcial de la secuencia nucleotídica de SEC ID nº:1. Dicha sonda puede prepararse mediante PCR, utilizando oligonucleótidos que se basan en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº:1 como cebadores, y un fragmento de ADN que contiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº:1 como una matriz. Cuando un fragmento de ADN de 300 pares de bases aproximadamente de longitud se utiliza como sonda, las condiciones de lavado para la hibridación, pueden ser, por ejemplo, de 50ºC, 2 x SSC, y SDS al 0,1%.

La transformación de la bacteria con un ADN que codifique una proteína, significa la introducción del ADN en una bacteria, por ejemplo, mediante procedimientos convencionales, para aumentar la expresión del gen que codifica la proteína de la presente invención, y para aumentar la actividad de la proteína en la bacteria.

La bacteria de la presente invención incluye también una en la que la actividad de la proteína de la presente invención es aumentada mediante la transformación de dicha bacteria con ADN que codifica una proteína según se define en (A) o (B), o alterando una secuencia reguladora de la expresión de dicho ADN en el cromosoma de la bacteria.

El ADN que se utiliza para la modificación de la bacteria de la presente invención codifica una proteína que posee una actividad transaldolásica. Más específicamente, el ADN puede ser el gen talB. El gen talB puede obtenerse, por ejemplo, mediante PCR, utilizando cebadores que se basan en la secuencia nucleotídica representada en SEC ID nº:1.

Los procedimientos de aumento de la expresión génica incluyen el aumento del número de copias génicas. La introducción de un gen en un vector que pueda funcionar en una bacteria que pertenezca al género Escherichia coli, aumenta el número de copias del gen. Se utilizan preferentemente vectores multicopia, e incluyen pBR322, pUC19, pBluescript KS+, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b, y similares. El aumento de la expresión génica puede alcanzarse introduciendo copias múltiples del gen en un cromosoma bacteriano, mediante, por ejemplo, procedimientos de recombinación homóloga y similares.

Alternativamente, el aumento de la expresión génica puede obtenerse situando el ADN de la presente invención bajo el control de un promotor más potente que el promotor natural. La intensidad de un promotor se define por la frecuencia de las acciones de iniciación de la síntesis del ARN. Los procedimientos para la evaluación de la intensidad de un promotor y los ejemplos de promotores potentes se describen por Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H., (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Por ejemplo, es conocido que el promotor PR es un potente promotor constitutivo. Otros conocidos promotores potentes son el promotor PL del fago lambda, el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, y similares.

El aumento de la traducción puede alcanzarse introduciendo una secuencia Shine-Dalgarno más eficiente en lugar de la secuencia original SD en el ADN de la presente invención. La secuencia SD es una región que se encuentra por encima del codón de iniciación del ARNm que interacciona con el 16S ARN del ribosoma (Shine J. y Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4, 1342-6).

La utilización de promotores potentes puede combinarse con la multiplicación de copias génicas.

Los procedimientos para la preparación del ADN cromosómico, hibridación, PCR, preparación del ADN plasmídico, digestión y unión del ADN, transformación, selección de un oligonucleótido como un cebador y similares, incluyen los procedimientos típicos bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos procedimientos se describen en Sambrook, J., y Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) y similares.

La bacteria de la presente invención puede obtenerse introduciendo los ADN mencionados anteriormente en una bacteria que posee inherentemente la capacidad para producir L-histidina. Alternativamente, la bacteria de la presente invención puede obtenerse impartiendo la capacidad de producir L-histidina en la bacteria que ya contiene los ADN.

Como cepas parentales en las que se va a aumentar la actividad de la proteína de la presente invención, están comprendidas las bacterias que pertenecen al género Escherichia que poseen capacidad para producir L-histidina, las cepas de bacterias que producen L-histidina pertenecientes al género Escherichia tales como la capa 24 de E. coli (VKPM B-5945, patente rusa 2003677); cepa 80 de E. coli (VKPM B-7270, patente rusa 2119536); cepas NRRL B-12116-B12121 de E. coli (patente US nº 4.388.405); cepas H-9342 (FERM BP-6675) y H-9343 (FERM BP-6676) de E. coli (patente US nº 6.344.347); cepa H-9341 (FERM BP-6674) de E. coli (solicitud de patente europea 1 085 087 A2); cepa AI80/pFM201 de E. coli (patente US nº 6.258.554) y similares.

Es deseable que la bacteria que produce L-histidina se modifique ulteriormente para que adquiera un aumento de la expresión de los genes de la biosíntesis de la L-histidina. Los genes efectivos para la biosíntesis de la L-histidina incluyen el gen hisG y los genes del operón hisBHAFI. Resulta preferido el gen hisG, que codifica una ATP fosforibosil transferasa, el cual gen es desensibilizado mediante inhibición retroactiva por la L-histidina (patentes rusas 2003677 y 2119536).

El procedimiento de la presente invención incluye la producción de L-histidina, que comprende las etapas de cultivo de la bacteria de la presente invención en un medio de cultivo, que permite que se obtenga la L-histidina, y la recuperación de la L-histidina acumulada a partir del medio de cultivo.

En la presente invención, el cultivo, recuperación y purificación de la L-histidina a partir del medio y similares, puede llevarse a cabo mediante procedimientos de fermentación convencionales para la producción de un aminoácido, utilizando un microorganismo.

Un medio utilizado para el cultivo puede ser, bien un medio sintético o un medio natural, siempre que el medio incluya una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y minerales y, si es necesario, las cantidades apropiadas de nutrientes que el microorganismo necesita para el crecimiento.

La fuente de carbono puede incluir diversos hidratos de carbono tales como glucosa y sacarosa, y varios ácidos orgánicos. Dependiendo del modo de asimilación de los microorganismos utilizados, puede utilizarse el alcohol, incluyendo el etanol y el glicerol.

Como fuente de nitrógeno, se utilizan varias sales amónicas tales como sulfato amónico y amoníaco, otros compuestos nitrogenados tales como aminas, una fuente natural de nitrógeno tal como peptona, hidrolizado de soja y microorganismos fermentativos digeridos.

Como minerales, se utilizan monofosfato potásico, sulfato magnésico, cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, cloruro cálcico, y similares. Pueden añadirse al medio, si es necesario, algunos nutrientes adicionales. Por ejemplo, si el microorganismo requiere prolina para el crecimiento (auxotrofía prolínica), puede añadirse al medio para el cultivo, la cantidad suficiente de prolina.

El cultivo se lleva a cabo preferentemente bajo condiciones aeróbicas tales como un cultivo al que se proporciona agitación y aireación, a una temperatura de entre 20 y 42ºC, preferentemente entre 37 y 40ºC. El pH del cultivo se encuentra habitualmente entre 5 y 9, preferentemente entre 6,5 y 7,2. El pH del cultivo puede ajustarse con amoníaco, carbonato cálcico, varios ácidos, varias bases y tampones. Habitualmente, un cultivo de entre 1 y 5 días conduce a una acumulación del L-aminoácido diana en el medio líquido.

Después del cultivo, sólidos tales como células pueden eliminarse del medio líquido mediante centrifugación o filtración de membrana, y entonces, el L-aminoácido diana puede recuperarse y purificarse mediante procedimientos de intercambio iónico, concentración y cristalización.

Ejemplos

La presente invención se explicará con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos siguientes. En los ejemplos, un aminoácido presenta la configuración L, si no se indica lo contrario.

Ejemplo 1: Clonación del gen talB de E. coli

Se ha informado de la secuencia nucleotídica completa de la cepa K-12 de E. coli (Science, 277, 1453-1474, 1997). Basándose en la secuencia nucleotídica de la que se ha informado, se sintetizaron los cebadores representados en SEC ID nº 3 (cebador 1) y nº 4 (cebador 2). El cebador 1 es una secuencia de entre 74 a 54 pares de bases situada por encima del codón de iniciación del gen talB, con el sitio enzimático de restricción de reconocimiento BglII que se introduce en su extremo 5'. El cebador 2 es una secuencia complementaria a una secuencia de entre 82 a 104 pares de bases que se sitúa por debajo del codón de finalización del gen talB, con el sitio enzimático de restricción de reconocimiento XbaI que se introduce en su extremo 5'.

El ADN cromosómico de E. coli K12 que se utilizó como matriz para la PCR, se preparó mediante un procedimiento ordinario. La PCR se llevó a cabo según el "Sistema 2400 PCR de amplificación génica de Applied Biosystems", bajo las condiciones siguientes: desnaturalización inicial del ADN a 95ºC durante 5 minutos; entonces, se llevaron a cabo 30 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, realizando la hibridación a 56ºC durante 60 segundos, y el alargamiento a 72ºC durante 120 segundos; y entonces, la polimerización final durante 7 minutos a 72ºC utilizando la Taq polimerasa (Fermentas, Lituania). El fragmento PCR obtenido que contenía el gen talB sin promotor, se trató con BglII y XbaI y se insertó bajo el control del promotor PR en el vector pMW119-PR que había sido tratado previamente con las mismas enzimas. El vector pMW119-PR fue construido a partir del vector pMW119 disponible comercialmente, insertando un promotor PR del fago λ. De esta forma, se obtuvo el plásmido pMW-PRtalB.

Ejemplo 2: Efecto de la expresión aumentada del gen talB en la producción de histidina.

La cepa 80 de E. coli productora de histidina se utilizó como cepa parental para la transformación con el plásmido pMW-PR-talB. La cepa 80 se ha descrito en la patente rusa 2119536 y se ha depositado en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (Rusia, 113545 Moscú, 1st Dorozhny proezd, 1), el 15 de octubre de 1999, con el número de registro VKPM B-7270. Entonces, se transfirió a un depósito internacional el 12 de julio de 2004, según lo estipulado por el Tratado de Budapest.

Ambas cepas, la 80 y la 80/pMW-PR-talB se cultivaron en un medio líquido L con 1 g/l de estreptomicina durante 6 horas a 29ºC. Entonces, 0,1 ml del cultivo obtenido, se inocularon en 2 ml de medio de fermentación en un tubo de ensayo de 20 x 200 mm, cultivándose durante 65 horas a 29ºC con un agitador rotatorio (350 rpm). Después del cultivo, se determinó la cantidad de histidina que se había acumulado en el medio, mediante cromatografía en papel. El papel se reveló con una fase móvil: n-butanol:ácido acético:agua=4:1:1 (vol/vol). Se utilizó una solución de ninhidrina (0,5%) en acetona como reactivo de visualización.

La composición del medio de fermentación (pH 6,0) (g/l):

Glucosa 100,0 Mameno 0,2 de TN

(hidrolizado proteico de soja) L-prolina 1,0 (NH4)2SO4 25,0 KH2PO4 2,0 MgSO4·7H2O 1.0 FeSO4·7H2O 0,01 MnSO4 0,01 Tiamina 0,001 Betaína 2,0 CaCO3 60,0 Estreptomicina 1,0

Los datos obtenidos se presentan en la Tabla 1

Tabla 1

Cepa de E. coli: OD450 Cantidad de histidina, g/l

80 (VKPM B-7270) 80/pMW-PR-talB: 27,5 28,2 16,2 19,1

A partir de la Tabla 1 puede apreciarse que el aumento de la expresión del gen talB mejoró la producción de la histidina por la cepa 80 de E. coli.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, puede aumentarse la productividad en fermentación de la L-histidina.

Listado de secuencias

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE L-HISTIDINA UTILIZANDO BACTERIAS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIÁCEAS

<130> C1760PC4093

<140>

<141> 2004-07-16

<150> RU2003121600

<151> 2003-07-16

<160> 5

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 954

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(954)

<400> 1

imagen1

<210> 2 5 <211> 317

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2 10

imagen1

<210> 3 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 3

ctcagatctg acgttgcgtc gtgatatca: 29

<210> 4 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 4

ctctctagac cgtttaaaca gtctcgttaa a: 31

<210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

<400> 5

cgcgcttcaa atgaaacaga t: 21

Claims

REIVINDICACIONES

1. Bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas, en la que la bacteria ha sido modificada de manera que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en la que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por:

(A)

una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y

(B)

la proteína de (A) que comprende deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que presenta una actividad enzimática transaldolásica,

en la que dicha bacteria presenta una expresión aumentada de por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes hisG, hisB, hisH, hisA, hisF y hisI.
2. Bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas, en la que la bacteria ha sido modificada de manera que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en la que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por:

(A)

una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y

(B)

la proteína de (A) que comprende deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que presenta actividad enzimática transaldolásica,

en la que dicha bacteria presenta una expresión aumentada de un gen de la ATP fosforibosiltransferasa de la Escherichia coli.
3.

Bacteria según la reivindicación 2, en la que dicho gen de la ATP fosforibosiltransferasa es desensibilizado a la retroinhibición por la L-histidina.
4.

Procedimiento para producir L-histidina, que comprende el cultivo de una bacteria productora de L-histidina de la familia Enterobacteriáceas en un medio de cultivo, y la recogida a partir del medio de cultivo de la L-histidina acumulada, en el que la bacteria se ha modificado de manera que la actividad enzimática transaldolásica por célula sea superior a la de una cepa no modificada aumentando el número de copias de dicho gen de la transaldolasa o reemplazando el promotor natural del gen de la transaldolasa por un promotor más potente, en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por:

(A)

una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID. nº:2; y

(B)

la proteína de (A) que comprende deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2 y que presenta actividad enzimática transaldolásica.
5.

Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína que presenta una identidad de 95% o más con la secuencia aminoácida de SEC. ID. nº:2, y presenta una actividad enzimática transaldolásica.
6.

Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho gen de la transaldolasa codifica una proteína que comprende la secuencia aminoácida representada en SEC. ID nº:2.
7.

Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho gen de la transaldolasa comprende una secuencia nucleotídica de los nucleótidos 1 a 954 en SEC ID nº:1.
8.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que dicha bacteria pertenece al género

Escherichia.
9.

Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha bacteria es la Escherichia coli.
10.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que el número de copias del gen de la transaldolasa es aumentado mediante la transformación de dicha bacteria con un vector multicopia que contiene dicho gen de la transaldolasa.
11.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en el que dicha bacteria presenta una expresión aumentada de por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por los genes hisG, hisB, hisH, hisA,

hisF y hisI.
12.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en el que dicha bacteria presenta una expresión aumentada de un gen de la ATP fosforibosiltransferasa de la Escherichia coli.
13.

Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho gen de la ATP fosforibosiltransferasa es desensibilizado a la retroinhibición por la L-histidina.