ES2291797T3 - Procedimiento para producir l-cisteina utilizando bacterias que pertenecen al genero escherichia. - Google Patents
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Abstract
Bacteria productora de L-cisteína que pertenece al género Escherichia, en el que la bacteria se ha modificado de forma que la cantidad de la expresión de los genes del grupo cysPTWAM es superior que la de una cepa antes de la modificación, aumentando el número de copias de los genes del grupo cysPTWAM o modificando una secuencia de control de la expresión de dichos genes.
Description
Procedimiento para producir
L-cisteína utilizando bacterias que pertenecen al
género Escherichia.
La presente invención se refiere a la
biotecnología, y particularmente a un procedimiento para producir
L-cisteína mediante fermentación. La presente
invención se refiere particularmente a genes derivados de
Escherichia coli. Se ha descubierto que estos genes resultan
útiles para mejorar la producción de L-cisteína de
E. coli.
Convencionalmente, se han producido
industrialmente L-aminoácidos utilizando cepas de
microorganismos obtenidos a partir de fuentes naturales o de sus
mutantes que se han modificado específicamente para potenciar la
producción de L-aminoácidos.
Se ha informado de muchas técnicas con respecto
a la potenciación de la producción de L-aminoácidos,
por ejemplo por transformación de un microorganismo mediante ADN
recombinante (véase, por ejemplo, la patente US nº 4.278.765).
Estas técnicas se basan en el aumento de las actividades de las
enzimas implicadas en la biosíntesis de los aminoácidos y/o en la
desensibilización de las enzimas diana a partir de la
retroinhibición por los L-aminoácidos producidos
(véase, por ejemplo, las patentes US nº 5.661.012 y nº
6.040.160).
La síntesis de la L-cisteína a
partir del azufre inorgánico es el mecanismo predominante por el que
azufre reducido se incorpora a los compuestos orgánicos en los
microorganismos, incluyendo Salmonella y Escherichia
coli. En este procedimiento, el sulfato inorgánico, la fuente
más abundante de azufre utilizable en la biosfera aeróbica, es
absorbido y reducido a sulfuro, que se incorpora entonces a La
L-cisteína en una etapa que es equivalente a la
fijación del amoníaco en la glutamina o el glutamato. La absorción
del sulfato se lleva a cabo mediante la sulfato permeasa, que está
codificada por los genes cysTWA y sbp (proteínas de
unión a sulfato). Para S. typhimurium y E. coli se
han descrito otros dos mecanismos para la fijación del azufre. El
primer mecanismo tiene lugar a través de la reacción del tiosulfato
con la
O-acetil-L-serina,
catalizada por el
O-acetilserin(tiol)-liasa-B
codificada por el gen Cysm, para formar el tiosulfonato
S-sulfocisteína, que es entonces reducido a
L-cisteína. En este mecanismo el tiosulfato es
transportado a la célula por la tiosulfato permeasa, que está
codificada por los genes cysPTWA. Como alternativa, el
sulfuro podría incorporarse a la
O-acetil-L-serina a
través de una reacción catalizada por la
O-acetilserina(tiol)-liasa-A
o B, que están codificadas por los genes CysK y cysM,
respectivamente, dando lugar a L-cisteína. El
segundo mecanismo implica la reacción de la
O-succinil-L-homoserina
con el sulfuro para formar la homocisteína en una reacción
catalizada por la cistationina \gamma-sintasa.
(Escherichia coli y Salmonella, 2ª Edición, Editor
\hbox{Jefe: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C.
1996).}
En (WO03006666A2) se ha dado a conocer un
procedimiento para la preparación de la L-treonina
mediante fermentación de los microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae en la que por lo menos uno o más de los
genes de la biosíntesis de la cisteína seleccionados de entre
cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD,
cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE y sbp están
potenciados, particularmente, sobreexpresados.
Hasta la fecha, no han habido informes, sin
embargo, que describan una mejoría en el rendimiento de la
L-cisteína por una bacteria que se haya
desarrollado en un medio que contenga tiosulfato, y en el que la
bacteria se haya modificado para haber potenciado la expresión del
grupo cysPTWAM.
Un objetivo de la presente invención consiste en
potenciar la productividad de cepas bacterianas productoras de
L-cisteína. Constituye otro objetivo de la presente
invención proporcionar un procedimiento para producir
L-cisteína utilizando dichas cepas.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar una bacteria productora de
L-cisteína que pertenezca al género
Escherichia, en el que la bacteria se ha modificado de forma
que la cantidad de la expresión de los genes del grupo PTWAM
es superior a la de una bacteria antes de la modificación aumentando
el número de copias de los grupos de genes cysPTWAM o
modificando una secuencia del control de la expresión de dichos
genes.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria anteriormente descrita, en el que el
número de copias aumenta transformándola con un vector multicopia
que alberga al conjunto de genes cysPTWAM.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria tal como se ha descrito anteriormente,
en el que el promotor nativo de dicho grupo es reemplazado con un
promotor, que es más potente que el original.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria tal como se ha descrito anteriormente,
en la que aumenta el número de copias integrando copias adicionales
del grupo de genes cysPTWAM en el cromosoma bacteriano.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria tal como se ha descrito anteriormente,
en el que el grupo de genes cysPTWAM se deriva de una
bacteria que pertenece al género Escherichia.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar la bacteria tal como se ha descrito anteriormente,
en el que la bacteria se ha modificado de forma que la cantidad de
la expresión del marco abierto de lectura de ydeD es
superior al del de una cepa antes de la modificación.
Todavía otro objetivo de la presente invención
consiste en proporcionar un procedimiento para producir
L-cisteína, que comprende el cultivo de la bacteria
tal como se ha descrito anteriormente en un medio de cultivo que
contiene tiosulfato y la recuperación de la
L-cisteína a partir de este medio de cultivo.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar el procedimiento tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la cantidad de la expresión de los genes
de la biosíntesis de la L-cisteína, en la bacteria,
es superior al del de una cepa antes de la modificación.
La Figura 1 muestra la posición relativa de los
cebadores cysEF, cysEX-1, cysEX-2 y
cysER.
La Figura 2 muestra la estructura del plásmido
pACYC-DES.
La Figura 3 muestra la estructura del plásmido
pMW119int.
Los objetivos mencionados anteriormente se han
alcanzado mediante el descubrimiento de que la potenciación de la
expresión de los grupos de genes cysPTWA, así como de la del
gen cysM, que codifica una sistema para el transporte del
sulfato/tiosulfato y de la
O-acetilserina(tiol)-liasa-B,
respectivamente, puede potenciar la producción de
L-cisteína cuando la nueva cepa modificada en la
presente memoria se cultiva en un medio que contiene
tiosulfato.
La bacteria de la presente invención es una
bacteria que produce L-cisteína que pertenece al
género Escherichia, que potencia la expresión de los genes
del grupo cysPTWAM, que potencia o aumenta el rendimiento de
la producción de L-cisteína. Más específicamente,
la bacteria de la presente invención es una bacteria productora de
L-cisteína, que pertenece al género
Escherichia, en el que la bacteria se ha modificado para
potenciar la expresión del grupo de genes cysPTWAM,
El término "bacteria productora de
L-cisteína" hace referencia una bacteria, que
posee capacidad para producir y secretar L-cisteína
en un medio, cuando la bacteria se cultiva en el medio. El término
"bacteria productora de L-cisteína" tal como
se utiliza en la presente memoria, puede asimismo hacer referencia a
una bacteria, que puede producir y secretar
L-cisteína en un medio de cultivo en una cantidad
superior a la de una cepa parental o de tipo salvaje, y significa
preferentemente que el microorganismo puede producir y secretar
L-cisteína en un medio en una cantidad de por lo
menos 0,5 g/l, más preferentemente en por lo menos 1,0 g/l.
La expresión "una bacteria que pertenece al
género Escherichia" significa que la bacteria se clasifica como
género Escherichia según la clasificación conocida por un
experto en la técnica microbiológica. Un microorganismo que
pertenece al género Escherichia tal como se utiliza en la
presente invención incluye, pero no se limita a Escherichia coli
(E. coli). E. coli es una de las bacterias más preferidas
de la presente invención.
La expresión "modificada para potenciar la
expresión del gen o genes" significa que la cantidad de la
expresión del gen o de los genes es superior que la de una cepa no
modificada, por ejemplo, una cepa de tipo salvaje. Por ejemplo,
aumentar el número de genes por célula, aumentar el número de
moléculas codificadas por los genes por célula, o aumentar el nivel
de expresión génica, y así sucesivamente, están englobados. El
número de copias del gen que se expresa, se mide, por ejemplo,
mediante la restricción del ADN cromosómico, seguido por
transferencia Southern, utilizando una sonda construida basándose
en la secuencia génica, hibridización in situ por
fluorescencia (FISH) y similares. El nivel de expresión génica puede
medirse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica,
que incluyen la transferencia Northern, la RT-PCR
cuantitativa, y similares. Además, una cepa de tipo salvaje, tal
como Escherichia coli K-12, puede servir como
control. Como resultado de la potenciación de la expresión del gen
o genes, aumenta en el medio la secreción y acumulación de la
L-cisteína.
La potenciación de la expresión del grupo de
genes cysPTWAM en una célula bacteriana se obtiene aumentando
el número de copias del grupo de genes cysPTWAM o
modificando la secuencia de control de la expresión del grupo de
genes, de forma que se potencie la expresión de éstos.
El grupo de genes cysPTWAM que se
utilizan en la presente invención incluye los derivados de bacterias
que pertenecen al género Escherichia, así como los derivados
de otras bacterias, tales como Salmonella. Se prefieren los
genes derivados de las bacterias que pertenecen al género
Escherichia.
\newpage
Se ha informado de las secuencias del grupo de
genes cysPTWAM de Escherichia coli, de la siguiente
forma (Blattner, F.R. et al, Science, 277 (5331),
1453-1474 (1997)):
gen cysP (SEC ID nº: 1)- nucleótidos
números 2540532 a 2541548 en la secuencia de GenBank,
registro
NC_000913.1 (gi:16130350)
NC_000913.1 (gi:16130350)
gen cysT (cysU) (SEC ID nº: 3)-
nucleótidos números 2539699 a 2540532 en la secuencia de GenBank,
registro NC_000913.1 (gi:16130349)
gen cysW (SEC ID nº: 5)- nucleótidos
números 2538824 a 2539699 en la secuencia de GenBank,
registro
NC_000913.1 (gi:16132224),
NC_000913.1 (gi:16132224),
gen cysA (SEC ID nº: 7)- nucleótidos
números 2537737 a 2538834 en la secuencia de GenBank,
registro
NC_000913.1 (gi:16130348)
NC_000913.1 (gi:16130348)
gen cysM (SEC ID nº: 9)- nucleótidos
números 2536692 a 2537603 en la secuencia de GenBank,
registro
NC_000913.1 (gi:16130347)
NC_000913.1 (gi:16130347)
El grupo cysPTWAM está localizado entre
el locus ychM ORF b2420 y el locus b2426 en el cromosoma de la cepa
K-12 de E. coli. Por tanto, estos genes
pueden obtenerse mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa;
referencia a White, T.J. et al., Trends Genet, 5,185 (1989))
utilizando cebadores basados en las secuencias nucleótidas que se
han informado de los genes. Los genes que codifican las proteínas
del sistema de transporte sulfato/tiosulfato que se derivan de
otros microorganismos, pueden obtenerse de forma similar.
Ejemplos de los genes del grupo cysPTWAM
que se derivan de Escherichia coli incluyen los ADN
siguientes:
- el gen cysP que codifica la proteína
(A) o (B):
- (A)
- una proteína que posee la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID n: 2; o
- (B)
- una variante proteica de la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 2, que muestra una actividad de la proteína que se une al tiosulfato periplásmico;
- gen cysT que codifica la proteína (C) o
(D);
- (C)
- una proteína que posee la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID n:4; o
- (D)
- una variante proteica de la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 4, que muestra una actividad de la permeasa del sistema de transporte sulfato/tiosulfato cuando se combina con las proteínas (E) o (F) y (G) o (H);
- gen cysW que codifica la proteína (E) o
(F);
- (E)
- una proteína que posee la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID n:6; o
- (F)
- una variante de proteína de la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 6, que muestra una actividad de la permeasa del sistema de transporte sulfato/tiosulfato cuando se combina con las proteínas (C) o (D) y (G) o (H);
- gen cysA que codifica la proteína (G) o
(H);
- (G)
- una proteína que posee la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID n:8; o
- (H)
- una variante proteica de la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 8, que es un componente de la unión a ATP de la permeasa sulfato/tiosulfato y muestra una actividad de la permeasa del sistema de transporte sulfato/tiosulfato cuando se combina con las proteínas (C) o (D), y (E) o (F);
- gen cysM que codifica la proteína (I) o
(J);
- (I)
- una proteína que posee la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID n:10; o
- (J)
- una variante proteica de la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 10, que muestra una actividad de la O-acetilserin(tiol)-liasa-B.
La frase "una actividad de la permeasa del
sistema de transporte sulfato/tiosulfato" significa la actividad
de una proteína que transporta al tiosulfato al interior celular a
partir del medio externo. La frase "una actividad de
O-acetilserin(tiol)-liasa-B"
significa una actividad que cataliza la reacción entre
O-acetil-L-serina y
tiosulfato, que proporciona S-sulfocisteína. La
presencia de estas actividades puede determinarse, por ejemplo,
mediante experimentos de complementación que utilicen bacterias que
presenten mutaciones en los genes correspondientes.
El ADN que codifica las proteínas de la presente
invención incluye un ADN que codifica variantes proteicas, que
presentan posiblemente deleciones, sustituciones, inserciones o
adiciones de uno o varios aminoácidos en una o más posiciones en
las proteínas (A), (C), (E), (G) o (I), siempre que dichos cambios
no produzcan pérdidas de la actividad de la proteína. El número de
"varios" aminoácidos difiere dependiendo de la posición de los
residuos aminoácidos en la estructura tridimensional de la proteína
y del tipo de aminoácidos. Sin embargo, significa preferentemente
entre 2 y 30, más preferentemente entre 2 y 20, y muy
preferentemente entre 2 y 10 para una proteína que tenga
aproximadamente 300 residuos aminoácidos. Esto es debido a que
algunos aminoácidos presentan una alta homología entre ellos y a
que las diferencias entre las secuencias aminoácidas no afectan de
forma importante a la estructura tridimensional de la proteína y a
su actividad. Por tanto, la proteína (B), (D), (F), (H) o (J),
puede ser una que presente una homología no inferior a entre 30 y 50
%, preferentemente entre el 50 y el 70%, más preferentemente entre
70 y 90%, más preferentemente no inferior al 90%, y muy
preferentemente no inferior al 95%, con respecto a la secuencia
aminoácida completa de la proteína (A), (C), (E), (G) o (I),
respectivamente, y que muestre la actividad de la proteína
respectiva.
Para evaluar el grado de homología proteica o
del ADN, pueden utilizarse procedimientos conocidos de cálculo,
tales como las búsquedas BLAST, FASTA y CrustalW.
BLAST (Herramienta de Búsqueda de la Alineación
Local Básica) es el algoritmo heurístico de búsqueda utilizado por
los programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, y tblastx,
estos programas atribuyen significado a sus hallazgos utilizando
los procedimientos estadísticos de Karlin, Samuel y Stephen F.
Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of
molecular sequence features by using general scoring schemes").
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68;
"Applications and statistics for multiple
high-scoring segments in molecular sequences"
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7).
Procedimiento FASTA de búsqueda descrito por W.R. Pearson ("Rapid
and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods
in Enzymology, 1990, 183:63-98). Procedimiento
ClustalW descrito por Thompson J.D., Higgins D.G. y Gibson T.J.
("CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple
sequence alignment through sequence weighting,
position-specific gap penalties and weight matrix
choice" Nucleic Acids Res. 1994,
22:4673-4680).
Los cambios para las proteínas definidas en (A),
(C), (E), (G) o (I), tales como los descritos anteriormente son
cambios típicamente conservadores de forma que mantengan la
actividad de cada proteína. Los cambios de sustitución incluyen
aquéllos en los que por lo menos, se ha sustituido un residuo en la
secuencia aminoácida y se ha insertado otro residuo en su lugar.
Ejemplos de aminoácidos que pueden sustituirse por un aminoácido
original en la proteína anterior y que se consideran como
sustituciones conservadoras incluyen: Ala que se sustituye con ser
o thr; arg que se sustituye con gln, his o lys;asn que se sustituye
con glu, gln, lys, his, asp; asp que se sustituye con asn, glu, o
gln; cys qye se sustituye con ser o ala; gln que se sustituye con
asn, glu, lys, his, asp o arg; glu que se sustituye con asn, gln,
lys, y asp; gly que se sustituye con pro; his que se sustituye con
asn, lys, gin, arg, tyr; ile que se sustituye con leu, met, val,
phe; leu que se sustituye con ile, met, val, phe; lys que se
sustituye con asn, glu, gln, his, arg; met que se sustituye con
ile, leu, val, phe; phe que se sustituye con trp, tyr, met, ile, o
leu; ser que se sustituye con thr, ala; thr que se sustituye con
ser o ala; trp que se sustituye con phe, tyr, tyr que se sustituye
con his, phe, o trp; y val que se sustituye con met, ile, leu.
El ADN que codifica sustancialmente las mismas
proteínas que las definidas en (A), (C), (E), (G) o (I), tales como
variantes de proteínas, pueden obtenerse mediante, por ejemplo,
modificación de la secuencia nucleótida que codifica la proteína
definida en (A), (C), (E), (G) o (I), utilizando mutagénesis
puntual, de forma que uno o varios residuos aminoácidos serán
eliminados, sustituidos, insertados o añadidos. Este ADN modificado
puede obtenerse mediante procedimientos convencionales de
tratamiento con reactivos bajo condiciones que típicamente generan
mutaciones. Estos tratamientos incluyen el tratamiento del ADN que
codifica proteínas de la presente invención, con hidroxilamina, o
tratando la bacteria que alberga el ADN con irradiación UV o un
reactivo tal como la
N-metil-N'-nitro-N-guanidina
o el ácido nitroso.
El ADN del grupo de genes cysPTWA
incluyen variantes derivadas de distintas cepas y variantes de
bacterias que pertenecen al género Escherichia debido a la
diversidad natural.
El ADN que codifica dichas variantes puede
obtenerse aislando el ADN que hibridiza a los genes cysP,
cysT, cysW, cysA o al gen cysM, o a una parte
suya bajo condiciones rigurosas, y que codifica la proteína que
posee una actividad inherente de la proteína codificada por cada uno
de los genes. El término "condiciones rigurosas" puede incluir
condiciones bajo las cuales se forma un denominado híbrido
específico, y no se forma un híbrido no específico. Por ejemplo,
las condiciones rigurosas incluyen condiciones bajo las cuales
pueden hibridizarse los ADN que muestran una alta homología, por
ejemplo, los ADN que muestran entre ellos una homología no inferior
al 70%, no inferior preferentemente al 80%, no inferior, más
preferentemente, al 90%, y no inferior, todavía más
preferentemente, al 95%. Alternativamente, las condiciones rigurosas
pueden incluir condiciones típicas de lavado, para hibridización
Southern, por ejemplo, 60ºC, 1 x SSC, SDS al 0,1%, preferentemente
0,1 x SSC, SDS al 0,1%. La duración del procedimiento de lavado
depende del tipo de membrana que se utilice para la transferencia
y, habitualmente, es recomendada por el fabricante. Por ejemplo, la
duración recomendada de lavado con la membrana de nylon
Hybond^{TM} N+ (Amersham) bajo condiciones rigurosas es de 15
minutos. Como sonda para el ADN que codifica variantes y se
hibridiza con los genes cysP, cysT, cysW, cysA
o al gen cysM, puede utilizarse asimismo una secuencia
parcial de la secuencia nucleótida de SEC ID nº:1, 3, 5, 7 ó 9.
Dicha sonda puede prepararse mediante PCR utilizando
oligonucleótidos basados en la secuencia nucleótida de SEC ID nº:
1, 3, 5, 7 ó 9 como cebadores, y un fragmento de ADN que contiene la
secuencia nucleótida de SEC ID nº: 1, 3, 5, 7 ó 9 como matriz.
Cuando un fragmento de ADN de aproximadamente 300 pares de bases de
longitud se utiliza como sonda, las condiciones de lavado par la
hibridización pueden ser, por ejemplo, 50ºC, 2 x SSC, y SDS al
0,1%.
Los procedimientos para potenciar la expresión
génica incluyen el aumento del número de copias del gen.
Introduciendo un gen en un vector que pueda funcionar en una
bacteria que pertenezca al género Escherichia coli, aumentará
el número de copias del gen. Pueden utilizarse preferentemente los
vectores multicopia, e incluyen pBR322, pUC19, pBluescript
KS^{+}, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b y similares. La
potenciación de la expresión génica puede alcanzarse introduciendo
copias múltiples de un gen en el cromosoma bacteriano mediante, por
ejemplo, procedimientos de recombinación homóloga y similares.
La transformación de una bacteria con un ADN que
alberga un gen que codifica una proteína, significa la introducción
del ADN en la bacteria, por ejemplo, mediante procedimientos
convencionales, para aumentar la expresión del gen en la
bacteria.
Además, la potenciación de la expresión génica
puede alcanzarse situando el ADN de la presente invención bajo el
control de un promotor bastante más potente que el promotor nativo.
El término "promotor nativo" significa una región del ADN que
se encuentra en un organismo de tipo salvaje, que se localiza por
encima del marco abierto de lectura (ORF) del gen, y que promueve
la expresión del gen. El acoplamiento traduccional de genes en el
grupo cysPTWA indica que estos genes se expresan como una
unidad transcripcional única de un promotor (que se encuentra)
justamente por encima del gen cysP (Hryniewicz, M.M.,
Kredich, N.M., J. Bacteriol., 173 (18), 5876-86
(1991)). El gen cysM está separado del gen cysA por sólo
174 pares de bases en el cromosoma de E. coli y puede formar
parte también de este operón, que se transcribe en sentido contrario
a las agujas del reloj en el cromosoma (Escherichia coli y
Salmonella, 2ª edición, Editor Jefe: F.C. Neidhardt, ASM
Press, Washington, D.C., 1996). La potencia del promotor se define
como la frecuencia de actos de iniciación de síntesis del ARN. Los
procedimientos para evaluar la potencia de un promotor se describen
por ejemplo, por Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H
(Promotores en Escherichia coli: una jerarquía de potencia
in vivo indica estructuras alternadas. EMBO J. 1986, 5,
2987-
2994).
2994).
La potenciación de la traducción puede obtenerse
asimismo introduciendo en el ADN de la presente invención una
secuencia Shine-Dalgarno más eficiente (secuencia
SD). La secuencia SD es una región situada por encima del codón de
iniciación del ARNm, que interacciona con el 16S ARN del ribosoma
(Shine J. y Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4,
1342-56). El término "secuencia SD original"
significa la secuencia SD que se encuentra presente en el organismo
de tipo salvaje. Un ejemplo de una secuencia SD eficiente incluye
la secuencia SD del gen \varphi10 del fago T7 (Olins P.O. et
al, Gene, 1988, 73, 227-235).
La utilización de promotores potentes puede
combinarse con la multiplicación de copias génicas. Asimismo, es
posible aumentar el número de copias génicas del grupo
cysPTWAM combinando la integración de uno o varios genes del
grupo con la introducción de uno de varios genes en un vector
multicopia.
Los procedimientos para la preparación del ADN
cromosómico, hibridización, PCR, preparación de ADN plasmídico,
digestión y unión del ADN, transformación, selección de un
oligonucleótido como un cebador y similares, incluyen
procedimientos típicos bien conocidos por el experto en la materia.
Dichos procedimientos se describen en Sambrook, J., y Russell D.,
"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition" Cold
Spring Harbor Laboratory Press (2001) y similares.
La bacteria de la presente invención puede
obtenerse mediante la introducción de los ADN mencionados
anteriormente en una bacteria que posea inherentemente la capacidad
para producir L-cisteína. Alternativamente, la
bacteria de la presente invención puede obtenerse transmitiendo la
capacidad para producir L-cisteína a la bacteria
que ya alberga los ADNS.
La cepa parental que va a modificarse para que
muestre una potenciación de la actividad de la proteína de la
presente invención, puede incluir una bacteria que produzca
L-cisteína que pertenezca al género
Escherichia, tal como la cepa JM15 de E. coli que se
transforma con distintos alelos cysE que codifican serin
acetiltransferasas retrorresistentes (patente US nº 6.218.168,
solicitud Ru 2003121601 de la patente Rusa publicada); teniendo la
cepa W3110 de E. coli genes sobreexpresados que codifican una
proteína capaz de secretar sustancias tóxicas a partir de las
células (patente US nº 5.972.663); cepas de E. coli con
escasa actividad cisteína desulfhidrasa (JP11155571A2); la cepa
W3110 de E. coli con un aumento de la actividad de un
regulador transcripcional positivo para el regulón de la cisteína
codificado por el gen cysB (solicitud PCT WO0127307A1) y
similares.
Se ha informado de que el gen ydeD, que
codifica una proteína membranosa que no está implicada en la vía
biosintética de cualquier L-aminoácido, puede
potenciar la producción de L-cisteína cuando se
introducen copias adicionales del gen en células de la respectiva
cepa productora (patente US nº 5.972.663). Por tanto, una forma de
realización de la presente invención incluye la bacteria productora
de L-cisteína que se modifica además para obtener
un aumento de la expresión del marco abierto de lectura de
ydeD.
La bacteria de la presente invención puede
asimismo poseer un aumento de la expresión de los genes
biosintéticos de la L-cisteína. Dichos genes
incluyen el gen cysE,que codifica la serin acetiltransferasa
retrorresistente (patente US nº 6.218.168), el gen serA, que
codifica la fosfoglicerato deshidrogenasa retrorresistente (patente
US nº 6.180.373), y similares.
Las proteínas codificadas por los genes
ydeD,cysE o serA, pueden ser variantes, de la
misma forma que se describe para los productos génicos de
cysP, cysT, cysW, cysA o cysM. El
procedimiento de la presente invención incluye la producción de
L-cisteína que comprende las etapas de cultivo de la
bacteria de la presente invención en un medio de cultivo,
permitiendo que se produzca la L-cisteína por la
bacteria y que sea secretada, y recuperando la
L-cisteína a partir del medio de cultivo.
En la presente invención, el cultivo,
recuperación y purificación de la L-cisteína a
partir del medio y similares puede llevarse a cabo mediante
procedimientos convencionales de fermentación y purificación que se
utilizan típicamente para la producción y el aislamiento de un
aminoácido utilizando un microorganismo.
El medio que se utiliza para el cultivo puede
ser un medio sintético o uno natural, siempre que incluya una
fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de azufre y
minerales y, si es necesario, cantidades apropiadas de nutrientes
que el microorganismo seleccionado necesita para su desarrollo.
La fuente de carbono puede incluir varios
hidratos de carbono tales como glucosa y sacarosa, y varios ácidos
orgánicos. Dependiendo de la forma de asimilación del microorganismo
seleccionado, pueden utilizarse alcohol, incluyendo etanol y
glicerol.
Como fuente de nitrógeno, pueden utilizarse
varias sales de amonio tales como sales de amoníaco y amónicas,
otros compuestos de nitrógeno tales como aminas, una fuente natural
de nitrógeno tal como peptonas, hidrolizado de soja y un
microorganismo fermentativo digerido.
Los tiosulfatos pueden utilizarse como fuente de
azufre para la presente invención.
El monofosfato potásico, el cloruro sódico, el
cloruro cálcico, las sales de magnesio, las sales ferrosas, las
sales de manganeso y similares pueden utilizarse como minerales.
Pueden añadirse algunos nutrientes adicionales
al medio, si es necesario. Por ejemplo, si el microorganismo
necesita metionina para su desarrollo (auxotrofía de la metionina),
puede añadirse una cantidad suficiente de metionina al medio para
llevar a cabo el cultivo.
Se prefiere que el cultivo se lleve a cabo bajo
condiciones aeróbicas tales como mediante agitación, y/o movimiento
con aireación, a una temperatura entre 20 y 42ºC, preferentemente
entre 34 y 40ºC. El pH del cultivo está habitualmente entre 5 y 9,
preferentemente entre 6,5 y 7,2. El pH del cultivo puede ajustarse
con amoníaco, carbonato cálcico, varios ácidos, varias bases, con
tampones. Habitualmente, un cultivo entre 1 y 5 días conduce a la
producción, secreción y acumulación de la L-cisteína
en el medio líquido.
Después del cultivo, los sólidos tales como las
células pueden eliminarse del medio líquido mediante centrifugación
o filtración de membrana, y la L-cisteína puede
recuperarse y purificarse mediante procedimientos tales como
intercambio iónico, concentración y/o cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se pondrá más claramente
de manifiesto haciendo referencia a los Ejemplos no limitativos
siguientes. En los Ejemplos, un aminoácido es de configuración L si
no se apunta lo contrario. El ADN cromosómico de la cepa MG1655 de
E. coli se utilizó como matriz en todas las PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se ha informado de que el gen ydeD, que
codifica una proteína transmembranosa, resulta útil para la
producción de cisteína (patente US nº 5.972.663) Por tanto, se
clonó el gen ydeD mediante PCR utilizando los cebadores
ydeD299F e yded299R (SEC ID nº: 19 y 20, respectivamente) y el ADN
cromosómico de la cepa MG1655 de E. coli.
Entonces, el gen mutante cysEX, que
codifica la serin acetiltransferasa sin la retroinhibición por la
cisteína, que se describe en la patente US nº 6.218.168, se
construyó mediante dos procedimientos PCR sucesivos para
mutagénesis puntual, utilizando los cebadores cysEF y
cysEX-1, cysEX-2 y cysER (SEC ID nº:
21 y 22, 23 y 24 respectivamente) y el ADN cromosómico de la cepa
MG1655 de E. coli, tal como se muestra en la Figura 1. Los
dos productos resultantes de la PCR se separaron mediante
electroforesis y se eluyeron a partir del gel. En la segunda PCR
estos dos fragmentos de ADN se hibridizaron y se completó el gen
mutante cysEX.
Asimismo, al gen mutante serA5, que
codifica la fosfoglicerato deshidrogenasa sin la retroinhibición por
la serina, que se describe en la patente US nº 6.180.373, se clonó
mediante PCR, utilizando los cebadores serA5F y serA5R (SEC ID nº:
25 y 26, respectivamente) y el ADN cromosómico de la cepa MG1655 de
E. coli. La serina es el precursor de la
L-cisteína, por lo que la amplificación del gen
mutante serA5 es necesaria para aumentar la cantidad de serina.
Finalmente, el promotor P_{ompA} se clonó
mediante PCT utilizando los cebadores que se muestran en SEC ID
nº:11 (cebador PrOMPAF) y nº: 12 (cebador PrOMPAR). El cebador
PrOMPAF contiene un sitio enzimático de restricción SalI de
reconocimiento que se introdujo en su extremo 5'. Asimismo, se
introdujo un sitio SalI en los cebadores delanteros para la
amplificación de los genes ydeD (SEC ID nº:19), cysEX
(SEC ID nº:21) y serA5 (SEC ID nº: 25). Así, el sitio
SalI se utilizó para reunir el promotor P_{ompA} y cada uno
de los genes. El cebador PrOMPAR contiene un sitio enzimático de
restricción PaeI que se introdujo en su extremo 5'. Esto
sitios de restricción se introdujeron para una reunión de los genes
posterior y la construcción de un plásmido que se utiliza para la
transformación.
Así pues, la totalidad de los tres genes, cada
uno de ellos bajo el control del promotor PompA, se clonaron en el
vector pACYCI84.
De esta forma, se obtuvo el plásmido
pACYC-DES (Figura 2).
Ejemplo
2
Los genes cysPTWA, que codifican
proteínas del sistema de transporte sulfato/tiosulfato, se clonaron
utilizando los cebadores que se muestran en SEC ID nº:13 (cebador
Mz025) y nº:14 (cebador Mz026). El cebador Mz025 es idéntico a una
secuencia que empieza 315 pares de bases por encima del codón de
iniciación del gen cysP, y que tiene un sitio de restricción
enzimática PaeI de reconocimiento introducido en su extremo
5'. El cebador Mz026 es una secuencia complementaria a una
secuencia que empieza 13 pares de bases por debajo del codón de
finalización del gen cysA y que tiene un sitio de restricción
enzimática SaelI de reconocimiento introducido en su extremo
5'. El fragmento PCR resultante, que contiene el grupo
cysPTWA bajo (el control) de su propio promotor, se trató
con las restrictasas PaeI y SalI y se insertó en el
vector pMW119, que se había tratado previamente con las mismas
enzimas. De este modo, se obtuvo el plásmido
pMW-PTWA.
Ejemplo
3
El gen cysM que codifica la
O-acetilserin(tiol)-liasa-B
se clonó mediante PCR utilizando los cebadores que se muestran en
SEC ID nº:15 (cebador cysMF) y nº 16 (cebador cysMR). El cebador
cysMF contiene un sitio enzimático de restricción SalI de
reconocimiento que se ha introducido en su extremo 5'. El cebador
cysMR contiene un sitio enzimático XbaI de reconocimiento
que se ha introducido en su extremo 5'.
El promotor P_{cysK} se obtuvo mediante PCR,
utilizando los cebadores que se muestran en SEC ID nº17 (cebador
P^{cyskF} y nº 18 (cebador PcysKR). El cebador PcysKF es idéntico
a una secuencia que empieza 6 pares de bases por encima del codón
de iniciación del gen cysK, y que tiene un sitio de
restricción enzimática SalI de reconocimiento que se ha
introducido en su extremo 5'. El cebador PcysKR es complementario a
una secuencia que empieza 301 pares de bases por encima del codón
de iniciación del gen cysK, habiéndose introducido en su
extremo 5' un sitio de restricción enzimática PaeI de
reconocimiento. Entonces, los dos productos PCR resultantes se
reunieron mediante tratamiento con la restrictasa SalI,
seguido por su unión, introduciéndose en el vector integrador
pMW119int. El vector pMW119int (Figura 3) se construyó a partir del
vector pMW119 disponible comercialmente insertando los sitios attR
y attL, que son necesarios para una ulterior integración de Mu en
el sitio SalI de pMW119. De este modo, se obtuvo el plásmido
pMW-P_{cysK}-cysM.
Ejemplo
4
Los genes tnaA y metC codifican
proteínas de la vía principal de degradación de la cisteína
(Solicitud de la patente publicada Japonesa JP200316668). Por
tanto, se construyó una cepa MG1655 de E. coli con un
sistema de degradación alterado de la cisteína (tnA^{-},
metC^{-}) de la siguiente forma:
Inicialmente, se indujo una mutación del gen
metC mediante tratamiento con la
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG), seguido por procedimientos múltiples de enriquecimiento en
ampicilina. Se seleccionó el mutante, que pudo desarrollarse sobre
cistationina, pero no sobre homocisteína. Entonces, el gen alterado
tnaA de la cepa CGSC7152 de E. coli
(tnaA300:Tn10(Tc^{R}), del Genetic Stock Center, USA), se
transfirió a la cepa metC^{-} resultante, mediante un
procedimiento estándar de transducción P1 (Sambrook et al,
"Molecular Cloning, A Laboratory manual, 2ª edición", Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
De este modo, se obtuvo la cepa MT de E.
coli.
Ejemplo
5
La cepa MT de E. coli se utilizó como una
cepa parental para evaluar el efecto de la potenciación de la
expresión del grupo de cysPTWA sobre la producción de
L-cisteína.
Inicialmente, el gen cysM se integró en
el cromosoma de la cepa MT, utilizando el plásmido
pMW-P_{cysK}-cysM mediante el
procedimiento estándar de la integración de Mu.
Entonces, los plásmidos
pACYC-DES y pMW-PTWA se introdujeron
a continuación en el transductante
MTintCYSM resultante, dando lugar a las cepas MTintCYSM/pACYC-DES y MTintCYSM/pACYC-DES/pMW-PTWA.
MTintCYSM resultante, dando lugar a las cepas MTintCYSM/pACYC-DES y MTintCYSM/pACYC-DES/pMW-PTWA.
Ambas cepas MTintCYSM/pACYC-DES
y MTintCYSM/pACYC-DES/pMW-PTWA se
cultivaron por la noche con agitación a 34ºC en 2 ml de caldo de
cultivo nutritivo que había sido suplementado con 50 m/l de
ampicilina y 20 \mug/ml de tetraciclina. 0,2 ml de los cultivos
resultantes se inocularon en 2 ml de un medio de fermentación que
contenía tetraciclina (20 mg/l) y ampicilina (50
mg/l) en tubos de ensayo de 20 x 200 mm, y se cultivaron a 34ºC
durante 42 horas con un agitador rotatorio a 250 rpm. La composición
del medio de fermentación fue de 15,0 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1,0
g/l de MgSO_{4}, 20,0 g/l de CaCO_{3}, 0,1 mg/l de tiamina, 1%
de caldo de cultivo Luria (medio LB), 4% de glucosa, 300 mg/l de
L-metionina y una concentración variada de
Na_{2}S_{2}O_{3}.
Después del cultivo, se determinó la cantidad de
L-cisteína que se había acumulado en el medio
mediante el procedimiento descrito por Gaitonde, M.K. (Biochem. J.,
104:2, 627-33 (1967). Los datos se presentan en la
Tabla 1.
Para la fermentación en un minirrecipiente de
fermentación, un asa de siembra de cada cepa
MTintCYSM/pACYC-DES y
MTintCYSM/pACYC-DES/pMW-PTWA que se
desarrollaron en L-agar, se transfirió al caldo de
cultivo L y se cultivaron a 34ºC con rotación (140 rpm) para
alcanzar la densidad óptica del cultivo, OD_{540} \simeq 2,0.
Entonces, 25 ml del cultivo de siembra se añadieron a 250 ml del
medio para fermentación y se cultivaron a 34ºC con rotación (1500
rpm) durante 48 horas.
La composición del medio de fermentación en un
recipiente fermentador (g/l):
| Triptona | 2,0 | |
| Extracto de levadura | 1,0 | |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 5,0 | |
| KH_{2}PO_{4} | 1,5 | |
| NaCl | 0,5 | |
| MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 0,3 | |
| CaCl_{2} \cdot 2H_{2}O | 0,015 | |
| FeSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 0,075 | |
| Citrato de sodio \cdot 2H_{2}O | 1,0 | |
| Glucosa | 100,0 | |
| Metionina | 0,45 |
El medio se suplementó con tiosulfato después de
6 horas de fermentación a una velocidad de 0,4 g/l*h.
Después del cultivo, la cantidad de
L-cisteína que se había acumulado en el medio, se
determinó tal como se ha descrito anteriormente. Los datos se
presentan en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se aprecia en las Tablas 1 y 2, el
aumento de la expresión de los genes del grupo cysPTWAM
mejoró la productividad de cisteína de la cepa MT.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para producir
L-cisteína utilizando bacterias que pertenecen al
género Escherichia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> RU2003131993
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-11-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1017
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1017)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 834
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).._(834)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 876
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).._(876)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1098
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1098)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 365
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 912
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(912)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 303
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctgagtcg accgcctcgt tatcatccaa aatc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctgagcat gcactaattt tccttgcgga ggc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctgagcat gctgatggcg gcagcacact gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskipagctgatcta gattacagca gacgggcgcg aatgg
\hfill35
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Claims (8)
1. Bacteria productora de
L-cisteína que pertenece al género
Escherichia, en el que la bacteria se ha modificado de forma
que la cantidad de la expresión de los genes del grupo
cysPTWAM es superior que la de una cepa antes de la
modificación, aumentando el número de copias de los genes del grupo
cysPTWAM o modificando una secuencia de control de la
expresión de dichos genes.
2. Bacteria según la reivindicación 1, en la que
el número de copias se aumenta transformando la bacteria con un
vector multicopia que alberga los genes del grupo
cysPTWAM.
3. Bacteria según la reivindicación 1, en la que
el promotor nativo de dicho grupo es reemplazado con un promotor
que es más potente que el promotor nativo.
4. Bacteria según la reivindicación 1, en la que
el número de copias se aumenta integrando copias adicionales de
dichos genes del grupo cysPTWAM en el cromosoma de la
bacteria.
5. Bacteria según la reivindicación 1, en la que
dichos genes del grupo cysPTWAM se deriva de una bacteria
que pertenece al género Escherichia.
6. Bacteria según la reivindicación 5, en la que
la bacteria se modifica además de manera que la cantidad de la
expresión del marco de lectura abierto de ydeD es superior al
de una cepa antes de la modificación.
7. Procedimiento para producir
L-cisteína que comprende el cultivo de la bacteria
según la reivindicación 1 en un medio de cultivo que contiene
tiosulfato, y la recuperación de la L-cisteína a
partir del medio de cultivo.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que la cantidad de la expresión de los genes de la biosíntesis
de la L-cisteína en la bacteria es superior a la de
una cepa antes de la modificación.
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