CN102080062B - L-半胱氨酸生产菌以及l-半胱氨酸的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新的L-半胱氨酸生产方法，所述方法在L-半胱氨酸生产菌的选育中使用了在肠杆菌科细菌中承担L-半胱氨酸摄入活性的基因。本发明还提供一种属于肠杆菌科的细菌，其具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过了修饰从而使得YdjN蛋白质、或者YdjN蛋白质和FliY蛋白质的活性降低，并通过在培养基中培养所述细菌，从该培养基中收集L-胱氨酸、其衍生物或前体、或者它们的混合物来制造这些化合物。

Description

L-半胱氨酸生产菌以及L-半胱氨酸的生产方法
技术领域
本发明涉及L-半胱氨酸或其关联物质的生产方法，具体来说涉及适于生产L-半胱氨酸或其关联物质的细菌、以及使用该细菌的L-半胱氨酸或其关联物质的生产方法。L-半胱氨酸以及其关联物质可以在医药品、化妆品以及食品领域中被利用。 
背景技术
L-半胱氨酸可以通过从毛发、角、羽毛等含有角蛋白质的物质中提取而获得，或者以DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸为前体通过细菌酶转化而获得。此外，还计划使用新型酶通过固定化酶方法大量生产L-半胱氨酸。 
还尝试通过使用细菌的发酵方法来生产L-半胱氨酸。例如，本发明人公开的使用下述埃希氏菌属细菌的L-半胱氨酸的生产方法，所述埃希氏菌属细菌的L-半胱氨酸分解系统受到了抑制、并且携带且降低了L-半胱氨酸反馈抑制的丝氨酸乙酰转移酶(serine acetyltransferase(EC 2.3.1.30)，下面也称为“SAT”)(专利文献1)。此外，作为通过抑制L-半胱氨酸分解系统从而提高了L-半胱氨酸生产能力的细菌，已知的有使胱硫醚-β-裂解酶(专利文献1)、色氨酸酶(专利文献2)、O-乙酰丝氨酸巯基水解酶B(专利文献3)的活性降低或缺失的棒状杆菌型细菌或埃希氏属细菌。此外，还已知使用下述细菌的L-半胱氨酸制造方法，所述细菌中，利用编码具有降低L-半胱氨酸反馈抑制的特定突变的SAT的DNA序列，使L-半胱氨酸物质代谢摆脱了调控(专利文献4)。 
还已知编码YdeD蛋白质的ydeD基因(非专利文献1)以及编码YfiK蛋白质的yfiK基因(专利文献5)与L-半胱氨酸途径的代谢产物的分泌有关。此外，已知通过增强作为编码适于分泌针对细胞的有毒物质的蛋白质的基因的mar-基因座、acr-基因座、cmr-基因座、mex-基因座、bmr-基因座、qacA-基因座(专利文献6)、或emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr或者cusA基因(专利文献7)的表达来提高L-半胱氨酸生产能力的技术。 
此外，作为L-半胱氨酸生产菌，已知有增强了由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控因子的活性的大肠杆菌(专利文献8)。 
另一方面，在L-氨基酸的发酵生产中，不仅L-氨基酸向细胞外的分泌，L-氨基酸的摄入也是很重要的。微生物在各自的生长繁育的环境中，具有从环境中向细胞内摄入多种氨基酸并加以利用的能力。例如大肠杆菌(E.coli)，其具有许多转运体，预计也应当具有相当多的与L-氨基酸的摄入相关的转运体。在预测具有“膜转运蛋白(membrane tranporter protein)”功能的物质中，估计其中的14％与氨基酸的转运相关(非专利文献2)。但是，由于在转运体中通常存在着多种基质特异性的各种种内同源物(パラログ，paralogue)，另外功能性的重复(对于同一基质存在多个摄入系统)也较多，因此对转运体的功能的鉴定是非常困难的(非专利文献3)。如上所述，转运体的功能、生理上的作用是非常复杂的。因此，就从同源性、表型出发简单地推定转运体的性质而言，有时具有不能反应出实际的转运体的生理功能的情况。例如，无法预测在对多种基质的输送中哪一种输送是具有生理上重要功能的等。此外，相反，即使了解了输送某种物质的过程，还具有存在其他多个同样转运该物质的因子的可能性。因此，就用于氨基酸发酵生产的微生物的修饰而言，利用转运体作为目标并不容易。 
此外，在细菌的L-半胱氨酸以及其关联化合物中，涉及到胱氨酸的摄入系统的有如下所示的几种看法，但基本上没有与L-半胱氨酸、S-磺酸半胱氨酸(S-スルフオシステイン，S-sulfocysteine)的摄入相关的有力的见解。 
推测在大肠杆菌中存在动力学特性(Kinetics)不同的至少2种胱氨酸摄入系统(非专利文献4)。在体外(in vitro)的实验体系中显示出FliY与胱氨酸相结合(非专利文献5)，fliY基因和与其邻近的yecC，yecS，yecO形成操纵子，推测其作为ABC转运体发挥功能(非专利文献6)。但是，它们是否在大肠杆菌中起生理上摄入胱氨酸的功能，目前尚未通过实验直接揭示出来。 
同样地，在沙门氏菌(Salmonella)属的细菌中，预计也存在动力学上不同的3种胱氨酸摄入系统(非专利文献7)，但目前还没有鉴定出与此相关的蛋白质、以及编码它们的基因。另外，已有报道称在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中具有3种胱氨酸摄入系统(YckKJI，YtmJKLMN，YhcL)，在该3种系统缺损的情况下，将胱氨酸作为唯一硫源时，该细菌不能生长繁育(非专利文献8)。 
有报道称大肠杆菌的YdjN与涉及枯草芽孢杆菌的胱氨酸摄入的TcyP具有45％的同源性(非专利文献8)，但实际上，无法确认其是否具有胱氨酸摄入活性。 
在发酵乳杆菌(Lactobaillus fermentum)BR11中，已知了由bspA编码胱氨酸摄入系统(Turner et al.J.Bacteriol.181.2192-2198(1999))。此外，推测在侵肺军团菌(Legionella pneumophila)中存在动力学上不同的2种半胱氨酸摄入系统(非专利文献9)，但尚未确定基因以及蛋白质。 
现有技术文献 
专利文献 
专利文献1特开平11-155571号 
专利文献2特开2003-169668 
专利文献3特开2005-245311 
专利文献4特表2000-504926 
专利文献5特开2004-49237 
专利文献6美国专利第5972663号 
专利文献7特开2005-287333 
专利文献8国际公开小册子第01/27307号 
非专利文献 
非专利文献1 Dabler et al.，Mol.Microbiol.36.1101-1112(2000) 
非专利文献2 Paulsen et al.，J.Mol.Biol.277.573-592(1998) 
非专利文献3 Hosie et al.，Res.Microbiol.152.259-270(2001) 
非专利文献4 Berger et al.，J.Biol.Chem.247.7684-7694(1972) 
非专利文献5 Butler et al.，Life Sci.52.1209-1215(1993) 
非专利文献6 Hosie et al.，Res.Microbiol.152.259-270(2001) 
非专利文献7 Baptist et al.，J.Bacteriol.131.111-118(1977) 
非专利文献8 Burguiere et al.，J.Bacteriol.186.4875-4884(2004) 
非专利文献9 Ewann et al.，Appl.Environ.Microbiol.72.3993-4000(2006) 
发明内容
发明所要解决的问题 
本发明的课题是：开发使细菌的L-半胱氨酸生产能力提高的新型技术，提供L-半胱氨酸生产菌、以及使用该细菌的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者它上述物质的混合物的生产方法。 
解决问题的方法 
本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现通过修饰细菌使得ydjN基因编码的蛋白质的活性降低，可以提高L-半胱氨酸的生产能力；还发现通过修饰细菌使得上述蛋白质和fliY基因编码的蛋白质的活性降低，可以进一步提高L-半胱氨酸的生产能力，从而完成了本发明。 
即，本发明如下所述。 
(1)一种属于肠杆菌科的细菌，其具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过了修饰从而使得YdjN蛋白质的活性降低。 
(2)上述的细菌，其中，所述YdjN蛋白质为具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白质或者该蛋白质的变体。 
(3)上述的细菌，其中，还经过了修饰从而使得FliY蛋白质的活性降低。 
(4)上述的细菌，其中，所述FliY蛋白质为具有SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列的蛋白质或者该蛋白质的变体。 
(5)上述的细菌，其中，所述YdjN蛋白质或FliY蛋白质活性是是通过降低编码所述YdjN蛋白质或FliY蛋白质的ydjN基因或fliY基因的表达量，或者破坏所述基因而降低的。 
(6)上述的细菌，其中，所述ydjN基因是下述(a)～(c)中的任一种DNA： 
(a)含有SEQ ID NO：1或3的碱基序列的DNA； 
(b)与SEQ ID NO：1或3的碱基序列的互补序列或能够由所述碱基序列制备的探针在严格条件下杂交的DNA； 
(c)与SEQ ID NO：1或3的碱基序列具有95％以上的同一性的DNA。 
(7)上述的细菌，其中，所述fliY基因是下述(d)～(f)中的任一种DNA： 
(d)含有SEQ ID NO：5或7的碱基序列的DNA； 
(e)与SEQ ID NO：5或7的碱基序列的互补序列或能够由所述碱基序列制备的探针在严格条件下杂交的DNA； 
(f)与SEQ ID NO：5或7的碱基序列具有95％以上的同一性的DNA。 
(8)上述的细菌，其中所述细菌还具有下述性质中的至少一种： 
i)经过修饰从而使得丝氨酸乙酰转移酶活性提高； 
ii)经过修饰从而使得yeaS基因的表达增强； 
iii)经过修饰从而使得3-磷酸甘油酸脱氢酶(phosphoglycerate dehydrogenase)活性提高； 
iv)经过修饰从而使得硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统(transport system)的活性增强。 
(9)上述的细菌，其中，所述细菌为属于泛菌属的细菌。 
(10)上述的细菌，其中，所述细菌为Pantoea ananatis。 
(11)上述的细菌，其中，所述细菌为大肠杆菌。 
(12)一种L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者上述物质的混合物的生产方法，该方法中，在培养基中培养所述细菌，并从所述培养基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者上述物质的混合物。 
发明效果 
通过本发明可以提高属于肠杆菌科的细菌的L-半胱氨酸生产能力。此外，通过本发明，可以更高效地生产L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者它们的混合物。 
附图说明
图1为显示在大肠杆菌MG1655中S-磺酸半胱氨酸的摄入的图。 
图2为显示在大肠杆菌MG1655中胱氨酸的摄入的图。 
图3为显示在大肠杆菌MG1655中半胱氨酸的摄入的图。 
图4为显示基于P.ananatis ydjN的S-磺酸半胱氨酸的摄入的图。 
图5为显示基于大肠杆菌fliY的缺损的胱氨酸的摄入的图。 
图6为显示基于大肠杆菌fliY的强化的胱氨酸的摄入的图。 
图7为显示基于大肠杆菌fliY的缺损的半胱氨酸的摄入的图。 
图8为显示启动子Pnlp的序列的图。 
发明的具体实施方式
<1>本发明的细菌 
本发明的细菌为具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过了修饰使得YdjN蛋白质活性降低的属于肠杆菌科的细菌。本发明细菌优选的方式为，经过 了修饰使得上述蛋白质以及FliY蛋白质的活性降低的细菌。YdjN蛋白质以及FliY蛋白质是由fliY以及ydjN基因编码的。所述蛋白质以及基因将在以下进行详述。 
L-半胱氨酸的生产能力是指，当在培养基中培养本发明的细菌时，在培养基中或者菌体内生成L-半胱氨酸，并且积累达到可以从培养基中或者菌体中回收的水平的能力。此外，具有L-半胱氨酸生产能力的细菌是指，与野生株或者亲本株相比可以生产更多L-半胱氨酸并使其在培养基中积累的细菌，优选可以生产并在培养基中积累0.3g/L以上，更优选为0.4g/L，特别优选为0.5g/L以上的量的L-半胱氨酸的微生物。 
微生物生产的L-半胱氨酸在培养基中通过二硫键一部分转化为L-胱氨酸。此外，如下述一样，有时L-半胱氨酸通过和培养基中含有的硫代硫酸反应生成S-磺酸半胱氨酸(Szczepkowski T.W.，Nature，vol.182(1958))。进一步，细菌的细胞内生成的L-半胱氨酸有时还和细胞中存在的酮或醛，例如与丙酮酸缩合，以硫代半酮缩醇(ヘミチオケタ一ル，hemithioketal)为中间体生成噻唑烷(チアゾリジン，thiazolidine)衍生物(参考日本专利第2992010)。这些噻唑烷衍生物以及硫代半酮缩醇有时作为平衡混合物存在。因此，L-半胱氨酸生产能力，不仅限于在培养基中或者菌体内积累L-半胱氨酸的能力，是指在培养基中积累除L-半胱氨酸之外，还包括L-胱氨酸、其衍生物或前体，或者它们的混合物的能力。作为所述L-半胱氨酸或L-胱氨酸的衍生物，可以列举出，例如S-磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物以及硫代半酮缩醇等。此外，作为L-半胱氨酸或L-胱氨酸的前体，可以列举出例如作为L-半胱氨酸的前体的O-乙酰丝氨酸。 
L-半胱氨酸或L-胱氨酸的前体中，也可以包括前体的衍生物，可以列举出例如作为O-乙酰丝氨酸的衍生物的N-乙酰丝氨酸。 
O-乙酰丝氨酸(OAS)为L-半胱氨酸生物合成的前体物质。OAS为细菌、植物的代谢物质，通过丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的酶反应，通过L-丝氨酸的乙酰化而产生。OAS在细胞内还可以转化为L-半胱氨酸。 
作为具有L-半胱氨酸生产能力的细菌，可以为天然具有L-半胱氨酸生产能力的细菌，但也可以是如下所述的细菌：通过利用突变方法、重组DNA技术进行修饰而具有了L-半胱氨酸生产能力的细菌。而且，在本发明中的半胱氨酸生产能力的细菌，可以为天然具有L-半胱氨酸生产能力的细菌，但也可以是如下所述的细菌：通过利用突变方法、重组DNA技术进行修饰而具有了L-半胱氨酸生产能力的细菌。而且，在本发明中的 L-半胱氨酸，如果没有特殊提及，是指还原型L-半胱氨酸、L-胱氨酸、或者上述那样的衍生物、或者它们的混合物。 
作为在本发明中使用的细菌，只要是具有L-半胱氨酸生产能力的细菌即可，没有特殊限制，可以是属于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、沙门氏菌属、摩根氏菌属等肠杆菌科的细菌。具体地说，可以使用按照NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information)数据库中记载的分类属于肠杆菌科的细菌(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgiyyid＝91347)。作为用于修饰的肠杆菌科的亲本株，其中优选使用埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、泛菌属细菌、欧文氏菌属、肠杆菌属、或克雷伯氏菌属。 
对于埃希氏菌属细菌，没有特别限制，具体而言，可以使用Neidhardt等的著作(Backmann，B.J.1996.Derivations and Genotypes of some mutantderivatives of Escherichia coli K-12，p.2460-2488.Table 1.In F.D.Neidhardt(ed.)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/SecondEdition，American Society for Microbiology Press，Washington，D.C.)列出的细菌。在这些细菌中，例如可列举大肠杆菌。作为大肠杆菌，具体地可列举源自原型野生型K12菌株的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)和大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)。 
这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland 20852 P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，UnitedStates of America)通过分售获得。即，对每种菌株都给予了登录号，可以使用这些号码通过分售获得菌株(参考http://www.atcc.org/)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了每种菌株的对应登录号。 
肠杆菌属细菌的实例可以列举出成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等、泛菌属细菌的实例可以列举出Pantoea ananatis。而且，近年来，成团肠杆菌根据其16S rRNA的碱基序列的解析，被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)或Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。在本发明中，只要是被分类为肠杆菌科的细菌，无论是属于肠杆菌属或者泛菌属中任一属的细菌均可。 
特别地，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为γ-变形细菌(γ-Proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的亲缘关系非常近(J Gen Appl Microbiol 1997Dec；43(6)355-361、International Journal of Systematic Bacteriology，Oct.1997，p1061-1067)。近年来，依据DNA-DNA杂交实验等，属于肠杆菌属的细菌中，有些被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)或Pantoea dispersa等(International Journal of Systematic Bacteriology，July 1989；39(3).p.337-345)。此外，属于欧文氏菌属的细菌中，有些被重新分类为菠萝泛菌(Pantoea ananas)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)(参考International Journal of Systematic Bacteriology，Jan 1993；43(1).p.162-173)。 
肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。具体地，可以使用欧州专利申请公开952221号说明书示例的菌株。作为肠杆菌属的代表性菌株，可以列举出成团肠杆菌ATCC12287株。 
作为泛菌属细菌的代表性菌株，可以列举出Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、成团泛菌、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。作为Pantoea ananatis具体地可以列举出Pantoea ananatis AJ13355株、SC17株、以及SC17(0)株。SC17株是以作为低pH下能够在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株从静冈县磐田市的土壤中分离出来的菌株AJ13355(FERMBP-6614)为起始，作为粘液质低生产突变株选择出来的菌株(美国专利第6,596,517号)。SC17(0)株是为了对Pantoea ananatis进行基因破坏，作为对λRed基因产物具有抗性的菌株而构建的菌株(WO2008/075483)。SC17株已于平成21年2月4日(2009年)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：邮政编码305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，并给予保藏号FERM ABP-11091。此外，SC17(0)株已于2005年9月21日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM)，GNII Genetika)地址为俄罗斯莫斯科(Russia，117545Moscow，1Dorozhny proezd.1)，保藏号为VKPMB-9246。 
Pantoea ananatis AJ13355株已于平成10年(1998年)2月19日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名称为独立行政产业技 术综合研究所专利生物保藏中心，地址：邮政编码305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号为FERM P-16644，并于平成11年(1999年)1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给予保藏号FERM BP-6614。而且，该菌株在分离时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，并当作成团肠杆菌AJ13355进行了保藏。但是，近年来，基于16S rRNA核苷酸序列分析等，其被重新分类为Pantoea ananatis。 
作为欧文氏菌属细菌，可以列举出解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；作为克雷伯氏菌属细菌，可以列举出植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。 
(L-半胱氨酸生产能力的赋予或增强) 
下面，对于给属于肠杆菌科的细菌赋予L-半胱氨酸生产能力的方法，或增强这些细菌的L-半胱氨酸生产能力的方法进行描述。 
为了给细菌赋予L-半胱氨酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等氨基酸生产菌的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变株、类似物抗性菌株或代谢调节突变株，创建L-半胱氨酸生物合成系统酶表达增强的重组菌株等等(参见《アミノ酸発酵》，(株)学会出版中心，1986年5月30日第一版发行，第77-100页)。这里，在L-半胱氨酸生产菌的选育中，被赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质可以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达被增强的L-半胱氨酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，可以将营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强组合进行。 
具有L-半胱氨酸生产能力的营养缺陷突变体菌株、L-半胱氨酸类似物抗性菌株或代谢调节突变株可如下获得：对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，即X-射线或UV照射或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等处理；其后，从所得的突变株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有L-氨基酸生产能力的菌株。 
通过增强L-半胱氨酸生物合成途径的酶，或，与生成L-丝氨酸等作为该途径的基质的化合物相关的酶，例如，3-磷酸甘油酸脱氢酶或丝氨酸乙酰转移酶等的活性，可以提高细菌的L-半胱氨酸生产能力。3-磷酸甘油酸脱氢酶受到丝氨酸的反馈抑制，但通过使细菌携带有编码该反馈抑制被降低或解除了的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA基因，可以增强该酶的活性。 
此外，丝氨酸乙酰转移酶受到L-半胱氨酸的反馈抑制。因此，通过使细菌携带有编码该反馈抑制被降低或解除了的丝氨酸乙酰转移酶的突变型cysE基因，可以增强该酶的活性。 
此外，通过增强硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的活性，也可以提高L-半胱氨酸的生产能力。硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的蛋白质群由cysPTWAM基因簇编码(特开2005-137369号公报，EP1528108号说明书)。 
此外，通过提高yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)的表达，也可以提高细菌的L-半胱氨酸生产能力。yeaS基因的碱基序列以及该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15以及16所示。在细菌中，除ATG之外，还已知GTG等多种密码子可以作为起始密码子使用(http://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm)。在SEQ IDNO：15以及16中，与最初的密码子gtg相当的氨基酸表记为Val，但实际上为Met的可能性较高。 
具体来说，L-半胱氨酸生产菌的实例可以列举出、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抑制抗性的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的多种cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利第6,218,168号)；具有编码适于向细胞分泌有毒物质的蛋白质的过表达基因的大肠杆菌W3110(美国专利第5,972,663号)；半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(特开平11-155571号公报)；由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控因子活性增强的大肠杆菌W3110(WO01/27307)等。 
在大肠杆菌中，作为具有分泌L-半胱氨酸活性的公知的蛋白质，已知有如上所述的由ydeD编码的蛋白质(特开2002-233384)、由yfiK编码的蛋白质(特开2004-49237)、由emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、cusA各基因编码的蛋白质(特开平2005-287333)。也可以增强所述L-半胱氨酸分泌蛋白质的活性。 
下面，作为赋予L-半胱氨酸生产能力的方法，对增强L-半胱氨酸生物合成酶活性的方法进行说明。 
作为L-半胱氨酸生物合成酶，可以列举出例如，丝氨酸乙酰转移酶(SAT)。在属于肠杆菌科的细菌的细胞内增强SAT活性，可以通过增加编码SAT基因的拷贝数、或者通过修饰编码SAT的基因的启动子等表达调节序列来实现。例如，将编码SAT的基因片段，与在属于肠杆菌科的细菌中发挥功能的载体、优选多拷贝型载体连接制作重组DNA，并将其导入到属于肠杆菌科的宿主细菌中来进行转化即可。 
下面，对强化SAT基因的表达的方法进行说明。对于其他的L-半胱氨酸生物合成系统酶基因，以及具有所述yeaS基因以及具有半胱氨酸分泌活性的蛋白质的基因，也可以适用相同的方法。 
就使SAT基因的表达增强的修饰而言，例如，可以利用基因重组技术，通过提高细胞内的SAT基因的拷贝数来进行。例如，将含有SAT基因的DNA片段，与在宿主细菌内发挥功能的载体，优选多拷贝型载体连接从而制成重组DNA，并将其导入细菌进行转化即可。 
例如，大肠杆菌的SAT基因可以通过下述方法获得：使用基于SEQ IDNO：9的碱基序列制作的引物，以大肠杆菌的染色体DNA为模板，通过PCR方法获得SAT基因。其他细菌的SAT基因也可以利用基于所述序列信息制作的探针，通过杂交方法，从细菌的染色体DNA或染色体DNA文库中获取。 
提高SAT基因的拷贝数，可以通过使SAT基因在细菌的染色体DNA上多拷贝地存在而实现。为了向细菌的染色体DNA上多拷贝地导入SAT基因，利用在染色体DNA上多拷贝存在的序列作为靶标，通过同源重组来进行。作为在染色体DNA上多拷贝存在的序列，可以利用重复DNA(repetitive DNA)、存在于转座元件的端部的反向重复序列等。或者，与特开平2-109985号公报中所公开的内容一样，可以将SAT基因搭载于转座子上并将其转移，在染色体DNA上多拷贝地导入。 
另外，就SAT基因表达的增强而言，除了上述基因拷贝数的扩增之外，如在国际公开00/18935号小册子中记载的一样，可以通过下述方法来实现：将染色体DNA上或者质粒上的SAT基因的启动子等表达调节序列替换成强启动子等表达调节序列，或者扩增使SAT表达增强的调节子，或者缺失或者弱化使SAT的表达降低的调节子。作为强启动子，已知的有例如lac启动子、trp启动子、trc启动子等。此外，通过向SAT基因的启动子领域内导入 碱基取代等，还可以修饰得到更强的启动子。通过这些启动子取代或者修饰可以强化SAT基因的表达。启动子强度的评价方法和强启动子的例子记载于Goldstein和Doi的论文(Goldstein，M.A.and Doi R.H.1995.Prokaryoticpromoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1，105-128)等中。而且，对表达调节序列的修饰也可以与提高SAT基因拷贝数的方法进行组合。此外为了提高SAT蛋白质的生成，也可以在SAT基因的翻译起始点附近导入突变从而提高翻译效率，也可以将其与增强SAT基因的表达相组合。 
对于SAT基因表达的提高，以及SAT蛋白质含量增加的确认，可以按照与后述的对目标基因转录量的降低，以及对目标蛋白质含量的降低的确认相同地，通过mRNA的定量，以及使用抗体的蛋白质印迹(Western blot)来进行。 
SAT基因可以任选埃希氏菌属细菌来源的基因以及其他生物来源的基因使用。作为编码大肠杆菌的SAT的基因，从野生株以及L-半胱氨酸分泌突变株中克隆了cysE，从而得知其碱基序列(Denk，D.and Boeck，A.，J.General Microbiol.，133，515-525(1987))。上述碱基序列以及该碱基序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：9以及10所示。使用基于该基因序列制成的引物，以埃希氏菌属细菌的染色体DNA为模板进行PCR，可以获得SAT基因(参考特开平11-155571号)。其他生物的编码SAT的基因也可以同样地获得。通过上述方法得到的SAT基因，也可以像上述cysE基因那样进行表达增强。 
而且，当在SAT基因的表达中存在“L-半胱氨酸反馈抑制”等抑制机理时，通过修饰表达调节序列或与抑制相关的基因从而使该抑制机制变为非敏感性的，也可以增强SAT基因的表达。 
例如，通过在属于肠杆菌科的细菌中携带降低或解除了L-半胱氨酸反馈抑制的SAT(下面，也称为“突变型SAT”)，可以使SAT活性升高。作为突变型SAT，可以列举出具有下述突变的SAT：用赖氨酸残基以及亮氨酸残基以外的氨基酸残基取代相当于野生型SAT(SEQ ID NO：10)的第256位的甲硫氨酸残基的氨基酸残基的突变，或者从相当于第256位的甲硫氨酸残基开始缺失C末端侧的区域的突变。作为所述赖氨酸残基以及亮氨酸残基以外的氨基酸残基，可以列举出，在通常构成蛋白质的氨基酸中，除甲硫氨酸残基、赖氨酸残基以及亮氨酸残基以外的17种氨基酸残基。可以列举出 更优选为异亮氨酸残基或者谷氨酸残基。作为向野生型SAT基因中导入所期望的突变的方法，可以列举出定点突变。作为突变型SAT基因，已知编码大肠杆菌的突变型SAT的突变型cysE(参考WO 97/15673号国际公开小册子、特开平11-155571号)。携带了含有编码由谷氨酸残基取代第256位的甲硫氨酸残基的突变型SAT的突变型cysE的质粒pCEM256E的大肠杆菌JM39-8菌株(大肠杆菌JM39-8(pCEM256E)、内部编号：AJ13391)，已经于平成9年(1997年)11月20日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305日本茨城县筑波市东1丁目1番地3号)，保藏号为FERMP-16527，并于2002年7月8日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给予保藏号FERM BP-8112。 
在本发明中，“对L-半胱氨酸的反馈抑制为非敏感性”既可以指如上所述的通过修饰而使得对L-半胱氨酸的反馈抑制变为非敏感性，也可以指原本就不受反馈抑制。已知拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SAT为不受L-半胱氨酸反馈抑制，在本发明中优选使用。作为含有拟南芥来源的SAT基因的质粒，已知的有pEAS-m(FEMS Microbiol.Lett.，179(1999)453-459)。 
此外，通过增强编码硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统蛋白质群的cysPTWAM基因簇的表达，也可以提高L-半胱氨酸的生产能力(特开2005-137369号公报、EP1528108号说明书)。 
此外，硫化物通过分别由cysK以及cysM基因编码的O-乙酰丝氨酸(巯基)-裂解酶-A或者B催化的反应而被导入O-乙酰基-L-丝氨酸，从而产生L-半胱氨酸。因此，通过增强编码所述酶的基因的表达也可以提高L-半胱氨酸的生产能力。 
此外，通过抑制L-半胱氨酸分解系统，可以提高L-半胱氨酸的生产能力。抑制L-半胱氨酸分解系统是指，细胞内的L-半胱氨酸的分解活性与野生株或者亲本株等非修饰株相比有降低。作为承担L-半胱氨酸分解系统的蛋白质，已知的有胱硫醚-β-裂解酶(metC产物、特开平11-155571号，Chandraet.al.，Biochemistry，21(1982)3064-3069)、色氨酸酶(tnaA产物、特开2003-169668，(Austin Newton et.al.，J.Biol.Chem.240(1965)1211-1218))、O-乙酰丝氨酸巯基水解酶B(cysM基因产物、特开2005-245311)、以及malY基因产物(特开2005-245311)。通过使所述蛋白质的活性降低，从而提高L-半胱氨酸的生产能力。 
使蛋白质活性降低的修饰，可以像后述的针对fliY或ydjN基因所记载的方法一样来进行。 
大肠杆菌的cysM基因的碱基序列以及该基因编码的氨基酸序列，分别如SEQ ID NO：25以及26所示。 
(YdjN蛋白质以及FliY蛋白质活性的降低) 
本发明的细菌，如上所述为具有L-半胱氨酸生产能力的属于肠杆菌科的细菌，其可以这样获得：通过修饰从而使YdjN蛋白质、或YdjN蛋白质以及FliY蛋白质的活性降低。而且，也可以是在进行了修饰使得YdjN蛋白质、或YdjN蛋白质以及FliY蛋白质的活性降低之后，再赋予其L-半胱氨酸的生产能力。YdjN蛋白质以及FliY蛋白质分别为由yjdN基因以及fliY基因编码的蛋白质。为了使YdjN蛋白质以及FliY蛋白质的活性降低，可以通过如下方法实现，例如，修饰具有fliY基因以及ydjN基因的细菌，从而使所述基因编码的FliY以及YdjN的活性降低。而且，在为了提高L-半胱氨酸生产能力而使活性降低时，可以是使FliY或YdjN中的任一方活性降低，但优选使YdjN的活性降低，更为优选使两方活性均降低。 
在本发明中，对活性的“降低”没有特殊限制，其包含修饰株的活性比野生株或者非修饰株低，以及活性完全消失这两个方面。 
本发明者从Pantoea ananatis的染色体DNA中，发现了编码其缺损可以使L-半胱氨酸生产能力提高的蛋白质的新基因，由于它们分别显示了和大肠杆菌的fliY、ydjN的较高的同源性(分别是78％、80％)，因此将它们分别命名为fliY和ydjN。而且，在本说明书中，“同源性(homoloyg)”有些情况下是指“同一性(identity)”。 
在本发明中，有时将大肠杆菌的fliY、ydjN基因和Pantoea ananatis的fliY、ydjN基因，以及其他细菌携带的所述基因的同源基因分别命名为fliY、ydjN基因。 
作为fliY基因的具体实例，可以列举出含有SEQ ID NO：5、7所示的碱基序列的基因。此外，作为ydjN基因的具体实例，可以列举出含有SEQ IDNO：1、3所示的碱基序列的基因。 
SEQ ID NO：5表示的是大肠杆菌MG1655菌株的fliY基因，SEQ IDNO：6表示的是该基因编码的氨基酸序列。此外，SEQ ID NO：7表示的是 Pantoea ananatis SC17菌株的fliY基因，SEQ ID NO：8表示的是该基因编码的氨基酸序列。。 
SEQ ID NO：1表示的是大肠杆菌MG1655菌株的ydjN基因的碱基序列，SEQ ID NO：2表示的是该基因编码的氨基酸序。此外，SEQ ID NO：3表示的是Pantoea ananatis SC17菌株的ydjN基因的碱基序列，SEQ ID NO：4表示的是该基因编码的氨基酸序列。 
FliY蛋白质以及YdjN蛋白质并不仅限于具有上述氨基酸序列的蛋白质以及它们的同源物，也可以是它们的变体(variant)。fliY或ydjN基因也可以是编码FliY蛋白质或YdjN蛋白质的变体的基因。FliY蛋白质以及YdjN蛋白质的变体是指具有在SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列中，在1个或者数个位置上具有1个或数个氨基酸取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列，且其具有FliY蛋白质或YdjN蛋白质的功能的蛋白质。而且上述“1个或数个”根据氨基酸残基在蛋白质的立体结构中的位置或者氨基酸残基的种类有所不同，但具体来说优选为1～20个、更优选为1～10个，更为优选为1～5个。 
ydjN基因缺损株如后述实施例所示，其S-磺酸半胱氨酸以及L-胱氨酸的摄入降低。因此，推测YdjN蛋白质具有与S-磺酸半胱氨酸以及L-胱氨酸的摄入有关的功能。 
另一方面，尽管有文献指出FliY可能与L-胱氨酸的摄入相关(Butler et al.，Life Sci.52.1209-1215(1993)，Hosie et al.，Res.Microbiol.152.259-270(2001))，但如实施例所示的一样，无论其与L-胱氨酸的摄入相关，或不相关，均可以推测与YdjN相比其活性较低。总之，使ydjN基因和fliY基因两方均缺损，与使各个基因单独缺损的情况相比，显著地提高了L-半胱氨酸的生产能力。因此，虽然FliY的功能仍不明确，但其具有下述特征：使其缺损时，能够提高L-半胱氨酸的生产能力。 
上述的1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或者添加为可以正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表为保守取代。保守取代是指，当取代部位为芳香族氨基酸时，在Phe、Trp、Tyr之间相互取代；当取代部位为疏水性氨基酸时，在Leu、Ile、Val间之间相互取代；当为极性氨基酸时，在Gln、Asn之间相互取代；当为碱性氨基酸时，在Lys、Arg、His之间相互取代；当为酸性氨基酸时，在Asp、Glu之间相互取代；当为具有羟 基的氨基酸时，为在Ser、Thr之间相互取代的突变。可视为保守取代的取代具体的可以列举出，用Ser或Thr取代Ala、用Gln、His或Lys取代Arg、用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn、用Asn、Glu或Gln取代Asp、用Ser或Ala取代Cys、用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln、用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu、用Pro取代Gly、用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His、用Leu、Met、Val或Phe的取代Ile、用Ile、Met、Val或Phe取代Leu、用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys、用Ile、Leu、Val或Phe取代Met、用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe、用Thr或Ala取代Ser、用Ser或Ala的取代Thr、用Phe或Tyr的取代Trp、用His、Phe或Trp取代Tyr、以及用Met、Ile或Leu的取代Val。此外，就上述这样的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或者倒位等而言，还包括因基因来源的细菌的个体差异、种间差异等情况而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或者倒位。 
此外，也可以为编码下述蛋白质的基因，该蛋白质与具有上述这样的保守突变的基因编码的氨基酸序列全体相比，具有80％以上的同源性，优选具有90％以上、更优选具有95％以上、更为优选具有97％以上、特别优选具有99％以上的同源性。编码这样的与FliY、YdjN具有同源性的蛋白质的基因，可以以上述大肠杆菌株野生型fliY、ydjN基因作为提问序列，使用BLAST检索或FASTA检索，从公开的数据库中容易地获取其序列信息，并通过使用基于该公知的基因序列作成的寡核苷酸作为引物来获得。 
此外，只要是fliY、YdjN基因编码的蛋白质的功能没有损坏即可，还可以是与上述碱基序列的互补序列、或者能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交的基因。在本发明中，严格的条件下是指，例如在60℃，1×SSC，0.1％SDS优选0.1×SSC，0.1％SDS相当的盐浓度下，洗涤1次优选2～3次。 
上述杂交用探针也可以为基因的互补序列的一部分。这样的探针，可以以基于公知的基因序列制得的寡核苷酸为引物，以包含这样的碱基序列的DNA片段为模板，通过PCR反应来制备。例如，当作为探针使用300bp左右长度的DNA片段时，上述杂交的洗涤条件可以列举出为50℃、2×SSC、0.1％SDS。 
下面，针对使FliY或YdjN蛋白质活性降低的方法进行说明。承担所述L-半胱氨酸分解系统的蛋白质等，也可以通过同样的方法使其活性降低。以下，将使其活性降低的对象蛋白质记为“目标蛋白质”，编码目标蛋白质的基因记为“目标基因”。 
使目标蛋白质的活性降低的修饰例如可以通过降低目标基因的表达来实现。具体来说例如，通过使染色体上的目标基因的编码区域的一部分或全部缺损，可以降低所述蛋白质的细胞内的活性。此外，通过修饰目标基因的启动子或shine-dalgarno(SD)序列等表达调节序列等，也可以降低目标蛋白质的活性。此外，对表达调节序列以外的非翻译区的修饰也可以降低基因的表达量。而且，还可以缺失包括染色体上的基因的前后序列的整个基因全体。此外，所述修饰还可以这样完成：向染色体上的目标基因的编码区域导入氨基酸取代(错意突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失一～二个碱基的移码突变(Journal of Biological Chemistry272：8611-8617(1997)Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 955511-5515(1998)，Journal of Biological Chemistry 266，20833-20839(1991))。此外，强化负向调节目标蛋白质的调节子的活性，或者抑制正向调节调节子的活性也可以使目标蛋白质的活性降低。添加负向调节目标蛋白质的活性或表达的物质、除去正向调节物质也可以使目标蛋白质的活性降低。 
此外，只要是可以使目的蛋白质的活性降低的修饰即可，也可以是通过X射线或紫外线照射、或者利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等突变剂进行的常规突变处理而引起的修饰。 
就表达调节序列的修饰而言，优选为1个碱基以上，更优选为2个碱基以上，特别优选为3个碱基以上。此外，在缺失编码区域时，只要目标蛋白质的功能降低即可，缺失的区域可以是N末端区域、内部区域、C末端区域中的任何区域，也可以是整个编码区域。通常，缺失的区域较长能够切实地使基因失活。此外，优选的是缺失区域的上游或下游的读码框不一致。 
在目标基因的编码区域中插入其他序列时，可以为基因的任何区域，但插入的序列较长时能够切实地使基因失活。插入部位的前后序列优选读码框不一致。对于其他序列没有特殊限制，只要是能够降低编码的目的蛋白质的功能即可，可以列举例如携带抗生素抗性基因或对L-半胱氨酸生产有用的基因的转座子等。 
使用抗体的蛋白质印迹(Western blot)可以对目标蛋白质的量的降低进行确认(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Coldspring Harbor(USA)，2001))。 
另外，目标蛋白质为YdjN蛋白质时，对于该蛋白质的量的降低的确认，可以通过测定细胞的S-磺酸半胱氨酸或L-胱氨酸摄入活性来进行。 
就蛋白质是否具有上述化合物的摄入活性而言，可以通过下述方法确认：制作使野生株或者亲本株中编码该蛋白质的基因的表达增强的细菌，在培养基中培养该细菌，并对培养基中蓄积的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、其衍生物或者前体、或者它们的混合物的量进行定量。或者，从野生株或亲本林出发制作使编码该蛋白质的基因的表达降低或缺损的细菌，在含有S- 磺酸半胱氨酸或L-胱氨酸的培养基中培养该细菌时，通过培养基中添加的这些化合物的减少量的变少来进行确认。具体实例如实施例所示。 
当使用大肠杆菌的fliY或ydjN基因作为fliY或ydjN基因时，使用基于SEQ ID NO：5或1的碱基序列制作的引物，以大肠杆菌的染色体DNA为模板，通过PCR方法可以获得fliY或ydjN基因。同样地，Pantoea ananatis的fliY或ydjN基因可以使用基于SEQ ID NO：7或3的碱基序列制作的引物，以Pantoea ananatis的染色体DNA为模板，通过PCR方法来获得。其他细菌的fliY或ydjN基因也可以使用基于上述序列信息制作的探针或引物，通过杂交方法或PCR方法，从细菌的染色体DNA或染色体DNA文库中获得。 
另一方面，为了确认FliY或YdjN蛋白质是否具有摄入S-磺酸半胱氨酸、L-胱氨酸、或L-半胱氨酸的活性，在必须提高fliY或ydjN基因的表达量的情况下，只要将所述基因多拷贝地导入细菌中即可。向细菌中多拷贝地导入fliY、ydjN基因时，可以适用像针对于SAT基因所记载的方法一样的使用多拷贝型载体的方法，或通过同源重组向染色体DNA上多拷贝地导入的方法等。 
<本发明的L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或它们的混合物的生产方法> 
在培养基中培养如上所述获得的本发明的细菌，通过从培养基中采集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或它们的混合物，可以生产所述化合物。作为L-半胱氨酸的衍生物，如上述的一样，可以列举出S-磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物、与该噻唑烷衍生物相当的硫代半酮缩醇等。 
作为使用的培养基，可以列举出含有碳源、氮源、硫源、无机离子以及需要的其他有机成分的通常的培养基。 
作为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉水解物等糖类、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。 
作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐、大豆水解物等有机氮、氨气、氨水等。 
作为硫源，可以列举出硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、连二亚硫酸盐(hyposulfite)、硫代硫酸盐等无机硫化物。 
作为有机微量营养源，优选适量含有维生素B1等必需物质或者酵母提取物等。除此之外，根据需要可以少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。 
培养在需氧的条件下进行30～90小时较好，培养温度为25℃～37℃，且优选将培养中的pH控制在5～8的范围内。此外，可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质，以及氨气等来调节pH值。就从培养物中采集L-半胱氨酸而言，可以通过组合通常的离子交换树脂法、沉淀法及其他公知的方法来实施。 
通过上述方法得到的L-半胱氨酸，可以用来生产L-半胱氨酸的衍生物。作为L-半胱氨酸的衍生物包含甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸(carbocysteine)、磺酸半胱氨酸、乙酰半胱氨酸等。 
此外，当L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培养基中积累时，从培养基中采集噻唑烷衍生物，使得噻唑烷衍生物和L-半胱氨酸之间的反应平衡向L-半胱氨酸一侧移动，从而可以生产L-半胱氨酸。此外，当S-磺酸半胱氨酸在培养基中积累时，例如可以使用二硫苏糖醇等还原剂通过进行还原转化得到L-半胱氨酸。 
本发明中采集出的L-半胱氨酸或其衍生物除了含有作为目标的化合物之外，还可以含有微生物菌体、培养基成分、水分以及微生物的代谢副产物等。采集的目的化合物的纯度为50％以上，优选为85％以上，特别优选为95％以上。 
以下，通过实施例针对本发明的进行更具体的说明。 
在下面所述的内容中，半胱氨酸以及胱氨酸为L-型。 
实施例
(实施例1)鉴定具有半胱氨酸或胱氨酸摄入活性的蛋白质 
(1)获得不能利用S-磺酸半胱氨酸作为单一半胱氨酸源的突变株 
(1-1)由大肠杆菌MG1655株(ATCC No.47076)获得cysE基因缺损株 
cysE基因的缺损通过Datsenko和Wanner等人开发的被称为“Red驱动整合”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，p6640-6645)和λ噬菌体来源的切出系统(J.Bacteriol.2000 184.5200-5203(2002))来进行。通过Red驱动整合，使用合成寡核苷酸作为引物得到PCR产物，使用该PCR 产物能够一步式地构建基因破坏菌株，所述合成寡核苷酸的5′侧设计有目的基因的一部分，3′侧设计有抗生物素抗性基因的一部分。另外通过组合λ噬菌体来源的切出系统，可以除去在基因破坏菌株中导入的抗生物素抗性基因。通过这样的Red驱动整合和λ噬菌体来源的切出系统使大肠杆菌基因缺损的方法在特开2005-058227A和WO2007/119880A1等中有详细描述。使用与这样的方法相同的方法，也可以获得cysE基因的缺损株。 
通过PCR方法获得了在cysE基因的两端的同源序列中插入了抗生物素抗性基因(卡那霉素抗性基因(Kmr))的DNA片段。除了使用DcysE(Ec)-F(ccggcccgcg cagaacgggc cggtcattat ctcatcgtgt ggagtaagca tgaagcctgc ttttttatac taagttggca：SEQ ID NO：50)、DcysE(Ec)-R(actgtaggcc ggatagatga ttacatcgca tccggcacga tcacaggaca cgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga：SEQ ID NO：51)作为引物，使用pMW118-(λattL-Kmr-λattR)(WO2006/093322A2)作为模板以外，具体的实验方法和实验材料，全部按照在特开2005-058227A1中记载的方法进行。将获得的缺损株命名为MG1655ΔcysE。 
(1-2)由MG1655ΔcysE菌株制作转座子突变株的文库 
使用EZ-Tn5<KAN-2>Tnp Transposome试剂盒(EPICENTRE公司)，由MG1655ΔcysE菌株制得将Tn5随机插入的突变株的文库。根据试剂盒产品中附带的说明书实施具体的实验方法。 
(1-3)从突变株文库中筛选不能以S-磺酸半胱氨酸作为单一半胱氨酸源加以利用的突变株 
利用上述文库，对不能以S-磺酸半胱氨酸作为单一半胱氨酸源加以利用的突变株进行筛选。在此“半胱氨酸源”是指被摄入到细胞内并用于生成半胱氨酸的基质。在细胞内不能合成半胱氨酸时，半胱氨酸本身也属于半胱氨酸源。在含有20μM半胱氨酸的M9琼脂培养基(Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Third Edition)，Cold Sprjng Harbor Laboratory Press)和含有20μM S-磺酸半胱氨酸(cat#C2196，SIGMA)的M9琼脂培养基上分别用牙签接种突变株，筛选出在含有半胱氨酸的培养基上可以生长繁育但在含有S-磺酸半胱氨酸的培养基上不能生长繁育的突变株。从约1000个菌林中，获得了1株突变株。对插入的Tn5的基因组区域进行鉴定，结果可知在ydjN基因中插入了Tn5。 
(1-4)ydjN基因缺损株的S-磺酸半胱氨酸同化能力的解析 
为了确认插入Tn5的突变株的表型是否是因为ydjN基因的功能缺损，利用上述的Red驱动整合由MG1655ΔcysE菌株构建了ydjN基因的缺损株。此时使用引物DydjN(Ec)-F(cactatgact gctacgcagt gatagaaata ataagatcag gagaacgggg tgaagcctgc ttttttatac taagttggca：SEQ ID NO：52)、DydjN(Ec)-R(aaagtaaggc aacggcccct atacaaaacg gaccgttgcc agcataagaa cgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga：SEQ ID NO：53)。将构建的缺损株命名为MG1655ΔcysEΔydjN::Km菌株，利用同样的方法由MG1655获得了MG1655ΔydjN::Km菌株。 
在含有50μM半胱氨酸、50μM胱氨酸或50μM S-磺酸半胱氨酸的M9琼脂培养基(但是，在此使用等浓度MgCl2代替培养基成分中的MgSO4)上的生长繁育如表1所示。 
[表1] 
在此，没有向M9琼脂培养基中添加硫源(M9，不含硫(w/o sulfur))，但利用微量混有的硫化物，cysE非破坏菌株能够生长繁育(MG1655菌株、MG1655ΔydjN::Km菌株等)。为此，为了研究是否可以利用S-磺酸半胱氨酸作为半胱氨酸源，需要cysE缺损的背景值。即，对于MG1655ΔcysE而言，在没有半胱氨酸源时(不含硫)不能生长繁育，在存在半胱氨酸、胱氨酸、S-磺酸半胱氨酸时能够利用它们作为半胱氨酸源生长繁育。明确了ydjN缺损株能够以半胱氨酸、胱氨酸作为半胱氨酸源生长繁育，但不能以S-磺酸半胱氨酸作为半胱氨酸源生长繁育(表1：MG1655ΔcysEΔydjN::Km菌株)。由此可知，ydjN为S-磺酸半胱氨酸同化所必须的基因。另一方面，即使缺损了ydjN，细菌仍然能够同化半胱氨酸和胱氨酸。 
(2)ydjN、fliY的功能解析 
(2-1)从大肠杆菌MG1655菌株以及P.ananatis SC17菌株中克隆ydjN基因 
在从大肠杆菌MG1655菌株以及Pantoea ananatis SC17菌株(美国专利6596517)中克隆ydjN基因时，利用以pMIV-Pnlp8以及pMIV-Pnlp0作为基础的表达载体。这些表达载体上整合了强力的nlp8启动子(或者nlp0启动子)和rrnB终止子，通过在启动子和终止子之间通过插入目的基因，可以作为表达单元发挥功能。“Pnlp0”表示野生型nlpD基因的启动子，“Pnlp8”表示nlpD基因的突变型启动子。作为构建这些表达载体的详细情况，在实施例3中记载了pMIV-Pnlp8-YeaS7以及pMIV-Pnlp0-YeaS3的构建。pMIV-Pnlp8-yeaS7以及pMIV-Pnlp0-yeaS3是通过SalI和XbaI部位，在nlp8或nlp0启动子与rrnB终止子之间克隆了yeaS基因的载体，但ydjN基因也可以通过预先在引物上设计SalI和XbaI位点，按与yeaS同样的方式插入到该载体中。即，构建的表达质粒具有相当于将后述的pMIV-Pnlp8-yeaS7以及pMIV-Pnlp0-yeaS3中的yeaS基因替换为ydjN基因的结构的表达质粒。 
扩增大肠杆菌的ydjN基因时，以MG1655菌株基因组DNA作为模板，以ydjN(Ec)-SalIFW2(acgcgtcgac atgaactttc cattaattgc gaacatcgtg gtg：SEQ ID NO：54)、ydjN(Ec)-xbaIRV2(ctagtctaga ttaatggtgt gccagttcgg cgtcg：SEQ ID NO：55)作为引物使用，进行PCR循环(94℃5分钟后，98℃5秒、55℃5秒、72℃90秒循环30次，最后在4℃保温)。当为P.ananatis时，以SC17菌株的基因组DNA为模板，以ydjN2(Pa)-SalIFW(acgcgtcgac atggatattc ctcttacgc：SEQ ID NO：56)、ydjN2(Pa)-xbaIRV(tgctctagat tagctgtgct ctaattcac：SEQ ID NO：57)作为引物使用，进行PCR循环(94℃5分钟后，98℃5秒、55℃5秒、72℃2分钟循环30次，最后在4℃保温)。在任一引物的两端上均分别设计了SalI和XbaI位点。将各扩增片段整合到pMIV-Pnlp0载体上，构建的质粒根据其各自基因的来源(大肠杆菌(Ec)或P.ananatis(Pa))按照如下方式命名：pMIV-Pnlp0-ydjN(Ec)、pMIV-Pnlp0-ydjN(Pa)。此外，作为与它们对应的空载体(对照用)使用pMIV-5JS(特开2008-99668)。 
(2-2)ydjN的功能解析 
在ydjN缺损时，因为细菌变为不能以S-磺酸半胱氨酸作为单一半胱氨酸源生长繁育，所以可以认为ydjN基因可能编码S-磺酸半胱氨酸的转运体(摄入因子)。因此，在MG1655菌株的ydjN缺损株(上述的MG1655ΔydjN::Km 菌株)和ydjN强化菌株(用pMIV-Pnlp0-ydjN(Ec)转化的MG1655菌株)中，对于在S-磺酸半胱氨酸的摄入能力方面是否存在差别进行了研究。此外，作为与S-磺酸半胱氨酸类似的关联化合物，对胱氨酸和半胱氨酸也进行了同样的研究。 
S-磺酸半胱氨酸的摄入实验如下所述。首先，在LB液体培养基中，过夜培养MG1655ΔydjN::Km菌株和作为其对照株的MG1655菌株，以及MG1655/pMIV-Pnlp0-ydjN(Ec)菌株和其对照株的MG1655/pMIV-5JS菌株(3ml试管、37℃、振荡培养)。从培养液中回收菌体，用含有0.4％葡萄糖的M9极限培养基清洗2次之后，按照菌体浓度为原有培养液的2倍，在含有0.4％葡萄糖的M9极限培养基中悬混。将通过这样制备的各菌体，在4ml的含有0.4％葡萄糖的M9极限培养基中接种40μl，使用自动OD测定培养装置BIO-PHOTORECORDER TN-1506(ADVANTEC公司)在37℃下进行振荡培养。 
在OD为0.3左右时(培养约5小时)，添加100mM的S-磺酸半胱氨酸20μl(最终浓度0.5mM)，将添加时间点作为0小时，在其后的2小时中，按时间进程进行取样(取0.2ml培养液与0.8ml的1当量的盐酸混合)。对各时间点的样品进行氨基酸分析(日立制造氨基酸分析仪L-8900)，与同样由1当量的盐酸制备的0.4mM标准样品相比较，从而定量培养基中的S-磺酸半胱氨酸的浓度。而且，在全部的培养中，向质粒携带菌株中添加25mg/L的氯霉素。 
在图1中，显示了各菌株的培养液中S-磺酸半胱氨酸浓度的变化。图中，将MG1655/pMIV-Pn1p0-ydjN(Ec)菌株简称为MG1655/ydjN(Ec)-plasmid，将MG1655/pMIV-5JS菌株简称为MG1655/vector，将MG1655ΔydjN::Km菌株简称为MG1655delta-ydjN。野生株的培养基中的S-磺酸半胱氨酸浓度缓慢地不断减少，但对于ydjN缺损株而言，S-磺酸半胱氨酸完全没有减少，此外，已知了ydjN强化株与对照株相比S-磺酸半胱氨酸的减少更快。此外，根据膜蛋白质预测程序SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)的解析结果，由于在YdjN中发现了10个跨膜区域，因此推测其为膜蛋白质。由此表明，ydjN编码S-磺酸半胱氨酸的转运体(摄入因子)的可能性较大。此外，由于ydjN的缺损使得无法同化S-磺酸半胱氨酸(表1)，因此可以认为ydjN为大肠杆菌中唯一的S-磺酸半胱氨酸转运体。 
此外，添加胱氨酸或半胱氨酸代替S-磺酸半胱氨酸作为基质，在同样的实验体系中对通过YdjN对胱氨酸和半胱氨酸的摄入进行了研究。结果如图2、3所示。图中，菌株名称与图1相同。 
如图2所示，以胱氨酸为基质时，得到了与S-磺酸半胱氨酸相同的结果，表明YdjN具有胱氨酸摄入活性。ydjN缺损株的胱氨酸摄入大幅地降低，由于残留的胱氨酸摄入活性非常少，因此可以认为YdjN在大肠杆菌MG1655菌株中核心胱氨酸转运体。但是，因为ydjN缺损株也可以以胱氨酸作为半胱氨酸源生长繁育(表1)，所以可以认为至少还存在ydjN之外的具有活性的胱氨酸转运体。另一方面，如图3所示，可知在以半胱氨酸为基质时，即使在强化了ydjN时，也不能促进摄入，由此可以认为ydjN可能与半胱氨酸的摄入无关。 
此外，将表达P.ananatis来源的ydjN的质粒pMIV-Pnlp0-ydjN(Pa)导入大肠杆菌和P.ananatis中，对强化了ydjN时的S-磺酸半胱氨酸的摄入进行了研究。结果如图4所示。图中，将pMIV-Pnlp0-ydjN(Pa)简称为ydjN(Pa)-plasmid、将pMIV-5JS简称为vector。 
确认了P.ananatis的YdjN也与大肠杆菌来源的YdjN同样，具有S-磺酸半胱氨酸摄入活性。此外，P.ananatis的YdjN与大肠杆菌的YdjN的氨基酸序列具有80％的同源性。 
(2-3)fliY的功能解析 
下面，为了研究fliY是否与胱氨酸以及半胱氨酸的摄入相关，首先进行了该基因缺损株和强化株的构建。 
fliY基因的缺失通过上述的Red驱动整合和λ噬菌体来源的切出系统进行。使用DfliY(Ec)-FW(atgaaattag cacatctggg acgtcaggca ttgatgggtg tgatggccgt tgaagcctgc ttttttatac taagttggca；SEQ ID NO：58)、以及DflY(Ec)-RV(ttatttggtc acatcagcac caaaccattt ttcggaaagg gcttgcagag cgctcaagtt agtataaaa agctgaacga；SEQ ID NO：59)作为引物，使用pMW118-(λattL-CmR-λattR)(Katashkina ZhI et al.Mol Biol(Mosk).39(5)：823-31.2005)作为模板。由MG1655菌株获得MG1655ΔfliY菌株，由上述MG1655ΔydjN::Km株获得MG1655ΔydjN::KmΔfliY::Cm菌株。 
另一方面，为了使用质粒来强化fliY基因，构建了pMIV-Pnlp0-fliY(Ec)。构建方法为与上述的将ydjN基因克隆到pMIV-Pnlp0中的方法相同，但在此为了扩增fliY基因，使用fliY(Ec)SalI-F(acgcgtcgac atgaaattag cacatctgggacg；SEQ ID NO：60)、fliY(Ec)XbaI-R(ctagtctaga ttatttggtc acatcagcac c；SEQ IDNO：61)作为引物。 
首先，为了研究fliY缺损对胱氨酸摄入产生的效果，使用MG1655菌株、MG1655ΔydjN∷Km菌株、MG1655ΔfliY菌株、MG1655ΔydjN∷KmΔfliY∷Cm菌株这4株菌株，以胱氨酸为基质进行了摄入实验。结果如图5所示。图中，“WT”表示MG1655菌株，“delta-ydjN”表示MG1655ΔydjN∷Km菌株，“delta fliY”表示MG1655ΔfliY菌株，“delta-ydjN，fliY”表示MG1655ΔydjN∷KmΔfliY∷Cm。其结果为，单独缺损fliY基因的菌株MG1655ΔfliY菌株，与MG1655菌株相比，胱氨酸的摄入速度没有变化(图5)。此外，虽然fliY、ydjN基因的双重缺损株MG1655ΔydjNΔfliY菌株，与ydjN单独缺损株MG1655ΔydjN株相比，观察到其胱氨酸的摄入速度有所降低，但其差异非常小，因此，无法确认fliY的缺损是否具有显著差异(图5)。 
另外，对于大肠杆菌MG1655菌株的fliY强化株，也研究了胱氨酸的摄入。结果如图6所示。图中，“fliY(Ec)-plasmid”表示pMIV-Pnlp0-fliY(Ec)，“vector”表示pMIV-5JS。在强化了fliY时，也没有发现具有胱氨酸的摄入显著差异(图6)。 
尽管有表明fliY具有与胱氨酸的摄入相关的可能性的文献(Butler et al.，Life Sci.52.1209-1215(1993)等)，但没有发现直接实验的证明。实际上，本实验也没有得到显示FliY与胱氨酸的摄入相关的结果。因此，从本实验的结果可知，即使假设fliY与胱氨酸的摄入相关，也可以预测其不是像ydjN这样活性高的转运体。而且，因为ydjN和fliY的双重缺损可以以胱氨酸为唯一的半胱氨酸源生长繁育，所以可以认为除该2种以外还存在其他的胱氨酸转运体。此外，研究了fliY缺损株的半胱氨酸摄入活性，但同样地与非缺损株相比，并没有发现如ydjN时发现的显著差异，可以认为FliY与半胱氨酸的摄入不相关(图7)。另一方面，由于培养基中的半胱氨酸缓慢地减少(图7)，因此预想半胱氨酸被摄入到细胞内，推测在大肠杆菌中存在某种半胱氨酸转运体(摄入系统)。 
(实施例2)通过缺损了ydjN和/或fliY的大肠杆菌生产半胱氨酸 
(1)大肠杆菌半胱氨酸生产菌株的构建 
为了给予ydjN和/或fliY缺损了的大肠杆菌半胱氨酸生产能力，构建了含有编码使L-半胱氨酸反馈抑制降低的突变型丝氨酸乙酰转移酶的突变型cysE(US20050112731(A1))的质粒。具体来说，首先，在特开2005-137369(US20050124049(A1)、EP1528108(A1))中记载的pACYC-DES构建方法中，将搭载编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA5基因(美国专利第6,180,373号中所记载)的步骤省略，从而构建了质粒pACYC-DE1。相对于在pACYC-DES上搭载了上述突变型serA5、编码受反馈抑制的突变型SAT基因的cysEX基因以及编码半胱氨酸、乙酰丝氨酸分泌因子的ydeD基因(US5972663A)，在pACYC-DE1上不含有上述serA5，但搭载了cysEX以及ydeD。各基因的表达均使用了ompA启动子。 
接下来，用MnuI酶切pACYC-DE1并进行自连接，构建了使ydeD基因的ORF内侧约330bp缺损的质粒。将通过这样的方法得到的，不表达作为半胱氨酸分泌因子发挥功能的YdeD，而仅搭载了cysEX的质粒命名为pACYC-E1，在下面的实验中使用。将该pACYC-E1转化到大肠杆菌MG1655、MG1655ΔfliY、MG1655ΔfliY∷Km、MG1655ΔydjN∷Km、MG1655ΔfliYΔydjN∷Km这5株菌株中，给予各自菌株半胱氨酸生产能力。 
(2)大肠杆菌中ydjN缺损、fliY缺损对半胱氨酸生产产生的效果的研究 
为了研究ydjN、fliY基因缺损对半胱氨酸以及半胱氨酸关联化合物的发酵生产产生的效果，进行下述半胱氨酸生产菌的发酵生产培养，所述半胱氨酸生产菌为在MG1655和由其诱导的ydjN与fliY的分别缺损株、以及双重缺损株中导入了pACYC-E1而得到的半胱氨酸生产菌，比较半胱氨酸以及半胱氨酸关联化合物的生产量。在培养中使用了下述组成的大肠杆菌半胱氨酸生产培养基。 
成分1： 
(大肠杆菌半胱氨酸生产培养基)(各成分的浓度为最终浓度) 
成分1： 
(NH4)2SO4         15g/L 
KH2PO4            1.5g/L 
MgSO4·7H2O       1g/L 
胰蛋白胨          10g/L 
酵母提取物        5g/L 
NaCl                      10g/L 
L-组氨酸盐酸盐一水合物    135mg/L 
L-甲硫氨酸                300mg/L 
成分2： 
葡萄糖                    40g/L 
成分3： 
硫代硫酸钠                7g/L 
成分4： 
吡哆醇盐酸盐              2mg/L 
成分5： 
碳酸钙                    20g/L 
各成分分别按照100/47.5倍(成分1)、100/47.5倍(成分2)、50倍(成分3)、1000倍(成分4)的浓度制成保存溶液，在使用时混合并用灭菌水补充至规定的量，从而制备成最终浓度。通过在110℃下30分钟高压灭菌(成分1、2)、在180℃下5小时以上干热灭菌(成分5)以及过滤灭菌(成分3、4)进行灭菌。 
半胱氨酸生产培养按照下述规程进行。将各生产菌在LB琼脂培养基上涂开，在37℃下进行过夜预培养，之后用10μL大小的接种环(NUNC公司Blueloop)从平板上2次挑取约7cm范围的菌体，并按照培养开始时刻的菌体量基本相同的方式接种到已经放入大试管(内径23mm、长度20cm)的2ml上述大肠杆菌半胱氨酸生产培养基中。在32℃下进行振荡培养，40小时后结束培养。按照Gaitonde，M.K.(Biochem J.1967 Aug；104(2)：627-33.)所述的方法对培养基中生产的半胱氨酸进行定量。而且，在此定量的半胱氨酸除半胱氨酸之外，还包含胱氨酸或它们的衍生物，例如S-硫代半胱氨酸、噻唑烷衍生物或者硫代半酮缩醇或它们的混合物，以下如果没有特殊限制，通过本方法定量的半胱氨酸均为上述含义。这样定量的半胱氨酸以及其他化合物，有时也记为L-半胱氨酸关联化合物。各菌株均进行了6组平行实验，此时的各平均值和标准偏差如表2所示。 
[表2] 
  菌株   基因型   半胱氨酸关联  化合物(g/L)
  MG1655/pACYC-E1   野生型   0.056±0.0055
  MG1655ΔfliY/pACYC-E1   ΔfliY   0.062±0.0214
  MG1655ΔfliY∷Km/pACYC-E1   ΔfliY(∷KmR)   0.082±0.0172
  MG1655ΔydjN∷Km/pACYC-E1   ΔydjN(∷KmR)   0.124±0.0113
  MG1655ΔfliYΔydjN∷Km/pACYC-E1   ΔfliYΔydjN(∷KmR)   0.273±0.0381
如表2所示的一样，可知fliY缺损、ydjN缺损均具有增加半胱氨酸关联化合物的积累的效果。此外，可知fliY、ydjN的双重缺损与各自单独地缺损相比较，特别地具有使半胱氨酸关联化合物增加的协同效果。 
(实施例3)ydjN和/或fliY缺损的P.ananatis的半胱氨酸生产 
(1)P.ananatis半胱氨酸生产菌EYPS1976(s)菌株的制作 
P.ananatis的半胱氨酸生产菌是按照下述方法构建的：导入了编码突变型丝氨酸乙酰转移酶的cysE5(美国专利申请公开第20050112731号)以及编码突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的serA348(J.Biol.Chem.，1996，271(38)：23235-8)，且强化了编码各种氨基酸的分泌因子的yeaS(JP2000189180(A)以及编码硫源摄入因子的cysPTWA簇。下面，对构建方法进行详细的描述。 
(1-1)向P.ananatis SC17菌株中导入CysE5、YeaS 
首先，构建了用于构建上述菌株的质粒。其方法如下所示。 
以大肠杆菌MG1655(ATCC No.47076)的染色体DNA为模板，使用P1(agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac：SEQ ID NO：30)、以及P2(agctgagcat gcttccaact gcgctaatga cgc：SEQ ID NO：31)作为引物，通过PCR获得了含有nlpD基因启动子区域(Pnlp0)约300bp的DNA片段。在上述引物的5’末端、3’末端分别设计了限制性内切酶SalI以及PaeI的位点。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、55℃20秒、72℃15秒循环25次，最后72℃、5分钟。用SalI以及PaeI处理得到的片段，并将其插入到pMIV-5JS(特开2008-99668)的SalI-PaeI位点中，得到pMIV-Pnlp0质粒。在该质粒pMIV-Pnlp0中插入的Pnlp0启动子的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID NO：27所示。 
随后，以MG1655的染色体DNA为模板，使用P3(agctgatcta gaaaacagaa tttgcctggc ggc：SEQ ID NO：32)和P4(agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc：SEQ ID NO：33)作为引物，通过PCR获得了含有rrnB基因的终止子区域约300bp的DNA片段。在上述引物的5’末端分别设计了限制性内切酶XbaI以及BamHI的位点。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、59℃20秒、72℃15秒循环25次，最后在72℃下5分钟。用XbaI以及BamHI处理得到的片段，并将其插入到pMIV-Pnlp0的XbaI-BamHI位点处从而得到pMIV-Pnlp0-ter质粒。 
接下来，以MG1655的染色体DNA为模板，使用P5(agctgagtcgacgtgttcgc tgaatacggg gt：SEQ ID NO：34)以及P6(agctgatcta gagaaagcatcaggattgca gc：SEQ ID NO：35)作为引物，通过PCR获得了含有yeaS基因的约700bp的DNA片段。在上述引物的5’末端分别设计了限制性内切酶SalI以及XbaI的位点。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、55℃20秒、72℃15秒循环25次，最后在72℃下5分钟。用SalI以及XbaI处理得到的片段，并将其插入到pMIV-Pnlp0-ter的SalI-XbaI位点处从而得到pMIV-Pnlp0-YeaS3质粒。由此，在pMIV-5JS载体上，构建了按照nlpD启动子、yeaS基因以及rrnB终止子的顺序连接的yeaS的表达单元。 
为了通过修饰nlpD启动子的-10区域来得到更强的启动子，采用下述方法进行了-10区域的随机化。在nlpD启动子区域(图8)中存在两个推测为起启动子功能的区域，在图中分别由pnlp1和pnlp2表示。以质粒pMIV-Pnlp0为模板，使用P1以及P7(atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatnangtcactgg(“n-”表示可以为a，t，g，c中的任意一种)，SEQ ID NO：36)作为引物，通过PCR获得了将包含于nlpD启动子的3’末端侧的-10区域(记为-10(Pnlp1))随机化而得的DNA片段。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃15秒循环25次，最后在72℃下5分钟。 
另一方面，同样地以质粒pMIV-Pnlp0为模板，使用P2以及P8(tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg cg(“n-”表示可以为a，t，g，c中的任意一种)，SEQ ID NO：37)作为引物，通过PCR获得了将包含于nlpD启动子的5’末端侧的-10区域(记为-10(Pnlp2))随机化而得的DNA片段。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃15秒循环25次，最后在72℃下5分钟。 
可以通过在引物P7和P8上设计的BglII位点将得到的3’末端侧和5’末端侧的片段连接，从而构建2个-10领域被随机化的完整nlpD启动子。以该片段为模板，使用P1以及P2作为引物，通过PCR获得了修饰型完整nlpD启动子的DNA片段。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃15秒循环12次，最后在72℃下5分钟。 
用在引物的5’末端上设计的限制性内切酶SalI以及PaeI处理扩增的片段，并通过将其插入到同样地用SalI以及PaeI处理的质粒pMIV-Pnlp0-YeaS3中，将质粒上的野生型nlpD启动子部位(Pnlp0)替换成突变型Pnlp。从其中选择了具有如SEQ ID NO：28所示的启动子序列(Pnlp8)的质粒，并将其命名为pMIV-Pnlp8-YeaS7。(插入在该质粒中的Pnlp8启动子的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID NO：28所示)。同样地，将含有突变的nlpD启动子区域的DNA片段插入到用SalI以及PaeI处理了的质粒pMIV-Pnlp0-ter上，从而将该质粒上的nlpD启动子部位(Pnlp0的部分)替换为突变型Pnlp。将其中的一个质粒命名为pMIV-Pnlp23-ter。该质粒中插入的Pnlp23启动子的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID NO：29所示。 
随后，从pMW-Pomp-cysE5(WO2005007841)中，用PaeI、SacI将Pomp-cysE5盒(cassette)的部分切出，插入到pMIV-5JS的相同位点处，从而构建了pMIV-Pomp-CysE5。pMW-Pomp-cysE5为将连接有ompC基因启动子的编码突变型SAT的基因cysE5插入到pMW118中而得到的质粒。从pACYC184(GenBank/EMBL登录号X06403、可从NIIPONGENE公司获得)上，用XbaI、Eco88I将四环素抗性基因切出，将该基因片段通过克列诺片段(Klenow fragment)处理后，插入到pMIV-Pomp-CysE5的PvuI位点处，从而构建了pMT-Pomp-CysE5。接下来，用HindIII酶切pMIV-Pnlp8-YeaS7，并通过克列诺片段进行平滑末端化后，用NcoI进行酶切，将含有Pnlp8-YeaS-rrnB终止子的盒和氯霉素抗性标记的片段切出。将该片段和，同样以pMIV-5JS为骨架(backbone)的pMT-Pomp-CysE5的SmaI、NcoI酶切片段分别连接，从而构建了pMT-EY2。pMT-EY2为在一个质粒上具有Pnlp8-YeaS-rrnB终止子盒和Pomp-CysE5盒的质粒。 
上述的pMT-EY2具备来源于pMIV-5JS(特开2008-99668)的Mu噬菌体附着位点(attachment site)。由于该质粒和具有Mu转座酶(Mu transposase)的 辅助质粒pMH10(Zimenkov D.et al.，Biotechnologiya(俄语)，6，1-22(2004))可以在同一细胞内共存，因此可以将该质粒pMT-EY2上以被Mu噬菌体的附着位点夹持的形式存在的含有氯霉素抗性标记的PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB terminator(终止子)盒，插入到P.ananatisSC17(美国专利6596517)菌株的染色体上。而且，由于在质粒pMT-EY2上存在的氯霉素抗性标记具有夹在2个λ噬菌体的辅助位点(λattR和λattL)之间的结构，因此通过后述的方法可以将氯霉素抗性标记除去。 
首先，将通过电穿孔向SC17菌株中导入了pMH10而得到的菌株，在含有20mg/L卡那霉素的LB琼脂培养基上，在30℃下过夜培养来进行了选择。将得到的转化菌株在30℃下培养，并进一步通过电穿孔向该菌株中导入pMT-EY2。将用pMH10和pMT-EY2这两者转化的菌株，在42℃，20分钟的条件下进行热击，然后在含有20mg/L氯霉素的LB琼脂培养基上选择氯霉素抗性菌株的菌落。此时培养温度为39℃。通过上述方法，获得约50个克隆，通过分别在LB琼脂培养基上在39℃下培养48小时，进行pMH10以及pMT-EY2的消除(curing)。获得了因在染色体上插入了盒而显示出氯霉素抗性，且消除了两个质粒后的结果是对卡那霉素以及氨苄青霉素显示敏感性的菌株。随后，以该菌株的染色体DNA为模板，使用P1和P6作为引物，通过PCR确认了得到的菌株的染色体上目的盒的插入。得到的完整克隆分别命名为EY01～EY50，并按照下述方法进行EY01～EY50的L-半胱氨酸生产培养。结果，筛选出L-半胱氨酸生产量最多的克隆EY19菌株。 
在培养中使用了L-半胱氨酸生产培养基(组成：15g/L硫酸铵，1.5g/L磷酸二氢钾，1g/L硫酸镁七水合物，0.1g/L胰蛋白质胨，0.05g/L酵母提取物，0.1g/L氯化钠，20g/L碳酸钙，40g/L葡萄糖，20mg/L四环素)。 
L-半胱氨酸生产培养按照下述规程进行。将SC17/pMT-PompCysE5菌株和SC17/pMT-EY2菌株在LB琼脂培养基上涂开，在34℃下进行过夜预培养，之后用接种环挑取平板的八分之一的菌体，并接种到已经放入大试管(内径23mm、长度20cm)的2mL的L-半胱氨酸培养基中，在220-230rpm下在32℃下进行振动培养，2天后结束培养。 
通过来源于λ噬菌体的切出系统除去EY19菌株中导入的氯霉素抗性标记。具体来说，用携带了λ噬菌体的Int-Xis基因的pMT-Int-Xis2(WO2005/010175)转化EY19菌株，从得到的转化菌株中获得了显示氯霉素敏感性的 EY19(s)菌株。通过λ噬菌体来源的切出系统除去标记的实例在JP2005058227A和WO2007/119880A1等中有详细的描述。 
(1-2)由EY19(s)菌株制作cysPTWA基因表达强化菌株 
接下来，为了强化cysPTWA基因的表达，将染色体上的在cysPTWA基因簇上游存在的启动子，替换为上述的强启动子Pnlp8。首先以pMIV-Pnlp8-YeaS7为模板，使用P1以及P2通过PCR获得含有nlp8启动子约300bp的DNA片段。PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、59℃20秒、72℃15秒循环20次，最后在72℃下5分钟。 
将扩增得到的含有nlp8启动子的DNA片段利用克列诺片段处理后插入到用XbaI酶切后通过克列诺片段处理的质粒pMW118-(λatt L-KmR-λattR)(WO2006/093322A2)上，从而得到了质粒pMW-Km-Pnlp8。将pMW-Km-Pnlp8作为模板使用，并使用引物P9(tccgctcacg atttttttca tcgctggtaaggtcatttat cccccaggaa aaattggtta，SEQ ID NO：38)以及P10(tttcacaccg ctcaaccgcagggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg，SEQ ID NO：39)进行PCR，扩增得到含有Km-Pnlp8盒的约1.6kb的DNA片段。此时的PCR循环如下所述：95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、54℃20秒、72℃90秒循环30次，最后在72℃下5分钟。在两个引物上设计有用于通过λ依赖整合(被称为“Red驱动整合”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，p6640-6645))插入目的片段的作为染色体上的靶标的序列(这种情况下为cysPTWA启动子附近的序列)。因此，在将得到的DNA片段通过该λ依赖整合插入到目的菌株中时，在染色体上的cysPTWA基因的邻近前方插入了Km-Pnlp8，从而形成了在nlp8启动子上连接了cysPTWA基因的结构。在SEQ ID NO：19中显示了cysPTWA基因簇的碱基序列，在SEQ ID NO：20～22中显示了cysP、cysT、cysW各基因编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：23、24分别显示了cysA基因的碱基序列，以及该基因编码的氨基酸序列。 
P.ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER菌株是用于使λ依赖整合效果更好地进行的宿主菌株，该菌株中导入了在对λRed基因产物具有抗性的P.ananatis菌株SC17(0)菌株中表达λ的gam、bet以及exo各基因(以下称为“λRed基 因”)的辅助质粒RSF-Red-TER(WO2008/075483)。该质粒RSF-Red-TER的构建方法在WO2008/075483中有详细地记载。 
在添加用于诱导λRed基因的表达的IPTG的条件下培养上述SC17(0)/RSF-Red-TER菌株，制备了电穿孔用的细胞。通过电穿孔向这些细胞中导入了上述的目的DNA片段，以卡那霉素抗性为指标，获得了通过λ依赖整合而在cysPTWA基因上游插入了nlp8启动子的重组菌株。以获得的菌株的染色体DNA为模板，使用P11(ctttgtccct ttagtgaagg，SEQ IDNO：40)和P12(agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac，SEQ IDNO：41)作为引物，通过PCR反应，确认形成了目标的Km-Pnlp8-cysPTWA结构，并将该菌株命名为SC17(0)-Pnlp8-PTWA菌株。 
接下来，纯化SC17(0)-Pnlp8-PTWA菌株的染色体DNA，将10μg该染色体DNA通过电穿孔法导入到EY19(s)菌株中，获得卡那霉素抗性菌株。以得到的菌株的染色体DNA为模板，使用P11、P12作为引物利用PCR进行扩增，从而确认了在EY19(s)菌株的染色体上导入了Km-Pnlp8-cysPTWA结构。将通过上述方法获得的菌株命名为EYP197菌株。进一步，使用上述的pMT-Int-Xis2，将卡那霉素抗性标记从染色体上除去，将变为卡那霉素敏感性的菌株命名为EYP197(s)菌株。 
(1-3)由EYP197(s)菌株制作携带了突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA348)基因的菌株 
通过下述的方法构建了serA348基因，该基因编码来源于Pantoeaananatis的3-磷酸甘油酸脱氢酶作为向半胱氨酸生产菌导入的3-磷酸甘油酸脱氢酶，且其编码的是用丙氨酸取代了第348位的天冬酰胺残基的突变型酶(N348A)(J.Biol.Chem.1996；271(38)：23235-8)。 
Pantoea ananatis来源的野生型serA基因的序列如SEQ ID NO：17所示、氨基酸的序列如SEQ ID NO：18所示。为了得到导入了上述突变的serA基因的3’侧的DNA片段，进行下述操作，以SC17菌株染色体DNA为模板，使用P13(agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactg gaa，SEQ ID NO：42)和P14(gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc，SEQ ID NO：43)作为引物进行PCR(95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃60秒循环25次，最后在72℃下5分钟)。接下来，为了同样地获得导入了突变的5’侧的DNA片段，以SC17菌株染色体DNA 为模板，使用P15(agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg，SEQ ID NO：44)和16(aaaaccgccc gggcgttctc ac，SEQ ID NO：45)作为引物进行PCR(95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃20秒循环20次，最后在72℃下5分钟)。通过限制性内切酶SmaI处理得到的两个PCR片段之后，通过DNA连接酶进行连接，得到含有目的突变(N348A)的突变型serA基因全长的DNA片段。以该DNA片段为模板，使用P13和P15作为引物，进行PCR扩增(95℃3分钟后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒循环2次，94℃20秒、60℃20秒、72℃75秒循环15次，最后在72℃下5分钟)。利用SalI、XbaI处理在P13和P15引物上设计的SalI、XbaI限制性内切酶位点之后，将其插入到同样用SalI、XbaI处理的pMIV-Pnlp8-ter中，制得pMIV-Pnlp8-serA348。 
构建的pMIV-Pnlp8-serA348上携带了来源于pMIV-5JS(特开2008-99668)的Mu附着位点。如果使用该质粒，则如上所述，通过使用具有Mu转座酶的辅助质粒pMH10，可以将含有氯霉素抗性标记的Pnlp8-serA348-rrnB terminator盒插入到P.ananatis SC17菌株的染色体上。在SC17(0)菌株中导入了质粒pMIV-Pnlp8-serA348以及pMH10，获得了在染色体上插入了Pnlp8-serA348-rrnB terminator盒的菌株。使用引物P1、P15，通过PCR反应确认了目的盒存在于细胞中。针对得到的50个克隆，测定细胞提取液中的3-磷酸甘油酸脱氢酶的活性，选择出活性最高的菌株，将其命名为SC17int-serA348菌株。接下来，将10μg的SC17int-serA348株的染色体DNA通过电穿孔导入到EYP197(s)菌株中，获得了氯霉素抗性菌株，使用引物P1、P15，通过PCR反应确认了在EYP197(s)菌株的染色体上与氯霉素抗性标记一起导入了Pnlp8-serA348的结构。将这样得到的菌株命名为EYPS1976菌株。通过上述的利用pMT-Int-Xis2的标记清楚方法，将氯霉素抗性标记除去，将获得的氯霉素敏感性菌株命名为EYPS1976(s)。 
(2)ydjN以及/或fliY缺损了的半胱氨酸生产菌的构建 
由EYPS1976(s)菌株出发构建ydjN以及/或fliY缺损的菌株。ydjN基因缺损株和fliY区域缺损株的制作，以上述的P.ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER菌株作为宿主菌通过λ依赖整合进行。 
在fliY基因的下游有yecS基因(碱基序列：SEQ ID NO：11、氨基酸序列：SEQ ID NO：12)和yecC基因(碱基序列：SEQ ID NO：13、氨基酸序列SEQ ID NO：14)，它们具有形成操纵子并作为ABC转运体发挥功能的可能性(在网络上公开的数据库(http://ecocyc.org/)中，登载了yecS、yecC具有形成一个转录单元的可能性的信息)。因此，fliY缺损是将上述3个基因全部(fliY周边区域)缺损。 
为了获得ydjN基因缺损株的DNA片段，使用了引物DydjN(Pa)-F(acctctgctg ctctcctgac cagggaatgc tgcattacat cggagttgct tgaagcctgcttttttatac taagttggca：SEQ ID NO：46)和引物DydjN(Pa)-R(agacaaaaacagagagaaag acctggcggt gtacgccagg tctggcgtga cgctcaagtt agtataaaaaagctgaacga：SEQ ID NO：47)，为了获得fliY区域缺损株的DNA片段，使用了引物DfliY-FW(atggctttct cacagattcg tcgccaggtg gtgacgggaa tgatggcggttgaagcctgc ttttttatac taagttggca：SEQ ID NO：48)和引物DyecC-RV(ttacgccgccaacttctggc ggcaccgggt ttattgatta agaaatttat cgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga：SEQID NO：49)。此外，作为模板使用了上述的pMW118-(λattL-Kmr-λattR)(WO2006/093322A2)，进行(94℃5分钟后，94℃30秒、55℃30秒、72℃2分钟30秒循环30次)的PCR反应，获得了在各自的用于重组的同源序列之间插入Kmr的DNA片段。 
将得到各DNA片段利用电穿孔法导入到P.ananatisSC17(0)/RSF-Red-TER菌株中，分别构建了SC17(0)ΔydjN∷Km菌株(在ydjN基因区域上插入λattL-Kmr-λattR片段)和SC17(0)ΔfliY∷Km菌株(fliY基因区域上插入λattL-Kmr-λattR片段)。接下来，使用由SC17(0)ΔydjN∷Km菌株和SC17(0)ΔfliY∷Km菌株制备的染色体DNA转化EYPS1976(s)菌株，从而由EYPS1976(s)菌株出发获得了各自的基因缺损株EYPSΔydjN∷Km菌株和EYPSΔfliY∷Km菌株。另外，向EYPSΔfliY∷Km菌株导入上述的pMT-Int-Xis2(WO2005/010175)，通过λ噬菌体来源的切出系统将卡那霉素抗性基因切出，从而获得显示卡那霉素敏感性的EYPSΔfliY菌株。接下来，向EYPSΔfliY菌株中转化了由SC17(0)ΔydjN∷Km菌株制备的染色体DNA，从而获得双重缺损株EYPSΔfliYΔydjN∷Km菌株。这样地，构建了以半胱氨酸生产菌EYPS1976(s)菌株为基础的ydjN基因缺损株、fliY区域缺损株、以及它们的双重缺损株。 
(3)研究在P.ananatis中ydjN缺损、fliY缺损对半胱氨酸生产产生的效果 
进行如上所述得到的ydjN基因缺损株、fliY区域缺损株以及它们的双重缺损株的发酵生产培养，比较了半胱氨酸关联化合物的生产量。在培养中使用了下述组成的P.ananatis半胱氨酸生产培养基。 
(P.ananatis半胱氨酸生产培养基)(各成分的浓度为最终浓度) 
成分1： 
(NH4)2SO4                 15g/L 
KH2PO4                    1.5g/L 
MgSO4·7H2O               1g/L 
硫胺盐酸盐                0.1mg/L 
成分2： 
FeSO4·7H2O               1.7mg/L 
Na2MoO4·2H2O             0.15mg/L 
CoCl2·6H2O               0.7mg/L 
MnCl·4H2O                1.6mg/L 
ZnSO4·7H2O               0.3mg/L 
CuSO4·5H2O               0.25mg/L 
成分3： 
胰蛋白胨                  0.6g/L 
酵母提取物                0.3g/L 
NaCl 0.6g/L 
成分4： 
碳酸钙                    20g/L 
成分5： 
L-组氨酸盐酸盐一水合物    135mg/L 
成分6： 
硫代硫酸钠                6g/L 
成分7： 
吡哆醇盐酸盐              2mg/L 
成分8： 
葡萄糖                    40g/L 
对于各成分，分别按照10倍(成分1)、1000倍(成分2)、100/6倍(成分3)、100倍(成分5)、350/6倍(成分6)、1000倍(成分7)以及10倍(成分8)的浓度制成保存溶液，在使用时混合并用灭菌水调整为规定的量，从而制备成最终浓度。通过在110℃下30分钟高压灭菌(成分1、2、3、5、8)，在180℃下5小时以上干热灭菌(成分4)、以及过滤灭菌(成分6、7)进行灭菌。 
半胱氨酸生产培养按照下述规程进行。将各生产菌在LB琼脂培养基上涂开，在34℃下进行过夜预培养，之后用10μL大小的接种环(NUNC公司Blueloop)从平板上2次挑取约7cm范围的菌体，并按照培养开始时刻的菌体量基本相同的方式接种到已经放入大试管(内径23mm、长度20cm)的2ml上述P.ananatis半胱氨酸生产培养基中。 
在32℃下进行振荡培养，43小时后结束培养。确认了此时培养基中的葡萄糖被完全消耗。按照Gaitonde，M.K.(Biochem J.1967 Aug；104(2)：627-33.)中记载的方法对培养基中生产的半胱氨酸关联化合物进行定量。各菌株均进行了6组平行实验，此时的各平均值和标准偏差如表3所示。在fliY单独缺损中没有发现半胱氨酸关联化合物的增加，在ydjN单独缺损中半胱氨酸关联化合物稍微增加。此外，发现了与各自单独地缺损相比，fliY和ydjN的双重缺损的半胱氨酸关联化合物的增加明显。可知P.ananatis中ydjN缺损对半胱氨酸关联化合物的生产产生效果，此外通过组合fliY缺损可以获得协同的效果。 
[表3] 
  菌株   基因类型   半胱氨酸关联化合物  (g/L)
  EYPS1976(s)   野生型   0.80±0.031
  EYPSΔfliY   ΔfliY   0.71±0.046
  EYPSΔydjN∷Km   ΔydjN(∷KmR)   0.92±0.069
  EYPSΔfliYΔydjN∷Km   ΔfliYΔydjN(∷KmR)   1.78±0.081
(序列表说明) 
SEQ ID NO：1：大肠杆菌的ydjN基因的碱基序列 
SEQ ID NO：2：大肠杆菌的YdjN的氨基酸序列 
SEQ ID NO：3：Pantoea ananatis的ydjN基因的碱基序列 
SEQ ID NO：4：Pantoea ananatis的YdjN的氨基酸序列 
SEQ ID NO：5：大肠杆菌的fliY基因的碱基序列 
SEQ ID NO：6：大肠杆菌的FliY的氨基酸序列 
SEQ ID NO：7：Pantoea ananatis的fliY基因的碱基序列 
SEQ ID NO：8：Pantoea ananatis的FliY的氨基酸序列 
SEQ ID NO：9：大肠杆菌的cysE基因的碱基序列 
SEQ ID NO：10：大肠杆菌的cysE基因编码的SAT的氨基酸的序列 
SEQ ID NO：11：Pantoea ananatis的yecS基因的碱基序列 
SEQ ID NO：12：Pantoea ananatis的yecS基因编码的氨基酸序列 
SEQ ID NO：13：Pantoea ananatis的yecC基因的碱基序列 
SEQ ID NO：14：Pantoea ananatis的yecC基因编码的氨基酸序列 
SEQ ID NO：15：大肠杆菌的yeaS基因的碱基序列 
SEQ ID NO：16：大肠杆菌的yeaS基因编码的氨基酸序列 
SEQ ID NO：17：Pantoea ananatis的serA基因的碱基序列 
SEQ ID NO：18：Pantoea ananatis的serA基因编码的氨基酸序列 
SEQ ID NO：19：cysPTWA基因簇的碱基序列 
SEQ ID NO：20：cysP基因编码的氨基酸序列 
SEQ ID NO：21：cysT基因编码的氨基酸序列 
SEQ ID NO：22：cysW基因编码的氨基酸序列 
SEQ ID NO：23：cysA基因的碱基序列 
SEQ ID NO：24：cysA基因编码的氨基酸序列 
SEQ ID NO：25：cysM基因的碱基序列 
SEQ ID NO：26：cysM基因编码的氨基酸序列 
SEQ ID NO：27：Pnlp0的碱基序列 
SEQ ID NO：28：Pnlp8的碱基序列 
SEQ ID NO：29：Pnlp23的碱基序列 
SEQ ID NO：30～45：引物P1～P16 
SEQ ID NO：46：引物DydjN(Pa)-F的碱基序列 
SEQ ID NO：47：引物DydjN(Pa)-R的碱基序列 
SEQ ID NO：48：引物DfliY-FW的碱基序列 
SEQ ID NO：49：引物DyecC-RV的碱基序列 
SEQ ID NO：50：引物DcysE(Ec)-F 
SEQ ID NO：51：引物DcysE(Ec)-R 
SEQ ID NO：52：引物DydjN(Ec)-F 
SEQ ID NO：53：引物DydjN(Ec)-R 
SEQ ID NO：54：引物ydjN(Ec)-SalIFW2 
SEQ ID NO：55：引物ydjN(Ec)-xbaIRV2 
SEQ ID NO：56：引物ydjN2(Pa)-SalIFW 
SEQ ID NO：57：引物ydjN2(Pa)-xbaIRV 
SEQ ID NO：58：引物DfliY(Ec)-FW 
SEQ ID NO：59：引物DfliY(Ec)-RV 
SEQ ID NO：60：引物fliY(Ec)SalI-F 
SEQ ID NO：61：引物fliY(Ec)XbaI-R 
序列表
<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)
<120>L-半胱氨酸生产菌以及L-半胱氨酸的生产方法
<130>OP-10006
<150>JP2009-059792
<151>2009-03-12
<160>61
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1392
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1392)
<400>1
atg aac ttt cca tta att gcg aac atc gtg gtg ttc gtt gta ctg ctg       48
Met Asn Phe Pro Leu Ile Ala Asn Ile Val Val Phe Val Val Leu Leu
1               5                   10                  15
ttt gcg ctg gct cag acc cgc cat aaa cag tgg agt ctg gcg aaa aaa       96
Phe Ala Leu Ala Gln Thr Arg His Lys Gln Trp Ser Leu Ala Lys Lys
            20                  25                  30
gtg ctg gtg ggt ctg gtg atg ggt gtg gtt ttt ggc ctt gcc ctg cat      144
Val Leu Val Gly Leu Val Met Gly Val Val Phe Gly Leu Ala Leu His
        35                  40                  45
acc att tat ggt tct gac agc cag gta ctt aaa gat tct gta cag tgg      192
Thr Ile Tyr Gly Ser Asp Ser Gln Val Leu Lys Asp Ser Val Gln Trp
    50                  55                  60
ttt aac atc gtt ggt aac ggc tat gtt caa ctg ctg caa atg atc gtt      240
Phe Asn Ile Val Gly Asn Gly Tyr Val Gln Leu Leu Gln Met Ile Val
65                  70                  75                  80
atg ccg tta gtc ttc gcc tct att ctg agc gcg gtt gcc cgt ctg cat      288
Met Pro Leu Val Phe Ala Ser Ile Leu Ser Ala Val Ala Arg Leu His
                85                  90                  95
aac gca tct cag tta ggc aaa atc agt ttt ctg acc atc ggt acg ctt      336
Asn Ala Ser Gln Leu Gly Lys Ile Ser Phe Leu Thr Ile Gly Thr Leu
            100                 105                 110
ttg ttt acc acg ctg att gcg gcg ctg gtc ggt gtg ctg gtc acc aac      384
Leu Phe Thr Thr Leu Ile Ala Ala Leu Val Gly Val Leu Val Thr Asn
        115                 120                 125
ctg ttt ggt ttg acg gct gaa ggt ctg gtt cag ggt ggt gca gaa act      432
Leu Phe Gly Leu Thr Ala Glu Gly Leu Val Gln Gly Gly Ala Glu Thr
    130                 135                 140
gca cgt ctg aac gcc att gaa agt aac tat gtt ggt aaa gtc tct gat      480
Ala Arg Leu Asn Ala Ile Glu Ser Asn Tyr Val Gly Lys Val Ser Asp
145                 150                 155                 160
ctg agc gtt ccg cag ctg gtc ttg tcc ttt atc ccg aaa aac ccg ttt      528
Leu Ser Val Pro Gln Leu Val Leu Ser Phe Ile Pro Lys Asn Pro Phe
                165                 170                 175
gcc gat ctt acc gga gcc aat ccg acg tca att atc agc gtg gta att      576
Ala Asp Leu Thr Gly Ala Asn Pro Thr Ser Ile Ile Ser Val Val Ile
            180                 185                 190
ttt gcc gca ttc ctc ggc gta gct gca ttg aaa ctg ctg aag gat gat      624
Phe Ala Ala Phe Leu Gly Val Ala Ala Leu Lys Leu Leu Lys Asp Asp
        195                 200                 205
gcg ccg aaa ggt gaa cgc gtc tta gcc gct atc gat acc cta caa agc      672
Ala Pro Lys Gly Glu Arg Val Leu Ala Ala Ile Asp Thr Leu Gln Ser
    210                 215                 220
tgg gtg atg aaa ctg gtt cgc ctg gtc atg cag ttg acc cct tac ggc      720
Trp Val Met Lys Leu Val Arg Leu Val Met Gln Leu Thr Pro Tyr Gly
225                 230                 235                 240
gtt ctg gct cta atg acc aaa gtg gtt gca ggt tct aac ttg caa gac      768
Val Leu Ala Leu Met Thr Lys Val Val Ala Gly Ser Asn Leu Gln Asp
                245                 250                 255
atc atc aaa ctg gga agt ttc gtt gtc gcg tcc tac ctc ggt ctg ctg      816
Ile Ile Lys Leu Gly Ser Phe Val Val Ala Ser Tyr Leu Gly Leu Leu
            260                 265                 270
att atg ttt gca gtg cat ggc att ctg ctg ggc att aat ggc gtg agt      864
Ile Met Phe Ala Val His Gly Ile Leu Leu Gly Ile Asn Gly Val Ser
        275                 280                 285
ccg ctg aag tac ttc cgt aag gta tgg cct gtg ctg acg ttt gcc ttt      912
Pro Leu Lys Tyr Phe Arg Lys Val Trp Pro Val Leu Thr Phe Ala Phe
    290                 295                 300
acc agc cgt tcc agt gct gcg tct atc cca ctg aat gtg gaa gca caa      960
Thr Ser Arg Ser Ser Ala Ala Ser Ile Pro Leu Asn Val Glu Ala Gln
305                 310                 315                 320
acg cgt cgt ctg ggc gtt cct gaa tcc atc gcc agt ttc gcc gcc tct     1008
Thr Arg Arg Leu Gly Val Pro Glu Ser Ile Ala Ser Phe Ala Ala Ser
                325                 330                 335
ttc ggt gca acc att ggt cag aac ggc tgc gcc ggt ttg tat ccg gca     1056
Phe Gly Ala Thr Ile Gly Gln Asn Gly Cys Ala Gly Leu Tyr Pro Ala
            340                 345                 350
atg ctg gcg gtg atg gtt gcg cct acg gtt ggc att aac ccg ctg gac     1104
Met Leu Ala Val Met Val Ala Pro Thr Val Gly Ile Asn Pro Leu Asp
        355                 360                 365
ccg atg tgg att gcg acg ctg gtc ggt att gtt acc gtt agt tcc gca     1152
Pro Met Trp Ile Ala Thr Leu Val Gly Ile Val Thr Val Ser Ser Ala
    370                 375                 380
ggc gtt gcc ggt gtc ggt ggt ggt gca act ttc gcc gca ctg att gta     1200
Gly Val Ala Gly ValGly Gly Gly Ala Thr Phe Ala Ala Leu Ile Val
385                 390                 395                 400
ctg cct gcg atg ggc ctg cca gta acc ctg gtg gcg ctg tta atc tcc     1248
Leu Pro Ala Met Gly Leu Pro Val Thr Leu Val Ala Leu Leu Ile Ser
                405                 410                 415
gtt gaa ccg ctt atc gac atg ggc cgt acg gcg tta aac gtt agt ggc     1296
Val Glu Pro Leu Ile Asp Met Gly Arg Thr Ala Leu Asn Val Ser Gly
            420                 425                 430
tcg atg aca gct ggc acg ctg acc agc cag tgg ctg aag caa acc gat     1344
Ser Met Thr Ala Gly Thr Leu Thr Ser Gln Trp Leu Lys Gln Thr Asp
        435                 440                 445
aaa gcc att ctg gat agc gaa gac gac gcc gaa ctg gca cac cat taa     1392
Lys Ala Ile Leu Asp Ser Glu Asp Asp Ala Glu Leu Ala His His
    450                 455                 460
<210>2
<211>463
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Asn Phe Pro Leu Ile Ala Asn Ile Val Val Phe Val Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Phe Ala Leu Ala Gln Thr Arg His Lys Gln Trp Ser Leu Ala Lys Lys
            20                  25                  30
Val Leu Val Gly Leu Val Met Gly Val Val Phe Gly Leu Ala Leu His
        35                  40                  45
Thr Ile Tyr Gly Ser Asp Ser Gln Val Leu Lys Asp Ser Val Gln Trp
    50                  55                  60
Phe Asn Ile Val Gly Asn Gly Tyr Val Gln Leu Leu Gln Met Ile Val
65                  70                  75                  80
Met Pro Leu Val Phe Ala Ser Ile Leu Ser Ala Val Ala Arg Leu His
                85                  90                  95
Asn Ala Ser Gln Leu Gly Lys Ile Ser Phe Leu Thr Ile Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Leu Phe Thr Thr Leu Ile Ala Ala Leu Val Gly Val Leu Val Thr Asn
        115                 120                 125
Leu Phe Gly Leu Thr Ala Glu Gly Leu Val Gln Gly Gly Ala Glu Thr
    130                 135                 140
Ala Arg Leu Asn Ala Ile Glu Ser Asn Tyr Val Gly Lys Val Ser Asp
145                 150                 155                 160
Leu Ser Val Pro Gln Leu Val Leu Ser Phe Ile Pro Lys Asn Pro Phe
                165                 170                 175
Ala Asp Leu Thr Gly Ala Asn Pro Thr Ser Ile Ile Ser Val Val Ile
            180                 185                 190
Phe Ala Ala Phe Leu Gly Val Ala Ala Leu Lys Leu Leu Lys Asp Asp
        195                 200                 205
Ala Pro Lys Gly Glu Arg Val Leu Ala Ala Ile Asp Thr Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Trp Val Met Lys Leu ValArg Leu Val Met Gln Leu Thr Pro Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Val Leu Ala Leu Met Thr Lys Val Val Ala Gly Ser Asn Leu Gln Asp
                245                 250                 255
Ile Ile Lys Leu Gly Ser Phe Val ValAla Ser Tyr Leu Gly Leu Leu
            260                 265                 270
Ile Met Phe Ala Val His Gly Ile Leu Leu Gly Ile Asn Gly Val Ser
        275                 280                 285
Pro Leu Lys Tyr Phe Arg Lys Val Trp Pro Val Leu Thr Phe Ala Phe
    290                 295                 300
Thr Ser Arg Ser Ser Ala Ala Ser Ile Pro Leu Asn Val Glu Ala Gln
305                 310                 315                 320
Thr Arg Arg Leu Gly Val Pro Glu Ser Ile Ala Ser Phe Ala Ala Ser
                325                 330                 335
Phe Gly Ala Thr Ile Gly Gln Asn Gly Cys Ala Gly Leu Tyr Pro Ala
            340                 345                 350
Met Leu Ala Val Met Val Ala Pro Thr Val Gly Ile Asn Pro Leu Asp
        355                 360                 365
Pro Met Trp Ile Ala Thr Leu Val Gly Ile Val Thr Val Ser Ser Ala
    370                 375                 380
Gly Val Ala Gly Val Gly Gly Gly Ala Thr Phe Ala Ala Leu Ile Val
385                 390                 395                 400
Leu Pro Ala Met Gly Leu Pro Val Thr Leu Val Ala Leu Leu Ile Ser
                405                 410                 415
Val Glu Pro Leu Ile Asp Met Gly Arg Thr Ala Leu Asn Val Ser Gly
            420                 425                 430
Ser Met Thr Ala Gly Thr Leu Thr Ser Gln Trp Leu Lys Gln Thr Asp
        435                 440                 445
Lys Ala Ile Leu Asp Ser Glu Asp Asp Ala Glu Leu Ala His His
    450                 455                 460
<210>3
<211>1392
<212>DNA
<213>Pantoea ananatis
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1392)
<400>3
atg gat att cct ctt acg ctt aac gtc gtg gca ttt gtg ctg cta ctg       48
Met Asp Ile Pro Leu Thr Leu Asn Val Val Ala Phe Val Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
ctt ttg ctg tca cgc ctt ggc cgg gca aac tgg agc ctg tcg aaa aag       96
Leu Leu Leu Ser Arg Leu Gly Arg Ala Asn Trp Ser Leu Ser Lys Lys
            20                  25                  30
gtt ctg act ggc ctg gtg ctg ggt gtg gtg ttt ggc ctc gcg ctc cag       144
Val Leu Thr Gly Leu Val Leu Gly ValVal Phe Gly Leu Ala Leu Gln
        35                  40                  45
ctg att tat ggc ggc aac agc gat atc gtt aaa gcc tct atc ggc tgg       192
Leu Ile Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Ile Val Lys Ala Ser Ile Gly Trp
    50                  55                  60
ttt aac atc gtg ggt aac ggt tat gtt cag ctg tta cag atg att gtg      240
Phe Asn Ile Val Gly Asn Gly Tyr Val Gln Leu Leu Gln Met Ile Val
65                  70                  75                  80
atg ccg ctg gtg ttc gtg tcg att ctc agc gcc gtg gcc cgc ctg cac      288
Met Pro Leu Val Phe Val Ser Ile Leu Ser Ala Val Ala Arg Leu His
                85                  90                  95
aat gcc tcc tca ctg ggg aaa atc agt ttt ctg acc atc ggc gta ctg      336
Asn Ala Ser Ser Leu Gly Lys Ile Ser Phe Leu Thr Ile Gly Val Leu
            100                 105                 110
ctg ttt aca acg gca att tct gcc ctg atc ggc gtt ttt gtc acc ggc      384
Leu Phe Thr Thr Ala Ile Ser Ala Leu Ile Gly Val Phe Val Thr Gly
        115                 120                 125
ctg ttt cac ctt aac gcg acc ggt ctg gta cag ggc gcc cag gaa acg      432
Leu Phe His Leu Asn Ala Thr Gly Leu Val Gln Gly Ala Gln Glu Thr
    130                 135                 140
gct cgc ctg agc gcg att cag agc aac tac gtt ggt aaa gtc gct gat      480
Ala Arg Leu Ser Ala Ile Gln Ser Asn Tyr Val Gly Lys Val Ala Asp
145                 150                 155                 160
ttg aca gtg cct cag tta atc ctg tca ttc att cct aaa aac ccg ttt      528
Leu Thr Val Pro Gln Leu Ile Leu Ser Phe Ile Pro Lys Asn Pro Phe
                165                 170                 175
gcc gac tta acc ggt gcc agc ccg acg tcc atc atc agc gtg gtc atc      576
Ala Asp Leu Thr Gly Ala Ser Pro Thr Ser Ile Ile Ser Val Val Ile
            180                 185                 190
ttc gcc gcg ttc ctg ggt gtg gct gcc ctg cag ttg cac aag gat gat      624
Phe Ala Ala Phe Leu Gly Val Ala Ala Leu Gln Leu His Lys Asp Asp
        195                 200                 205
gag gta aaa ggc cag cgg gta ctg acc gcc att gat acg ctg cag tcg      672
Glu Val Lys Gly Gln Arg Val Leu Thr Ala Ile Asp Thr Leu Gln Ser
    210                 215                 220
tgg gtg atg aag ctg gtt cgc ctg att atg aag ctg aca cct tat ggt      720
Trp Val Met Lys Leu Val Arg Leu Ile Met Lys Leu Thr Pro Tyr Gly
225                 230                 235                 240
gtg ctg gcg ctg atg acc aaa gtc gtt gcc ggc tcc aac gtg cag gac      768
Val Leu Ala Leu Met Thr Lys Val Val Ala Gly Ser Asn Val Gln Asp
                245                 250                 255
atc atc aag ctg ggc agc ttt gtt gtg gca tcc tat ttg ggc ctg acc      816
Ile Ile Lys Leu Gly Ser Phe Val Val Ala Ser Tyr Leu Gly Leu Thr
            260                 265                 270
ctt atg ttt gtg gtt cat gcg ctg ctc ctg tcg gtc aac ggc atc aat      864
Leu Met Phe Val Val His Ala Leu Leu Leu Ser Val Asn Gly Ile Asn
        275                 280                 285
cct atg cgc ttc ttc cgc aaa gtg tgg ccg gta ttg acc ttt gcc ttt      912
Pro Met Arg Phe Phe Arg Lys Val Trp Pro Val Leu Thr Phe Ala Phe
    290                 295                 300
acc agc cgc tcc agc gcc gcc agc att cca ctg aac gtg gag gcg caa      960
Thr Ser Arg Ser Ser Ala Ala Ser Ile Pro Leu Asn Val Glu Ala Gln
305                 310                 315                 320
acc cgc cgc ctt ggc gta cct gaa tcg att gcc agc ttc tcg gcc tca     1008
Thr Arg Arg Leu Gly Val Pro Glu Ser Ile Ala Ser Phe Ser Ala Ser
                325                 330                 335
ttt ggt gcc acc att gga cag aac ggc tgt gcc ggt ctt tat ccg acg     1056
Phe Gly Ala Thr Ile Gly Gln Asn Gly Cys Ala Gly Leu Tyr Pro Thr
            340                 345                 350
atg ctg gca gtg atg gtc gcc ccg acg gtc ggc atc aat cct ttt gat     1104
Met Leu Ala Val Met Val Ala Pro Thr Val Gly Ile Asn Pro Phe Asp
        355                 360                 365
ccg ctg tgg att gcc acg ctg gtc ggc att gtg aca ttg agt tca gca     1152
Pro Leu Trp Ile Ala Thr Leu Val Gly Ile Val Thr Leu Ser Ser Ala
    370                 375                 380
ggc gta gcc ggt gtc ggc ggc gga gcg acc ttt gcc gcg ctg atc gtc     1200
Gly Val Ala Gly Val Gly Gly Gly Ala Thr Phe Ala Ala Leu Ile Val
385                 390                 395                 400
ctg cct gcg atg ggg ctg ccg gtc acg ctg gtc gcg ctg ctg att tcc     1248
Leu Pro Ala Met Gly Leu Pro Val Thr Leu Val Ala Leu Leu Ile Ser
                405                 410                 415
att gag cct ctg att gac atg gga cga aca gcg tta aac gtc aat ggc     1296
Ile Glu Pro Leu Ile Asp Met Gly Arg Thr Ala Leu Asn Val Asn Gly
            420                 425                 430
tca atg acc gca gga tcg ctc acc agt cgc tgg ctg ggc ctg acc gat     1344
Ser Met Thr Ala Gly Ser Leu Thr Ser Arg Trp Leu Gly Leu Thr Asp
        435                 440                 445
aaa cgc gtt tta gag cgc agc gaa cac agt gaa tta gag cac agc taa     1392
Lys Arg Val Leu Glu Arg Ser Glu His Ser Glu Leu Glu His Ser
    450                 455                 460
<210>4
<211>463
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>4
Met Asp Ile Pro Leu Thr Leu Asn Val Val Ala Phe Val Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Ser Arg Leu Gly Arg Ala Asn Trp Ser Leu Ser Lys Lys
            20                  25                  30
Val Leu Thr Gly Leu Val Leu Gly Val Val Phe Gly Leu Ala Leu Gln
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Ile Val Lys Ala Ser Ile Gly Trp
    50                  55                  60
Phe Asn Ile Val Gly Asn Gly Tyr Val Gln Leu Leu Gln Met Ile Val
65                  70                  75                  80
Met Pro Leu Val Phe Val Ser Ile Leu Ser Ala Val Ala Arg Leu His
                85                  90                  95
Asn Ala Ser Ser Leu Gly Lys Ile Ser Phe Leu Thr Ile Gly Val Leu
            100                 105                 110
Leu Phe Thr Thr Ala Ile Ser Ala Leu Ile Gly Val Phe Val Thr Gly
        115                 120                 125
Leu Phe His Leu Asn Ala Thr Gly Leu Val Gln Gly Ala Gln Glu Thr
    130                 135                 140
Ala Arg Leu Ser Ala Ile Gln Ser Asn Tyr Val Gly Lys Val Ala Asp
145                 150                 155                 160
Leu Thr Val Pro Gln Leu Ile Leu Ser Phe Ile Pro Lys Asn Pro Phe
                165                 170                 175
Ala Asp Leu Thr Gly Ala Ser Pro Thr Ser Ile Ile Ser Val Val Ile
            180                 185                 190
Phe Ala Ala Phe Leu Gly Val Ala Ala Leu Gln Leu His Lys Asp Asp
        195                 200                 205
Glu Val Lys Gly Gln Arg Val Leu Thr Ala Ile Asp Thr Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Trp Val Met Lys Leu Val Arg Leu Ile Met Lys Leu Thr Pro Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Val Leu Ala Leu Met Thr Lys Val Val Ala Gly Ser Asn Val Gln Asp
                245                 250                 255
Ile Ile Lys Leu Gly Ser Phe Val Val Ala Ser Tyr Leu Gly Leu Thr
            260                 265                 270
Leu Met Phe Val Val His Ala Leu Leu Leu Ser Val Asn Gly Ile Asn
        275                 280                 285
Pro Met Arg Phe Phe Arg Lys Val Trp Pro Val Leu Thr Phe Ala Phe
    290                 295                 300
Thr Ser Arg Ser Ser Ala Ala Ser Ile Pro Leu Asn Val Glu Ala Gln
305                 310                 315                 320
Thr Arg Arg Leu Gly Val Pro Glu Ser Ile Ala Ser Phe Ser Ala Ser
                325                 330                 335
Phe Gly Ala Thr Ile Gly Gln Asn Gly Cys Ala Gly Leu Tyr Pro Thr
            340                 345                 350
Met Leu Ala Val Met Val Ala Pro Thr Val Gly Ile Asn Pro Phe Asp
        355                 360                 365
Pro Leu Trp Ile Ala Thr Leu Val Gly Ile Val Thr Leu Ser Ser Ala
    370                 375                 380
Gly Val Ala Gly Val Gly Gly Gly Ala Thr Phe Ala Ala Leu Ile Val
385                 390                 395                 400
Leu Pro Ala Met Gly Leu Pro Val Thr Leu Val Ala Leu Leu Ile Ser
                405                 410                 415
Ile Glu Pro Leu Ile Asp Met Gly Arg Thr Ala Leu Asn Val Asn Gly
            420                 425                 430
Ser Met Thr Ala Gly Ser Leu Thr Ser Arg Trp Leu Gly Leu Thr Asp
        435                 440                 445
Lys Arg Val Leu Glu Arg Ser Glu His Ser Glu Leu Glu His Ser
    450                 455                 460
<210>5
<211>801
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(801)
<400>5
atg aaa tta gca cat ctg gga cgt cag gca ttg atg ggt gtg atg gcc        48
Met Lys Leu Ala His Leu Gly Arg Gln Ala Leu Met Gly Val Met Ala
1               5                   10                  15
gtg gcg ctg gtt gcg ggc atg agc gtt aaa agt ttt gca gat gaa ggt        96
Val Ala Leu Val Ala Gly Met Ser Val Lys Ser Phe Ala Asp Glu Gly
            20                  25                  30
ctg ctt aat aaa gtt aaa gag cgc ggc acg ctg ctg gta ggg ctg gaa      144
Leu Leu Asn Lys Val Lys Glu Arg Gly Thr Leu Leu Val Gly Leu Glu
        35                  40                  45
gga act tat ccg ccg ttc agt ttt cag gga gat gac ggc aaa tta acc      192
Gly Thr Tyr Pro Pro Phe Ser Phe Gln Gly Asp Asp Gly Lys Leu Thr
    50                  55                  60
ggt ttt gaa gtg gaa ttt gcc caa cag ctg gca aaa cat ctt ggc gtt      240
Gly Phe Glu Val Glu Phe Ala Gln Gln Leu Ala Lys His Leu Gly Val
65                  70                  75                  80
gag gcg tca cta aaa ccg acc aaa tgg gac ggt atg ctg gcg tcg ctg      288
Glu Ala Ser Leu Lys Pro Thr Lys Trp Asp Gly Met Leu Ala Ser Leu
                85                  90                  95
gac tct aaa cgt att gat gtg gtg att aat cag gtc acc att tct gat      336
Asp Ser Lys Arg Ile Asp Val Val Ile Asn Gln Val Thr Ile Ser Asp
            100                 105                 110
gag cgc aag aaa aaa tac gat ttc tca acc ccg tac acc att tct ggt      384
Glu Arg Lys Lys Lys Tyr Asp Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Ile Ser Gly
        115                 120                 125
att cag gcg ctg gtg aaa aaa ggt aac gaa ggc acc att aaa aca gcc      432
Ile Gln Ala Leu Val Lys Lys Gly Asn Glu Gly Thr Ile Lys Thr Ala
    130                 135                 140
gat gat ctg aaa ggc aaa aaa gtg ggg gtc ggt ctg ggc acc aac tat      480
Asp Asp Leu Lys Gly Lys Lys Val Gly Val Gly Leu Gly Thr Asn Tyr
145                 150                 155                 160
gaa gag tgg ctg cgg cag aat gtt cag ggc gtc gat gtg cgt acc tat      528
Glu Glu Trp Leu Arg Gln Asn Val Gln Gly Val Asp Val Arg Thr Tyr
                165                 170                 175
gat gat gac ccg acc aaa tat cag gat ctg cgc gta ggg cgt atc gat      576
Asp Asp Asp Pro Thr Lys Tyr Gln Asp Leu Arg Val Gly Arg Ile Asp
            180                 185                 190
gcg atc ctc gtt gat cgt ctg gcg gcg ctg gat ctg gtg aag aaa acc      624
Ala Ile Leu Val Asp Arg Leu Ala Ala Leu Asp Leu ValLys Lys Thr
        195                 200                 205
aac gat acg ctg gca gta acc ggt gaa gca ttc tcc cgt cag gag tct      672
Asn Asp Thr Leu Ala Val Thr Gly Glu Ala Phe Ser Arg Gln Glu Ser
    210                 215                 220
ggc gtg gcg ctg cgt aaa gga aat gag gac ctg ctg aaa gca gtg aat      720
Gly Val Ala Leu Arg Lys Gly Asn Glu Asp Leu Leu Lys Ala Val Asn
225                 230                 235                 240
gat gca att gcg gaa atg caa aaa gat ggc act ctg caa gcc ctt tcc      768
Asp Ala Ile Ala Glu Met Gln Lys Asp Gly Thr Leu Gln Ala Leu Ser
                245                 250                 255
gaa aaa tgg ttt ggt gct gat gtg acc aaa taa                            801
Glu Lys Trp Phe Gly Ala Asp Val Thr Lys
            260                 265
<210>6
<211>266
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>6
Met Lys Leu Ala His Leu Gly Arg Gln Ala Leu Met Gly Val Met Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Leu Val Ala Gly Met Ser Val Lys Ser Phe Ala Asp Glu Gly
            20                  25                  30
Leu Leu Asn Lys Val Lys Glu Arg Gly Thr Leu Leu Val Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Gly Thr Tyr Pro Pro Phe Ser Phe Gln Gly Asp Asp Gly Lys Leu Thr
    50                  55                  60
Gly Phe Glu Val Glu Phe Ala Gln Gln Leu Ala Lys His Leu Gly Val
65                  70                  75                  80
Glu Ala Ser Leu Lys Pro Thr Lys Trp Asp Gly Met Leu Ala Ser Leu
                85                  90                  95
Asp Ser Lys Arg Ile Asp Val Val Ile Asn Gln Val Thr Ile Ser Asp
            100                 105                 110
Glu Arg Lys Lys Lys Tyr Asp Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Ile Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Gln Ala Leu Val Lys Lys Gly Asn Glu Gly Thr Ile Lys Thr Ala
    130                 135                 140
Asp Asp Leu Lys Gly Lys Lys Val Gly Val Gly Leu Gly Thr Asn Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Glu Trp Leu Arg Gln Asn Val Gln Gly Val Asp Val Arg Thr Tyr
                165                 170                 175
Asp Asp Asp Pro Thr Lys Tyr Gln Asp Leu Arg Val Gly Arg Ile Asp
            180                 185                 190
Ala Ile Leu Val Asp Arg Leu Ala Ala Leu Asp Leu Val Lys Lys Thr
        195                 200                 205
Asn Asp Thr Leu Ala Val Thr Gly Glu Ala Phe Ser Arg Gln Glu Ser
    210                 215                 220
Gly Val Ala Leu Arg Lys Gly Asn Glu Asp Leu Leu Lys Ala Val Asn
225                 230                 235                 240
Asp Ala Ile Ala Glu Met Gln Lys Asp Gly Thr Leu Gln Ala Leu Ser
                245                 250                 255
Glu Lys Trp Phe Gly Ala Asp ValThr Lys
            260                 265
<210>7
<211>801
<212>DNA
<213>Pantoea ananatis
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(801)
<400>7
atg gct ttc tca cag att cgt cgc cag gtg gtg acg gga atg atg gcg       48
Met Ala Phe Ser Gln Ile Arg Arg Gln Val Val Thr Gly Met Met Ala
1               5                   10                  15
gtt gcg ctg gtg gca ggc ttc agc gtt aaa acg ttt gcg gca gac gat        96
Val Ala Leu Val Ala Gly Phe Ser Val Lys Thr Phe Ala Ala Asp Asp
            20                  25                  30
tta ctg gcg cag gtt aaa agc aaa ggc gag ctg cgc gtc ggt ctg gaa      144
Leu Leu Ala Gln Val Lys Ser Lys Gly Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu
        35                  40                  45
ggc acc tat cct cct ttc agt ttt cag gat gaa aag ggc aag ctg acg       192
Gly Thr Tyr Pro Pro Phe Ser Phe Gln Asp Glu Lys Gly Lys Leu Thr
    50                  55                  60
ggc ttt gaa gtg gag ttt gct cag gat ctg gcc aaa cat atg ggg gtt      240
Gly Phe Glu Val Glu Phe Ala Gln Asp Leu Ala Lys His Met Gly Val
65                  70                  75                  80
aaa gcc gtc ctg aag cca acc aag tgg gat ggc atg tta gcg gcg ctg      288
Lys Ala Val Leu Lys Pro Thr Lys Trp Asp Gly Met Leu Ala Ala Leu
                85                  90                  95
gat tcg aaa cgc atc gat gtg gtc atc aat cag gtg acg atc tcc gat       336
Asp Ser Lys Arg Ile Asp Val Val Ile Asn Gln Val Thr Ile Ser Asp
            100                 105                 110
gag cgt aaa aag aaa tat gat ttc tct acg ccg tat acg att tct ggc       384
Glu Arg Lys Lys Lys Tyr Asp Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Ile Ser Gly
        115                 120                 125
gtg cag gcg ctg acg ctg aag aaa aac gcg ggc agc atc act aag cca      432
Val Gln Ala Leu Thr Leu Lys Lys Asn Ala Gly Ser Ile Thr Lys Pro
    130                 135                 140
gaa gac ctc gca ggg aag aaa gtc ggt gtg ggc ctg ggg acc aac tac      480
Glu Asp Leu Ala Gly Lys Lys Val Gly Val Gly Leu Gly Thr Asn Tyr
145                 150                 155                 160
gag cag tgg ctg cgc gcg aac gta aaa ggt gtg gat atc cgc act tat       528
Glu Gln Trp Leu Arg Ala Asn Val Lys Gly Val Asp Ile Arg Thr Tyr
                165                 170                 175
gat gat gac cca acc aaa tat cag gat ctg cgt tct ggt cgc gtt gat       576
Asp Asp Asp Pro Thr Lys Tyr Gln Asp Leu Arg Ser Gly Arg Val Asp
            180                 185                 190
gcg att ctg gtg gat cgc ctg gct gct ctg gat ctg gtg aag aaa acg      624
Ala Ile Leu Val Asp Arg Leu Ala Ala Leu Asp Leu Val Lys Lys Thr
        195                 200                 205
ggc gat acc atg gcg gta gcc ggt ccg gca ttc tcg cgt ctg gaa gcg      672
Gly Asp Thr Met Ala Val Ala Gly Pro Ala Phe Ser Arg Leu Glu Ala
    210                 215                 220
ggc gtt gcg ctg cgt aag ggc aac gaa gat tta ctg aag gcg atc gat      720
Gly Val Ala Leu Arg Lys Gly Asn Glu Asp Leu Leu Lys Ala Ile Asp
225                 230                 235                 240
cag gcc att gcg gaa atg cag aaa gac ggc acc ctt aaa aag ctg tca      768
Gln Ala Ile Ala Glu Met Gln Lys Asp Gly Thr Leu Lys Lys Leu Ser
                245                 250                 255
gaa aaa tgg ttt ggc gcg gac gtt act aaa taa                            801
Glu Lys Trp Phe Gly Ala Asp Val Thr Lys
            260                 265
<210>8
<211>266
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>8
Met Ala Phe Ser Gln Ile Arg Arg Gln Val Val Thr Gly Met Met Ala
1               5                   10                  15
ValAla Leu Val Ala Gly Phe Ser Val Lys Thr Phe Ala Ala Asp Asp
           20                  25                  30
Leu Leu Ala Gln Val Lys Ser Lys Gly Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Gly Thr Tyr Pro Pro Phe Ser Phe Gln Asp Glu Lys Gly Lys Leu Thr
    50                  55                  60
Gly Phe Glu Val Glu Phe Ala Gln Asp Leu Ala Lys His Met Gly Val
65                  70                  75                  80
Lys Ala Val Leu Lys Pro Thr Lys Trp Asp Gly Met Leu Ala Ala Leu
                85                  90                  95
Asp Ser Lys Arg Ile Asp Val Val Ile Asn Gln Val Thr Ile Ser Asp
            100                 105                 110
Glu Arg Lys Lys Lys Tyr Asp Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Ile Ser Gly
        115                 120                 125
Val Gln Ala Leu Thr Leu Lys Lys Asn Ala Gly Ser Ile Thr Lys Pro
    130                 135                 140
Glu Asp Leu Ala Gly Lys Lys Val Gly Val Gly Leu Gly Thr Asn Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Gln Trp Leu Arg Ala Asn Val Lys Gly Val Asp Ile Arg Thr Tyr
                165                 170                 175
Asp Asp Asp Pro Thr Lys Tyr Gln Asp Leu Arg Ser Gly Arg Val Asp
            180                 185                 190
Ala Ile Leu Val Asp Arg Leu Ala Ala Leu Asp Leu Val Lys Lys Thr
        195                 200                 205
Gly Asp Thr Met Ala Val Ala Gly Pro Ala Phe Ser Arg Leu Glu Ala
    210                 215                 220
Gly Val Ala Leu Arg Lys Gly Asn Glu Asp Leu Leu Lys Ala Ile Asp
225                 230                 235                 240
Gln Ala Ile Ala Glu Met Gln Lys Asp Gly Thr Leu Lys Lys Leu Ser
                245                 250                 255
Glu Lys Trp Phe Gly Ala Asp Val Thr Lys
            260                 265
<210>9
<211>1422
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(301)..(1119)
<400>9
tcggtcaggg catggatgta caaagcgcgc aggagaagat tggtcaggtg gtggaaggct     60
accgcaatac gaaagaagtc cgcgaactgg cgcatcgctt cggcgttgaa atgccaataa    120
ccgaggaaat ttatcaagta ttatattgcg gaaaaaacgc gcgcgaggca gcattgactt    180
tactaggtcg tgcacgcaag gacgagcgca gcagccacta accccaggga acctttgtta    240
ccgctatgac ccggcccgcg cagaacgggc cggtcattat ctcatcgtgt ggagtaagca    300
atg tcg tgt gaa gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa      348
Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu
1               5                   10                  15
gcc aga acg ctg gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac      396
Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His
            20                  25                  30
gcg acg cta ctc aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg      444
Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met
        35                  40                  45
ctg gcg aac aag ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt      492
Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg
    50                  55                  60
gaa gtg gtg gaa gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct      540
Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser
65                  70                  75                  80
gcg gcc tgt gat att cag gcg gtg cgt acc cgc gac ccg gca gtc gat      588
Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp
                85                  90                  95
aaa tac tca acc ccg ttg tta tac ctg aag ggt ttt cat gcc ttg cag      636
Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln
            100                 105                 110
gcc tat cgc atc ggt cac tgg ttg tgg aat cag ggg cgt cgc gca ctg      684
Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu
        115                 120                 125
gca atc ttt ctg caa aac cag gtt tct gtg acg ttc cag gtc gat att      732
Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile
    130                 135                 140
cac ccg gca gca aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca      780
His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr
145                 150                 155                 160
ggc atc gtc gtt ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att      828
Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile
                165                 170                 175
ctg caa tct gtg acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt      876
Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg
            180                 185                 190
cac ccg aaa att cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc      924
His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile
        195                 200                 205
ctc ggc aat att gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc      972
Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser
    210                 215                 220
gtg gtg ctg caa ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg     1020
Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro
225                 230                 235                 240
gct cgt att gtc ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca atg gat atg     1068
Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met
                245                 250                 255
gac cag cat ttc aac ggt att aac cat aca ttt gag tat ggg gat ggg     1116
Asp Gln His Phe Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly
            260                 265                 270
atc taatgtcctg tgatcgtgcc ggatgcgatg taatcatcta tccggcctac          1169
Ile
agtaactaat ctctcaatac cgctcccgga taccccaact gccgccaggc ttcatacacc   1229
actaccgaca ccgcattgga cagattcatg ctgcggctgt ccggcaccat cggaatgcga   1289
attttttgtt cagcgggcag ggcatcaaga atgctcgctg gcaggccgcg tgtttccggg   1349
ccgaacatca gataatcgcc atcctgatag cttacggcgc tgtgagcagg tgtacctttc   1409
gtggtgaggg cga                                                      1422
<210>10
<211>273
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>10
Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu
1               5                   10                  15
Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His
            20                  25                  30
Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met
        35                  40                  45
Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg
    50                  55                  60
Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser
65                  70                  75                  80
Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp
                85                  90                  95
Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln
            100                 105                 110
Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu
        115                 120                 125
Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile
    130                 135                 140
His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr
145                 150                 155                 160
Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg
            180                 185                 190
His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile
        195                 200                 205
Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser
    210                 215                 220
Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro
225                 230                 235                 240
Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met
                245                 250                 255
Asp Gln His Phe Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly
            260                 265                 270
Ile
<210>11
<211>669
<212>DNA
<213>Pantoea ananatis
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(669)
<400>11
atg cag gaa agt tta caa ctg gtg ctg gac tca gca ccc ttt ctt ctt       48
Met Gln Glu Ser Leu Gln Leu Val Leu Asp Ser Ala Pro Phe Leu Leu
1               5                   10                  15
aag ggc gcg ctg ttc acg ctg cag ctc agt att ggc ggt atg ttt ttc       96
Lys Gly Ala Leu Phe Thr Leu Gln Leu Ser Ile Gly Gly Met Phe Phe
            20                  25                  30
ggg ctg ata ctg ggc ttt ttg ctg gcg ctg atg cgc ctg tcc cgc ttc       144
Gly Leu Ile Leu Gly Phe Leu Leu Ala Leu Met Arg Leu Ser Arg Phe
        35                  40                  45
tgg ccc gtg aac tgg ctg gcg cgt atc tac gtg tcc atc ttt cgt ggc      192
Trp Pro Val Asn Trp Leu Ala Arg Ile Tyr Val Ser Ile Phe Arg Gly
    50                  55                  60
acg ccg ctt atc gcc cag ctg ttt atg atc tac tac ggt ctg ccg cag      240
Thr Pro Leu Ile Ala Gln Leu Phe Met Ile Tyr Tyr Gly Leu Pro Gln
65                  70                  75                  80
ttt ggc att gag ctg gat ccc att ccc tcg gcg atg att ggg ctg tcg      288
Phe Gly Ile Glu Leu Asp Pro Ile Pro Ser Ala Met Ile Gly Leu Ser
                85                  90                  95
ctt aac atg gcg gcc tat gcc tca gaa tct ctg cgc ggc gcg att gct      336
Leu Asn Met Ala Ala Tyr Ala Ser Glu Ser Leu Arg Gly Ala Ile Ala
            100                 105                 110
gcc atc gag cgc ggc cag tgg gaa gcg gcg gcc agt atc ggc atg acg      384
Ala Ile Glu Arg Gly Gln Trp Glu Ala Ala Ala Ser Ile Gly Met Thr
        115                 120                 125
ccg tgg caa acg ctg cgt cgg gtt gtt tta ccg cag gcc gcc cgc acc      432
Pro Trp Gln Thr Leu Arg Arg Val Val Leu Pro Gln Ala Ala Arg Thr
    130                 135                 140
gca ctc ccg cct ttg ggt aac agc ttt atc agt ctg gta aaa gat acc      480
Ala Leu Pro Pro Leu Gly Asn Ser Phe Ile Ser Leu Val Lys Asp Thr
145                 150                 155                 160
tcg ctg gct gcc acg atc cag gtt ccg gaa ctg ttt cgt cag gcg cag      528
Ser Leu Ala Ala Thr Ile Gln Val Pro Glu Leu Phe Arg Gln Ala Gln
                165                 170                 175
ctg att act tca cgc acg ttg gag gtg ttc acc atg tat ctg gcg gct      576
Leu Ile Thr Ser Arg Thr Leu Glu Val Phe Thr Met Tyr Leu Ala Ala
            180                 185                 190
tcg ctg atc tat tgg gtg atg gca acc gta ctg tca gca ttg cag aac      624
Ser Leu Ile Tyr Trp Val Met Ala Thr Val Leu Ser Ala Leu Gln Asn
        195                 200                 205
cga ctg gaa gca cac gtt aac cgt cag gat cag gag gcg aaa tga          669
Arg Leu Glu Ala His Val Asn Arg Gln Asp Gln Glu Ala Lys
    210                 215                 220
<210>12
<211>222
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>12
Met Gln Glu Ser Leu Gln Leu Val Leu Asp Ser Ala Pro Phe Leu Leu
1               5                   10                  15
Lys Gly Ala Leu Phe Thr Leu Gln Leu Ser Ile Gly Gly Met Phe Phe
            20                  25                  30
Gly Leu Ile Leu Gly Phe Leu Leu Ala Leu Met Arg Leu Ser Arg Phe
        35                  40                  45
Trp Pro Val Asn Trp Leu Ala Arg Ile Tyr Val Ser Ile Phe Arg Gly
    50                  55                  60
Thr Pro Leu Ile Ala Gln Leu Phe Met Ile Tyr Tyr Gly Leu Pro Gln
65                  70                  75                  80
Phe Gly Ile Glu Leu Asp Pro Ile Pro Ser Ala Met Ile Gly Leu Ser
                85                  90                  95
Leu Asn Met Ala Ala Tyr Ala Ser Glu Ser Leu Arg Gly Ala Ile Ala
            100                 105                 110
Ala Ile Glu Arg Gly Gln Trp Glu Ala Ala Ala Ser Ile Gly Met Thr
        115                 120                 125
Pro Trp Gln Thr Leu Arg Arg Val Val Leu Pro Gln Ala Ala Arg Thr
    130                 135                 140
Ala Leu Pro Pro Leu Gly Asn Ser Phe Ile Ser Leu Val Lys Asp Thr
145                 150                 155                 160
Ser Leu Ala Ala Thr Ile Gln Val Pro Glu Leu Phe Arg Gln Ala Gln
                165                 170                 175
Leu Ile Thr Ser Arg Thr Leu Glu Val Phe Thr Met Tyr Leu Ala Ala
            180                 185                 190
Ser Leu Ile Tyr Trp Val Met Ala Thr Val Leu Ser Ala Leu Gln Asn
        195                 200                 205
Arg Leu Glu Ala His Val Asn Arg Gln Asp Gln Glu Ala Lys
    210                 215                 220
<210>13
<211>783
<212>DNA
<213>Pantoea ananatis
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(753)
<400>13
atg agt gct att gaa gtt cgc cag ttg gtg aaa aag ttt aac gga caa       48
Met Ser Ala Ile Glu Val Arg Gln Leu Val Lys Lys Phe Asn Gly Gln
1               5                   10                  15
acg gta ctg cac ggc atc gat ctc gat gtc gcc ccg ggc gaa atc gtc        96
Thr Val Leu His Gly Ile Asp Leu Asp Val Ala Pro Gly Glu Ile Val
            20                  25                  30
gcg ata atc ggc ccc agt ggc tca ggt aaa acc acg ctg ttg cgc agc       144
Ala Ile Ile Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu Arg Ser
        35                  40                  45
atc aac ctc ctt gag gtc ccg gat gct ggc cgc att aaa gtg ggt gac       192
Ile Asn Leu Leu Glu Val Pro Asp Ala Gly Arg Ile Lys Val Gly Asp
    50                  55                  60
atc acc att gac gcc agc ctg ggc atg aac aga cag aaa gag cgg gtg      240
Ile Thr Ile Asp Ala Ser Leu Gly Met Asn Arg Gln Lys Glu Arg Val
65                  70                  75                  80
cgg atg ttg cgt cag cag gtg ggt ttt gtc ttt caa aac ttc aat tta      288
Arg Met Leu Arg Gln Gln Val Gly Phe Val Phe Gln Asn Phe Asn Leu
                 85                  90                  95
ttt ccg cat cgt tcg gtg ctg gaa aat att att gaa ggt ccg gtg att      336
Phe Pro His Arg Ser Val Leu Glu Asn Ile Ile Glu Gly Pro Val Ile
            100                 105                 110
gtg aag cgg gaa gcg aaa gcg gac gcg gtt gcc cgc gcg cgc agc ctg      384
Val Lys Arg Glu Ala Lys Ala Asp Ala Val Ala Arg Ala Arg Ser Leu
        115                 120                 125
ctt gaa aaa gtt gga ctc aac ggc aag gaa gac agc tac cca cgg cgc      432
Leu Glu Lys Val Gly Leu Asn Gly Lys Glu Asp Ser Tyr Pro Arg Arg
    130                 135                 140
ctg tcc ggt ggt cag cag cag cgt gtc gcc att gcc cgt gcg ttg gcg      480
Leu Ser Gly Gly Gln Gln Gln Arg Val Ala Ile Ala Arg Ala Leu Ala
145                 150                 155                 160
atg cag cca gaa gtc att ttg ttt gat gaa ccg acc tct gcg ctg gat      528
Met Gln Pro Glu Val Ile Leu Phe Asp Glu Pro Thr Ser Ala Leu Asp
                165                 170                 175
ccg gaa ctg gtg ggt gaa gta ctg aac acc att cgc gga ctg gct cag      576
Pro Glu Leu Val Gly Glu Val Leu Asn Thr Ile Arg Gly Leu Ala Gln
            180                 185                 190
gaa aaa cgc acc atg gtt atc gtg acg cac gag atg agc ttt gcc cgc      624
Gl u Lys Arg Thr Met Val Ile Val Thr His Glu Met Ser Phe Ala Arg
         195                 200                 205
gac gtc gcc gac cgc gcc att ttt atg gat cag ggc cgt gtt gtt gaa      672
Asp Val Ala Asp Arg Ala Ile Phe Met Asp Gln Gly Arg Val Val Glu
    210                 215                 220
cag ggc cct gct aag gca ctc ttc agc gat cct cag gag ccg cgt acc      720
Gln Gly Pro Ala Lys Ala Leu Phe Ser Asp Pro Gln Glu Pro Arg Thr
225                 230                 235                 240
cgg cag ttt ctg aat aaa ttt ctt aat caa taa acccggtgcc gccagaagtt    773
Arg Gln Phe Leu Asn Lys Phe Leu Asn Gln
                245                 250
ggcggcgtaa                                                           783
<210>14
<211>250
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>14
Met Ser Ala Ile Glu Val Arg Gln Leu Val Lys Lys Phe Asn Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Leu His Gly Ile Asp Leu Asp Val Ala Pro Gly Glu Ile Val
            20                  25                  30
Ala Ile Ile Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu Arg Ser
        35                  40                  45
Ile Asn Leu Leu Glu Val Pro Asp Ala Gly Arg Ile Lys Val Gly Asp
    50                  55                  60
Ile Thr Ile Asp Ala Ser Leu Gly Met Asn Arg Gln Lys Glu Arg Val
65                  70                  75                  80
Arg Met Leu Arg Gln Gln Val Gly Phe Val Phe Gln Asn Phe Asn Leu
                85                  90                  95
Phe Pro His Arg Ser Val Leu Glu Asn Ile Ile Glu Gly Pro Val Ile
            100                 105                 110
Val Lys Arg Glu Ala Lys Ala Asp Ala Val Ala Arg Ala Arg Ser Leu
        115                 120                 125
Leu Glu Lys Val Gly Leu Asn Gly Lys Glu Asp Ser Tyr Pro Arg Arg
    130                 135                 140
Leu Ser Gly Gly Gln Gln Gln Arg Val Ala Ile Ala Arg Ala Leu Ala
145                 150                 155                 160
Met Gln Pro Glu Val Ile Leu Phe Asp Glu Pro Thr Ser Ala Leu Asp
                165                 170                 175
Pro Glu Leu Val Gly Glu Val Leu Asn Thr Ile Arg Gly Leu Ala Gln
            180                 185                 190
Glu Lys Arg Thr Met Val Ile Val Thr His Glu Met Ser Phe Ala Arg
        195                 200                 205
Asp Val Ala Asp Arg Ala Ile Phe Met Asp Gln Gly Arg Val Val Glu
    210                 215                 220
Gln Gly Pro Ala Lys Ala Leu Phe Ser Asp Pro Gln Glu Pro Arg Thr
225                 230                 235                 240
Arg Gln Phe Leu Asn Lys Phe Leu Asn Gln
                245                 250
<210>15
<211>1039
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(201)..(339)
<400>15
tgcggataac ggtagaattt ttacgccagt attttgccga gcactacccg aatttttcac     60
tggagcatgc ctgattaatg attcaattat cgggttgata tcaggttaaa acctgatttt    120
ctcctttcta agccgctaca gattggttag catattcacc tttaatcgcg catgatcgaa    180
agataattaa agaggttaat gtg ttc gct gaa tac ggg gtt ctg aat tac tgg    233
                      Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp
                      1               5                   10
acc tat ctg gtt ggg gcc att ttt att gtg ttg gtg cca ggg cca aat      281
Thr Tyr Leu Val Gly Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn
            15                  20                  25
acc ctg ttt gta ctc aaa aat agc gtc agt agc ggt atg aaa ggc ggt      329
Thr Leu Phe Val Leu Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly
        30                  35                  40
tat ctt gcg gcc tgc ggt gta ttt att ggc gat gcg gta ttg atg ttt      377
Tyr Leu Ala Ala Cys Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe
    45                  50                  55
ctg gca tgg gct gga gtg gcg aca tta att aag acc acc ccg ata tta      425
Leu Ala Trp Ala Gly Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu
60                  65                  70                  75
ttc aac att gta cgt tat ctt ggt gcg ttt tat ttg ctc tat ctg ggg      473
Phe Asn Ile Val Arg Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly
                80                  85                  90
agt aaa att ctt tac gcg acc ctg aag ggt aaa aat agc gag gcc aaa      521
Ser Lys Ile Leu Tyr Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys
            95                 100                 105
tcc gat gag ccc caa tac ggt gct att ttt aaa cgc gcg tta att ttg      569
Ser Asp Glu Pro Gln Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu
        110                 115                 120
agc ctg act aat ccg aaa gcc att ttg ttc tat gtg tcg ttt ttc gta      617
Ser Leu Thr Asn Pro Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val
    125                 130                 135
cag ttt atc gat gtt aat gcc cca cat acg gga att tca ttc ttt att      665
Gln Phe Ile Asp Val Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile
140                 145                 150                 155
ctg gcg gcg acg ctg gaa ctg gtg agt ttc tgc tat ttg agc ttc ctg      713
Leu Ala Ala Thr Leu Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu
                160                 165                 170
att ata tct ggt gct ttt gtc acg cag tac ata cgt acc aaa aag aaa      761
Ile Ile Ser Gly Ala Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys
            175                 180                 185
ctg gct aaa gtt ggc aac tca ctg att ggt ttg atg ttc gtg ggt ttc      809
Leu Ala Lys Val Gly Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe
        190                 195                 200
gct gcc cga ctg gcg acg ctg caa tcc tga tgctttcagc ccgcgttgtc        859
Ala Ala Arg Leu Ala Thr Leu Gln Ser
    205                 210
gcgggcttcc catctataat cctccctgat tcttcgctga tatggtgcta aaaagtaacc    919
aataaatggt atttaaaatg caaattatca ggcgtaccct gaaacggctg gaataaaccg    979
ttttcagcgc attcaccgaa ggagggaaaa ggatgcttca aatcccacag aattatattc   1039
<210>16
<211>212
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>16
Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly
1               5                   10                  15
Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu
            20                  25                  30
Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys
        35                  40                  45
Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly
    50                  55                  60
Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr
                85                  90                  95
Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln
            100                 105                 110
Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro
        115                 120                 125
Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val
    130                 135                 140
Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala
                165                 170                 175
Phe ValThr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly
           180                 185                 190
Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala
        195                 200                 205
Thr Leu Gln Ser
    210
<210>17
<211>1779
<212>DNA
<213>Pantoea ananatis
<220>
<221>CDS
<222>(301)..(1536)
<400>17
gtcaaaaccc tcaaaaaata aagcaccggg cgcacaacag ggcgcccgct ttttttgatt     60
taaaaaaact tttctcacca ggctgaaatt tggtgactta tgtcacataa ccgtcatcgg    120
cagcgggttc gttcttctcg atgcggccaa cccacgattt tgtctggcaa agtacgtcct    180
ctgagccctg ccatgctggc ggtcaggcaa tcgtttgtat tgccgcaggc gatttttttg    240
atattttgac agacggctga ctgcgttcag tcctcgttga attctgaata gggttgggaa    300
atg gca aag gta tca ctg gaa aaa gac aaa att aag ttc ctg ctg gtg      348
Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val
1               5                   10                  15
gaa ggt gtc cat cag agc gcg ctg gaa aat ctt cgt gct gca ggt tac      396
Glu Gly Val His Gln Ser Ala Leu Glu Asn Leu Arg Ala Ala Gly Tyr
            20                  25                  30
acc aat att gaa ttc cac aaa ggc gca ctg gat gcc gag gcg tta aaa      444
Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Ala Glu Ala Leu Lys
        35                  40                  45
gct tcc gct cgc gat gcg cat ttt atc ggt atc cgt tcc cgt tcc caa      492
Ala Ser Ala Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Ile Arg Ser Arg Ser Gln
    50                  55                  60
ctg acc gaa gag att ttt gcc gct gca gaa aaa ctg gta gcg gtg ggc      540
Leu Thr Glu Glu Ile Phe Ala Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Val Gly
65                  70                  75                  80
tgt ttc tgt atc gga acg aat cag gtt gat tta aat gcc gca gcg aaa      588
Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asn Ala Ala Ala Lys
                85                  90                  95
cgc ggt atc ccg gtt ttt aac gca cct ttc tca aat acg cgc tct gtg      636
Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val
            100                 105                 110
gcc gag ctg gtt att ggc gag atg ctg ctg atg ctg cgc ggt gtt ccg      684
Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Met Leu Leu Met Leu Arg Gly Val Pro
        115                 120                 125
gaa gcg aat gcc aaa gcg cac cgt ggt atc tgg aat aaa atc gcc aaa      732
Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Ile Trp Asn Lys Ile Ala Lys
    130                 135                 140
ggc tct ttt gaa gcg cgc ggt aaa aag ctg ggt atc att ggc tat ggc      780
Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly
145                 150                 155                 160
cat atc ggt atg caa ctg ggc gtg ctg gca gaa agt ctg ggc atg cac      828
His Ile Gly Met Gln Leu Gly Val Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met His
                165                 170                 175
gtt tacttc tat gac atc gaa aac aag ctg ccg ttg ggc aac gca tca      876
Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Ser
            180                 185                 190
cag gtt cgt agc ctg acg cag ttg cta aat atg agt gac gtt gtc agc      924
Gln Val Arg Ser Leu Thr Gln Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser
        195                 200                 205
ctg cat gtc ccg gaa acc gcc tct acg caa aat atg att tct gcc aat      972
Leu His Val Pro Glu Thr Ala Ser Thr Gln Asn Met Ile Ser Ala Asn
    210                 215                 220
gag ctg gct cag atg aag cct ggc ggc ctg ctg ata aat gcc tca cgc     1020
Glu Leu Ala Gln Met Lys Pro Gly Gly Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg
225                 230                 235                 240
ggc acc gtg gta gat att cct gct ttg tgc gaa gcg ctg gcc agc aag     1068
Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Glu Ala Leu Ala Ser Lys
                245                 250                 255
cag gtt ggt ggc gct gcg att gat gtg ttc cct gta gag ccg gcg acc      1116
Gln Val Gly Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Val Glu Pro Ala Thr
            260                 265                 270
aac agc gat ccg ttt gtt tcc cca ctg agc gaa ttc gac aac gtt atc      1164
Asn Ser Asp Pro Phe Val Ser Pro Leu Ser Glu Phe Asp Asn Val Ile
        275                 280                 285
ctg acg ccg cac atc ggg gga tcg acg gaa gaa gct cag gag aat atc      1212
Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Glu Glu Ala Gln Glu Asn Ile
    290                 295                 300
ggg att gaa gtc gcg ggc aag ctg gcg aaa tat tcg gat aac ggt tca     1260
Gly Ile Glu Val Ala Gly Lys Leu Ala Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser
305                 310                 315                 320
acg ctg tcc gcc gtc aat ttc ccg gaa gtg tca ttg ccg atg cac ggc      1308
Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Met His Gly
                325                 330                 335
att agc gcc agt cgt ctg ctg cat att cac gaa aac cgt ccg ggc gtt      1356
Ile Ser Ala Ser Arg Leu Leu His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val
            340                 345                 350
ctc acc gcg atc aac cag att ttc gct gaa caa ggc atc aac att gcc      1404
Leu Thr Ala Ile Asn Gln Ile Phe Ala Glu Gln Gly Ile Asn Ile Ala
        355                 360                 365
gct cag tac ctg caa acc tct ccg atg atg ggt tat gtg gtc atc gac      1452
Ala Gln Tyr Leu Gln Thr Ser Pro Met Met Gly Tyr Val Val Ile Asp
    370                 375                 380
att gat gct gag cac gaa ctg gca gag aaa gct ctg caa ctg atg aag      1500
Ile Asp Ala Glu His Glu Leu Ala Glu Lys Ala Leu Gln Leu Met Lys
385                 390                 395                 400
gcg att ccg gga acg att cgc gcc cgc ctg ctt tac tgatcccacg           1546
Ala Ile Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr
                405                 410
ctgtcaccta cccgggcaca caagcatgcc cgggtttatt catcccatag ccacagtttt    1606
gatggcgtca gcacggccgg caaaggaatg tcccacgccg ctgtaggcag cgcgtcaacc    1666
cgctgacagt catgagcgat gcccaccggt aaaaacccat gctgtttcca gttctgtaag    1726
gtgcgatcgt agaagccgcc ccccattcct aaacgctgtc cggcgcgatc gaa           1779
<210>18
<211>412
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>18
Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val
1               5                   10                  15
Glu Gly Val His Gln Ser Ala Leu Glu Asn Leu Arg Ala Ala Gly Tyr
            20                  25                  30
Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Ala Glu Ala Leu Lys
        35                  40                  45
Ala Ser Ala Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Ile Arg Ser Arg Ser Gln
    50                  55                  60
Leu Thr Glu Glu Ile Phe Ala Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Val Gly
65                  70                  75                  80
Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asn Ala Ala Ala Lys
                85                  90                  95
Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val
            100                 105                 110
Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Met Leu Leu Met Leu Arg Gly Val Pro
        115                 120                 125
Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Ile Trp Asn Lys Ile Ala Lys
    130                 135                 140
Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly
145                 150                 155                 160
His Ile Gly Met Gln Leu Gly Val Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met His
                165                 170                 175
Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Ser
            180                 185                 190
Gln Val Arg Ser Leu Thr Gln Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser
        195                 200                 205
Leu His Val Pro Glu Thr Ala Ser Thr Gln Asn Met Ile Ser Ala Asn
    210                 215                 220
Glu Leu Ala Gln Met Lys Pro Gly Gly Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg
225                 230                 235                 240
Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Glu Ala Leu Ala Ser Lys
                245                 250                 255
Gln Val Gly Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Val Glu Pro Ala Thr
            260                 265                 270
Asn Ser Asp Pro Phe Val Ser Pro Leu Ser Glu Phe Asp Asn Val Ile
        275                 280                 285
Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Glu Glu Ala Gln Glu Asn Ile
    290                 295                 300
Gly Ile Glu Val Ala Gly Lys Leu Ala Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser
305                 310                 315                 320
Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Met His Gly
                325                 330                 335
Ile Ser Ala Ser Arg Leu Leu His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val
            340                 345                 350
Leu Thr Ala Ile Asn Gln Ile Phe Ala Glu Gln Gly Ile Asn Ile Ala
        355                 360                 365
Ala Gln Tyr Leu Gln Thr Ser Pro Met Met Gly Tyr Val Val Ile Asp
    370                 375                 380
Ile Asp Ala Glu His Glu Leu Ala Glu Lys Ala Leu Gln Leu Met Lys
385                 390                 395                 400
Ala Ile Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr
                405                 410
<210>19
<211>4403
<212>DNA
<213>Pantoea ananatis
<220>
<221>CDS
<222>(301)..(1311)
<220>
<221>CDS
<222>(1317)..(2147)
<220>
<221>CDS
<222>(2150)..(3022)
<400>19
tacagcggaa cctggcacgg gccagaaggg ttgatgccgt cggatgacac actcaagagc     60
tggacgctca gcaaaattgt ctggcagcgc taagtctttt ttcacaccgc tcaaccgcag    120
ggcataaccg gccctgcgcg tccaattctg tttttcgtct gtcttttccc gccgccttat    180
gcctttttcg actttgaaat cagcaaacga tatataaaac cgttacgggt ttacgctgag    240
ttataaataa actgctgtat ctgcagatga gatctgcatc aaatttcctc agggtgaacc    300
atg acc tta cca gcg atg aaa aaa atc gtg agc gga ctc gca ctg tcg      348
Met Thr Leu Pro Ala Met Lys Lys Ile Val Ser Gly Leu Ala Leu Ser
1               5                   10                  15
ctg agt ctg gcc ggt gcc gca aac gcg acc gag ctg ttg aac agc tct      396
Leu Ser Leu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Thr Glu Leu Leu Asn Ser Ser
            20                  25                  30
tac gat gtc gca cgt gaa tta ttt gtc gcc ctg aat gcg cct ttt gtc      444
Tyr Asp Val Ala Arg Glu Leu Phe Val Ala Leu Asn Ala Pro Phe Val
        35                  40                  45
agc cag tgg gat gcc agc cat cct gac gac aag ctg acc att aag atg      492
Ser Gln Trp Asp Ala Ser His Pro Asp Asp Lys Leu Thr Ile Lys Met
    50                  55                  60
tcc cat gcc ggg tca tcc aaa cag gcg ctg gcg atc ctg caa ggc ctg      540
Ser His Ala Gly Ser Ser Lys Gln Ala Leu Ala Ile Leu Gln Gly Leu
65                  70                  75                  80
cgt gcc gat gtg gtg acc tat aac cag gtc acc gat gtg cag gtg ctg      588
Arg Ala Asp Val Val Thr Tyr Asn Gln Val Thr Asp Val Gln Val Leu
                85                  90                  95
cac gat aaa ggc aaa ctg atc cct gcc gac tgg caa acc cgc ctg ccg      636
His Asp Lys Gly Lys Leu Ile Pro Ala Asp Trp Gln Thr Arg Leu Pro
            100                 105                 110
aat aac agt tcg ccg ttt tac tcc acc atg gcg ttc ctg gtg cgc aag      684
Asn Asn Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Thr Met Ala Phe Leu Val Arg Lys
        115                 120                 125
gga aac cca aag cag att cac gac tgg tcc gat tta acc cgt gac gat       732
Gly Asn Pro Lys Gln Ile His Asp Trp Ser Asp Leu Thr Arg Asp Asp
    130                 135                 140
gtg aag ctg att ttt cct aat ccc aaa acc tcg ggc aac gga cgt tat      780
Val Lys Leu Ile Phe Pro Asn Pro Lys Thr Ser Gly Asn Gly Arg Tyr
145                 150                 155                 160
acc tat ctt gct gcc tgg ggc gcc gcc agc aac act gac ggg ggc gat      828
Thr Tyr Leu Ala Ala Trp Gly Ala Ala Ser Asn Thr Asp Gly Gly Asp
                165                 170                 175
cag gct aaa acc cgc gct ttt atg aca aaa ttt ctg aaa aat gtt gaa      876
Gln Ala Lys Thr Arg Ala Phe Met Thr Lys Phe Leu Lys Asn Val Glu
            180                 185                 190
gtc ttc gat acc ggt ggc cga ggt gct acg acc acc ttt gct gaa cgc      924
Val Phe Asp Thr Gly Gly Arg Gly Ala Thr Thr Thr Phe Ala Glu Arg
        195                 200                 205
ggt ctg ggc gat gtg ttg atc agt ttt gag tct gaa gtg aat aac atc      972
Gly Leu Gly Asp Val Leu Ile Ser Phe Glu Ser Glu Val Asn Asn Ile
    210                 215                 220
cgc aac cag tac ggc aaa gac gac tac gaa gtc gtg gtg cct aaa acc      1020
Arg Asn Gln Tyr Gly Lys Asp Asp Tyr Glu Val Val Val Pro Lys Thr
225                 230                 235                 240
gat att ctc gcg gag ttt ccc gtt gcc tgg gta gat aaa aac gtc gag     1068
Asp Ile Leu Ala Glu Phe Pro Val Ala Trp Val Asp Lys Asn Val Glu
                245                 250                 255
cag aat aaa aca gcc gat gca gcg aaa gcc tat ctg acc tgg ctg tat      1116
Gln Asn Lys Thr Ala Asp Ala Ala Lys Ala Tyr Leu Thr Trp Leu Tyr
            260                 265                 270
tct cct gcg gcg cag aaa att att acg gat ttc tat tac cgc gtg aac      1164
Ser Pro Ala Ala Gln Lys Ile Ile Thr Asp Phe Tyr Tyr Arg Val Asn
        275                 280                 285
aat ccg cag tta atg gcg cag caa aaa gcc cgt ttt cct gcc acg aac      1212
Asn Pro Gln Leu Met Ala Gln Gln Lys Ala Arg Phe Pro Ala Thr Asn
    290                 295                 300
ctg ttt cgt gtt gaa gac att ttt ggc ggc tgg gat aac gtg atg aaa     1260
Leu Phe Arg Val Glu Asp Ile Phe Gly Gly Trp Asp Asn Val Met Lys
305                 310                 315                 320
acc cat ttc gcc agc ggt ggc gag cta gac cag tta tta gcg gcg ggg     1308
Thr His Phe Ala Ser Gly Gly Glu Leu Asp Gln Leu Leu Ala Ala Gly
                325                 330                 335
cgg tgatc atg ttt gca gcc agc caa aaa cgc gtc ctg ccc ggt ttc ggt   1358
Arg       Met Phe Ala Ala Ser Gln Lys Arg Val Leu Pro Gly Phe Gly
                  340                 345                 350
ctc agc ctg ggc acc agc ctg ctc ttt acc tgt ctg gtg ctg ctg ctg     1406
Leu Ser Leu Gly Thr Ser Leu Leu Phe Thr Cys Leu Val Leu Leu Leu
            355                 360                 365
cca atc agc gca ctg att atg cag ctg tcg cag atg acg ttg cag caa     1454
Pco Ile Ser Ala Leu Ile Met Gln Leu Ser Gln Met Thr Leu Gln Gln
        370                 375                 380
tac tgg gac gtg gtc acc aat ccg cag ctc atc gcg gcc tat aag gtc      1502
Tyr Trp Asp Val Val Thr Asn Pro Gln Leu Ile Ala Ala Tyr Lys Val
    385                 390                 395
acg ctg ctg tcg gcc ggt gtg gcc tca ctg ttt aat gcc gta ttc ggc     1550
Thr Leu Leu Ser Ala Gly Val Ala Ser Leu Phe Asn Ala Val Phe Gly
400                 405                 410                 415
atg tta atg gcg tgg atc tta acg cgt tac cgt ttt ccg ggc cgc acg     1598
Met Leu Met Ala Trp Ile Leu Thr Arg Tyr Arg Phe Pro Gly Arg Thr
                420                 425                 430
ctg ctc gat ggt ctg atg gat ctg ccg ttt gcg ctg ccg acc gcg gtt      1646
Leu Leu Asp Gly Leu Met Asp Leu Pro Phe Ala Leu Pro Thr Ala Val
            435                 440                 445
gct ggc ctg acg ctg gcc ggt ctg ttt tcc gtg aac ggc tgg tac gga     1694
Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Leu Phe Ser Val Asn Gly Trp Tyr Gly
        450                 455                 460
caa tgg ttc gcg cat ttt gat atc aag atc tcc tat acc tgg atc ggt      1742
Gln Trp Phe Ala His Phe Asp Ile Lys Ile Ser Tyr Thr Trp Ile Gly
    465                 470                 475
atc gcg ctc gcg atg gcc ttc acc agt att ccg ttt gtg gtg cgt acc      1790
Ile Ala Leu Ala Met Ala Phe Thr Ser Ile Pro Phe Val Val Arg Thr
480                 485                 490                 495
gtg cag ccg gtg ctg gaa gag ctg ggg cct gaa tat gag gaa gcg gct      1838
Val Gln Pro Val Leu Glu Glu Leu Gly Pro Glu Tyr Glu Glu Ala Ala
                500                 505                 510
caa acg ctg ggc gcc acg ccc tgg cag agc ttc cgc cgg gtc gtt ctg     1886
Gln Thr Leu Gly Ala Thr Pro Trp Gln Ser Phe Arg Arg Val Val Leu
            515                 520                 525
cct gaa gtg gca ccg gcc tta ctt gcg ggc acc gcg ctg tcg ttt acc     1934
Pro Glu Val Ala Pro Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ala Leu Ser Phe Thr
        530                 535                 540
cgc agc ctg ggc gag ttt ggt gcg gta atc ttt att gcc ggc aac atc     1982
Arg Ser Leu Gly Glu Phe Gly Ala Val Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ile
    545                 550                 555
gct tgg aaa acc gaa gtg acc tcg ctg atg atc ttc gtg cgc ctg cag     2030
Ala Trp Lys Thr Glu Val Thr Ser Leu Met Ile Phe Val Arg Leu Gln
560                 565                 570                 575
gag ttt gac tat ccg gca gcc agc gcc att gcc tcg gtc att ctg gcg     2078
Glu Phe Asp Tyr Pro Ala Ala Ser Ala Ile Ala Ser Val Ile Leu Ala
                580                 585                 590
gca tca ctg ctg tta ctt ttc gct atc aat acc tta caa agc cgc ttt     2126
Ala Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ala Ile Asn Thr Leu Gln Ser Arg Phe
            595                 600                 605
ggt cgt cgt ctg gga ggc cat ta atg gca gag att tcg caa ctc aat      2173
Gly Arg Arg Leu Gly Gly His    Met Ala Glu Ile Ser Gln Leu Asn
        610                    615                 620
cat gcc gac cgc cag cct gtt aac tgg gcc aag tgg ctg ctt att ggt     2221
His Ala Asp Arg Gln Pro Val Asn Trp Ala Lys Trp Leu Leu Ile Gly
        625                 630                 635
att ggt gcg ctg ata tcc ttg ctg ctg ctg gtc gtg ccg atg gtg tcc     2269
Ile Gly Ala Leu Ile Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Pro Met Val Ser
    640                 645                 650
atc ttc tgg gag gcc ctg cat aaa gga ctg ggc gtc acc tta agt aat     2317
Ile Phe Trp Glu Ala Leu His Lys Gly Leu Gly Val Thr Leu Ser Asn
655                 660                 665                 670
ctg acc gac agc gac atg ctc cat gcc ata tgg ctc acg gtg ctg gtc     2365
Leu Thr Asp Ser Asp Met Leu His Ala Ile Trp Leu Thr Val Leu Val
                675                 680                 685
gca ttg att acc gtg ccg gtg aat tta gtg ttc ggc acg ctg ctg gcc     2413
Ala Leu Ile Thr Val Pro Val Asn Leu Val Phe Gly Thr Leu Leu Ala
            690                 695                 700
tgg ctg gtg aca cgc ttt acc ttt ccg gga cgt cag ctg ctt ttg acg     2461
Trp Leu Val Thr Arg Phe Thr Phe Pro Gly Arg Gln Leu Leu Leu Thr
        705                 710                 715
ctg ttc gat att ccc ttt gcg gta tcg cct gtg gtc gcc ggt ctg atg     2509
Leu Phe Asp Ile Pro Phe Ala Val Ser Pro Val Val Ala Gly Leu Met
    720                 725                 730
tat ctc ctg ttc tgg ggc att aac ggc ccg gcg ggc ggc tgg ctg gat     2557
Tyr Leu Leu Phe Trp Gly Ile Asn Gly Pro Ala Gly Gly Trp Leu Asp
735                 740                 745                 750
gcc cat aat att cag gtg atg ttc tcc tgg cct ggc atg gtg ctg gtc     2605
Ala His Asn Ile Gln Val Met Phe Ser Trp Pro Gly Met Val Leu Val
                755                 760                 765
acc gtc ttc gtt acc tgt ccg ttt gtg gtg cgc gaa ctg gtg ccg gtg     2653
Thr Val Phe Val Thr Cys Pro Phe Val Val Arg Glu Leu Val Pro Val
            770                 775                 780
atg ctg agc cag ggc agt cat gaa gat gaa gcc gcg gtg ctg tta ggt     2701
Met Leu Ser Gln Gly Ser His Glu Asp Glu Ala Ala Val Leu Leu Gly
        785                 790                 795
gcc tcg ggc tgg cag atg ttc cgt cgc gtg acg ctg ccg aat att cgc     2749
Ala Ser Gly Trp Gln Met Phe Arg Arg Val Thr Leu Pro Asn Ile Arg
    800                 805                 810
tgg gcc atg ctg tat ggc gtc gtg ctg acc aac gcc cgc gcg att ggt     2797
Trp Ala Met Leu Tyr Gly Val Val Leu Thr Asn Ala Arg Ala Ile Gly
815                 820                 825                 830
gag ttt ggc gcg gtt tcc gtg gtt tcg ggt tct att cgc ggt gaa acc     2845
Glu Phe Gly Ala Val Ser Val Val Ser Gly Ser Ile Arg Gly Glu Thr
                835                 840                 845
tac act tta ccg ctt cag gtt gaa tta ctg cat cag gat tac aac acg     2893
Tyr Thr Leu Pro Leu Gln Val Glu Leu Leu His Gln Asp Tyr Asn Thr
            850                 855                 860
gtg ggc gcc ttt act gcc gca gcc tta ctg acc gtg atg gca atc gtg     2941
Val Gly Ala Phe Thr Ala Ala Ala Leu Leu Thr Val Met Ala Ile Val
        865                 870                 875
acg ctg ttt ctg aaa agc att gtg caa tgg cgt tta gag caa cag cac     2989
Thr Leu Phe Leu Lys Ser Ile Val Gln Trp Arg Leu Glu Gln Gln His
    880                 885                 890
aaa cgc ctg caa ctg gag gac aat cat gag cat tgagattaac cagatcaaca   3042
Lys Arg Leu Gln Leu Glu Asp Asn His Glu His
895                 900                 905
aatcctttgg tcgcacagcg gtgctgaacg atatctcact ggatattcct tctggccaga   3102
tggtggcctt actggggccg tccggttccg gtaaaaccac gctgctgcgc atcattgctg   3162
gactggaaca tcagaacagc ggtcagattc gttttcacga ccacgatgtc agccgcctgc   3222
acgcccgcga tcgccaggtc ggatttgtct tccagcacta tgcgctgttc cgtcatatga   3282
cggtcttcga caatattgcc tttggcctga ccgtgctgcc gcgccgtgag cgtccgtcca   3342
gtgcggaaat taaaaaacgc gtcacgcgcc tgctggagat ggtgcagctt tcccatctgg   3402
cgaaccgttt cccggcccag ctttcgggag ggcagaagca gcgcgtcgcg ctggcaagag   3462
ccctggccgt ggaaccgcaa atcctgttgc tggatgagcc ctttggtgcg ctggacgctc   3522
aggtgcgtaa agagctgcgc cgttggttac gtcagctgca cgaagaattg aagttcacca   3582
gcgtgttcgt cacccacgat caggaagagg cgatggaagt ggccgatcgc gtggtggtga   3642
tgagccaggg cagcatcgaa caggtgggga cgccggatga agtctggcgc gatcccgcca   3702
cgcgcttcgt gctggaattc ctgggtgagg ttaaccgctt cgacggtgaa gtgcatggtt   3762
ctcagttcca tgtcggggcg caccactggc cgttaggcta tacctctgca catcagggcg   3822
cggtcgatct gttcctgcgc ccgtgggaaa tcgacgtttc gcgcagaagt agcctggaaa   3882
cgccgctgcc cgttcaggtc ttagaagtga gtcctcgtgg tcacttctgg cagctggtgg   3942
tgcagccaac gggatggcag agcgagccct tctcgctggt ctttgacggt gaacagaccg   4002
cgccgttgcg cggcgagcgc ctgttcgtgg ggctgcagca ggccagactg taccagggcg   4062
cgacaccgtt acgggcggtt gcctttgcac acagcgcctg ataggttgag tgaatgttaa   4122
acgcccggag gcgcttcccg cgatccgggc tttttaatgg caaggtttgt aacctgtaga   4182
cctgataaga cgcgcaagcg tcgcatcagg caacaccacg tatggataga gatcgtgagt   4242
acattagaac aaacaatagg caatacgcct ctggtgaagt tgcagcgaat ggggccggat   4302
aacggcagtg aagtgtggtt aaaactggaa ggcaataacc cggcaggttc ggtgaaagat   4362
cgtgcggcac tttcgatgat cgtcgaggcg gaaaagcgcg g                       4403
<210>20
<211>337
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>20
Met Thr Leu Pro Ala Met Lys Lys Ile Val Ser Gly Leu Ala Leu Ser
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Thr Glu Leu Leu Asn Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Asp Val Ala Arg Glu Leu Phe Val Ala Leu Asn Ala Pro Phe Val
        35                  40                  45
Ser Gln Trp Asp Ala Ser His Pro Asp Asp Lys Leu Thr Ile Lys Met
    50                  55                  60
Ser His Ala Gly Ser Ser Lys Gln Ala Leu Ala Ile Leu Gln Gly Leu
65                  70                  75                  80
Arg Ala Asp Val Val Thr Tyr Asn Gln ValThr Asp Val Gln Val Leu
                85                  90                  95
His Asp Lys Gly Lys Leu Ile Pro Ala Asp Trp Gln Thr Arg Leu Pro
            100                 105                 110
Asn Asn Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Thr Met Ala Phe Leu Val Arg Lys
        115                 120                 125
Gly Asn Pro Lys Gln Ile His Asp Trp Ser Asp Leu Thr Arg Asp Asp
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ile Phe Pro Asn Pro Lys Thr Ser Gly Asn Gly Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Thr Tyr Leu Ala Ala Trp Gly Ala Ala Ser Asn Thr Asp Gly Gly Asp
                165                 170                 175
Gln Ala Lys Thr Arg Ala Phe Met Thr Lys Phe Leu Lys Asn Val Glu
            180                 185                 190
Val Phe Asp Thr Gly Gly Arg Gly Ala Thr Thr Thr Phe Ala Glu Arg
        195                 200                 205
Gly Leu Gly Asp Val Leu Ile Ser Phe Glu Ser Glu Val Asn Asn Ile
    210                 215                 220
Arg Asn Gln Tyr Gly Lys Asp Asp Tyr Glu Val Val Val Pro Lys Thr
225                 230                 235                 240
Asp Ile Leu Ala Glu Phe Pro Val Ala Trp Val Asp Lys Asn Val Glu
                245                 250                 255
Gln Asn Lys Thr Ala Asp Ala Ala Lys Ala Tyr Leu Thr Trp Leu Tyr
            260                 265                 270
Ser Pro Ala Ala Gln Lys Ile Ile Thr Asp Phe Tyr Tyr Arg Val Asn
        275                 280                 285
Asn Pro Gln Leu Met Ala Gln Gln Lys Ala Arg Phe Pro Ala Thr Asn
    290                 295                 300
Leu Phe Arg Val Glu Asp Ile Phe Gly Gly Trp Asp Asn Val Met Lys
305                 310                 315                 320
Thr His Phe Ala Ser Gly Gly Glu Leu Asp Gln Leu Leu Ala Ala Gly
                325                 330                 335
Arg
<210>21
<211>277
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>21
Met Phe Ala Ala Ser Gln Lys Arg Val Leu Pro Gly Phe Gly Leu Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Thr Ser Leu Leu Phe Thr Cys Leu Val Leu Leu Leu Pro Ile
            20                  25                  30
Ser Ala Leu Ile Met Gln Leu Ser Gln Met Thr Leu Gln Gln Tyr Trp
        35                  40                  45
Asp Val Val Thr Asn Pro Gln Leu Ile Ala Ala Tyr Lys Val Thr Leu
    50                  55                  60
Leu Ser Ala Gly Val Ala Ser Leu Phe Asn Ala Val Phe Gly Met Leu
65                  70                  75                  80
Met Ala Trp Ile Leu Thr Arg Tyr Arg Phe Pro Gly Arg Thr Leu Leu
                85                  90                  95
Asp Gly Leu Met Asp Leu Pro Phe Ala Leu Pro Thr Ala Val Ala Gly
            100                 105                 110
Leu Thr Leu Ala Gly Leu Phe Ser Val Asn Gly Trp Tyr Gly Gln Trp
        115                 120                 125
Phe Ala His Phe Asp Ile Lys Ile Ser Tyr Thr Trp Ile Gly Ile Ala
    130                 135                 140
Leu  Ala Met Ala Phe Thr Ser Ile Pro Phe Val Val Arg Thr Val Gln
145                 150                 155                 160
Pro Val Leu Glu Glu Leu Gly Pro Glu Tyr Glu Glu Ala Ala Gln Thr
                165                 170                 175
Leu Gly Ala Thr Pro Trp Gln Ser Phe Arg Arg Val Val Leu Pro Glu
            180                 185                 190
Val Ala Pro Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ala Leu Ser Phe Thr Arg Ser
        195                 200                 205
Leu Gly Glu Phe Gly Ala Val Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ile Ala Trp
    210                 215                 220
Lys Thr Glu Val Thr Ser Leu Met Ile Phe Val Arg Leu Gln Glu Phe
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Pro Ala Ala Ser Ala Ile Ala Ser Val Ile Leu Ala Ala Ser
                245                 250                 255
Leu Leu Leu Leu Phe Ala Ile Asn Thr Leu Gln Ser Arg Phe Gly Arg
            260                 265                 270
Arg Leu Gly Gly His
        275
<210>22
<211>291
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>22
Met Ala Glu Ile Ser Gln Leu Asn His Ala Asp Arg Gln Pro Val Asn
1               5                   10                  15
Trp Ala Lys Trp Leu Leu Ile Gly Ile Gly Ala Leu Ile Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Leu Leu Val Val Pro Met Val Ser Ile Phe Trp Glu Ala Leu His Lys
        35                  40                  45
Gly Leu Gly Val Thr Leu Ser Asn Leu Thr Asp Ser Asp Met Leu His
    50                  55                  60
Ala Ile Trp Leu Thr Val Leu Val Ala Leu Ile Thr Val Pro Val Asn
65                  70                  75                  80
Leu Val Phe Gly Thr Leu Leu Ala Trp Leu Val Thr Arg Phe Thr Phe
                85                  90                  95
Pro Gly Arg Gln Leu Leu Leu Thr Leu Phe Asp Ile Pro Phe Ala Val
            100                 105                 110
Ser Pro Val Val Ala Gly Leu Met Tyr Leu Leu Phe Trp Gly Ile Asn
        115                 120                 125
Gly Pro Ala Gly Gly Trp Leu Asp Ala His Asn Ile Gln Val Met Phe
    130                 135                 140
Ser Trp Pro Gly Met Val Leu Val Thr Val Phe Val Thr Cys Pro Phe
145                 150                 155                 160
Val Val Arg Glu Leu Val Pro Val Met Leu Ser Gln Gly Ser His Glu
                165                 170                 175
Asp Glu Ala Ala Val Leu Leu Gly Ala Ser Gly Trp Gln Met Phe Arg
            180                 185                 190
Arg Val Thr Leu Pro Asn Ile Arg Trp Ala Met Leu Tyr Gly Val Val
        195                 200                 205
Leu Thr Asn Ala Arg Ala Ile Gly Glu Phe Gly Ala Val Ser Val Val
    210                 215                 220
Ser Gly Ser Ile Arg Gly Glu Thr Tyr Thr Leu Pro Leu Gln Val Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu His Gln Asp Tyr Asn Thr Val Gly Ala Phe Thr Ala Ala Ala
                245                 250                 255
Leu Leu Thr Val Met Ala Ile Val Thr Leu Phe Leu Lys Ser Ile Val
            260                 265                 270
Gln Trp Arg Leu Glu Gln Gln His Lys Arg Leu Gln Leu Glu Asp Asn
        275                 280                 285
His Glu His
    290
<210>23
<211>1403
<212>DNA
<213>Pantoea ananatis
<220>
<221>CDS
<222>(15)..(1103)
<400>23
actggaggac aatc atg agc att gag att aac cag atc aac aaa tcc ttt        50
                Met Ser Ile Glu Ile Asn Gln Ile Asn Lys Ser Phe
                1               5                   10
ggt cgc aca gcg gtg ctg aac gat atc tca ctg gat att cct tct ggc        98
Gly Arg Thr Ala Val Leu Asn Asp Ile Ser Leu Asp Ile Pro Ser Gly
        15                  20                  25
cag atg gtg gcc tta ctg ggg ccg tcc ggt tcc ggt aaa acc acg ctg      146
Gln Met Val Ala Leu Leu Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu
    30                  35                  40
ctg cgc atc att gct gga ctg gaa cat cag aac agc ggt cag att cgt       194
Leu Arg Ile Ile Ala Gly Leu Glu His Gln Asn Ser Gly Gln Ile Arg
45                  50                  55                  60
ttt cac gac cac gat gtc agc cgc ctg cac gcc cgc gat cgc cag gtc       242
Phe His Asp His Asp Val Ser Arg Leu His Ala Arg Asp Arg Gln Val
                65                  70                  75
gga ttt gtc ttc cag cac tat gcg ctg ttc cgt cat atg acg gtc ttc      290
Gly Phe Val Phe Gln His Tyr Ala Leu Phe Arg His Met Thr Val Phe
            80                  85                  90
gac aat att gcc ttt ggc ctg acc gtg ctg ccg cgc cgt gag cgt ccg      338
Asp Asn Ile Ala Phe Gly Leu Thr Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Pro
        95                 100                 105
tcc agt gcg gaa att aaa aaa cgc gtc acg cgc ctg ctg gag atg gtg      386
Ser Ser Ala Glu Ile Lys Lys Arg Val Thr Arg Leu Leu Glu Met Val
    110                 115                 120
cag ctt tcc cat ctg gcg aac cgt ttc ccg gcc cag ctt tcg gga ggg      434
Gln Leu Ser His Leu Ala Asn Arg Phe Pro Ala Gln Leu Ser Gly Gly
125                 130                 135                 140
cag aag cag cgc gtc gcg ctg gca aga gcc ctg gcc gtg gaa ccg caa      482
Gln Lys Gln Arg Val Ala Leu Ala Arg Ala Leu Ala Val Glu Pro Gln
                145                 150                 155
atc ctg ttg ctg gat gag ccc ttt ggt gcg ctg gac gct cag gtg cgt      530
Ile Leu Leu Leu Asp Glu Pro Phe Gly Ala Leu Asp Ala Gln Val Arg
            160                 165                 170
aaa gag ctg cgc cgt tgg tta cgt cag ctg cac gaa gaa ttg aag ttc      578
Lys Glu Leu Arg Arg Trp Leu Arg Gln Leu His Glu Glu Leu Lys Phe
        175                 180                 185
acc agc gtg ttc gtc acc cac gat cag gaa gag gcg atg gaa gtg gcc      626
Thr Ser Val Phe Val Thr His Asp Gln Glu Glu Ala Met Glu Val Ala
    190                 195                 200
gat cgc gtg gtg gtg atg agc cag ggc agc atc gaa cag gtg ggg acg      674
Asp Arg Val Val Val Met Ser Gln Gly Ser Ile Glu Gln Val Gly Thr
205                 210                 215                 220
ccg gat gaa gtc tgg cgc gat ccc gcc acg cgc ttc gtg ctg gaa ttc      722
Pro Asp Glu Val Trp Arg Asp Pro Ala Thr Arg Phe Val Leu Glu Phe
                225                 230                 235
ctg ggt gag gtt aac cgc ttc gac ggt gaa gtg cat ggt tct cag ttc      770
Leu Gly Glu Val Asn Arg Phe Asp Gly Glu Val His Gly Ser Gln Phe
            240                 245                 250
cat gtc ggg gcg cac cac tgg ccg tta ggc tat acc tct gca cat cag      818
His Val Gly Ala His His Trp Pro Leu Gly Tyr Thr Ser Ala His Gln
        255                 260                 265
ggc gcg gtc gat ctg ttc ctg cgc ccg tgg gaa atc gac gtt tcg cgc      866
Gly Ala Val Asp Leu Phe Leu Arg Pro Trp Glu Ile Asp Val Ser Arg
    270                 275                 280
aga agt agc ctg gaa acg ccg ctg ccc gtt cag gtc tta gaa gtg agt      914
Arg Ser Ser Leu Glu Thr Pro Leu Pro Val Gln Val Leu Glu Val Ser
285                 290                 295                 300
cct cgt ggt cacttc tgg cag ctg gtg gtg cag cca acg gga tgg cag      962
Pro Arg Gly His Phe Trp Gln Leu Val Val Gln Pro Thr Gly Trp Gln
                305                 310                 315
agc gag ccc ttc tcg ctg gtc ttt gac ggt gaa cag acc gcg ccg ttg     1010
Ser Glu Pro Phe Ser Leu ValPhe Asp Gly Glu Gln Thr Ala Pro Leu
            320                 325                 330
cgc ggc gag cgc ctg ttc gtg ggg ctg cag cag gcc aga ctg tac cag     1058
Arg Gly Glu Arg Leu Phe Val Gly Leu Gln Gln Ala Arg Leu Tyr Gln
        335                 340                 345
ggc gcg aca ccg tta cgg gcg gtt gcc ttt gca cac agc gcc tga         1103
Gly Ala Thr Pro Leu Arg Ala Val Ala Phe Ala His Ser Ala
    350                 355                 360
taggttgagt gaatgttaaa cgcccggagg cgcttcccgc gatccgggct ttttaatggc   1163
aaggtttgta acctgtagac ctgataagac gcgcaagcgt cgcatcaggc aacaccacgt   1223
atggatagag atcgtgagta cattagaaca aacaataggc aatacgcctc tggtgaagtt   1283
gcagcgaatg gggccggata acggcagtga agtgtggtta aaactggaag gcaataaccc   1343
ggcaggttcg gtgaaagatc gtgcggcact ttcgatgatc gtcgaggcgg aaaagcgcgg   1403
<210>24
<211>362
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>24
Met Ser Ile Glu Ile Asn Gln Ile Asn Lys Ser Phe Gly Arg Thr Ala
1               5                   10                  15
Val Leu Asn Asp Ile Ser Leu Asp Ile Pro Ser Gly Gln Met Val Ala
            20                  25                  30
Leu Leu Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu Arg Ile Ile
        35                  40                  45
Ala Gly Leu Glu His Gln Asn Ser Gly Gln Ile Arg Phe His Asp His
    50                  55                  60
Asp Val Ser Arg Leu His Ala Arg Asp Arg Gln Val Gly Phe Val Phe
65                  70                  75                  80
Gln His Tyr Ala Leu Phe Arg His Met Thr Val Phe Asp Asn Ile Ala
                85                  90                  95
Phe Gly Leu Thr Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Pro Ser Ser Ala Glu
            100                 105                 110
Ile Lys Lys Arg Val Thr Arg Leu Leu Glu Met Val Gln Leu Ser His
        115                 120                 125
Leu Ala Asn Arg Phe Pro Ala Gln Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg
    130                 135                 140
Val Ala Leu Ala Arg Ala Leu Ala Val Glu Pro Gln Ile Leu Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asp Glu Pro Phe Gly Ala Leu Asp Ala Gln Val Arg Lys Glu Leu Arg
                165                 170                 175
Arg Trp Leu Arg Gln Leu His Glu Glu Leu Lys Phe Thr Ser Val Phe
            180                 185                 190
Val Thr His Asp Gln Glu Glu Ala Met Glu Val Ala Asp Arg Val Val
        195                 200                 205
Val Met Ser Gln Gly Ser Ile Glu Gln Val Gly Thr Pro Asp Glu Val
    210                 215                 220
Trp Arg Asp Pro Ala Thr Arg Phe Val Leu Glu Phe Leu Gly Glu Val
225                 230                 235                 240
Asn Arg Phe Asp Gly Glu Val His Gly Ser Gln Phe His Val Gly Ala
                245                 250                 255
His His Trp Pro Leu Gly Tyr Thr Ser Ala His Gln Gly Ala Val Asp
            260                 265                 270
Leu Phe Leu Arg Pro Trp Glu Ile Asp Val Ser Arg Arg Ser Ser Leu
        275                 280                 285
Glu Thr Pro Leu Pro Val Gln Val Leu Glu ValSer Pro Arg Gly His
    290                 295                 300
Phe Trp Gln Leu ValVal Gln Pro Thr Gly Trp Gln Ser Glu Pro Phe
305                 310                 315                 320
Ser Leu Val Phe Asp Gly Glu Gln Thr Ala Pro Leu Arg Gly Glu Arg
                325                 330                 335
Leu Phe Val Gly Leu Gln Gln Ala Arg Leu Tyr Gln Gly Ala Thr Pro
            340                 345                 350
Leu Arg Ala Val Ala Phe Ala His Ser Ala
        355                 360
<210>25
<211>1512
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(301)..(1212)
<400>25
agccgctggg gtggtacaac gaaccgctga cggtcgtgat gcatggcgac gatgccccgc     60
agcgtggcga gcgtttattc gttggtctgc aacatgcgcg gctgtataac ggcgacgagc    120
gtatcgaaac ccgcgatgag gaacttgctc tcgcacaaag cgcctgatag gttgagtgaa    180
tgttaaacgc ccggaggcgc ttcccgcgat ccgggctttt taatggcaag gtttgtaacc    240
tgtagacctg ataagacgcg caagcgtcgc atcaggcaac accacgtatg gatagagatc    300
gtg agt aca tta gaa caa aca ata ggc aat acg cct ctg gtg aag ttg      348
Val Ser Thr Leu Glu Gln Thr Ile Gly Asn Thr Pro Leu Val Lys Leu
1               5                   10                  15
cag cga atg ggg ccg gat aac ggc agt gaa gtg tgg tta aaa ctg gaa      396
Gln Arg Met Gly Pro Asp Asn Gly Ser Glu Val Trp Leu Lys Leu Glu
            20                  25                  30
ggc aat aac ccg gca ggt tcg gtg aaa gat cgt gcg gca ctt tcg atg      444
Gly Asn Asn Pro Ala Gly Ser Val Lys Asp Arg Ala Ala Leu Ser Met
        35                  40                  45
atc gtc gag gcg gaa aag cgc ggg gaa att aaa ccg ggt gat gtc tta      492
Ile Val Glu Ala Glu Lys Arg Gly Glu Ile Lys Pro Gly Asp Val Leu
    50                  55                  60
atc gaa gcc acc agt ggt aac acc ggc att gcg ctg gca atg att gcc      540
Ile Glu Ala Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Ala Leu Ala Met Ile Ala
65                  70                  75                  80
gcg ctg aaa ggc tat cgc atg aaa ttg ctg atg ccc gac aac atg agc      588
Ala Leu Lys Gly Tyr Arg Met Lys Leu Leu Met Pro Asp Asn Met Ser
                85                  90                  95
cag gaa cgc cgt gcg gcg atg cgt gct tat ggt gcg gaa ctg att ctt      636
Gln Glu Arg Arg Ala Ala Met Arg Ala Tyr Gly Ala Glu Leu Ile Leu
            100                 105                 110
gtc acc aaa gag cag ggc atg gaa ggt gcg cgc gat ctg gcg ctg gag      684
Val Thr Lys Glu Gln Gly Met Glu Gly Ala Arg Asp Leu Ala Leu Glu
        115                 120                 125
atg gcg aat cgt ggc gaa gga aag ctg ctc gat cag ttc aat aat ccc      732
Met Ala Asn Arg Gly Glu Gly Lys Leu Leu Asp Gln Phe Asn Asn Pro
    130                 135                 140
gat aac cct tat gcg cat tac acc acc act ggg ccg gaa atc tgg cag      780
Asp Asn Pro Tyr Ala His Tyr Thr Thr Thr Gly Pro Glu Ile Trp Gln
145                 150                 155                 160
caa acc ggc ggg cgc atc act cat ttt gtc tcc agc atg ggg acg acc      828
Gln Thr Gly Gly Arg Ile Thr His Phe Val Ser Ser Met Gly Thr Thr
                165                 170                 175
ggc act atc acc ggc gtc tca cgc ttt atg cgc gaa caa tcc aaa ccg      876
Gly Thr Ile Thr Gly Val Ser Arg Phe Met Arg Glu Gln Ser Lys Pro
            180                 185                 190
gtg acc att gtc ggc ctg caa ccg gaa gag ggc agc agc att ccc ggc      924
Val Thr Ile Val Gly Leu Gln Pro Glu Glu Gly Ser Ser Ile Pro Gly
        195                 200                 205
att cgc cgc tgg cct acg gaa tat ctg ccg ggg att ttc aac gct tct      972
Ile Arg Arg Trp Pro Thr Glu Tyr Leu Pro Gly Ile Phe Asn Ala Ser
    210                 215                 220
ctg gtg gat gag gtg ctg gat att cat cag cgc gat gcg gaa aac acc     1020
Leu Val Asp Glu Val Leu Asp Ile His Gln Arg Asp Ala Glu Asn Thr
225                 230                 235                 240
atg cgc gaa ctg gcg gtg cgg gaa gga ata ttc tgt ggc gtc agc tcc     1068
Met Arg Glu Leu Ala Val Arg Glu Gly Ile Phe Cys Gly Val Ser Ser
                245                 250                 255
ggc ggc gcg gtt gcc gga gca ctg cgg gtg gca aaa gct aac cct gac     1116
Gly Gly Ala Val Ala Gly Ala Leu Arg Val Ala Lys Ala Asn Pro Asp
            260                 265                 270
gcg gtg gtg gtg gcg atc atc tgc gat cgt ggc gat cgc tac ctt tct     1164
Ala Val Val Val Ala Ile Ile Cys Asp Arg Gly Asp Arg Tyr Leu Ser
        275                 280                 285
acc ggg gtg ttt ggg gaa gag cat ttt agc cag ggg gcg ggg att taa     1212
Thr Gly Val Phe Gly Glu Glu His Phe Ser Gln Gly Ala Gly Ile
    290                 295                 300
ggattaatag catcggagac tgatgacaaa cgcaaaactg cctgatgcgc tacgcttatc   1272
aggcctacaa ggtttctgca atatattgaa ttagcacgat tttgtaggcc ggataaggcg   1332
tttacgccgc atccggcata aacaaagcgc acttttttaa cagttgttgc tgccgacaaa   1392
tgcagtattt aattttcgtg aggaaacgcc gtaaggtcat caatcatttt ttgaagtatt   1452
ggtgagtcct gaccgtcacc ccattgaaga atttttgcgg taagctgatg acgcgctagt   1512
<210>26
<211>303
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>26
Val Ser Thr Leu Glu Gln Thr Ile Gly Asn Thr Pro Leu Val Lys Leu
1               5                   10                  15
Gln Arg Met Gly Pro Asp Asn Gly Ser Glu ValTrp Leu Lys Leu Glu
            20                  25                  30
Gly Asn Asn Pro Ala Gly Ser Val Lys Asp Arg Ala Ala Leu Ser Met
        35                  40                  45
Ile Val Glu Ala Glu Lys Arg Gly Glu Ile Lys Pro Gly Asp Val Leu
    50                  55                  60
Ile Glu Ala Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Ala Leu Ala Met Ile Ala
65                  70                  75                  80
Ala Leu Lys Gly Tyr Arg Met Lys Leu Leu Met Pro Asp Asn Met Ser
                85                  90                  95
Gln Glu Arg Arg Ala Ala Met Arg Ala Tyr Gly Ala Glu Leu Ile Leu
            100                 105                 110
Val Thr Lys Glu Gln Gly Met Glu Gly Ala Arg Asp Leu Ala Leu Glu
        115                 120                 125
Met Ala Asn Arg Gly Glu Gly Lys Leu Leu Asp Gln Phe Asn Asn Pro
    130                 135                 140
Asp Asn Pro Tyr Ala His Tyr Thr Thr Thr Gly Pro Glu Ile Trp Gln
145                 150                 155                 160
Gln Thr Gly Gly Arg Ile Thr His Phe Val Ser Ser Met Gly Thr Thr
                165                 170                 175
Gly Thr Ile Thr Gly Val Ser Arg Phe Met Arg Glu Gln Ser Lys Pro
            180                 185                 190
Val Thr Ile Val Gly Leu Gln Pro Glu Glu Gly Ser Ser Ile Pro Gly
        195                 200                 205
Ile Arg Arg Trp Pro Thr Glu Tyr Leu Pro Gly Ile Phe Asn Ala Ser
    210                 215                 220
Leu Val Asp Glu Val Leu Asp Ile His Gln Arg Asp Ala Glu Asn Thr
225                 230                 235                 240
Met Arg Glu Leu Ala Val Arg Glu Gly Ile Phe Cys Gly Val Ser Ser
                245                 250                 255
Gly Gly Ala Val Ala Gly Ala Leu Arg Val Ala Lys Ala Asn Pro Asp
            260                 265                 270
Ala Val Val Val Ala Ile Ile Cys Asp Arg Gly Asp Arg Tyr Leu Ser
        275                 280                 285
Thr Gly Val Phe Gly Glu Glu His Phe Ser Gln Gly Ala Gly Ile
    290                 295                 300
<210>27
<211>313
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>27
gcatgcttcc aactgcgcta atgacgcagc tggacgaagg cgggattctc gtcttacccg     60
taggggagga gcaccagtat ttgaaacggg tgcgtcgtcg gggaggcgaa tttattatcg    120
ataccgtgga ggccgtgcgc tttgtccctt tagtgaaggg tgagctggct taaaacgtga    180
ggaaatacct ggatttttcc tggttatttt gccgcaggtc agcgtatcgt gaacatcttt    240
tccagtgttc agtagggtgc cttgcacggt aattatgtca ctggttatta accaattttt    300
cctgggggtc gac                                                       313
<210>28
<211>312
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变体nlpD启动子
<400>28
gcatgcttcc aactgcgcta atgacgcagc tggacgaagg cgggattctc gtcttacccg     60
taggggagga gcaccagtat ttgaaacggg tgcgtcgtcg gggaggcgaa tttattatcg    120
ataccgtgga ggccgtgcgc tttgtccctt tagtgaaggg tgagctggct taaaacgtga    180
ggaaatacct ggatttttcc tggttatttt gccgcaggtc agcgtataat gaagatcttt    240
tccagtgttg acaagggtcc ttgcacggtt ataatgtcac tggttattaa ccaatttttc    300
ctgggggtcg ac                                                        312
<210>29
<211>313
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变体nlpD启动子
<400>29
gcatgcttcc aactgcgcta atgacgcagc tggacgaagg cgggattctc gtcttacccg     60
taggggagga gcaccagtat ttgaaacggg tgcgtcgtcg gggaggcgaa tttattatcg    120
ataccgtgga ggccgtgcgc tttgtccctt tagtgaaggg tgagctggct taaaacgtga    180
ggaaatacct ggatttttcc tggttatttt gccgcaggtc agcgtataat gaagatcttt    240
tccagtgttc agtagggtgc cttgcacggt tataatgtca ctggttatta accaattttt    300
cctgggggtc gac                                                       313
<210>30
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P1
<400>30
agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac                              36
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P2
<400>31
agctgagcat gcttccaact gcgctaatga cgc                                 33
<210>32
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P3
<400>32
agctgatcta gaaaacagaa tttgcctggc ggc                                 33
<210>33
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P4
<400>33
agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc                                 33
<210>34
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P5
<400>34
agctgagtcg acgtgttcgc tgaatacggg gt                                  32
<210>35
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P6
<400>35
agctgatcta gagaaagcat caggattgca gc                                  32
<210>36
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P7
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)..(28)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(46)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(49)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(51)..(51)
<223>n是a，c，g或t
<400>36
atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatna ngtcactgg    59
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P8
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(20)
<223>n是a，c，g或t
<400>37
tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg cg                                  32
<210>38
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P9
<400>38
tccgctcacg atttttttca tcgctggtaa ggtcatttat cccccaggaa aaattggtta    60
<210>39
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P10
<400>39
tttcacaccg ctcaaccgca gggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag    60
ttg                                                                   63
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P11
<400>40
ctttgtccct ttagtgaagg                                                 20
<210>41
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P12
<400>41
agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac                      44
<210>42
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P13
<400>42
agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactg gaa                                  33
<210>43
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P14
<400>43
gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc                                 34
<210>44
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P15
<400>44
agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg                                   32
<210>45
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P16
<400>45
aaaaccgccc gggcgttctc ac                                             22
<210>46
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DydjN(Pa)-F
<400>46
acctctgctg ctctcctgac cagggaatgc tgcattacat cggagttgct tgaagcctgc    60
ttttttatac taagttggca                                                80
<210>47
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DydjN(Pa)-R
<400>47
agacaaaaac agagagaaag acctggcggt gtacgccagg tctggcgtga cgctcaagtt    60
agtataaaaa agctgaacga                                                80
<210>48
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DfliY-FW
<400>48
atggctttct cacagattcg tcgccaggtg gtgacgggaa tgatggcggt tgaagcctgc    60
ttttttatac taagttggca                                                80
<210>49
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DyecC-RV
<400>49
ttacgccgcc aacttctggc ggcaccgggt ttattgatta agaaatttat cgctcaagtt    60
agtataaaaa agc tgaacga                                               80
<210>50
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DcysE(Ec)-F
<400>50
ccggcccgcg cagaacgggc cggtcattat ctcatcgtgt ggagtaagca tgaagcctgc    60
ttttttatac taagttggca                                                80
<210>51
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DcysE(Ec)-R
<400>51
actgtaggcc ggatagatga ttacatcgca tccggcacga tcacaggaca cgctcaagtt    60
agtataaaaa agctgaacga                                                80
<210>52
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DydjN(Ec)-F
<400>52
cactatgact gctacgcagt gatagaaata ataagatcag gagaacgggg tgaagcctgc    60
ttttttatac taagttggca                                                80
<210>53
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DydjN(Ec)-R
<400>53
aaagtaaggc aacggcccct atacaaaacg gaccgttgcc agcataagaa cgctcaagtt    60
agtataaaaa agctgaacga                                                80
<210>54
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ydjN(Ec)-SalIFW2
<400>54
acgcgtcgac atgaactttc cattaattgc gaacatcgtg gtg                      43
<210>55
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ydjN(Ec)-xbaIRV2
<400>55
ctagtctaga ttaatggtgt gccagttcgg cgtcg                               35
<210>56
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ydjN2(Pa)-SalIFW
<400>56
acgcgtcgac atggatattc ctcttacgc                                      29
<210>57
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ydjN2(Pa)-xbaIRV
<400>57
tgctctagat tagctgtgct ctaattcac                                      29
<210>58
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DfliY(Ec)-FW
<400>58
atgaaattag cacatctggg acgtcaggca ttgatgggtg tgatggccgt tgaagcctgc    60
ttttttatac taagttggca                                                80
<210>59
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DfliY(Ec)-RV
<400>59
ttatttggtc acatcagcac caaaccattt ttcggaaagg gcttgcagag cgctcaagtt    60
agtataaaaa agctgaacga                                                80
<210>60
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物fliY(Ec)SalI-F
<400>60
acgcgtcgac atgaaattag cacatctggg acg                                 33
<210>61
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物fliY(Ec)XbaI-R
<400>61
ctagtctaga ttatttggtc acatcagcac c                                   31

Claims (7)

1.一种属于大肠杆菌或Pantoea ananatis的细菌，其具有L-半胱氨酸生产能力，并且经过了修饰从而使得YdjN蛋白质的活性消失，其中所述YdjN蛋白质具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的细菌，其还经过了修饰从而使得FliY蛋白质的活性消失，其中所述FliY蛋白质具有SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述YdjN蛋白质或FliY蛋白质的活性是通过降低编码YdjN蛋白质或FliY蛋白质的ydjN基因或fliY基因的表达量，或者破坏所述基因而降低的。
4.根据权利要求3所述的细菌，其中，所述ydjN基因是含有SEQ IDNO：1或3的碱基序列的DNA。
5.根据权利要求3所述的细菌，其中，所述fliY基因是含有SEQ IDNO：5或7的碱基序列的DNA。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细菌，其中，所述细菌还具有下述性质中的至少一种：
i)经过修饰从而使得丝氨酸乙酰转移酶活性提高，
ii)经过修饰从而使得yeaS基因的表达提高，
iii)经过修饰从而使得3-磷酸甘油酸脱氢酶活性提高，
iv)经过修饰从而使得硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的活性增强。
7.一种L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者上述物质的混合物的生产方法，该方法中，在培养基中培养根据权利要求1～6中任一项所述的细菌，并从所述培养基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或前体、或者上述物质的混合物。
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