ES2333055T3 - Acetolactato sintasa mutante y procedimiento para producir l-aminoacidos de cadena ramificada. - Google Patents
Acetolactato sintasa mutante y procedimiento para producir l-aminoacidos de cadena ramificada. Download PDFInfo
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Abstract
Subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) que comprende la subunidad pequeña de acetolactato sintasa de tipo salvaje de Escherichia coli que comprende una mutación seleccionada de entre el grupo que consiste en: A) sustituir el L-aminoácido en la posición 17 y/o 30 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con otro L-aminoácido, B) sustituir la parte N-terminal corriente abajo desde el L-aminoácido en la posición 44 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con diversos L-aminoácidos, y C) sus combinaciones, y en la que dicha subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa se desensibiliza a la inhibición por retroalimentación por valina.
Description
Acetolactato sintasa mutante y procedimiento
para producir L-aminoácidos de cadena
ramificada.
La presente invención se refiere a
biotecnología, y particularmente a un procedimiento para preparar
L-aminoácidos de cadena ramificada. Más
específicamente, la presente invención da a conocer la utilización
de una nueva enzima resistente a L-valina
involucrada en la biosíntesis de L-aminoácidos de
cadena ramificada. Más específicamente, la presente invención se
refiere a acetolactato sintasa mutante (AHAS I) resistente a
L-valina purificada a partir de E. coli, una
bacteria de la familia Enterobacteriaceae que contiene dicha
enzima sintasa, y a un procedimiento para preparar
L-aminoácidos de cadena ramificada por fermentación
utilizando las cepas de dicha
bacteria.
bacteria.
Tradicionalmente, los
L-aminoácidos se han producido industrialmente por
fermentación utilizando cepas de microorganismos obtenidas de
fuentes naturales, o mutantes de las mismas que se han modificado
específicamente con el fin de aumentar la productividad de los
L-aminoácidos.
Anteriormente se han descrito muchas técnicas
para aumentar específicamente la productividad de
L-aminoácidos, tal como, por ejemplo, la
transformación de microorganismos con ADN recombinante (véase, por
ejemplo, la patente US nº 4.278.765). Dichas técnicas se basan en
incrementar las actividades de las enzimas involucradas en la
biosíntesis de aminoácidos y/o desensibilizar las enzimas diana a la
inhibición por retroalimentación por el
L-aminoácido producido (véase, por ejemplo, la
solicitud de patente japonesa abierta a inspección
56-18596 (1981), WO 95/16042 o las patentes US nº
5.661.012 y nº 6.040.160).
La biosíntesis de isoleucina, leucina y valina
tiene lugar a través de una ruta ramificada en la que tres etapas
son comunes a cada producto final. La reacción AHAS representa la
primera etapa biosintética común a los tres productos. Dicha
reacción está catalizada por isoenzimas que son la diana de la
inhibición del producto final por valina. Dicha regulación tiene un
papel central en el control fisiológico de la ruta en la bacteria.
La reacción incluye la condensación del acetaldehído activo
(derivado de piruvato) con \alpha-cetobutirato o
piruvato con el fin de obtener
\alpha-aceto-\alpha-hidroxibutirato
(un precursor de isoleucina) o \alpha-acetolactato
(un precursor de leucina y valina), respectivamente.
Se ha documentado que la valina y su precursor
ceto-ácido, el ácido \alpha-cetoisovalérico,
inhiben el crecimiento de E. coli K12, y que la isoleucina
contrarresta dicha inhibición (Tatum, E.L., Fed. Proc. 8:511
(1946)). Actualmente, se acepta de forma generalizada que la
inhibición de valina resulta principalmente de bloquear la síntesis
de
\alpha-aceto-\alpha-hidroxibutirato.
Un análisis de la E. coli K12 ha puesto de manifiesto que
esta cepa contiene los genes estructurales para las tres actividades
AHAS, que se designan como isoenzimas AHAS I, AHAS II y AHAS III.
AHAS I y AHAS III son inhibidas por valina, mientras que AHAS II es
resistente a la misma; sin embargo, AHAS II no está expresada
normalmente en las células de E. coli K12 (Guardiola, J. y
otros, Mol. Gen. Genet. 156: 17-25 (1977)). Todas
las isoenzimas AHAS de enterobacterias están compuestas por una
subunidad grande y una subunidad pequeña en una estructura
\alpha_{2}\beta_{2}, desempeñando las subunidades grandes
una función catalítica y desempeñando las subunidades pequeñas una
función reguladora. Las subunidades pequeñas son absolutamente
necesarias para la sensibilidad de la actividad enzimática al
inhibidor por retroalimentación por valina. Un estudio de las
propiedades individuales de las subunidades de AHAS I y AHAS III
(Weinstock O. y otros, J. Bacteriol. 174:5560-5566
(1992)) mostró que las subunidades pequeñas inducen específicamente
una conformación catalíticamente competidora de la enzima entera y
estabilizan el estado de transición.
Sobre la base de un modelo de la región
enlazadora de valina de la subunidad pequeña reguladora de la AHAS
III de la E. coli, se llevaron a cabo truncamientos del
extremo carboxilo de la subunidad pequeña. Dichos truncamientos
inducen la ausencia de sensibilidad a la valina en las enzimas
truncadas de AHAS III (Mendel S. y otros, J Mol
Biol.10;325(2):275-84 (2003)).
Sin embargo, en la actualidad no existen
trabajos que describan una acetolactato sintasa bacteriana mutante
(AHAS I) que sea resistente a la retroalimentación por valina y la
utilización de una acetolactato sintasa mutante de este tipo para
mejorar la producción de L-aminoácidos de cadena
ramificada en las correspondientes cepas productoras de
L-aminoácidos.
La presente invención da a conocer una nueva
acetolactato sintasa bacteriana mutante con el objetivo de
desarrollar cepas productoras de L-aminoácidos de
cadena ramificada con una productividad aumentada de
L-aminoácidos de cadena ramificada, y da a conocer
un procedimiento para producir L-aminoácidos de
cadena ramificada utilizando dichas cepas.
La presente invención se alcanzó construyendo
una nueva acetolactato sintasa mutante a partir de E. coli.
Esta acetolactato sintasa mutante procedente de E. coli
presenta una mutación en la unidad reguladora IlvN, específicamente
Asn-17, Ala-30 y/o
Ile-44. Se demostró que esta acetolactato sintasa
mutante aumenta la producción de L-aminoácidos de
cadena ramificada cuando el ADN que codifica la enzima mutante se
introduce en la cepa productora de L-aminoácido de
cadena ramificada.
Un aspecto de la presente invención consiste en
proporcionar una subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa
bacteriana (AHAS I) que comprende la subunidad pequeña de
acetolactato sintasa de tipo salvaje de Escherichia coli que
comprende una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en:
sustituir el L-aminoácido de la posición 17 y/o 30
de la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con otro
L-aminoácido, sustituir la parte
N-terminal corriente abajo con respecto al
L-aminoácido de la posición 44 de la secuencia de
aminoácidos de SEC ID nº 2 con diversos
L-aminoácidos, y combinaciones de los mismos,
estando dicha subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa
desensibilizada a la inhibición por retroalimentación por
valina.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, estando
sustituido dicho L-aminoácido de la posición 17 con
un residuo de lisina.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, estando
sustituido dicho L-aminoácido de la posición 30 con
un residuo de prolina.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, estando
sustituida dicha parte N-terminal corriente abajo
con respecto al L-aminoácido de la posición 44 con
arginina y fenilalanina.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, en la que dicho
L-aminoácido de la posición 17 sustituido con un
residuo de lisina es asparagina.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, en la que dicho
L-aminoácido de la posición 30 sustituido con un
residuo de prolina es alanina.
otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, en la que dicho
L-aminoácido de la posición 44 sustituido con
arginina y fenilalanina es isoleucina.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar una acetolactato sintasa bacteriana mutante que
comprende la subunidad pequeña descrita anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la acetolactato sintasa mutante descrita
anteriormente, en la que dicha acetolactato sintasa mutante
comprende la subunidad grande de Escherichia coli.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la acetolactato sintasa bacteriana mutante descrita
anteriormente, en la que la subunidad pequeña incluye eliminaciones,
sustituciones, inserciones o adiciones de uno a 15 aminoácidos en
una o más posiciones distintas de la posición 17, 30 y/o 44, y en la
que dicha acetolactato sintasa mutante mantiene la actividad de
acetolactato sintasa y está desensibilizada a la inhibición por
retroalimentación por valina.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar un ADN que codifica la subunidad pequeña de la
acetolactato sintasa descrita anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar una bacteria de la familia Enterobacteriaceae
que contiene el ADN descrito anteriormente y tiene la capacidad de
producir L-aminoácidos de cadena ramificada.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria descrita anteriormente, seleccionándose
dichos L-aminoácidos de cadena ramificada entre el
grupo que consiste en L-leucina,
L-isoleucina y L-valina.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria descrita anteriormente, estando
potenciada la actividad de la acetolactato sintasa mutante en dicha
bacteria.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria descrita anteriormente, perteneciendo
dicha bacteria al género Escherichia.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que la
actividad de la acetolactato sintasa mutante se potencia
incrementando la expresión del gen de la acetolactato sintasa
mutante.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que la
actividad de la acetolactato sintasa mutante se aumenta mediante un
procedimiento seleccionado de entre el grupo que consiste en:
- a)
- aumentar el número de copias del gen de la acetolactato sintasa mutante,
- b)
- modificar una secuencia de control de expresión del gen de tal modo que la expresión del gen aumenta, y
- c)
- sus combinaciones.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria descrita anteriormente, en la que el
número de copias se aumenta mediante la integración de múltiples
copias del gen de la acetolactato sintasa mutante en el cromosoma
de la bacteria.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar un procedimiento para preparar
L-aminoácidos de cadena ramificada que comprende
cultivar la bacteria descrita anteriormente en un medio de cultivo y
recoger los L-aminoácidos de cadena ramificada de
dicho medio de cultivo.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar el procedimiento descrito anteriormente, en el que
la bacteria presenta una expresión aumentada de genes involucrados
en la biosíntesis de L-aminoácidos de cadena
ramificada.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar el procedimiento descrito anteriormente, en el que
dichos L-aminoácidos de cadena ramificada se
seleccionan de entre el grupo que consiste en
L-leucina, L-isoleucina y
L-valina.
La figura 1 representa la construcción del
plásmido pMIV-P_{ivbL}-ilvBN;
La figura 2 representa la estrategia para
secuenciar el operón ilvBN33;
La figura 3 representa una alineación de las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ilvN y
ilvN33. La secuencia de nucleótidos se indica en letras
minúsculas, y la de aminoácidos en letras mayúsculas. Una
repetición directa de 34 bp en ilvN33 está representada en
negrita y marcada con flechas;
La figura 4 representa la construcción del
plásmido pM12;
La figura 5 representa la construcción del
plásmido pM12-ter(thr);
La figura 6 representa la construcción del
casete integrador intJS;
La figura 7 representa la construcción del
plásmido pMTV-5JS;
La figura 8 representa la construcción de un
fragmento de ADN cromosómico con el gen ilvBN inactivado.
A continuación, la presente invención se
describe con detalle.
El término "acetolactato sintasa
bacteriana" se refiere a acetolactato sintasa de tipo salvaje o
endógena presente en bacterias de la familia
Enterobacteriaceae, corinebacterias, bacterias pertenecientes
al género Bacillus, etc. La familia
Enterobacteriaceae incluye bacterias pertenecientes a los
géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y
Serratia. Resulta preferido el género Escherichia.
La expresión "actividad de acetolactato
sintasa" se refiere a la actividad que cataliza la formación de
2-aceto-2-hidroxi-butirato
y CO_{2} a partir de piruvato y 2-oxobutanoato,
o la formación de 2-acetolactato y CO_{2} a partir
de dos moléculas de piruvato. Dicha actividad se puede medir en
extractos bacterianos utilizando el método de F.C. Stormer y H.E.
Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5,
587-592 (1964)).
La acetohidroxibutanoato sintasa I, también
denominada acetolactato sintasa I (AHAS I), es una proteína
heterotetramérica que incluye dos dominios catalíticos y dos
dominios reguladores (Weinstock, O. y otros, J. Bacteriol.,
174(17), 5560-5566 (1992)). Se acepta
generalmente que las subunidades grandes (aprox. 60 kDa) son
catalíticas, mientras que las pequeñas son reguladoras. La AHAS I
está codificada por los genes ilvB e ilvN.
\newpage
Sustituyendo la asparagina de la posición 17 y/o
la alanina de la posición 30 en la subunidad pequeña de acetolactato
sintasa de Escherichia coli [EC 4.1.3.18] con
cualquier aminoácido, preferentemente lisina en la posición 17, y
prolina en la posición 30, se obtiene una proteína mutante que es
resistente a la inhibición por retroalimentación por valina.
Además, sustituyendo la parte N-terminal corriente
abajo respecto al L-aminoácido de la posición 44
con uno o varios aminoácidos, preferentemente 2 aminoácidos tales
como arginina y fenilalanina, se obtiene una proteína mutante que
es resistente a la inhibición por retroalimentación por valina. Un
ejemplo típico de un mutante de este tipo es IlvN33 (SEC ID nº 11).
Diversos aminoácidos se pueden sustituir corriente abajo con
respecto a la posición 44, pero típicamente se sustituyen entre 1 y
20, preferentemente entre 1 y 10, y más preferentemente 2. La
subunidad pequeña de acetolactato sintasa de tipo salvaje que
presenta una sustitución o sustituciones en la posición 17 y/o en
la posición 30, o que presenta diversos aminoácidos sustituidos en
la parte N-terminal corriente abajo con respecto a
la posición 44, se puede designar "subunidad pequeña mutante".
La acetolactato sintasa que contiene la subunidad pequeña mutante se
puede designar "acetolactato sintasa mutante". Un ADN que
codifica la subunidad pequeña mutante se puede designar "gen
ilvN mutante". La subunidad pequeña de acetolactato
sintasa sin ninguna sustitución se puede designar "subunidad
pequeña de tipo salvaje". Una acetolactato sintasa que contiene
subunidades pequeñas de tipo salvaje se puede designar
"acetolactato sintasa de tipo salvaje". Además, un ADN que
codifica la subunidad pequeña mutante según la presente invención y
una subunidad grande de acetolactato sintasa se puede designar
"gen de acetolactato sintasa mutante".
El gen ilvB (sinónimo - b3671) codifica
la subunidad grande de acetolactato sintasa. El gen ilvB
(nucleótidos complementarios a las posiciones de nucleótido 3849119
a 3850807; número de acceso GeneBank NC_000913.2; gi:16129170) está
localizado entre el gen ilvN y el gen ivbL en el cromosoma de
E. coli K-12.
El gen ilvN (sinónimo - b3670) codifica
la subunidad pequeña de acetolactato sintasa. El gen ilvN
(nucleótidos complementarios a las posiciones de nucleótido 3848825
a 3849115; número de acceso GeneBank NC_000913.2; gi:49175990) está
localizado entre el gen uhpA y el gen ilvB en el cromosoma de
E. coli K-12. La secuencia de nucleótidos
del gen ilvN y la secuencia de aminoácidos de la subunidad
pequeña de la acetolactato sintasa codificada por el gen
ilvN se muestran en SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2,
respectivamente. Los genes ilvB e ilvN forman el
operón ilvB.
La subunidad pequeña mutante se obtienen
introduciendo mutaciones en un gen ilvN de tipo salvaje
utilizando métodos conocidos. El operón ilvBN se puede
obtener por PCR (reacción en cadena de la polimerasa; véase White,
T.J. y otros, Trends Genet., 5, 185 (1989)) utilizando cebadores
basados en la secuencia de nucleótidos del operón. Se pueden
obtener genes que codifican la acetolactato sintasa a partir de
otros microorganismos de un modo
similar.
similar.
La subunidad pequeña mutante puede incluir
eliminaciones, sustituciones, inserciones o adiciones de uno o
varios aminoácidos en una o más posiciones distintas de 17, 30 y/o
44, siempre y cuando se mantenga la actividad de la acetolactato
sintasa que contiene las subunidades mutantes. El número de
"varios" aminoácidos difiere dependiendo de la posición en la
estructura tridimensional de la proteína o del tipo de residuos de
aminoácido. Esto es debido a que algunos aminoácidos son similares
entre sí en su estructura y función dentro de una proteína, y el
intercambio de dichos aminoácidos no afecta en grado elevado a la
estructura tridimensional o a la función de la proteína. En
consecuencia, la acetolactato sintasa mutante según la presente
invención puede ser una acetolactato sintasa que presenta una
homología no menor del 70%, preferentemente 80%, y más
preferentemente 90%, y aún más preferentemente de 95% con respecto
a la secuencia de aminoácidos entera para la acetolactato sintasa,
y la cual mantiene la actividad de acetolactato sintasa.
Alternativamente, el número de "varios" aminoácidos puede ser
de 1 a 30, preferentemente de 1 a 15, y más preferentemente de 1 a
5.
Las sustituciones, eliminaciones, inserciones o
adiciones de uno o varios residuos de aminoácido son una mutación o
mutaciones conservativas, de tal modo que se mantiene la actividad.
La mutación conservativa representativa es una sustitución
conservativa. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen
la sustitución de Ser o Thr por Ala, la sustitución de Gln, His o
Lys por Arg, la sustitución de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn, la
sustitución de Asn, Glu o Gln por Asp, la sustitución de Ser o Ala
por Cys, la sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln,
la sustitución de Asn, Gln, Lys o Asp por Glu, la sustitución de Pro
por Gly, la sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His, la
sustitución de Leu, Met, Val o Phe por Ile, la sustitución de Ile,
Met, Val o Phe por Leu, la sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg
por Lys, la sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met, la
sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe, la sustitución de
Thr o Ala por Ser, la sustitución de Ser o Ala por Thr, la
sustitución de Phe o Tyr por Trp, la sustitución de His, Phe o Trp
por Tyr, y la sustitución de Met, Ile o Leu por
Val.
Val.
La subunidad grande de la acetolactato sintasa
codificada por el gen ilvB también puede incluir
eliminaciones, sustituciones, inserciones o adiciones de uno o
varios aminoácidos en una o más posiciones.
En la presente invención, la expresión
"L-aminoácido de la posición 17, 30 y/o 44" se
refiere a un residuo de aminoácido correspondiente al residuo de
aminoácido de la posición 17, 30 y/o 44 de la secuencia de
aminoácidos de SEC ID nº 2, que es la secuencia de la subunidad
pequeña de tipo salvaje de E. coli de la acetolactato
sintasa. En la subunidad pequeña de la acetolactato sintasa de E.
coli, el residuo de aminoácido de la posición 17 es asparagina,
el residuo de aminoácido de la posición 30 es alanina, y el residuo
de aminoácido de la posición 44 es isoleucina. La posición de un
residuo aminoácido puede cambiar. Por ejemplo, si un residuo de
aminoácido se inserta en la parte N-terminal, el
residuo de aminoácido de la posición 17, 30 y/o 44 se convierte en
la posición 18, 31 y/o 45. En dicho caso, en la presente invención
el residuo de aminoácido de la posición original 17, 30 y/o 44 se
designa residuo aminoácido de la posición 17, 30 y/o 44.
Para determinar el L-aminoácido
de la posición 17, 30 y/o 44 de una subunidad pequeña de
acetolactato sintasa a partir de una bacteria de interés, la
secuencia de aminoácidos de la subunidad pequeña de la acetolactato
sintasa de E. coli (SEC ID nº 2) se alinea con la secuencia
de aminoácidos de la unidad pequeña de la acetolactato sintasa de
la bacteria de interés, y se pueden determinar los
L-aminoácidos de la posición 17, 30 y/o 44 de la
subunidad pequeña de la acetolactato sintasa de la bacteria de
interés.
El ADN que codifica la sustancialmente misma
proteína que la subunidad pequeña mutante descrita anteriormente se
obtiene, por ejemplo, modificando la secuencia de nucleótidos por
mutagénesis dirigida al sitio, de tal modo que se eliminan,
sustituyen, insertan o añaden uno o más residuos aminoácido en un
sitio específico. El ADN modificado tal como se ha descrito
anteriormente se obtiene mediante tratamientos de mutación
comúnmente conocidos. Dichos tratamientos de mutación incluyen
tratar un ADN que contiene el gen mutante ilvN in
vitro, por ejemplo, con hidroxilamina, y tratar un
microorganismo, por ejemplo, una bacteria perteneciente al género
Escherichia que posee el gen mutante ilvN, con
irradiación ultravioleta o un agente mutante conocido, tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) y ácido nitroso.
Las sustituciones, eliminaciones, inserciones o
adiciones de nucleótidos, tal como se han descrito anteriormente,
incluyen también mutaciones naturales (mutante o variante), por
ejemplo, con base en diferencias individuales o diferencias en
especies o géneros de la bacteria que contiene la acetolactato
sintasa.
El ADN que codifica la sustancialmente misma
proteína que la subunidad pequeña mutante se puede obtener aislando
un ADN que se hibridiza con un ADN que presenta una secuencia
complementaria a la secuencia conocida del gen ilvN o parte
de la misma en condiciones estrictas, y el cual codifica una
proteína que forma una enzima completa que presenta actividad de
acetolactato sintasa con una subunidad grande, a partir de una
célula que se ha sometido a tratamiento de mutación.
El término "condiciones estrictas" incluye
las condiciones bajo las cuales se forma un híbrido específico, por
ejemplo, un híbrido que presenta una homología no menor del 60%,
preferentemente no menor del 70%, más preferentemente no menor del
80%, aún más preferentemente no menor del 90%, y de la manera más
preferida no menor del 95%, y no se forma un híbrido no específico,
por ejemplo, un híbrido que presenta una homología menor que las
anteriores. Por ejemplo, un ejemplo de condiciones estrictas
consiste en lavar una o más veces, preferentemente dos o tres
veces, a una concentración de sal de 1 x SSC, 0,1% SDS,
preferentemente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 60ºC. La duración del lavado
depende del tipo de membrana utilizada para la transferencia
("blotting"), y como norma debe ser la recomendada por el
fabricante. Por ejemplo, la duración de lavado recomendada para la
membrana de nylon Hybond^{TM} N+ (Amersham) en condiciones
estrictas es de 15 minutos. Preferentemente, el lavado se lleva a
cabo de 2 a 3 veces. La longitud de la sonda se puede seleccionar
adecuadamente dependiendo de las condiciones de hibridización, y
habitualmente está comprendida entre 100 bp y 1 kbp.
Para evaluar el grado de homología de proteína o
de ADN, se pueden utilizar diversos métodos de cálculo, tales como
una búsqueda BLAST, una búsqueda FASTA y ClustalW.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es el
algoritmo de búsqueda heurística utilizado por los programas
blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn y tblastx. Estos
programas atribuyen significación a sus descubrimientos utilizando
los métodos estadísticos de Karlin, Samuel y Stephen F. Altschul
("Methods for assessing the statistical significance of molecular
sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications
and statistics for multiple high-scoring segments in
molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993,
90:5873-7). El método de búsqueda FASTA se describe
en W. R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with
FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63- 98). El
método ClustalW se describe en Thompson J.D., Higgins D.G. y Gibson
T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive
multiple sequence alignment through sequence weighting,
position-specific gap penalties and weight matrix
choice", Nucleic Acids Res. 1994,
22:4673-4680).
Los genes que pueden hibridizarse en las
condiciones descritas anteriormente incluyen genes que presentan un
codón de parada dentro de la región codificadora y genes que son
inactivos debido a la mutación del sitio activo. Sin embargo,
dichos inconvenientes se pueden eliminar fácilmente ligando el gen
con un vector de expresión comercializado e investigando la
actividad de acetolactato sintasa de la enzima entera que contiene
la proteína expresada.
la bacteria según la presente invención es una
bacteria productora de L-aminoácidos de cadena
ramificada de la familia Enterobacteriaceae que contiene un
ADN que codifica la subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa. Además, la bacteria según la presente invención es una
bacteria productora de L-aminoácidos de cadena
ramificada de la familia Enterobacteriaceae que presenta una
actividad aumentada de acetolactato sintasa mutante.
Específicamente, la bacteria según la presente invención es una
bacteria productora de L-aminoácidos de cadena
ramificada de la familia Enterobacteriaceae en la que la
producción de L-aminoácidos de cadena ramificada
aumenta debido a la introducción en dicha bacteria del gen mutante
ilvN, que codifica la subunidad pequeña mutante según la
presente invención. La bacteria según la presente invención es una
bacteria productora de L-aminoácidos de cadena
ramificada perteneciente al género Escherichia, en la que la
producción de L-aminoácidos de cadena ramificada
aumenta potenciando la actividad de acetolactato sintasa,
concretamente acetolactato sintasa mutante resistente a valina, en
dicha bacteria. Más concretamente, la bacteria según la presente
invención contiene el gen mutante ilvN en el cromosoma
bacteriano o en un plásmido, estando dicho gen sobreexpresado y
presentando dicha bacteria una capacidad aumentada de producir
L-aminoácidos de cadena ramificada.
La expresión "bacteria que tiene capacidad de
producir L-aminoácidos de cadena ramificada" se
refiere a una bacteria que tiene la capacidad de provocar una
acumulación de los L-aminoácidos de cadena
ramificada en un medio, tales como L-leucina,
L-isoleucina y L-valina, cuando la
bacteria según la presente invención se cultiva en dicho medio. La
capacidad de producción de L-aminoácidos de cadena
ramificada se puede proporcionar o potenciar mediante la
reproducción. La expresión "bacteria que tiene capacidad para
producir L-aminoácidos de cadena ramificada"
utilizada en el presente documento se refiere también a una bacteria
capaz de producir y provocar la acumulación en el medio de cultivo
de una cantidad mayor de L-aminoácidos de cadena
ramificada que una cepa de tipo salvaje o parental, y
preferentemente se refiere al hecho de que la bacteria es capaz de
producir y provocar la acumulación en el medio de no menos de 0,5
g/l, más preferentemente no menos de 1,0 g/l de los
L-aminoácidos de cadena ramificada. Ejemplos de
L-aminoácidos incluyen L-leucina,
L-isoleucina y L-valina.
La familia Enterobacteriaceae incluye
bacterias pertenecientes a los géneros Escherichia, Enterobacter,
Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella,
Serratia, Shigella, Morganella y Yersinia, etc. Específicamente, se
pueden utilizar las clasificadas como Enterobacteriaceae
según la taxonomía utilizada en la base de datos del NCBI (National
Center for Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/
wwwtax.cgi?id=91347). Resulta preferente una bacteria perteneciente al género Escherichia o Pantoea.
wwwtax.cgi?id=91347). Resulta preferente una bacteria perteneciente al género Escherichia o Pantoea.
El término "bacteria perteneciente al género
Escherichia" se refiere a la bacteria clasificada como
género Escherichia según la clasificación conocida por una
persona experta en microbiología. Un ejemplo es Escherichia
coli (E. coli).
La expresión "se potencia la actividad de la
acetolactato sintasa mutante" se refiere al hecho de que la
actividad por célula es mayor que la de una cepa no modificada, por
ejemplo, una cepa de tipo salvaje. Ejemplos de actividades
potenciadas incluyen cuando el número de moléculas de acetolactato
sintasa mutante por célula aumenta, y cuando la actividad
específica por molécula de acetolactato sintasa mutante aumenta,
etc. Además, un ejemplo de cepa de tipo salvaje que se puede
utilizar como comparación es, por ejemplo, la Escherichia
coli K-12. Como resultado de potenciar la
actividad intracelular de la acetolactato sintasa mutante, la
cantidad de L-aminoácidos de cadena ramificada en
el medio aumenta.
La actividad de la acetolactato sintasa mutante
en una célula bacteriana se puede potenciar aumentando la expresión
del gen que codifica la acetolactato sintasa mutante. Se puede
utilizar cualquier gen que codifica la acetolactato sintasa mutante
derivado o aislado de bacterias de la familia
Enterobacteriaceae o bacterias corineformes. Entre estos,
resultan preferidos los genes derivados de bacterias pertenecientes
al género Escherichia.
Transformar una bacteria con un ADN que codifica
una proteína significa introducir el ADN en una célula bacteriana,
por ejemplo por métodos convencionales, con el fin de incrementar la
expresión del gen que codifica la proteína según la presente
invención y potenciar la actividad de dicha proteína en la célula
bacteriana.
Los métodos para potenciar la expresión del gen
incluyen aumentar el número de copias del gen. Introducir un gen en
un vector capaz de funcionar en una bacteria perteneciente al género
Escherichia hace aumentar el número de copias del gen. Con
estos propósitos se pueden utilizar preferentemente vectores
multicopia, tales como pBR322, pUC19, pBluescript KS+, pACIC177,
pACIC184, pAYC32, pMW119, pET22b, o similares. La expresión del gen
también se puede potenciar introduciendo múltiples copias de dicho
gen en el cromosoma bacteriano, por ejemplo, por recombinación
homóloga o similar.
La expresión del gen también se puede potenciar
poniendo el ADN según la presente invención bajo el control de un
promotor más potente que el promotor nativo. La potencia de un
promotor se define como la frecuencia de iniciación de síntesis de
ARN. En Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters
in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength
indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5,
2987-2994) se describen métodos para evaluar la
potencia de un promotor y ejemplos de promotores potentes. Por
ejemplo, el promotor P_{R} es conocido como un potente promotor
constitutivo. Otros promotores potentes conocidos son el promotor
P_{L}, el promotor lac, el promotor trp, el promotor
trc, de fago lambda y similares.
La traducción se puede potenciar introduciendo
en el ADN según la presente invención una secuencia
Shine-Dalgarno más eficiente (secuencia SD) en el
lugar de la secuencia SD nativa, cuando la secuencia SD está
corriente arriba en el sentido de la secuencia que el codón de
inicio del mARN que interactúa con el ARN 16S de ribosoma (Shine J.
y Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4,
1342-6).
La utilización de un promotor potente se puede
combinar con la utilización de múltiples copias del gen.
Los métodos para preparar ADN cromosómico,
hibridización, PCR, preparación de ADN plásmido, digestión y
ligación de ADN, transformación, selección de un oligonucleótido
como cebador, y similares, pueden ser métodos típicos bien
conocidos para el experto en la materia. Dichos métodos se describen
en Sambrook, J., y Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory
Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press
(2001), y
similares.
similares.
La bacteria según la presente invención se puede
obtener introduciendo los ADN mencionados anteriormente en una
bacteria que puede inherentemente producir
L-aminoácidos de cadena ramificada.
Alternativamente, la bacteria según la presente invención se puede
obtener proporcionando capacidad para producir
L-aminoácidos de cadena ramificada a una bacteria
que ya contenga los ADN.
Para la cepa madre según la presente invención,
se utilizan bacterias productoras de L-valina
pertenecientes al género Escherichia, tales como
H-81 (VKPM B- 8066), NRRL B-12287 y
NRRL B-12288 (patente US nº No. 4.391.907), VKPM
B-4411 (patente US nº No. 5.658.766), VKPM
B-7707 (solicitud de patente europea EP1016710A2),
o similares. También se pueden utilizar bacterias productoras de
L-leucina pertenecientes al género
Escherichia, tales como H-9070 (FERM
BP-4704) y H- 9072 (FERM BP-4706)
(US5744331), VKPM B-7386 y VKPM
B-7388 (RU2140450), W1485atpA401/pMWdAR6,
W14851ip2/pMWdAR6 y AJ12631/pMWdAR6 (EP0872547), o similares.
También se pueden utilizar bacterias productoras de
L-isoleucina pertenecientes al género
Escherichia, tales como la cepa (NZ10) TDH6/pVIC40, pMWD5
(Hashiguchi, K. y otros, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(4),
672-679 (1999)), o la cepa AJ12919 descrita en la
solicitud de patente europea EP 685555 A1, o similares.
El método según la presente invención incluye la
producción de un L-aminoácido de cadena ramificada,
tal como L-leucina, Lisoleucina y
L-valina, cultivando la bacteria según la presente
invención en un medio de cultivo, permitiendo la producción del
L-aminoácido de cadena ramificada en el medio de
cultivo y recogiendo el L-aminoácido de cadena
ramificada de dicho medio de cultivo.
En la presente invención, el cultivo,
recolección y purificación de los L-aminoácidos de
cadena ramificada del medio y similares se pueden llevar a cabo de
un modo similar a los métodos convencionales de fermentación en los
que se produce un aminoácido utilizando un microorganismo. El medio
utilizado para el cultivo puede ser un medio sintético o natural,
siempre y cuando incluya una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno y minerales y, si es necesario, las cantidades apropiadas
de nutrientes que requiera el microorganismo para su crecimiento.
La fuente de carbono puede incluir diversos hidratos de carbono,
tales como glucosa y sucrosa, y diversos ácidos orgánicos. En
función del modo de asimilación del microorganismo escogido, se
pueden utilizar alcoholes, incluyendo etanol y glicerol. Como
fuente de nitrógeno, se utilizan diversas sales de amonio, tales
como amoníaco y sulfato de amonio, otros compuestos de nitrógeno,
tales como aminas, una fuente natural de nitrógeno, tal como
peptona, hidrolizado de soja y microorganismos fermentativos
digeridos. Como minerales, se utilizan monofosfato de potasio,
sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de
manganeso, cloruro de calcio y similares. Si es necesario, se
pueden añadir nutrientes adicionales al medio. Por ejemplo, si el
microorganismo requiere prolina para su crecimiento (auxotrofia de
prolina), se puede añadir una cantidad suficiente de prolina al
medio.
El cultivo se lleva a cabo preferentemente en
condiciones aeróbicas, tales como un medio en agitación y un medio
en agitación con aireación, a una temperatura de 20 a 42ºC,
preferentemente de 37 a 40ºC. Habitualmente, el pH del cultivo está
comprendido entre 5 y 9, preferentemente entre 6,5 y 7,2. El pH del
cultivo se puede ajustar con amoníaco, carbonato de calcio,
diversos ácidos, diversas bases y tampones. Habitualmente, un
cultivo de 1 a 5 días conduce a la acumulación del
L-aminoácido objetivo en el medio líquido.
Tras el cultivo, los sólidos, tales como
células, se pueden eliminar del medio líquido por centrifugación o
filtración de membrana, y a continuación el
L-aminoácido objetivo se puede recolectar y
purificar por intercambio iónico, concentración y métodos de
cristalización.
A continuación se describe la presente invención
con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos no limitativos
siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se clonó el operón ilvBN en el vector
pMIV5JS como parte de un producto PCR de 2439 bp. La construcción
del vector pMIV5JS se describe a continuación, en el ejemplo de
referencia 1. El cromosoma MG1655 se utilizó como plantilla en la
reacción PCR. Los oligonucleótidos sintéticos ilvBX60 (SEC ID
nº 3) e ilvBR64 (SEC ID nº 4) se utilizaron como cebadores.
El cebador ilvBX60 contiene el lugar de restricción XbaI en
el extremo 5', y el cebador ilvBR64 contiene el lugar de
restricción SalI en el extremo 5'. Las condiciones para la PCR
fueron las siguientes: desnaturalización durante 5 min a 94ºC;
perfil durante 30 ciclos: 30 s a 94ºC, 30 s a 59ºC, 2 min a 72ºC;
etapa final: 7 min a 72ºC. El producto PCR de 2449 bp se purificó en
un gel de agarosa, se trató con XbaI y SalI, y se clonó en el
vector pMIV5JS, que se había tratado con las mismas restrictasas.
La cepa B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH se utilizó
como receptora para la clonación. La construcción de la cepa
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH se describe a
continuación, en el ejemplo de referencia 2. El plásmido resultante
pMIV-P_{ivbL}-ilvBN (fig. 1) complementaba
el fenotipo AHAS de la cepa
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La cepa
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH/pMW-P_{ivbL}-ilvBN
descrita en el ejemplo 1 contiene únicamente un operón que codifica
AHAS (operón ilvBN). Los mutantes resistentes a valina
espontáneos se seleccionaron en placas con medio mínimo y se
suplementaron con 1 g/l de valina. Se determinaron la actividad de
la acetolactato sintasa y la resistencia de las enzimas a la
inhibición por L-valina en extractos crudos
mediante el método de F.C. Stomer y H.E. Umbarger (Biochem. Biophys.
Res. Commun., 17, 5, 587-592 (1964)). Para los
extractos crudos, se cultivaron células en medio mínimo M9 hasta el
final de la fase logarítmica, se lavaron con tampón
KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 100 mM suplementado con KCl 100
mM, pH 7,0. Se prepararon los extractos celulares crudos por
sonicación de las células en el mismo tampón. Los plásmidos aislados
de los mutantes resistentes a valina seleccionados se utilizaron
para la retransformación de la cepa
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH deficiente en
AHAS. Como resultado, se obtuvo el plásmido
pMIVP_{ivbL}-ilvBN^{ValR33}, que proporcionó el
crecimiento resistente a valina de la cepa receptora deficiente en
AHAS. Dicho plásmido contiene un operón que codifica AHAS I
resistente a la inhibición por valina. Se midió la actividad
residual de AHAS en presencia de L-valina 10 mM. La
actividad residual de AHAS es igual a la actividad en presencia de
L-valina (nmol/min\cdotmg) * 100%/la actividad en
ausencia de L-valina (nmol/min\cdotmg). La
actividad de AHAS se midió mediante el método de F.C. Stormer y
H.E. Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5,
587-592 (1964)). Los resultados de las mediciones
de actividad de AHAS para esta cepa se indican en la tabla
número
1.
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se utilizaron cinco oligonucleótidos para
secuenciar el fragmento de ADN ilvBN clonado en
pMIV-P_{ivbL}-ilvBN33:
ML74 (SEC ID nº 5), LattRS1 (SEC ID nº 6), ilvbS31 (SEC ID nº 7), ilvbS32 (SEC ID nº 8), e ilvbS33 (SEC ID nº 9). La estrategia de secuenciación se muestra en la figura 2.
ML74 (SEC ID nº 5), LattRS1 (SEC ID nº 6), ilvbS31 (SEC ID nº 7), ilvbS32 (SEC ID nº 8), e ilvbS33 (SEC ID nº 9). La estrategia de secuenciación se muestra en la figura 2.
La secuencia resultante se muestra como
ilvBN33 (SEC ID nº 10) en el listado de secuencias. La
comparación de esta secuencia con programas de cálculo puso de
manifiesto una repetición directa de 34 nucleótidos en la región
que codifica la subunidad pequeña. El gen mutante se designó
ilvN33 (fig. 3). Esta reorganización del ADN condujo a una
terminación más temprana de la traducción, lo que provocó la
sustitución de la parte N-terminal corriente abajo
a la isoleucina de la posición 44 con arginina y fenilalanina, que
forma la proteína IlvN33 (SEC ID nº 11) truncada de 45
aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Con el fin de integrar el
mini-Mu::cat-P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33}
en el cromosoma bacteriano, se utilizaron procedimientos
estándares. El
pMIV-P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33} se introdujo
en las células
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH/pMH10. La Mu
transposasa codificada por pMH10 (derivado de pACYC177 que posee el
gen Km^{R}, los genes Mu-fago A y B que codifican
la Mu transposasa, el gen cts62 que codifica el represor de Mu, y el
gen represor de fago lambda cI857) (patente europea EP1149911) se
indujo por incubación durante 20 min a 44ºC inmediatamente después
de la transforma-
ción.
ción.
Se seleccionaron clones resistentes a
cloramfenicol (Cm^{R}) a 30ºC sobre placas de agar LB que
contenían 20 mg/l de cloramfenicol. Tras eliminar los dos plásmidos
por cultivo de estos clones en LB, se obtuvieron clones
Cm^{R}Km^{S}Ap^{S} que fueron capaces de crecer en medio
mínimo sin adiciones.
Como resultado, se obtuvo la cepa
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::cat-P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33}
que contenía el casete integrado
mini-Mu::cat-P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33}
en un sitio cromosómico no identificado.
Para eliminar el marcador de resistencia de
cloramfenicol de B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH,
se transformaron células
mini-Mu::cat-P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33}
con el plásmido pMW118-int-xis
(Ap^{R}) (WO 2005/010175). Los clones Ap^{R} se cultivaron en
placas de agar LB que contenían 150 mg/l de ampicilina a 30ºC. Se
recogieron diversas decenas de clones Ap^{R} y se analizó su
sensibilidad a cloramfenicol. El plásmido
pMW118-int-xis se eliminó de las
células Cm^{S} por incubación en placas de agar LB a 42ºC. Como
resultado, se obtuvo la cepa
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
Mini-Mu::P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33} que
contenía el casete integrado mini-Mu::
P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33} en un sitio cromosómico no
identificado. Se midió la actividad residual de AHAS en presencia
de L-valina 10 mM. Los resultados de las mediciones
de actividad de AHAS para esta cepa se indican en la tabla número
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La modificación de la región reguladora del
operón ilvBN^{ValR33}, concretamente la sustitución de la
región promotora nativa del operón ilvBN con el promotor
P_{L} se llevó a cabo con el método desarrollado primeramente por
Datsenko y Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12),
6640-6645), designado "Red-driven
integration" ("integración conducida por rojo"). Según este
procedimiento, se construyeron los cebadores PCR ilvB-attR1
(SEC ID nº 12) e ilvB-PLSD (SEC ID nº13). El oligonucleótido
ilvB-attRl (SEC ID nº 12) es homólogo a la región corriente
arriba del gen ilvB y a la región adyacente al gen que
confiere resistencia a antibióticos presente en el ADN cromosómico
de BW25113 cat-P_{L}-yddG. El
oligonucleótido ilvB-PLSD (SEC ID nº 13) es homólogo a la
región ilvB y a la región corriente abajo al promotor P_{L}
presente en el cromosoma de BW25113
cat-P_{L}-yddG. La obtención de
BW25113 cat-P_{L}-yddG ha sido
descrita en detalle (EP 1449918 A1, patente rusa RU 2222596). El
ADN cromosómico de la cepa BW25113
cat-P_{L}-yddG se utilizó como
plantilla para la PCR. Las condiciones para la PCR fueron las
siguientes: desnaturalización durante 3 min a 95ºC; perfil durante
dos ciclos: 1 min a 95ºC, 30 s a 34ºC, 40 s a 72ºC; perfil para los
últimos 30 ciclos: 30 s a 95ºC, 30 s a 50ºC, 40 min a 72ºC; etapa
final: 5 min a 72ºC. Como resultado, el producto PCR (SEC ID nº 14)
se obtuvo, se purificó en gel de agarosa y se utilizó para la
electroporación de la cepa de E. coli
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33}, que
contiene el plásmido pKD46 con un origen de replicación sensible a
la temperatura. El plásmido pKD46 (Datsenko y Wanner, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) incluye el
fragmento de ADN de 2,154 nt (31088-33241) de fago
\lambda (número de acceso GenBank J02459), que contiene los genes
del sistema de recombinación homólogo \lambda rojo (genes
\gamma, \beta, exo) bajo el control del promotor P_{araB}
inducible por arabinosa. El plásmido pKD46 es necesario para la
integración del producto PCR en el cromosoma de la cepa
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33}.
Las células electrocompetentes se prepararon del
modo siguiente: la cepa de E. coli
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33} se
cultivó durante una noche a 30ºC en medio LB que contenía ampicilina
(100 mg/l), y el cultivo se diluyó 100 veces con 5 ml de medio SOB
(Sambrook y otros, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second
Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) con
ampicilina y L-arabinosa (1 mM). Las células se
cultivaron con aireación a 30ºC hasta una OD_{600} de \approx
0,6 y a continuación se volvieron electrocompetentes concentrándolas
100 veces y lavándolas tres veces con H_{2}O desionizada gélida.
La electroporación se llevó a cabo utilizando 70 \mul de células y
\approx 100 ng de producto PCR. Tras la electroporación, las
células se incubaron con 1 ml de medio SOC (Sambrook y otros,
"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)) a 37ºC durante 2,5 h, se
colocaron en placas de L-agar, y se cultivaron a
37ºC con el fin de seleccionar recombinantes Cm^{R}. A
continuación, con el fin de eliminar el plásmido pKD46, se llevaron
a cabo 2 pasajes sobre L-agar con Cm a 42ºC y se
analizó la sensibilidad a la ampicilina de las colonias
resultantes.
Se obtuvo el clon
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::cat-P_{L}-ilvBN^{ValR33},
que contiene el casete
mini-Mu::cat-P_{L}-ilvBN^{ValR33}
con el operón mutante ilvBN^{ValR33} que codifica la AHAS
I resistente a retroalimentación bajo el control del promotor de
fago lambda P_{L}, marcado con el gen de resistencia Cm. La
sustitución de la región reguladora nativa ilvBN con el
promotor P_{L}, marcado con el gen de resistencia Cm, se purificó
por PCR. El cebador de fago Mu específico a enlace derecho MR74
(SEC ID nº 15) y el cebador específico al gen de la cloramfenicol
acetiltransferasa Cm-test2 (SEC ID nº 16) se
utilizaron en PCR para la verificación. Las condiciones para la
verificación por PCR fueron las siguientes: desnaturalización
durante 3 min a 94ºC; perfil durante los 30 ciclos: 30 s a 94ºC, 30
s a 55ºC, 1 min a 72ºC; etapa final: 7 min a 72ºC. El producto PCR
obtenido utilizando las células de
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::cat-P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33}
como plantilla tuvo una longitud de 586 nt (SEC ID nº 17). El
producto PCR obtenido utilizando las células de
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::cat-P_{L}-ilvBN^{ValR33}
como plantilla tuvo una longitud de 879 nt (SEC ID nº 18). Se midió
la actividad residual de AHAS en la cepa
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::cat-P_{L}-ilvBN^{ValR33}
en presencia de L-valina 10 mM. Los resultados de
las mediciones de actividad de AHAS para esta cepa se indican en la
tabla número 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Las dos cepas de E. coli
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33} y
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::cat-P_{L}-ilvBN^{ValR33}
se cultivaron durante 18 horas a 37ºC sobre placas de
L-agar. A continuación, se introdujeron células de
aproximadamente 0,5 cm^{2} de la superficie de la placa en
el medio de fermentación (2 ml) y se cultivaron en tubos con
aireación durante 72 horas a 32ºC. Para la cepa deficiente en AHAS
autotrófica B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH, el
medio de fermentación se complementó adicionalmente con 100
\mug/ml en cada caso de isoleucina y valina. La
L-valina acumulada se midió por TLC. Los resultados
se indican en la tabla 2.
Composición del medio de fermentación (g/l):
- Glucosa
- 60,0
- (NH_{4})_{2}SO_{4}
- 18,0
- KH_{2}PO_{4} 3H_{2}O
- 2,0
- MgSO_{4} 7H_{2}O
- 1,0
- CaCO_{3}
- 25,0
- Tiamina
- 0,02
- Mameno
- 4,0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la tabla 2, la expresión
de AHAS I resistente a valina llevó a la producción de valina. El
operón P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33} se controla por atenuación
de transcripción y AMP cíclico. La sustitución de la región
reguladora nativa del operón ilvBN^{ValR33} (incluyendo la
eliminación del gen (ivbL) que codifica el péptido líder) en la
cepa de E. coli
B7\DeltailvBN\DeltailvGM\DeltailvIH
mini-Mu::P_{ivbL}-ilvBN^{ValR33} con el
promotor P_{L} de fago lambda hizo aumentar la producción de
L-valina 1,5 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
la región reguladora nativa del operón
ilvBN se sustituyó con el promotor de fago lambda P_{L}
mediante el mismo método descrito en el ejemplo 5 en la cepa B7
\DeltailvIH \DeltailvGM (véase ejemplo de referencia 2, sección
5). La cepa presenta únicamente AHAS I. La cepa B7 \DeltailvIH
\DeltailvGM cat-P_{L}-ilvBN resultante
era sensible a la valina. A partir de esta cepa se obtuvieron nuevos
mutantes espontáneos de AHAS I resistentes a valina. Se
caracterizaron las cepas que crecían mejor en 1 g/l de valina (tabla
3).
También se obtuvieron mutaciones resistentes a
valina que eran resistentes a isoleucina. Se obtuvieron variantes
con una actividad específica mayor que la del tipo salvaje. Tal como
se muestra en la tabla 4, la expresión de AHAS I resistente a
valina llevó a la producción de valina. El medio de fermentación
contenía 6% de glucosa. Se determinaron las secuencias de
nucleótidos de los operones mutantes para los dos mejores mutantes,
ilvBN ValR1 e ilvBN ValR4. Se puso de manifiesto que
IlvBN ValR1 contenía una mutación puntual en IlvN: A30P
Ala-Pro (Ala de la posición 30 se sustituye por Pro;
el correspondiente codón gcc se sustituyó con ccc), e IlvBN ValR4
también contenía una mutación puntual en IlvN: N17K
Asn-Lys (Asn de la posición 17 se sustituye por
Lys; el correspondiente codón aac se sustituyó con aag). En ambos
casos, dichas sustituciones fueron raras.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se introdujo el casete
cat-P_{L}-ilvBN ValR4 en la cepa productora
de L-leucina de E. coli 57 (patente rusa RU
2140450, VKPM B-7386). Con este propósito, se
infectó la cepa de E. coli 57 con fago P1_{vir} cultivado
sobre la cepa dadora B7 \DeltailvIH \DeltailvGM
cat-P_{L}-ilvBNValR4. Los transductores se
seleccionaron sobre placas de L-agar complementadas
con cloramfenicol (20 \mug/ml). La cepa 57 se depositó en la
Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM)
(Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny proezd, 1) el 19 de mayo de 1997
con el número de acceso VKPM B-7386.
Las dos cepas de E. coli 57 y 57
cat-P_{L}-ilvBNValR4 se cultivaron tal como
se muestra en el ejemplo 6. La L-leucina acumulada
se midió por TLC. Los resultados se indican en la tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la tabla 5, la cepa 57
cat-P_{L}-ilvBNValR4 produjo una mayor
cantidad de L-leucina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
1
El PMIV-5JS se construyó según
el esquema siguiente. En primer lugar, se construyó el plásmido pM12
integrando in vivo un casete de integración derivado de Mu
en el plásmido pMW1, que es un derivado de pMW 119 (figura 4). Se
sintetizaron dos secuencias de oligonucleótidos de terminación
complementarias entre sí (SEC ID nº: 19 y SEC ID nº 20). El
terminador thrL se obtuvo por hibridación de dichos oligonucleótidos
sintéticos en las direcciones de avance (SEC ID nº 19) y retroceso
(SEC ID nº 20). El terminador thrL estaba flanqueado por los sitios
HindIII y PstI. A continuación, el plásmido
pM12-ter(thr) se construyó insertando la
secuencia de terminador sintético Ter(thr) en pM12 digerido
con HindIII y Mph1103I (figura 5).
El casete integrador intJS se construyó del modo
siguiente (figura 6):
- a)
- se obtuvo un fragmento LattL de 0,12 kbp por amplificación por PCR utilizando un cebador corriente arriba (SEC ID nº 21) (se subraya el sitio para BglII), y un cebador corriente abajo fosforilado (SEC ID nº 22). El plásmido pMW118-attL-tetattR- ter_rrnB se utilizó como plantilla (WO2005/010175);
- b)
- se obtuvo un fragmento Cm^{R} de 1,03 kbp por amplificación por PCR utilizando un cebador corriente arriba fosforilado (SEC ID nº 23), y un cebador corriente abajo (SEC ID nº 24) (se subraya el sitio para PstI). El plásmido pACIC184 se utilizó como plantilla;
- c)
- se obtuvo un fragmento LattL de 0,16 kbp por amplificación por PCR utilizando un cebador corriente arriba (SEC ID nº 25) (se subraya el sitio para PstI), y un cebador corriente abajo (SEC ID nº 26) (se subraya el sitio para SacI). El plásmido pMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB se utilizó como plantilla;
- d)
- se ligaron los fragmentos LattL y Cm^{R} y el fragmento LattL-Cm^{R} resultante de 1,15 kbp se purificó;
- e)
- se digirieron los fragmentos LattL-Cm^{R} y LattR mediante PstI, se ligaron y el fragmento resultante LattL-Cm^{R}-LattR de 1,31 kbp se purificó;
- f)
- un fragmento de ADN de doble hebra de 70 bp que contenía sitios de clonación múltiple (MCS) se obtuvo por hibridación de dos oligonucleótidos sintetizados: el oligonucleótido con la secuencia representada en SEC ID nº 27 y otro oligonucleótido con una secuencia complementaria a SEC ID nº 27;
- g)
- los fragmentos LattL-Cm^{R}-LattR y MCS se digirieron mediante SacI, se ligaron, y el casete resultante LattL-Cm^{R}-LattR-MCS de 1,38 kbp se purificó;
\vskip1.000000\baselineskip
Para la última etapa, el fragmento
LattL-Cm^{R}-LattR-MCS
se digirió mediante BglII y HindIII y se clonó en
pM12-ter(thr) que había sido digerido con
BamHI y HindIII con el fin de obtener el plásmido
pMIV-5JS (figura 7).
\newpage
Ejemplo de referencia
2
El operón ilvBN se eliminó mediante el
método desarrollado primeramente por Datsenko y Wanner (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645),
designado "Red-driven integration". Según este
procedimiento, se construyeron los cebadores PCR ilvBN1 (SEC
ID nº 28) e ilvBN2 (SEC ID nº 29) homólogos a la región
adyacente al operón ilvBN y al gen que proporciona
resistencia al cloramfenicol en el plásmido de plantilla. El
plásmido
pMW-attL-Cm-attR
(solicitud PCT WO 05/010175) se utilizó como plantilla en la
reacción PCR. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes:
desnaturalización durante 3 min a 95ºC; perfil para los dos
primeros ciclos: 1 min a 95ºC, 30 s a 34ºC, 40 s a 72ºC; perfil para
los últimos 30 ciclos: 30 s a 95ºC, 30 s a 50ºC, 40 sec a 72ºC;
etapa final: 5 min a 72ºC.
El producto PCR de 1713 bp resultante se
purificó en gel de agarosa y se utilizó para la electroporación de
la cepa de E. coli MG1655, que contiene el plásmido pKD46 con
un origen de replicación sensible a la temperatura. El plásmido
pKD46 (Datsenko y Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,
97:12:6640-45) incluye un fragmento de ADN de 2,154
nt (31088-33241) de fago \lambda (número de acceso
GenBank J02459), que contiene los genes del sistema de
recombinación homólogo \lambda rojo (genes \gamma, \beta, exo)
bajo el control del promotor P_{araB} inducible por arabinosa. El
plásmido pKD46 es necesario para la integración del producto PCR en
el cromosoma de la cepa de E. coli
MG1655.
MG1655.
Las células electrocompetentes se prepararon del
modo siguiente: la cepa de E. coli MG1655/pKD46 se cultivó
durante una noche a 30ºC en medio LB complementado con ampicilina
(100 mg/l), se diluyó 100 veces con 5 ml de medio SOB (Sambrook y
otros, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition",
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) con ampicilina y
L-arabinosa (1 mM). El cultivo se cultivó con
aireación a 30ºC hasta una OD_{600} de \approx 0,6 y a
continuación se volvió electrocompetente concentrándolo 100 veces y
lavándolo tres veces con H_{2}O desionizada gélida. La
electroporación se llevó a cabo utilizando 70 \mul de células y
\approx 100 ng de producto PCR. Tras la electroporación, las
células se incubaron con 1 ml de medio SOC (Sambrook y otros,
"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)) a 37ºC durante 2,5 h, se
colocaron en placas de L-agar, y se cultivaron a
37ºC con el fin de seleccionar recombinantes Cm^{R}. A
continuación, con el fin de eliminar el plásmido pKD46, se llevaron
a cabo 2 pasajes sobre L-agar con Cm a 42ºC y se
analizó la sensibilidad a la ampicilina de las colonias
resultantes. De este modo, se construyó la cepa mutante MG1655
\DeltailvBN::cat con un operón ilvBN
inactivado.
Se verificaron por PCR los mutantes con el
operón ilvBN eliminado y marcados con el gen de resistencia
Cm. Se utilizaron los cebadores específicos de sitio ilvBNC5
(SEC ID nº 30) e ilvBNC6 (SEC ID nº 31) en PCR para la
verificación. Las condiciones para la verificación por PCR fueron
las siguientes: desnaturalización durante 3 min a 94ºC; perfil
durante los 30 ciclos: 30 s a 94ºC, 30 s a 53ºC, 1 min a 72ºC; etapa
final: 7 min a 72ºC. El producto PCR obtenido en la reacción
utilizando el ADN cromosómico de la cepa madre ilvBN^{+}
MG1655 como plantilla tenía una longitud de 2275 nt. El producto PCR
obtenido en la reacción utilizando el ADN cromosómico de la cepa
mutante MG1655 \DeltailvBN::cat como plantilla tenía una
longitud de 1995 nt (figura 8).
El operón ilvIH se eliminó mediante los
mismos métodos en la eliminación del operón ilvBN descrita
en la sección 1. Según este procedimiento, se construyeron los
cebadores PCR ilvIH1 (SEC ID nº 32) e ilvIH2 (SEC ID nº 33)
homólogos a la región adyacente al operón ilvIH y al gen que
proporciona resistencia al cloramfenicol en el plásmido de
plantilla. El plásmido
pMW-attL-Cm-attR
(solicitud PCT WO 05/010175) se utilizó como plantilla en la
reacción PCR. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes:
desnaturalización durante 3 min a 95ºC; perfil para los dos primeros
ciclos: 1 min a 95ºC, 30 s a 34ºC, 40 s a 72ºC; perfil para los
últimos 30 ciclos: 30 s a 95ºC, 30 s a 50ºC, 40 min a 72ºC; etapa
final: 5 min a 72ºC.
El producto PCR de 1713 bp se purificó en un gel
de agarosa y se utilizó para la electroporación de la cepa de E.
coli MG1655/pKD46. Tras la electroporación se seleccionaron
recombinantes resistentes a cloramfenicol y se verificaron por
medio de PCR con los cebadores específicos de sitio ilvIHC3 (SEC ID
nº 34) e ilvIHC4 (SEC ID nº 35). Las condiciones para la
verificación por PCR fueron las siguientes: desnaturalización
durante 3 min a 94ºC; perfil durante los 30 ciclos: 30 s a 94ºC, 30
s a 53ºC, 1 min 20 s a 72ºC; etapa final: 7 min a 72ºC. El producto
PCR obtenido en la reacción utilizando el ADN cromosómico de la cepa
madre IIvIH^{+} MG1655B7 \DeltailvBN::cat como plantilla
tenía una longitud de 2491 nt. El producto PCR obtenido en la
reacción utilizando el ADN cromosómico de la cepa mutante MG1655B7
\DeltailvBN::cat como plantilla tenía una longitud de 1823
nt. Como resultado, se obtuvo la cepa MG1655 \DeltailvIH::cat.
El operón ilvGM se eliminó mediante los mismos
métodos en la eliminación del operón ilvBN descrita en la
sección 1. Según este procedimiento, se construyeron los cebadores
PCR ilvGM1 (SEC ID nº 36) e ilvGM2 (SEC ID nº 37) homólogos a la
región adyacente al operón ilvGM y al gen que proporciona
resistencia al cloramfenicol en el plásmido de plantilla. El
plásmido
pMW-attL-Cm-attR
(solicitud PCT WO 05/010175) se utilizó como plantilla en la
reacción PCR. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes:
desnaturalización durante 3 min a 95ºC; perfil para los dos primeros
ciclos: 1 min a 95ºC, 30 s a 34ºC, 40 s a 72ºC; perfil para los
últimos 30 ciclos: 30 s a 95ºC, 30 s a 50ºC, 40 min a 72ºC; etapa
final: 5 min a 72ºC.
El producto PCR de 1713 bp se purificó en un gel
de agarosa y se utilizó para la electroporación de la cepa de E.
coli MG1655/pKD46. Tras la electroporación se seleccionaron
recombinantes resistentes a cloramfenicol y se verificaron por
medio de PCR con los cebadores específicos de sitio ilvGMC3 (SEC ID
nº 38) e ilvGMC4 (SEC ID nº 39). Las condiciones para la
verificación por PCR fueron las siguientes: desnaturalización
durante 3 min a 94ºC; perfil durante los 30 ciclos: 30 s a 94ºC, 30
s a 54ºC, 1 min 30 s a 72ºC; etapa final: 7 min a 72ºC. El producto
PCR obtenido en la reacción utilizando el ADN cromosómico de la cepa
madre MG1655 como plantilla tenía una longitud de 2209 nt. El
producto PCR obtenido en la reacción utilizando el ADN cromosómico
de la cepa mutante MG1655 \DeltailvGM::cat como plantilla tenía
una longitud de 1941 nt. Como resultado, se obtuvo la cepa MG1655
\DeltailvGM::cat.
Se eliminaron los genes ilvIH
(\DeltailvIH::cat) en la cepa de tipo salvaje de E.
coli K12 (VKPM B-7) por transducción en P1
(Sambrook y otros, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second
Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). La cepa de
E. coli MG1655 \DeltailvIH::cat descrita en la sección 3
se utilizó como cepa donante, y se seleccionaron transductores CmR.
Como resultado, se obtuvo la cepa B7 \DeltailvIH::cat. Para
eliminar el marcador de resistencia de cloramfenicol de B7
\DeltailvIH::cat, se transformaron células con el plásmido
pMW118-int-xis (ApR)
(WO2005/010175). Los clones Ap^{R} se cultivaron en placas de
agar LB que contenían 150 mg/l de ampicilina a 30ºC. Se recogieron
diversas decenas de clones Ap^{R} y se analizó su sensibilidad a
cloramfenicol. Se eliminó el plásmido
pMW118-int-xis de las células
Cm^{S} por incubación en placas de agar LB a 42ºC. Como resultado,
se obtuvo la cepa B7 \DeltailvIH.
Los genes ilvBN
(\DeltailvBN::cat) se eliminaron en la cepa de E.
coli B7 \DeltailvIH por transducción en P1. La cepa de E.
coli MG1655 \DeltailvBN::cat descrita en la sección 1
se utilizó como cepa donante, y se seleccionaron transductores
Cm_{R}. Como resultado, se obtuvo la cepa B7 \DeltailvIH
\DeltailvBN::cat. El marcador de resistencia a
cloramfenicol se eliminó de B7 \DeltailvIH
\DeltailvBN::cat tal como se ha descrito anteriormente.
Como resultado, se obtuvo la cepa B7 \DeltailvIH
\DeltailvBN.
Los genes ilvGM (\DeltailvGM::cat) se
eliminaron en las cepas de E. coli B7 \DeltailvIH por
transducción en P1. La cepa de E. coli MG1655
\DeltailvBN::cat descrita en la sección 4 se utilizó como
cepa donante, y se seleccionaron transductores Cm_{R}. Como
resultado, se obtuvo la cepa B7 \DeltailvIH \DeltailvGM::cat.
El marcador de resistencia a cloramfenicol se eliminó de B7
\DeltailvIH \DeltailvGM::cat tal como se ha descrito
anteriormente. Como resultado, se obtuvo la cepa B7 \DeltailvIH
\DeltailvGM. La cepa B7 \DeltailvIH \DeltailvGM era
prototrófica, y en consecuencia la eliminación de los genes ilvGM no
impidió la expresión de los genes distales del operón
isoleucina-valina.
Los genes ilvGM (\DeltailvGM::cat) se
eliminaron en las cepas de E. coli B7 \DeltailvIH
\DeltailvBN por transducción en P1. La cepa de E.
coli MG1655 \DeltailvGM::cat descrita en la sección 4 se
utilizó como cepa donante; se seleccionaron transductores Cm_{R}.
Como resultado, se obtuvo la cepa B7 \DeltailvIH
\DeltailvBN \DeltailvGM::cat. El marcador de resistencia
a cloramfenicol se eliminó de B7 \DeltailvIH \DeltailvBN
\DeltailvGM::cat tal como se ha descrito anteriormente. Como
resultado, se obtuvo la cepa B7 \DeltailvIH \DeltailvBN
\DeltailvGM.
Aunque la presente invención ha sido descrita
con detalle haciendo referencia a las formas de realización
preferidas de la misma, resultará evidente para el experto en la
materia que se pueden introducir diversas modificaciones y se
pueden utilizar equivalentes sin apartarse del alcance de la
invención.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ACETOLACTATO SINTASA MUTANTE Y
PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR L-AMINOÁCIDOS DE CADENA
RAMIFICADA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EPA-64335
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> RU2006132818
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2006-09-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli K12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(291)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli K12
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
ilvBX60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
ilvBR64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador ML74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador LattRS1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador ilvbS31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador ilvbS32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador ilvbS33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1830
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: gen mutante
ilvBN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteínas truncadas IlvN33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
ilvB-attR1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
ilvB-^{L}PLSD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1968
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: fragmento de ADN que
contiene el gen cat y el promotor PL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador MR74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
Cm-test2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 586
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: región reguladora nativa
ilvBN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 879
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: región reguladora después
de la modificación ilvBN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético terminador
directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético terminador
inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvBN1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvBN2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvBNC5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvBNC6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvIH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvIH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvIHC3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvIHC4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvGM1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvGM2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvGMC3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador ilvGMC4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (21)
1. Subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana (AHAS I) que comprende la subunidad pequeña de
acetolactato sintasa de tipo salvaje de Escherichia coli que
comprende una mutación seleccionada de entre el grupo que consiste
en:
- A)
- sustituir el L-aminoácido en la posición 17 y/o 30 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con otro L-aminoácido,
- B)
- sustituir la parte N-terminal corriente abajo desde el L-aminoácido en la posición 44 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con diversos L-aminoácidos, y
- C)
- sus combinaciones,
y en la que dicha subunidad pequeña
mutante de acetolactato sintasa se desensibiliza a la inhibición por
retroalimentación por
valina.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana según la reivindicación 1, en la que dicho
L-aminoácido en la posición 17 se sustituye por un
residuo de lisina.
3. Subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana según la reivindicación 1, en la que dicho
L-aminoácido en la posición 30 se sustituye por un
residuo de prolina.
4. Subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana según la reivindicación 1, en la que dicha parte
N-terminal corriente abajo desde el
L-aminoácido en la posición 44 se sustituye con
arginina y fenilalanina.
5. Subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana según la reivindicación 2, en la que dicho
L-aminoácido en la posición 17 que se sustituye por
un residuo de lisina es la asparagina.
6. Subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana según la reivindicación 3, en la que dicho
L-aminoácido en la posición 30 que se sustituye por
un residuo de prolina es la alanina.
7. Subunidad pequeña mutante de acetolactato
sintasa bacteriana según la reivindicación 4, en la que dicho
L-aminoácido en la posición 44 es la isoleucina.
8. Acetolactato sintasa mutante que comprende la
subunidad pequeña según la reivindicación 1.
9. Acetolactato sintasa mutante según la
reivindicación 8, en la que dicha acetolactato sintasa mutante
comprende la subunidad grande de Escherichia coli.
10. acetolactato sintasa mutante según la
reivindicación 8, en la que la subunidad pequeña incluye
eliminaciones, sustituciones, inserciones, o adiciones de uno a 15
aminoácidos en una o más posiciones distintas de la posición 17, 30
y/o 44, y en la que dicha acetolactato sintasa mutante mantiene la
actividad de acetolactato sintasa y está desensibilizada a la
inhibición por retroalimentación por valina.
11. ADN que codifica la subunidad pequeña
mutante de la acetolactato sintasa según la reivindicación 1.
12. Bacteria de la familia
Enterobacteriaceae, que contiene el ADN según la
reivindicación 11 y presenta la capacidad de producir
L-aminoácidos de cadena ramificada.
13. Bacteria según la reivindicación 12, en la
que dichos L-aminoácidos de cadena ramificada se
seleccionan de entre el grupo que consiste en
L-leucina, L-isoleucina y
L-valina.
14. Bacteria según la reivindicación 13, en la
que se aumenta la actividad de la acetolactato sintasa mutante.
15. Bacteria según la reivindicación 14, en la
que la bacteria pertenece al género Escherichia.
16. Bacteria según la reivindicación 15, en la
que se aumenta la actividad de la acetolactato sintasa mutante
incrementando la expresión del gen de la acetolactato sintasa
mutante.
17. Bacteria según la reivindicación 16, en la
que se incrementa la actividad de la acetolactato sintasa mutante
mediante un procedimiento seleccionado de entre el grupo que
consiste en:
- a)
- incrementar el número de copias del gen de la acetolactato sintasa mutante,
- b)
- modificar una secuencia de control de expresión del gen de manera que la expresión del gen aumenta, y
- c)
- sus combinaciones.
18. Bacteria según la reivindicación 17, en la
que el número de copias se incrementa mediante la integración de
múltiples copias del gen de la acetolactato sintasa mutante en el
cromosoma de la bacteria.
19. procedimiento para preparar un
L-aminoácido de cadena ramificada que comprende
cultivar la bacteria según la reivindicación 12 en un medio de
cultivo y recoger los L-aminoácidos de cadena
ramificada del medio de cultivo.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que la bacteria presenta una expresión aumentada de genes
implicados en la biosíntesis de L-aminoácido de
cadena ramificada.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicho L-aminoácido de cadena ramificada se
selecciona de entre el grupo que consiste en
L-leucina, L-isoleucina y
L-valina.
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