BRPI1006643A2 - bactéria pertencente à famìlia enterobacteriaceae, e, método para produzir l- cisteìna, l-cistina, um derivado ou precursor das mesmas, ou uma mistura dos mesmos - Google Patents
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Abstract
BACTéRIA PERTENCENTE à FAMìLIA ENTEROBACTERIACEAE, E, MéTODO PARA PRODUZIR L- CISTEìNA, L-CISTINA, UM DERIVADO OU PRECURSOR DAS MESMAS, OU UMA MISTURA DOS MESMOS. A presente invenção obtém uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae, que é capaz de produzir L-cisteína, e tem sido modificada para decrescer a atividade da proteína YdjN, ou as atividades da proteína YdjN e da proteína FliY. Esta bactéria é cultivada em um meio, e L-cisteína, L-cistina, um seu derivado ou precursor, ou uma mistura destes podem ser colhidos do meio.
Description
"BACTÉRIA PERTENCENTE À FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE, E, MÉTODO PARA PRODUZIR L-CISTEÍNA, L-CISTINA, UM DERIVADO OU PRECURSOR DAS MESMAS, OU UMA MISTURA DOS MESMOS"
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Campo da invenção
A presente invenção refere-se a um método para produtor L- cisteína ou substâncias relacionadas. Especificamente, a presente invenção refere-se a uma bactéria capaz de produzir L-cisteína ou substâncias relacionadas e a um método para produzir L-cisteína ou substâncias relacionadas utilizando a bactéria. L-cisteína e substâncias relacionadas à L- cisteína são úteis nos campos das drogas, cosméticos, e alimentos. Arte anterior
L-cisteína é obtida pela extração de substâncias contendo queratina tais como cabelo, chifres e penas, ou pela conversão de ácido DL-2- amino-tiazolina-4-carboxílico como um precursor usando uma enzima microbiana. Também é planejado produzir L-cisteína em uma escala grande por um método de enzima imobilizada utilizando uma enzima nova.
Ademais, também é tentado produzir L-cisteína por fermentação utilizando uma bactéria. Por exemplo, os inventores da presente invenção revelaram um método para produzir L-cisteína usando uma bactéria Escherichia tendo um sistema de decomposição de L-cisteína suprimido e uma serina-acetil-transferase (EC 2.3.1.30, daqui em diante também chamada de "SAT") na qual retro-inibição por L-cisteína está atenuada (Patente Japonesa Publicada (Kokai) No 11-155571). Ademais, as bactérias nas quais a capacidade de produzir L-cisteína é intensificada pela supressão do sistema de decomposição de L-cisteína, há bactérias corineformes conhecidas ou bactérias Eseheriehia nas quais a atividade de cistationina-P-liase (Patente Japonesa Publicada N0 11-155571), triptofanase (Patente Japonesa Publicada N0 2003-169668), ou O-acetil-serina-sulfidrilase B (Patente Japonesa Publicada N0 2005-245311) está atenuada ou deletada. Também é conhecido um método para produzir L-cisteína pelo uso de uma bactéria na qual o metabolismo de L-cisteína é descontrolado pelo uso de uma seqüência de DNA codificadora de SAT que tem uma mutação específica para atenuar a retro-inibição pela L-cisteína (Publicação Nacional da Versão Traduzida em Japão (Kohyo) N0 2000-504926)
Ademais, é sabido que o gene ydeD que codifica a proteína YdeD (Dabler et al., Mol. Microbiol., 36,1101-1112 (2000)) e o geneyfiKque codifica a proteína YfiK (Patente Japonesa Publicada N0 2004-49237) participam na secreção dos produtos metabólicos da rota de cisteína. Além disso, também são conhecidas técnicas de intensificação da capacidade de produção de L-cisteína pelo aumento da expressão do locus mars, locus aer, locus cmr, gene mex, gene bmr, ou gene qacA, que codificam proteínas adequadas para secretar uma substância tóxica das células (Patente U.S. N0 5.972.663), ou emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr ou cusA gene (Patente Japonesa Publicada N0 2005-287333).
Como uma bactéria produtora de L-cisteína, é também conhecida Escherichia coli na qual a está aumentada atividade do fator de controle de transcrição positiva do regulon de cisteína codificado pelo gene eysB (Publicação de Patente Internacional WOO1/27307).
Ademais, na produção de L-aminoácidos por fermentação, não apenas a secreção de L-aminoácidos das células, mas também a absorção de L-aminoácidos é importante. Microorganismos têm uma capacidade para absorverem muitos tipos de aminoácidos para dentro das células a partir do meio ambiente, no qual cada microorganismo cresce, e os usa. Por exemplo, Eseheriehia coli (E. coli) tem um número grande de transportadores, e é suposto que muitos deles participam na absorção de L-aminoácidos. Há mesmo uma estimativa de que entre aquelas preditas em serem "proteínas transportadoras de membrana" a respeito de suas funções, 14% delas participam no transporte de aminoácidos (Paulsen et al., J. Mol. Biol., 277,573-592 (1998)). Contudo, há geralmente um número grande de vários parálogos de transportadores a respeito da especificidade de substrato, e muitas sobreposições de funções (há uma pluralidade de sistemas de absorção para o mesmo substrato). Portanto, é extremamente difícil identificar uma função como um transportador (Hosie et al., Res. Microbiol., 152,259-270 (2001)). Como descrito acima, funções e papéis fisiológicos de transportadores são muito complicados. Portanto, características de um transportador simplesmente estimado baseando-se em homologia ou fenótipo podem não refletir as funções fisiológicas como as de um transportador real. Por exemplo, não pode ser esperado o transporte cujo substrato é uma função fisiologicamente importante entre transporte de uma pluralidade de tipos de substratos, ou semelhantes. Ademais, mesmo se é verificado que uma certa substância é transportada, pode haver uma pluralidade de fatores que também transportam aquela substância. Portanto, quando um microorganismo usado para produção de aminoácido por fermentação é modificado, não é fácil utilizar um transportador como um alvo.
Ademais, embora haja várias descobertas como descritas abaixo referentes aos sistemas de absorção de bactérias para cisteína entre L- cisteína e seus compostos relacionados, não há descoberta substancialmente importante sobre a absorção de L-cisteína e de S-sulfo-cisteína.
E esperado que E coli tenha pelo menos dois tipos de sistemas de absorção de cisteína mostrando características cinéticas diferentes (Berger et al., J. Biol. Chem., 247,7684-7694 (1972)). Tem sido demonstrado que FliY se liga em cisteína em um sistema experimental in vitro (Butler et al., Life Sci., 52,1209-1215 (1993)), e é esperado que o gene fliY forme um operon junto com yecC, yecS e yecO existindo próximos, e funcione como um transportador de ABC (Hosie et al., Res. Microbiol., 152,259-270 (2001)). Contudo, não tem sido experimentalmente demonstrado se funcionam como um sistema de absorção fisiológica de cisteína em E. coli.
Embora seja similarmente esperado que três sistemas de absorção de cisteína de cinéticas diferentes também estejam presentes em bactérias Salmonella (Baptist et al., J. Bacterid., 131,111-118 (1977)), proteínas envolvidas nelas e os genes codificadores delas ainda não têm sido identificados. Ademais, têm sido relatados três tipos de sistemas de absorção de cisteína (YckKJI, YtmJKLMN, YhcL) para Bacillus subtilis, e se estes três tipos de sistemas são deletados, a bactéria torna-se incapaz de crescer com cisteína como uma única fonte de enxofre (Burguiere et al, J. Bacterid., 186,4875-4884 (2004)).
Embora tenha sido relatado que YdjN de E coli tenha uma homologia de 45% com TcyP, é que conhecida em estar envolvida em absorção de cisteína de Bacillus subtilis (Burguiere et al., J. Bacterid., 186,4875-4884 (2004)), não tem sido confirmado se ela realmente tem atividade de absorção de cisteína.
E sabido que em Lactobacillus fermentum BRl 1, bspA codifica o sistema de captação de cisteína (Turner et al., J. Bacterid., 181,2192-2198 (1999)). Ademais, embora seja esperado que haja dois tipos de sistemas de absorção de cisteína mostrando cinéticas diferentes em Legionella pneumophila (Ewann et al., Appl. Environ. Microbiol., 72,3993- 4000 (2006)), nenhuns genes nem proteínas dos mesmos têm ainda sido identificados.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Um objetivo da presente invenção é desenvolver técnicas novas para melhorar a produção bacteriana de L-cisteína, deste modo obter uma bactéria produtora de L-cisteína, bem como um método para produzir L- cisteína, L-cistina, um seu derivado ou precursor, ou uma mistura destes usando uma tal bactéria.
Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas com o propósito de alcançar o objetivo acima mencionado, e como um resultando, descobriram que a capacidade de produção de L-cisteína de uma bactéria poderia ser melhorada pela modificação da bactéria para decrescer a atividade de uma proteína codificadora pelo gene ydjN, e a capacidade de produção de L-cisteína poderia ser ainda mais melhorada pela modificação da bactéria para decrescer a atividade de uma proteína codificada pelo gene flíY em adição à proteína anteriormente citada, e concluíram a presente invenção.
A presente invenção assim proporciona os seguintes.
(1) Uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae, que é capaz de produzir L-cisteína, e tem sido modificada para decrescer a atividade da proteína YdjN.
(2) A bactéria descrita acima, sendo que a proteína YdjN tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4, ou uma sua variante.
(3) A bactéria descrita acima, que tem sido adicionalmente modificada para decrescer a atividade da proteína FliY.
(4) A bactéria descrita acima, sendo que a proteína FliY tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou 8, ou uma sua variante.
(5) A bactéria descrita acima, sendo que a atividade da proteína YdjN ou FliY é decrescida pela redução da expressão do gene ydjN ou do gene fliY codificador da proteína, ou por rompimento do gene.
(6) A bactéria descrita acima, sendo que o gene ydjN é selecionado do grupo consistindo de:
(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 3,
(b) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou uma sonda que é preparada a partir da seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes, (c) um DNA que tem uma homologia de 95% ou maior com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 3.
(7) A bactéria descrita acima, sendo que o gene fliY é selecionado do grupo consistindo de:
(d) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou 7,
(e) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou 7, ou uma sonda que é preparada a partir da seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes,
(f) um DNA que tem uma homologia de 95% ou maior com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou 7.
(8) A bactéria descrita acima, que adicionalmente tem pelo menos uma das seguintes características:
i) tem sido modificada para aumentar a atividade de serina- acetil-transferase,
derivado ou precursor, ou uma mistura destes, que compreende cultivar a bactéria descrita acima em um meio e colher L-cisteína, L-cistina, um seu derivado ou precursor, ou uma mistura destes do meio.
(9) A bactéria descrita acima, que pertence ao gênero Pantoea.
(10) A bactéria descrita acima, que é Pantoea ananatis.
(11) A bactéria descrita acima, que é Escherichia eoli.
(12) Um método para produzir L-cisteína, L-cistina, um seu De acordo com a presente invenção, a capacidade de produção de L-cisteína das bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae pode ser melhorada. Ademais, de acordo com a presente invenção, L-cisteína, L- cistina, seus derivados e precursores, e misturas deles podem ser eficientemente produzidos.
DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS
Fig. 1 mostra a absorção de S-sulfo-cisteína por E. eoli MG165S.
Fig. 2 mostra a absorção de cistina por E. eoli MG1655. Fig. 3 mostra a absorção de cisteína por E. eoli MG2655. Fig. 4 mostra a absorção de S-sulfo-cisteína por P. ananatis ydjN.
Fig. 5 mostra a absorção de cistina por E. eoli deficiente em fliY.
Fig. 6 mostra a absorção de cistina por E. eoli intensificada em fliY.
Fig. 7 mostra a absorção de cisteína por E. eoli deficiente em fliY.
Fig. 8 mostra a seqüência do promotor Pnlp (SEQ ID NO: 62).
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES EXEMPLARES
<1> Bactéria
A bactéria da presente invenção pertence à família Enterobaeteriaeeae, que é capaz de produzir L-cisteína, e tem sido modificada para decrescer a atividade da proteína YdjN. Uma modalidade preferida da bactéria da presente invenção é uma bactéria descrita acima, que tem sido adicionalmente modificada para decrescer a atividade da proteína FliY em adição à proteína YdjN. As proteínas YdjN e FliY são codificadas pelos genes ydjN e fliY, respectivamente. Estas proteínas e estes genes serão explicados mais adiante. A capacidade de produção de L-cisteína refere-se a uma capacidade da bactéria de produzir L-cisteína em um meio ou células e causar o acúmulo de L-cisteína em uma quantidade tal que L-cisteína pode ser colhida do meio ou das células quando a bactéria é cultivada no meio.
Ademais, uma bactéria tendo capacidade de produção de L-cisteína significa uma bactéria que pode produzir e causar o acúmulo de uma quantidade maior de L-cisteína em um meio ou células em comparação com uma cepa não modificada, parental ou de tipo selvagem, preferivelmente um microorganismo que pode produzir ou causar o acúmulo de L-cisteína em um meio em uma quantidade de, preferivelmente 0,3 g/L ou maior, mais preferivelmente 0,4 g/L ou maior, particularmente preferivelmente 0,5 g/L ou maior.
Uma porção de L-cisteína produzida pelo microorganismo pode ser convertida em L-cistina no meio pela formação de uma ligação de dissulfeto. Ademais, como descrito abaixo, S-sulfo-cisteína pode ser gerada pela reação de L-cisteína e ácido tio-sulfurico que estão presentes no meio (Szczepkowski T.W., Nature, vol. 182 (1958)). Ademais, L-cisteína gerada nas células bacterianas pode ser condensada com uma cetona, um aldeído, ou, por exemplo, ácido pirúvico, que está presente nas células, para produzir um derivado de tiazolidina via um hemi-tio-cetal (referir à Patente Japonesa N0 2992010). Derivado de tiazolidina ou hemi-tio-cetal pode existir como uma mistura equilibrada. Portanto, a capacidade para produzir L-cisteína não é limitada à produção de apenas L-cisteína em um meio ou células, mas também inclui a produção de L-cistina ou um seu derivado ou precursor, ou uma mistura destes, em adição à L-cisteína. Exemplos de derivados acima mencionados de L-cisteína ou L-cistina incluem, por exemplo, S-sulfo- cisteína, derivados de tiazolidina, hemi-tio-cetais, e assim por diante. Exemplos do precursor de L-cisteína ou L-cistina incluem, por exemplo, O- acetil-serina, que é um precursor de L-cisteína. Os precursores de L-cisteína ou L-cistina também incluem derivados dos precursores, e exemplos incluem, por exemplo, N-acetil-serina, que é a derivado de 0-acetil-serína,e assim por diante.
O-Acetil-serina (OAS) é um precursor da biossíntese de L- cisteína. OAS é um metabólito de bactérias e plantas, e é produzido por acetilação de L-serina como uma reação enzimática catalisada por serina- acetil-transferase (SAT). OAS é adicionalmente convertida em L-cisteína em células.
A capacidade para produzir L-cisteína pode ser herdada pela bactéria, ou pode ser obtida por modificação de um microorganismo tais como aqueles descritos abaixo por mutagênese ou uma técnica de DNA recombinante. Na presente invenção, a não ser que seja especificamente mencionado, o termo L-cisteína pode ser usado para se referir à L-cisteína de tipo reduzido, L-cistina, um derivado ou precursor tais como aqueles mencionados acima ou uma sua mistura.
A bactéria usada na presente invenção não é particularmente limitada desde que a bactéria pertença à família Enterobacteriaceae tais como aquelas dos gêneros Eseheriehia, Enterobaeter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella e Morganella, e tenha a capacidade de produção de L- cisteína. Especificamente, podem ser usadas aquelas classificadas na família Enterobaeteriaeeae de acordo com a taxonomia usada no banco de dados de NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347). Como uma cepa parental da família Enterobaeteriaeeae usada para a modificação, uma bactéria do gênero Eseheriehia, Enterobaeter,Pantoea, Erwinia, ou Klebsiella pode ser usada.
Embora as bactérias Eseheriehia não sejam particularmente limitadas, especificamente, aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et ai. (Backmann B.J., 1996, "Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12", p.2460-2488, Table 1, em ED. Neidhardt (ed.), uEseheriehia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology"/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.) podem ser usadas. Eseheriehia coli é preferível. Exemplos de Escherichia coli incluem bactérias derivadas da cepa de tipo selvagem protótipo, cepa K12, tal como Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MGl 655 (ATCC 47076) e assim por diante.
Estas cepas estão disponíveis, por exemplo, na American Type Culture Collection (Address: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA20108, United States of America). Isto é, números de registro são dados a cada uma das cepas, e as cepas podem ser encomendadas pelo uso destes números de registro (referir a http://www.atcc.org/). Os números de registro das cepas estão listados no catálogo da American Type Culture Collection.
Exemplos de bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes e assim por diante, exemplos de bactérias Pantoea bactéria incluem Pantoea ananatis. Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, ou Pantoea stewartii baseando-se na análise da seqüência de nucleotídeos de 16S rRNA etc. Uma bactéria pertencendo ao gênero Enterobacter ou Pantoea pode ser usada desde que ela seja classificada na família Enterobacteriaceae.
Em particular, bactérias Pantoea, bactérias Erwinia, e bactérias Enterobacter são classificadas como γ-proteobactérias, e são taxonomicamente muito próximas umas das outras (J. Gen. Appl. Microbiol., 1997,43,355-361; International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, pp. 1061-1067). Em anos recentes, algumas bactérias pertencendo ao gênero Enterobacter foram classificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa, ou semelhantes, tendo por base experimentos de hibridização de DNA-DNA etc. (International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989, 39(3), pp.337-345). Ademais, algumas bactérias pertencendo ao gênero Erwinia foram reclassificadas como Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (referir ao International Journal of Systematic Bacteriology, Jan. 1993; 43(1), pp.162-173).
Exemplos das bactérias Enterobacter incluem, mas não são limitados a, Enterobacter agglomerans, Enterobaeter aerogenes, e assim por diante. Especificamente cepas exemplificadas em Publicação de Patente Européia N0 952221 podem ser usadas. Uma cepa típica do gênero Enterobaeter é a Enterobaeter agglomeranses cepa ATCC 12287.
Cepas típicas das bactérias Pantoea incluem, mas não são limitadas a, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, e Pantoea eitrea. Exemplos específicos de Pantoea ananatis incluem a Pantoea ananatis cepa AJ13355, cepa SC17, e cepa SC17(0). A cepa SC17 foi selecionada como uma cepa mutante baixa produtora de muco da cepa AJ13355 (PERM BP-6634) isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japão como uma cepa que pode se proliferar em um meio de pH baixo contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono (Patente U.S. N0 6.596.517). A cepa SC 17(0) foi construída para ser resistente ao produto do gene λ Red para realizar a rompimento do gene em Pantoea ananatis (W02008/075483). A cepa SC17 foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository (endereço: Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba- shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) aos 4 de Fevereiro de 2 009, e recebeu o número de acesso de TERM ABP-11091. A cepa SC 17(0) foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (endereço: Rússia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1) aos 21 de Setembro de 2005 com um número de acesso de VKPM B-9246.
A Pantoea ananatis cepa AJl3355 foi depositada no National Institute ou Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, endereço: Tsukuba Central 6, 1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) aos 19 de Fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERMP-16644. Foi então convertida em um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste aos 11 de Janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6614. Esta cepa foi identificada como Enterobacter agglomerans quando ela foi isolada e depositada como Enterobaeter agglomerans cepa AJ13355. Contudo, foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis baseando-se no sequenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA e assim por diante.
Exemplos das bactérias Erwinia incluem, mas não são limitados a, Erwinia amylovora e Erwinia carotovora, e exemplos das bactérias Klebsiella incluem Klebsiella planticola.
Concessão ou intensificação da capacidade de produção de L- cisteína
Daqui em diante serão descritos métodos para conceder a capacidade de produção de L-cisteína às bactérias pertencendo a Enterobacteriaceae, ou métodos para intensificar a capacidade de produção de L-cisteína de tais bactérias.
Para conceder a capacidade para produzir L-cisteína, podem ser usados métodos convencionalmente utilizados na geração de bactérias corineformes ou bactérias do gênero Escherichia (veja "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), Ist Edition, publicada aos 30 de Maio de 1986, pp. 77-100). Tais métodos incluem pela aquisição das propriedades de um mutante auxotrófico, uma cepa resistente análoga, ou um mutante de regulação metabólica, ou pela construção de uma cepa recombinante de modo que ele sobre-expresse a enzima de bissíntese de L- cisteína. Aqui, na geração de uma bactéria produtora de L-cisteína, uma ou mais das propriedades descritas acima tais como auxotrofia, resistência a análogo, e mutação de regulação metabólica podem ser concedidas. A expressão de enzima(s) da biossíntese de L-cisteína pode ser intensificada sozinha ou em combinações com duas ou mais. Ademais, os métodos de concessão de propriedades tais como uma auxotrofia, resistência a análogo, e mutação de regulação metabólica podem ser combinados com intensificação das enzimas de biossíntese.
Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente a análogo de L- cisteína, ou cepa mutante de regulação metabólica com a capacidade para produzir L-cisteína pode ser obtida pela sujeição de uma cepa parental ou cepa de tipo selvagem à mutagênese convencional, tal como exposição aos raios-X ou à irradiação UV, ou tratamento com um mutageno tal como N- metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina, metano-sulfonato de etila (EMS) etc., e então seleção daquelas que exibem auxotrofia, resistência a análogo, ou uma mutação de regulação metabólica e que também têm a capacidade para produzir L-cisteína das cepas mutantes obtidas.
A capacidade de produção de L-cisteína de uma bactéria pode ser melhorada pela intensificação da atividade de uma enzima da rota de biossíntese de L-cisteína ou de uma enzima envolvida na produção de um composto servindo como um substrato daquela rota tal como L-serina, por exemplo, 3-fosfo-glicerato-desidrogenase, serina-acetil-transferase, e assim por diante. 3-Fosfo-glicerato-desidrogenase é submetido à retro-inibição por serina, e portanto a sua atividade enzimática pode ser intensificada pela incorporação de um gene serA mutante codificador de uma 3-fosfo-glicerato- desidrogenase mutante para a qual a retro-inibição é eliminada ou atenuada em uma bactéria.
Ademais, serina-acetil-transferase é submetida à retro-inibição por L-cisteína. Portanto, a sua atividade enzimática pode ser intensificada pela incorporação de um gene cysE mutante codificador de uma serina-acetil- transferase mutante para a qual a retro-inibição está eliminada ou atenuada em uma bactéria.
A capacidade de produção de L-cisteína também pode ser melhorada pela intensificação da atividade do sistema de transporte de sulfato/tiossulfato. O grupo de proteínas do sistema de transporte de sulfato/tiossulfato é codificado pelo grupo de genes cysPTWAM (Patente Japonesa Publicada N0 2005-137369. Patente Européia N0 1528108)
A capacidade de produção de L-cisteína de uma bactéria também pode ser melhorada pelo aumento da expressão do gene yeaS (Patente Européia Publicada N0 1016710). A seqüência de nucleotídeos do gene yeaS e a seqüência de aminoácidos codificada pelo gene são mostradas em SEQ ID NOS: 15 e 16, respectivamente. É sabido que as bactérias usam vários códons tal como GTG além de ATG como o códon de iniciação (http://depts-washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm). Embora o aminoácido correspondendo ao códon de iniciação gtg seja indicado como Val em SEQ ID NOS; 15 e 16, é elevadamente possível que ele seja realmente Met.
Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-cisteína incluem, mas não são limitados a, E coli JM15 transformada com múltiplos tipos de alelos de gene cysE codificadores de serina-acetil-transferase (SAT) resistente à retro-inibição (Patente U.S. N0 6.218.168), E. coli W3110 na qual é sobre-expressado um gene codificador de uma proteína responsável pela excreção de substâncias citotóxicas (Patente U.S. N0 5.972.663), cepa de E. coli tendo atividade decrescida de cisteína-desulfidrase (Patente Japonesa Publicada N0 11-155571), e E. coli W3110 na qual está aumentada a atividade do fator de controle transcricional positivo para regulon de cisteína codificado pelo gene cysB (WOO1/27307). Para proteínas de E. coli, são conhecidas aquelas que têm uma atividade de secretar L-cisteína, tal como a proteína codificada por ydeD (Patente Japonesa Publicada N0 2002-233384), a proteína codificada por yfiK (Patente Japonesa Publicada N0 2004-49237) e as proteínas codificadas por emrAB, emrKY, yojIH, aerEF; ber, e cusA, respectivamente (Patente Japonesa Publicada N0 2005-287333) como descrito acima. Atividades destas proteínas secretoras de L-cisteína podem ser aumentadas.
Daqui por diante, será descrito o método para conceder uma capacidade para produzir L-cisteína, intensificar uma atividade da enzima de sistema de biossíntese de L-cisteína.
Exemplos da enzima de biossíntese de L-cisteína incluem, por exemplo, serina-acetil-transferase (SAT). A atividade de SAT em células de uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae pode ser intensificada pelo aumento do número de cópias de um gene codificador de SAT, ou modificação da seqüência de controle de expressão tal como promotor do gene codificador de SAT. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado pela ligação de um fragmento de gene codificador de SAT em um vetor, tal como um vetor de multicópias, que é capaz de funcionar na bactéria hospedeira escolhida pertencendo à família Enterobaeteriaeeae para preparar um DNA recombinante. Este DNA recombinante pode ser então introduzido em uma bactéria hospedeira pertencendo à família Enterobaeteriaeeae para transformá-la.
Métodos para intensificar a expressão do gene SAT serão descritos abaixo. Métodos similares também podem ser aplicados para outros genes de enzima de sistemas de biossíntese de L-cisteína, o gene yeaS, e genes de proteínas tendo atividade de secreção de cisteína.
Modificação para intensificar a expressão do gene SAT pode ser realizada, por exemplo, pelo aumento do número de cópias do gene SAT nas células por meio de técnicas de recombinação genética. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado pela ligação de um fragmento de DNA contendo o gene SAT em um vetor, preferivelmente um vetor de multicópias, que é capaz de funcionar em uma bactéria hospedeira, e introduzido em uma bactéria para transformá-la.
Por exemplo, o gene SAT de Escherichia coli pode ser obtido por PCR usando DNA cromossômico de Eseheriehia coli como um modelo e iniciadores preparados tendo por base a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9. Os genes SAT de outras bactérias também podem ser obtidos de DNA cromossômico ou de biblioteca de DNAs cromossômicos das bactérias por hibridização usando uma sonda preparada baseando-se na informação de seqüência anteriormente mencionada.
Número de cópia do gene SAT também pode ser aumentado pela introdução de cópias múltiplas do gene SAT em um DNA cromossômico de uma bactéria. Para introduzir cópias múltiplas do gene SAT em um DNA cromossômico de uma bactéria, recombinação homóloga pode ser realizada com seleção de uma seqüência presente em um DNA cromossômico em um número de cópias múltiplas. Um DNA repetitivo ou repetição invertida na extremidade de um elemento reversível pode ser usado como a seqüência presente em um DNA cromossômico em um número de cópias múltiplas. Alternativamente, como revelado em Patente Japonesa Publicada N0 2- 109985,cópias múltiplas do gene SAT podem ser introduzidas em um DNA cromossômico pela incorporação delas em um transposon e transferência dele.
Ademais, além da amplificação do número de cópias do gene descrito acima, expressão do gene SAT também pode ser intensificada pela substituição de uma seqüência regulatória de expressão do gene SAT tal como um promotor em um DNA cromossômico ou um plasmídeo com um promotor mais forte, por amplificação de um regulador que aumenta a expressão do gene SAT, ou por deleção ou atenuação de um regulador que reduz a expressão do gene SAT. Como promotores fortes, por exemplo; promotor lae, promotor trp, promotor trc e assim por diante são conhecidos. Ademais, um promotor do gene SAT também pode ser modificado para ser mais forte pela introdução de substituição de nucleotídeos ou semelhantes na região de promotor do gene SAT. A modificação ou substituição anteriormente mencionada do promotor intensifica a expressão do gene SAT. Exemplos de métodos para avaliar a força dos promotores e de promotores fortes são descritos em um artigo por Goldstein e Doi (Goldstein, M.A. e Doi R.H., 1995, "Prokaryotic promotors in biotechnology", Biotechnol. Annu. Rev., 1,105-128), e assim por diante. Modificação de uma seqüência regulatória de expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópias do gene SAT. Ademais, com o propósito de intensificar a produção da proteína SAT, uma mutação pode ser introduzida próxima do sítio de iniciação de tradução do gene SAT para aumentar a eficiência de tradução, e isto pode ser combinada com intensificação da expressão do gene SAT.
Aumento da expressão do gene SAT e aumento da quantidade de proteína SAT podem ser confirmados por quantificação de mRNA ou por Western blotting usando um anticorpo, como a confirmação do decréscimo da quantidade de um gene alvo e a confirmação do decréscimo em uma quantidade de proteína alvo descrita mais adiante.
Como o gene SAT, um gene SAT derivado de bactérias
Escherichia ou um gene SAT derivado de outros organismos podem ser usados. Como o gene codificador de SAT de Eseheriehia eoli, eyeE tem sido clonado de uma cepa de tipo selvagem e uma cepa mutante de excreção de L- cisteína, e a sua seqüência de nucleotídeos tem sido elucidada (Denk, D. e Boeck, A., J. General Microbiol., 133,515-525 (1987)). A sua seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de nucleotídeos são mostradas em SEQ ID NOS: 9 e 10, respectivamente. Um gene SAT pode ser obtido por PCR utilizando iniciadores preparados tendo por base a seqüência de nucleotídeos e o DNA cromossômico a bactéria Escherichia como o modelo (referir à Patente Japonesa Publicada N0 11- 155571). Genes codificadores de SAT de outros organismos também podem ser obtidos em uma maneira similar. Expressão do gene SAT como descrito acima pode ser intensificada na mesma maneira como aquela para o gene cysE explicado acima.
Quando um mecanismo de supressão tal como uma "retro- inibição por L-cisteína" existe para a expressão do gene SAT, expressão do gene SAT também pode ser intensificada pela modificação de uma seqüência regulatória de expressão ou de um gene envolvido na supressão de modo que a expressão do gene SAT seja insensível ao mecanismo de supressão.
Por exemplo, a atividade de SAT pode ser adicionalmente aumentada pela mutação de SAT de modo que a retro-inibição por L-cisteína seja reduzida ou eliminada na bactéria (doravante também chamado de " SAT mutante"). Exemplos de SAT mutante incluem SAT tendo uma mutação substituindo um resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo de metionina na posição 256 de um SAT de tipo selvagem (SEQ ID NO: 10) por um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de lisina e resíduo de leucina, ou uma mutação de deleção de uma região lateral C-terminal de um resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo de metionina como posição 256. Exemplos dos resíduos de aminoácido diferentes de lisina e leucina incluem os 17 resíduos de aminoácido que tipicamente compõem proteínas exceto metionina, lisina e leucina. Isoleucina e ácido glutâmico são exemplos mais preferidos. Para introduzir uma mutação desejada em um gene SAT de tipo selvagem, mutagênese sítio-específica pode ser usada. Como um gene SAT mutante, um cysE mutante codificador de uma SAT mutante de Eseheriehia eoli é conhecido (referir à Publicação de Patente Internacional W097/15673 e à Patente Japonesa Publicada N0 11-355571). Eseheriehia eoli cepa JM39-8 hospedando um plasmídeo pCEM256E contendo um cysE mutante codificador de uma SAT mutante na qual o resíduo de metionina em posição 256 está substituído por um resíduo de ácido glutâmico (E. coli JM39-8 (pCEM256E), número privado: AJ13391) foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Código postal: 305,1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, Japão) aos 20 de Novembro de 1997 e recebeu o número de acesso de PERM P-16527. O depósito foi então convertido em um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste aos 8 de Julho de 2002, e recebeu um número de acesso de FERM BP-8112.
Embora uma "SAT insensível à retro-inibição por L-cisteína" pode ser SAT que tem sido modificada de modo que ela é insensível à retro- inibição por L-cisteína, ela pode ser uma SAT que em sua forma nativa é insensível à retro-inibição por L-cisteína. Por exemplo, SAT de Arabidopsis thaliana é conhecidamente não sujeita à retro-inibição por L-cisteína e pode ser adequadamente usada na presente invenção. Como um plasmídeo contendo o gene SAT derivado de Arabidopsis thaliana, pEAS-m é conhecido (FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459).
Ademais, a capacidade para produzir L-cisteína também pode ser concedida pela intensificação da expressão dos genes do grupo cysPTWAM codificadores das proteínas do sistema de transporte de sulfato/tiossulfato (Patente Japonesa Publicada N0 2005-137369, EP 1528108).
Ademais, um sulfeto pode ser incorporado em O-acetil-L- serina via uma reação catalisada por O-acetil-serina (tiol)-liase A ou B codificada pelos genes cysK e cysM, respectivamente, para produzir L- cisteína. Portanto, a capacidade para produzir L-cisteína também pode ser melhorada pela intensificação da expressão dos genes codificadores destas enzimas.
Além disso, a capacidade de produção de L-cisteína também pode ser melhorada pela supressão do sistema de decomposição de L-cisteína. "Sistema de decomposição de L-cisteína suprimido" pode significar que a atividade de decomposição de L-cisteína intracelular é decrescida em comparação com aquela de uma cepa não modificada tal como uma cepa parental ou de tipo selvagem. Como proteínas responsáveis pelo sistema de decomposição de L-cisteína, cistationina-P-liase (produto de metC, Patente Japonesa Publicada N0 11-155571, Chandra et al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069), triptofanase (produto de tnaA, Patente Japonesa Publicada N0 2003-169668, Austin Newton et al., J. Biol. Chem., 240 (1965) 1211-1218)), O-acetil-serina-sulfidrilase B (produto de gene cysM, Patente Japonesa Publicada N0 2005-245311) e o produto de gene malY (Patente Japonesa Publicada N0 2005-245311) são conhecidas. Pelo decréscimo das atividades destas proteínas, a capacidade de produção de L-cisteína pode ser melhorada.
Modificação para decrescer a atividade de uma proteína pode ser realizada na mesma maneira que aquelas para o gene fliY ou gene ydjN descritos adiante.
A seqüência de nucleotídeos do gene cysM de Escherichia eoli e a seqüência de aminoácidos codificada pelo gene são mostradas em SEQ ID NOS: 25 e 26, respectivamente.
Decréscimo de atividades de proteína YdjN e de proteína FliY
A bactéria da presente invenção pode ser obtida pela modificação de uma tal bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae e tendo a capacidade para produzir L-cisteína como descrito acima para decrescer a atividade da proteína YdjN ou as atividades da proteína YdjN e da proteína FliY. Após uma bactéria ser modificada para decrescer a atividade da proteína YdjN ou as atividades da proteínas YdjN e FliY, a capacidade de produção de L-cisteína pode ser concedida à bactéria. A proteína YdjN e a proteína FliY são proteínas codificadas pelo gene ydjN e pelo gene fliY, respectivamente. As atividades das proteínas YdjN e FliY de uma bactéria podem ser decrescidas, por exemplo, por modificação da bactéria tendo os genes fliY e ydjN para diminuir as atividades de FliY e YdjN codificadas por estes genes. Com o propósito de intensificar a capacidade de produção de L- cisteína,quer a atividade de FliY quer a atividade de YdjN pode ser diminuída, mas é preferível decrescer a atividade de, YdjN, e é mais preferível decrescer ambas as atividades.
Na presente invenção, "decrescer" a atividade inclui decrescer a atividade de uma cepa modificada para um nível menor do que aquela do da cepa de tipo selvagem ou não modificada, e desaparecimento completo da atividade, a não ser que especialmente especificado.
Os inventores da presente invenção encontraram genes novos codificadores de proteínas cujas deleções do DNA cromossômico de Pantoea ananatis intensificou a capacidade de produção de L-cisteína, e designados de fliY e ydjN, respectivamente, porque mostraram homologia alta com fliY e ydjN de E. coli (78% e 80%, respectivamente). Neste relatório descritivo, "homologia" pode significar "identidade".
N presente invenção, em adição aos genes fliY e ydjN de E. coli, genes fliY e ydjN de Pantoea ananatis, e genes homólogos daqueles genes de outras bactérias também podem ser chamados de gene fliY e gene ydjN, respectivamente.
Exemplos específicos do gene fliY incluem um gene compreendendo a seqüência de nucleotídeos em SEQ ID NO; 5 ou 7. Exemplos específicos do gene ydjN incluem um gene compreendendo a seqüência de nucleotídeos em SEQ ID NO: 1 ou 3.
O gene fliY de Escherichia coli cepa MGl 655 é mostrado em SEQ ID NO: 5, e a seqüência de aminoácidos codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO: 6. O gene fliY de Pantoea ananatis cepa SCl 7 é mostrado em SEQ ID NO: 7,e a seqüência de aminoácidos codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO. 8.
A seqüência de nucleotídeos do gene ydjN de Escherichia coli cepa MGl655 é mostrada em SEQ ID NO: 1, e a seqüência de aminoácidos codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO: 2. A seqüência de nucleotídeos do gene ydjN de Pantoea ananatis cepa SC17 é mostrada em SEQ ID NO: 3, e a seqüência de aminoácidos codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO: 4.
As proteínas FliY e YdjN não são limitadas às proteínas tendo as seqüência de aminoácidos e seus homólogos anteriormente mencionados, e podem ser uma sua variante, o gene fliY ou gene ydjN pode ser um gene codificador de uma variante da proteína FliY ou proteína YdjN. Uma variante da proteína FliY ou da proteína YdjN significa uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, 4, 6 ou 8 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições, e tendo a função da proteína FliY ou proteína YdjN. Embora o número significado pelo termo acima mencionado "uma ou várias" possa diferir dependendo das posições dos resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína ou dos tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, é preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente 1 a 5.
Uma cepa deficiente em gene ydjN mostra absorção decrescida de S-sulfo-cisteína e L-cistina como mostrado na seção de Exemplos. Portanto, é estimado que a proteína YdjN tem uma função para participar na absorção de S-sulfo-cisteína e L-cistina.
Por outro lado, embora haja uma referência apontando para a possibilidade de participação de FliY em absorção de L-cistina (Butler et al., Life Sci., 52,1209-1215 (1993); Hosie et al., Res. Microbiol., 152,259-270 (2001)), é estimado que ela não participa na absorção de L-cistina, ou a sua atividade é menor do que aquela de YdjN, se ela participa naquela absorção, como mostrado na seção de Exemplos. Em qualquer caso, se ambos os genes ydjN e fliY são deletados, a capacidade de produção de L-cisteína é notavelmente aumentada em comparação com aquela obtenível pela deleção de qualquer um deles. Portanto, embora a função de FliY ainda seja indefinida, ela é caracterizada pelo fato de que sua deleção melhora a capacidade de produção de L-cisteína.
As substituições, deleções, inserções ou adições anteriormente mencionadas de um ou vários resíduos de aminoácido são uma mutação conservativa que preserva a função normal da proteína. A mutação conservativa é tipicamente uma substituição conservativa. A substituição conservativa é uma mutação na qual substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição for um sítio de ácido aromático; entre Leu, Ile e Vai, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofóbico, entre Gln e Asn, se for um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se for um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Exemplos específicos de substituições conservativas incluem; substituição de Ser ou Thr no lugar de Ala; substituição de Gln, His ou Lys no lugar de Arg; substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp no lugar de Asn; substituição de Asn, Glu ou Gln no lugar de Asp; substituição de Ser ou Ala no lugar de Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg no lugar de Gln; substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp no lugar de Glu; substituição de Pro no lugar de Gly; substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr no lugar de His; substituição de Leu, Met, Val ou Phe no lugar de lie; substituição de lie, Met, Val ou Phe no lugar de Leu; substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg no lugar de Lys; substituição de lie, Leu, Val ou Phe no lugar de Met; substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu no lugar de Phe; substituição de Thr ou Ala no lugar de Ser; substituição de Ser ou Ala no lugar de Thr; substituição de Phe ou Tyr no lugar de Trp; substituição de His, Phe ou Trp no lugar de Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu no lugar de Vai. As acima mencionas substituição, deleção, inserção, adição, inversão etc. de aminoácidos podem resultar de uma mutação naturalmente ocorrente (mutante ou variante) devido à diferença individual, uma diferença de espécies, ou semelhantes de uma bactéria da qual o gene é derivado.
Ademais, o gene tendo uma tal mutação conservativa como descrita acima pode ser um gene codificador de uma proteína mostrando uma homologia de 80% ou maior, preferivelmente 90% ou maior, mais preferivelmente 95% ou maior, ainda mais preferivelmente 97% ou maior, particularmente preferivelmente 99% ou maior, com a seqüência de aminoácidos codificada inteira. Informação de seqüência dos genes codificadores de uma proteína homóloga a tal FliY ou YdjN pode ser facilmente obtida de bancos de dados abertos ao público por pesquisa BLAST ou pesquisa FASTA usando o gene fliY ou gene ydjN de tipo selvagem da cepa de Escherichia coli anteriormente mencionada como uma seqüência de consulta, e os genes podem ser obtidos pelo uso de oligonucleotídeos produzidos baseados em tais seqüências de gene conhecidas como iniciadores.
Os genes fliY ou YdjN podem ser um gene que hibridiza com uma seqüência complementar às seqüência de nucieotídeos anteriormente mencionadas ou uma sonda que pode ser preparada das seqüências de nucieotídeos anteriormente mencionadas sob condições estringentes, desde que a função da proteína codificada pelo gene fliY ou gene ydjN seja mantida. Exemplos de "condições estringentes" incluem condições de lavagem a 60°C, lxSSC, 0,1% SDS, preferivelmente 60°C, 0,lxSSC, 0,1% SDS, uma vez ou preferivelmente duas ou três vezes.
A sonda usada para a hibridização acima mencionada pode ter uma seqüência parcial de uma seqüência complementar do gene. Uma tal sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos preparados baseados nas seqüência de nucieotídeos conhecidas do gene como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo estas seqüências como o modelo. Quando um fragmento de DNA de um comprimento de cerca de 300 pb é usado como a sonda, as condições de lavagem após a hibridização podem ser, por exemplo, 50°C, 2xSSC, e 0,1% SDS
Métodos para decrescer as atividades da proteína FliY ou proteína YdjN serão explicados abaixo. As atividades das proteínas do Sistema de decomposição de L-cisteína também podem ser decrescidas pelos mesmos métodos. Nas seguintes descrições, uma proteína objetiva cuja atividade é para ser decrescida é chamada de uma "proteína alvo", e um gene codificador da proteína alvo é chamado de um "gene alvo".
Atividade de uma proteína alvo pode ser decrescida, por exemplo, por redução da expressão de um gene alvo. Especificamente, por exemplo atividade intracelular da proteína alvo pode ser reduzida pela deleção de parte da ou da região codificadora inteira do gene alvo em um cromossomo. Para decrescer a atividade de uma proteína alvo, expressão do gene alvo também pode ser decrescida pela modificação de uma seqüência de controle de expressão do gene alvo tal como promotor e seqüência de Shine- Dalgarno (SD). Ademais, a quantidade de expressão do gene também pode ser reduzida pela modificação de uma região de não-tradução diferente da seqüência de controle de expressão. Ademais, o gene inteiro incluindo as seqüências em ambos os lados do gene em um cromossomo pode ser deletado. Ademais, a expressão do gene também pode ser reduzida pela introdução de uma mutação de uma substituição de aminoácido (mutação missensé), um códon de terminação (mutação nonsensé), ou uma mutação de deslocamento de matriz que adiciona ou deleta um ou dois nucleotídeos na região codificadora do gene alvo em um cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 266,20833-20839 (1991)). Atividade de uma proteína alvo também pode ser decrescida pela intensificação da atividade de um regulador que infra-regula a proteína alvo, ou supressão da atividade de um regulador de supra-regula a proteína alvo. Atividade de uma proteína alvo também pode ser decrescida pela adição de uma substância que infra-regula a atividade ou a expressão da proteína alvo, ou eliminação de uma substância que supra-regula a atividade ou a expressão da proteína alvo.
Ademais, a modificação pode ser uma modificação caudada por uma mutagênese típica causada por raios-X ou irradiação UV, ou pelo uso de um mutágeno tal como N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina, desde que a modificação resulte em um decréscimo da atividade da proteína alvo.
Modificação de uma seqüência de controle de expressão é realizada preferivelmente em um ou mais nucleotídeos, mais preferivelmente dois ou mais nucleotídeos, particularmente preferivelmente três ou mais nucleotídeos. Quando uma região codificadora é deletada, a região a ser deletada pode ser uma região N-terminal, uma região interna ou uma região C-terminal, ou mesmo a região codificadora inteira, desde que a função da proteína alvo seja decrescida ou deletada. Deleção de uma região mais longa pode costumeiramente mais seguramente inativar um gene. Ademais, matrizes de leitura a montante e a jusante da região a ser deletada podem ser iguais ou diferentes.
Para inativar um gene pela inserção de uma seqüência na região codificadora do gene, a seqüência pode ser inserida em qualquer parte da região codificadora do gene. Quanto mais longa a seqüência inserida, maior a possibilidade de inativação do gene. Matrizes de leitura localizadas a montante e a jusante do sítio de inserção podem ser iguais ou diferentes. A seqüência a ser inserida não é particularmente limitada desde que a inserção decresça ou delete a função da proteína alvo codificada, e exemplos incluem, por exemplo, um transposon trazendo um gene de resistência a antibiótico, um gene útil para a produção de L-cisteína e assim por diante.
Um gene alvo no cromossomo pode ser modificado como descrito acima, por exemplo, pela preparação de uma versão do tipo deleção do gene na qual uma seqüência parcial do gene é deletada de modo que a versão do tipo deleção do gene não produza uma proteína alvo que normalmente funciona, e transformação de uma bactéria com um DNA contendo o gene do tipo deleção para causar recombinação homóloga entre o gene do tipo deleção e o gene nativo no cromossomo, e desta maneira substituir o gene do tipo deleção no lugar do gene no genoma. A proteína alvo codificada pelo gene do tipo deleção tem uma conformação diferente daquela da proteína de tipo selvagem, se ela for mesmo produzida, e assim a função é reduzida ou deletada. Tal rompimento de gene baseada em substituição de gene utilizando recombinação homóloga tem sido já estabelecida, e há um método chamado integração conduzida por Red (Datsenko, K.A., e Warmer, BX., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97:6640-6645 (2000)), um método de uso de um DNA linear tal como um método utilizando a integração conduzida por Red em combinação com um sistema de excisão derivado de fago λ (Cho, E.H., Gumport, R.I, Gardner, J.R, J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) (referir a W02005/010175), um método de uso de um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura ou um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método de utilização de um vetor suicida não tendo origem de replicação em um hospedeiro (Patente U.S. N0 6.303.383, Patente Japonesa Publicada N0 05-007491), e assim por diante.
Decréscimo do nível de transcrição de um gene alvo pode ser confirmada por comparação da quantidade de mRNA transcrito do gene com aquela da cepa de tipo selvagem ou não modificada. Exemplos do método para confirmar a quantidade de mRNA incluem hibridização de Northern, RT-PCR (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001), e assim por diante.
Decréscimo da quantidade de uma proteína alvo também pode ser confirmado por Western blotting usando um anticorpo (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
Ademais, quando a proteína alvo é a proteína YdjN, decréscimo da quantidade da proteína também pode ser confirmado pela medição da atividade de absorção de S-sulfo-cisteína ou L-cistina da célula.
Se uma proteína tem a atividade para absorver o composto anteriormente mencionado pode ser confirmado pela preparação de uma bactéria na qual expressão de um gene codificador da proteína é aumentada a partir de uma cepa parental ou de tipo selvagem, pela cultura desta cepa em um meio, e pela quantificação de L-cisteína, L-cistina, um seu derivado ou precursor, ou uma mistura deles acumulado no meio contendo S-sulfo-cisteína ou L-cistina, e pela confirmação do decréscimo da quantidade decrescida do composto adicionado no meio. Exemplos específicos são descritos na seção de Exemplos.
Quando o gene fliY ou gene ydjN de Escherichia coli é usado como o gene fliY ou gene ydjN, o gene fliY ou gene ydjN pode ser obtido por PCR usando DNA cromossômico de Eseheriehia coli como um modelo e iniciadores preparados baseando-se na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou 1. Similarmente, o gene fliY ou gene ydjN de Pantoea ananatis pode ser obtido por PCR usando DNA cromossômico de Pantoea ananatis como um modelo e iniciadores preparados baseando-se na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 ou 3. O gene fliY ou gene ydjN de outras bactérias também pode ser obtido de cromossomos ou de biblioteca de DNAs cromossômicos das bactérias por hibridização ou PCR usando uma sonda ou iniciadores preparados baseando-se na informação de seqüência acima mencionada.
Quando é necessário aumentar a expressão do gene fliY ou gene ydjN com o propósito de confirmar se a proteína FliY ou proteína YdjN tem a atividade para absorver S-sulfo-cisteína, L-cistina ou L-cisteína,cópias múltiplas do gene podem ser introduzidas em uma bactéria. Com o objetivo de introduzir cópias múltiplas do gene fliY ou gene ydjN em uma bactéria, o método de uso de um vetor do tipo cópias múltiplas, o método de introdução de cópias múltiplas de genes em DNA cromossômico por recombinação homóloga, e assim por diante podem ser usados como descrito para o geme SAT.
<2> Método para produzir L-cisteína, L-cístina, seu derivado ou precursor ou sua mistura da presente invenção
Estes compostos podem ser produzidos pelo cultivo da bactéria da presente invenção obtida como descrito acima em um meio, e colheita de L-cisteína, L-cistina, um seu derivado ou precursor ou uma sua mistura do meio. Exemplos do derivado ou precursor de L-cisteína incluem S- sulfo-cisteína, um derivado de tiazolidina, um hemi-tio-cetal correspondendo ao derivado de tiazolidina mencionado acima, e assim por diante.
Exemplos do meio usado para a cultura podem incluir meios ordinários contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fonte de enxofre, íons inorgânicos, e outros componentes orgânicos como exigidos.
Como a fonte de carbono, sacarídeos tais como glicose, frutose, sacarose, melaço e hidrolisado de amido, e ácidos orgânicos tais como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico podem ser usados.
Como a fonte de nitrogênio, sais inorgânicos de amônio tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio, compostos orgânicos de nitrogênio tal como hidrolisado de feijão-soja, gás amônia e assim por diante podem ser utilizados.
Como a fonte de enxofre, compostos inorgânicos de enxofre podem ser usados tais como sulfatos, sulfitos, sulfetos, hipossulfitos e tiossulfatos.
Como nutrientes orgânicos em quantidades traço, é desejável adicionar substâncias exigidas tais como bitamina Bb extrato de levedo e assim por diante em quantidades apropriadas. Diferentes destes, fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons de ferro e assim por diante são adicionados em quantidades pequenas.
A cultura é preferivelmente realizada sob condições aeróbicas por 30 a 90 horas. A temperatura da cultura é preferivelmente controlada para estar em 250C a 37°C, e o pH é preferivelmente controlado para ser 5 a 8 durante a cultura. Para ajuste do pH, substâncias orgânicas ou inorgânicas ácidas ou alcalinas, gás amônia e assim por diante podem ser usadas. Colheita de L-cisteína da cultura pode ser realizada, por exemplo, por qualquer combinação de métodos de resina de troca iônica conhecidos, precipitação e outros métodos conhecidos.
L-Cisteina obtida como descrito acima pode ser utilizada para a produção de derivados de L-cisteína. Os derivados de cisteína incluem metil-cisteína, etil-cisteína, carbo-cisteína, sulfo-cisteína, acetil-cisteína, e assim por diante.
Ademais, quando um derivado de tiazolidina de L-cisteína é acumulado no meio, L-cisteína pode ser produzida pela colheita do derivado de tiazolidina do meio para quebrar a reação de equilíbrio entre o derivado de tiazolidina e a L-cisteína de modo que L-cisteína seja excessivamente produzida. Além do mais, quando S-sulfo-cisteína é acumulada no meio, ela pode ser convertida em L-cisteína pela redução com um agente redutor tal como ditiotreitol.
L-Cisteína, um seu derivado, e assim por diante colhidos na presente invenção podem conter células de microorganismos, componentes do meio, umidade, e subprodutos de metabolismo microbiano em adição ao composto desejado. Pureza do composto desejado colhido é 50% ou mais alta, preferivelmente 85% ou mais alta, particularmente preferivelmente 95% ou mais alta.
Exemplos
Daqui em diante, a presente invenção será explicada mais especificamente. Nas seguintes descrições, cisteína significa L-cisteína.
Exemplo 1: Identificação de proteína tendo atividade para absorção de cisteína ou cistina(1) Aquisição de cepa mutante incapaz de utilizar S-sulfo-cisteína como única fonte de cisteína(l-l) Aquisição de cepa deficiente em gene cysE a partir de E. coli cepa MG1655 (ATCC N0 47076)
O gene cysE foi deletado pelo método chamado de "integração acionada por Red" desenvolvido por Datsenko, Warmer et ai. (Proc. Natl Acad. Sei. USA, 2000, vol. 97, N0 12, pp.6640-6645) e o sistema de excisão derivado de fago λ (J. Bacteriol., 2000, 184,5200-5203 (2002)). De acordo com a integração acionada por Red, uma cepa de gene disruptado pode ser construída em uma etapa pelo uso de um produto de PCR obtido com oligonucleotídeos sintéticos planejados de modo a terem uma parte de um gene desejado no lado 5', e uma parte de um gene de resistência a antibiótico no lado 3'. Por combinação adicional do sistema de excisão derivado do fago λ, o gene de resistência a antibiótico incorporado na cepa de gene disruptado pode ser eliminado. Métodos para deleção de um gene de E. coli usando esta integração acionada por Red e o sistema de excisão derivado de fago λ são descritos em detalhe em Patente Japonesa Publicada N0 2005-058227, W02007/179880, e assim por diante. Uma cepa deficiente em gene cysE também foi obtida na mesma maneira.
Um fragmento de DNA contendo um gene de resistência a antibiótico (gene de resistência à canamicina (Kmr)) entre seqüências homólogas a ambas as extremidades do gene cysE foi obtido por PCR. Materiais experimentais e procedimento experimental específicos foram iguais àqueles descritos em Patente Japonesa Publicada N0 2005-058227, exceto que DcysE(Ec)-F (ccggcccgcg cagaacgggc cggtcattat ctcatcgtgt ggagtaagca tgaagcctgc ttttttatac taagttggca, SEQ ID NO: 50), e DcysE(Ec)-R (actgtaggcc ggatagatga ttacatcgca tccggcacga tcacaggaca cgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga, SEQ ID NO: 51) foram usados como os iniciadores, e pMW118-(ÀattL-Kmr-XattR) (W02006/093322A2) foi utilizado como um modelo. A cepa deficiente obtida foi chamada MG1655AcysE.
(1-2) Preparação de bibliotecas de cepas mutadas em transposon a partir da cepa MG1655AcysE Pelo uso de EZ-Tn5<KAN-2>Tnp Transposome Kit (EPICENTRE), uma biblioteca de cepas nas quais Tn5 foi aleatoriamente inserido foi preparada a partir da cepa MG1655AcysE. Como para procedimento experimental específico, o experimento foi realizado de acordo com a instrução anexada ao kit.
(1-3) Triagem de biblioteca de cepas mutantes para cepa mutante incapaz de utilizar S-sulfo-cisteína como a única fonte de cisteína
A biblioteca acima mencionada foi tríada para uma cepa mutante incapaz de utilizar S-sulfo-cisteína como a única fonte de cisteína. A "fonte de cisteína" aqui refere-se a um substrato que é absorvido pelas células e usado para a produção de cisteína. Quando cisteína não pode ser sintetizada em células, a própria cisteína está incluída na fonte de cisteína. As cepas mutantes foram cada uma aplicadas como mancha com um palito de dente sobre cada um de o meio de ágar M9 (Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press) contendo 20 μΜ de cisteína e o meio de ágar M9 contendo 20 μΜ de S-sulfo-cisteína (cat# C2196, SIGMA) para realizar a triagem de uma cepa mutante capaz de crescer sobre um meio contendo cisteína, mas incapaz de crescer sobre um meio contendo S-sulfo-cisteína. Uma cepa foi obtida como a cepa mutante alvo a partir de cerca de 1.000 cepas. Quando a região do genoma de Tn5 inserido foi identificado, foi verificado que Tn5 estava inserido no gene ydjN.
(1 -4) Análise de capacidade de assimilação de S-sulfo- cisteína de cepa deficiente em gene ydjN
Com o objetivo de elucidar se o fenótipo da cepa mutante obtida pela inserção de Tn5 foi devido à deficiência funcional do gene ydjN, uma cepa deficiente em gene ydjN foi construída a partir da cepa MG1655AcysE pela integração acionada por Red descrita acima. Para estas construções, iniciadores DydjN(Ec)-F (cactatgact gctacgcagt gatagaaata ataagatcag gagaacgggg tgaagcctgc ttttttatac taagttggca, SEQ ID NO: 52), e DydjN(Ec)-R (aaagtaaggc aacggcccct atacaaaacg gaccgttgcc agcataagaa cgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga, SEQ ID NO: 53) foram usados. A cepa deficiente construída foi chamada de cepa MG1655AcysEAydjN::Km. A cepa MG1655AcysEAydjN::Km também foi obtida a partir de MG1655 pelo mesmo método.
Crescimento das cepas sobre o meio de ágar M9 (desde que MgCl2 fosse utilizado no lugar de MgSO4 na mesma concentração como o componente do meio) contendo 50 μΜ de cisteína, 50 μΜ de cistina ou 50 μΜ de S-sulfo-cisteína é mostrado na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 34</column></row><table>
Embora qualquer fonte de enxofre de enxofre não fosse adicionada no meio de ágar M9 neste experimento (M9 sem enxofre), as cepas não-rompidas em cysE (cepa MG1655, cepa MG1655AydjN::Km etc.) podem crescer com uma quantidade traço de compostos enxofre contaminantes. Portanto, com o propósito de investigar se é possível ou não o uso de S-sulfo-cisteína como uma fonte cisteína, a origem {background) da cepa deficiente em cysE deve ser determinada. Isto é, a cepa MG1655AcysE não pode crescer sem fonte de cisteína (sem enxofre), mas pode crescer pelo uso de cisteína, cistina ou S-sulfo-cisteína como uma fonte de cisteína, se existirem. Foi verificado que a cepa deficiente em ydjN pôde crescer com cisteína ou cistína como uma fonte de cisteína, mas ela não pôde crescer com S-sulfo-cisteína como uma fonte de cisteína (Tabela 1, cepa MG1655∆cysE∆ydjN::Km). Deste resultado, foi verificado que ydjN foi um gene indispensável para a assimilação de S-sulfo-cisteína. Por outro lado, mesmo se ydjN fosse deletado, cisteína e cistina poderiam ser assimiladas.
(2) Análise funcional de ydjN e fliY
(2-1) Clonagem do gene ydjN de E. coli cepa MG1655 e de P ananatis cepa SC17
Quando o gene ydjN foi clonado de E. coli cepa MG1655 de Pantoea ananatis cepa SC17 (Patente U.S. N0 6,596,517), vetores de expressão baseados em pMIV-Pnlp8 e pMIV-Pn1pO foram usados. O promotor potente nlp8 (ou promotor nlpO) e um terminador rrnB foram integrados nestes vetores de expressão, e pela inserção de um gene alvo entre o promotor e o terminador, ele pode ser funcionalizado como uma unidade de expressão. "PnlpO" indica um promotor de um gene nlpD de tipo selvagem, e "Pnlp8" indica um promotor mutante do gene nlpD. Os detalhes da construção destes vetores de expressão são descritos em Exemplo 3 como construção de pMIV-Pnlp8-YeaS7 e pMIV-PnlpO-YeaS3. Em pMIV-Pnlp8-yeaS7 e pMIV- PnlpO-yeaS3, o gene yeaS está clonado entre o promotor nlp8 ou nlpO e o terminador rrnB usando os sítios SalI e Xbal. Se os sítios Sall e Xbal são antecipadamente planejados em iniciadores, o gene ydjN também pode ser inserido naqueles vetores na mesma maneira que aquela para yeaS.
Isto é, os plasmídeos de expressão a serem construídos correspondem aos plasmídeos de expressão tendo estruturas de pMIV-Pnlp8- yeaS7 e pMTV-PnlpO-yeaS3 mencionadas adiante nos quais o gene yeaS está substituído pelo gene ydjN.
O gene ydjN de E. coli foi amplificado pelo uso de DNA genômico usando o DNA genômico da cepaMG1655 como um modelo bem como ydjN(Ec)-SalIFW2 (acgcgtcgac atgaactttc cattaattgc gaacatcgtg gtg, SEQ ID NO: 54) e >^7V(Ec)-xbaIRV2 (ctagtctaga ttaatggtgt gccagttcgg cgtcg, SEQ ID NO; 55) como iniciadores com um ciclo de PCR consistindo de 94°C por 5 minutos, seguidos por 30 ciclos de 98°C por 5 segundos, 55°C por 5 segundos e 72°C por 90 segundos, e incubação final a 4°C. No caso de P.
ananatis, o gene ydjN foi amplificado pelo uso do DNA genômico da cepa SC17 como um modelo bem como ydjN2(Pa)SalIFW (acgcgtcgac atggatattc ctcttacgc, SEQ ID NO: 56) e ydjN2(Pa)-xbalRV (tgctctagat tagctgtgct ctaattcac, SEQ ID NO: 57) como iniciadores como um ciclo de PCR consistindo de 94°C por 5 minutos, seguidos por 30 ciclos de 98°C por 5 segundos, 55°C por 5 segundos e 12°C por 2 minutos, e incubação final a 4°C. Sítios SaR e Xbal foram planejados em ambas as extremidades em todos os iniciadores. Os fragmentos amplificados foram cada um integrados no vetor pMIV-PnlpO, e os plasmídeos construídos foram chamados de acordo com a origem do gene {E. coli (Ec) ou P. ananatis (Pa)) como pMIV-PnlpO- ydjN(Ec) e pMIV-PnlpO-ydjN(Pa), respectivamente. Ademais, como um vetor vazio correspondendo a estes plasmídeos para controle, foi usado pMIV-5JS (Patente Japonesa Publicada N0 2008-99668).
(2-2) Análise funcional de ydjN
Quando ydjN foi deletado, as cepas não puderam crescer com S-sulfo-cisteína como uma única fonte de cisteína. Portanto, foi presumido que o gene ydjN pode codificar um transportador (fator de absorção) de S- sulfo-cisteína. Portanto, foi examinado se houve alguma diferença na capacidade para absorver S-sulfo-cisteína entre a cepa deficiente em ydjN da cepa MG1655 (cepa MG1655AydjN::Km descrita acima) e cepa intensificada em ydjN da cepa MG1655 (cepa MG1655 transformada com pMIV-PnlpO- ydjN(Ec)). Investigação similar também foi conduzida para cistina e cisteína como compostos relacionados similares à S-sulfo-cisteína.
O experimento de absorção de S-sulfo-cisteína foi realizado como segue. Primeiro, a cepa MG1655AydjN::Km e uma cepa de controle para a mesma, cepa MGl655, bem como a cepa MG1655/pMIV-PnlpO- ydjN(Ec) e uma cepa de controle para a mesma, cepa MG1655/pMIV-5JS, foram cultivadas durante a noite no meio líquido LB (tubo de ensaio de 3 ml, 37°C, cultura agitada). As células foram colhidas do meio de cultura, lavadas duas vezes com o meio mínimo M9 contendo 0,4% de glicose, e então suspensas no meio mínimo M9 contendo 0,4% de glicose em uma densidade duas vezes mais alta do que aquela do meio de cultura original. A suspensão de células de cada cepa preparada como descrito acima foi inoculada em um volume de 40 μl a 4 ml do meio mínimo M9 contendo 0,4% de glicose, e cultura foi realizada a 37°C com agitação pelo uso de um aparelho de cultura medidor de OD automaticamente, BIO-PHOTORECORDER TN-1506 (ADVANTEC).
Quando OD alcançou cerca de 0,3 (cultura por cerca de 5 horas), 20 μl de S-sulfo-cisteína 100 mM foram adicionados (concentração final: 0,5 mM), e o meio foi amostrado (0,2 ml do meio de cultura foi retirado e misturado com 0,8 ml de ácido clorídrico 1 N) durante o tempo de 2 horas após a adição de S-sulfo-cisteína (0 hora). Análise de aminoácido da amostra em cada instante de tempo foi realizada com um analisador de aminoácido (L- 8900, Hitachi), e concentração de S-sulfo-cisteína no meio foi determinada por comparação com uma amostra padrão de 0,4 mM similarmente preparada com ácido clorídrico 1 N. Na cultura, 25 mg/L de cloranfenicol foram adicionados no meio para todas as cepas hospedando plasmídeo.
Mudança da concentração de S-sulfo-cisteína do meio de cultura de cada cepa é mostrada em Fig. 1. No gráfico, as cepas MG1655/pMIV-PnlpO-ydjN(Ec), MG1655/pMIV-5JS, e MG1655∆cysE∆ydjN::Km são abreviadas como MG1655/ydjN(Ec)- plasmídeo, MG1655/vetor e MGl 655 delta-ydjN, respectivamente. Foi verificado que a concentração de S-sulfo-cisteína no meio gradualmente decresceu com a cepa de tipo selvagem, mas S-sulfo-cisteína não decresceu com a cepa deficiente em ydjN, e decréscimo de S-sulfo-cisteína foi acelerado com a cepa deficiente em ydjN em comparação com a cepa de controle. Ademais, quando YdjN foi analisada com um programa de predição de proteína de membrana SOSUI (http://pb.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/), dez domínios de transmembrana foram encontrados em YdjN, e portanto foi esperado ela era uma proteína de membrana. Os resultados descritos acima fortemente sugeriram que ydjN codificou um transportador (fator de absorção) de S-sulfo-cisteína. Ademais, visto que deficiência em ydjN incitou incapacidade de assimilação de S-sulfo-cisteína (Tabela 1), ydjN é considerado como o único transportador de S-sulfo-cisteína em E. coli.
Ademais, absorção de cistina ou cisteína por YdjN também foi examinada pelo uso do mesmo sistema experimental e adição de cistina ou cisteína como um substrato em vez de S-sulfo-cisteína. Os resultados são mostrados em Figs. 2 e 3. Os nomes de cepa nos gráficos são iguais àqueles usados em Fig. 1.
Como mostrado em Fig. 2, os mesmos resultados que aqueles para S-sulfo-cisteína foram obtidos quando cistina foi usada como o substrato, e portanto foi sugerido que YdjN teve a atividade de absorção de cistina. Neles cepa deficiente em ydjN, absorção de cistina notavelmente diminuiu, e atividade residual para absorção de cistina tornou-se extremamente fraca.
Portanto, foi considerado que YdjN é um transportador maior de cistina na E. coli cepa MG1655. Contudo, visto que a cepa deficiente em ydjN pôde também crescer com cistina como a fonte de cisteína (Tabela 1), foi considerado que houve um transportador de cisteína diferente de pelo menos YdjN. Por outro lado, quando cisteína foi usada como o substrato, a absorção não foi promovida mesmo quando ydjN foi intensificado como mostrado em Fig. 3, e portanto foi presumido que ele pode não participar na absorção de cisteína.
Ademais, o plasmídeo pMIV-PnlpO-ydjN(Pa) expressando ydjN derivado de P. ananatis foi introduzido em E. coli e P. ananatis para intensificar ydjN, e foi examinada absorção de S-sulfo-cisteína sob tal intensificação de ydjN. Os resultados são mostrados em Fig. 4. No gráfico, pMIV-PnlpO-ydjN(Pa) e pMIV-5JS estão abreviados como ydjN(Pa)- plasmídeo e vetor, respectivamente.
Foi confirmado que YdjN de P. ananatis também teve a atividade para absorver S-sulfo-cisteína como YdjN de E. coli. Ademais, as seqüências de aminoácidos de YdjN de P. ananatis e YdjN de E. coli mostram uma homologia de 80%.
(2-3) Análise funcional de fliY
Então, com o propósito de examinar se fliY participou na absorção de cistina e cisteína, cepas intensificadas e deficiente em fliY foram construídas primeiro.
Deleção do gene fliY foi realizada pelo uso da integração acionada por Red e do sistema de excisão acima mencionados derivado de fago λ. DfliY(Ec)-FW (atgaaattag cacatctggg acgtcaggca ttgatgggtg tgatggccgt tgaagcctgc ttttttatac taagttggca, SEQ ID NO: 58) e DfliY(Ec)-RV (ttatttggtc acatcagcac caaaccattt ttcggaaagg gcttgcagag cgctcaagtt agtataaaa agctgaacga, SEQ ID NO: 59) foram usados como iniciadores, e pMW118- (AattL-CmR-AattR) (Katashkina ZhI et al., Mol. Biol. (Mosk), 39(5):823-31, 2005) foi utilizado como um modelo. Cepa MG1655AfliY foi obtida da cepa MG1655, e cepa MGl 655AydjN:: KmAfliY::Cm foi obtida da cepa MG1655AydjN::Km descritas acima.
Ademais, com o propósito de intensificar o gene fliY usando um plasmídeo, pMIV-PnlpO-fliY(Ec) foi construído. O método de construção foi igual ao método de clonagem do gene ydjN em pMIV-PnlpO mencionado acima, mas neste experimente, para amplificação do gene fliY, fliY(Ec)SalI-F (acgcgtcgac atgaaattag cacatctggg acg, SEQ ID NO: 60) e fliY(Ec)XbaI-R (ctagtctaga ttatttggtc acatcagcac c, SEQ ID NO: 61) foram utilizados como iniciadores.
Primeiro, com o propósito de investigar o efeito da deficiência de fliY sobre a absorção de cistina, um experimento de absorção foi conduzido pelo uso de cistina como um substrato com 4 cepas, as cepas MGl 655, MG165AydjN::Km, MG1655AfliY, e MG1655AydjN::KmAfliY: :Cm. Os resultados são mostrados em Fig. 5. No gráfico, "WT" representa a cepa MG1655, "delta-ydjN" representa a cepa MG1655ΔydjN, "delta fliY" representa a cepa MGl 655ΔfliY, e "delta-ydjN,fliY" representa a cepa MG1655AydjN: : KmΔfli Y: :Cm. Como um resultado, a taxa de absorção de cistina da cepa MG1655AfliY, na qual apenas o gene fliY foi deletado, não foi diferente daquela da cepa MGl655 (Fig. 5). Ademais, embora fosse observado que a taxa de absorção de cistina da cepa MG1655ΔydjNAfliY, que foi uma cepa duplamente deficiente em gene fliY e em gene ydjN, pareceu decrescer em comparação com aquela da cepa MG1655ΔydjN, na qual apenas ydjN era deficiente, a diferença foi muito pequena, e portanto não ficou claro se foi uma diferença significativa induzida pela deficiência de fliY{Fig. 5).
Ademais, absorção de cistina pela E. coli cepa MGl655 intensificada em fliY também foi investigada. Os resultados são mostrados em Fig. 6. No gráfico, "fliY(Ec)-plasmídeo" representa pMIV-PnlpO-fliY(Ec), e "vetor" representa pMIV-5JS. Também quando fliY foi intensificado, diferença significativa em absorção de cistina não foi observada (Fig. 6).
Embora houvesse referências sugerindo uma possibilidade de participação de fliY em absorção de cisteína (Butler et al., Life Sci., 52,1209- 1215 (1993) etc.), não houve descobertas diretamente provando isto através de experimentos. De fato, resultados mostrando participação de FliY em absorção de cisteína não foram obtidos também neste experimento. Ademais, dos resultados deste experimento, foi predito que mesmo se FliY participou na absorção de cistina, ela não foi um transportados elevadamente ativo, como YdjN. Em adição, visto que a cepa duplamente deficiente em ydjN e fliY pôde crescer com cistina como uma única fonte de cisteína, é considerado que um transportador de cistina existe além destes dois tipos de transportadores. Ademais, embora a atividade de absorção de cisteína de cepa deficiente em fliY também fosse examinada, uma tal diferença significativa como vista para ydjN não foi vista em comparação com a cepa não deficiente, e foi considerado que FliY não participou na absorção de cisteína (Fig. 7). Por outro lado, visto que cisteína no meio gradualmente decresceu (Fig. 7), absorção de cisteína para dentro das células foi esperada, e é suposto que um certo transportador de cisteína (sistema de absorção) existe em E. coli.
Exemplo 2: Produção de cisteína por E. coli deficiente em ydjN e/ou em fliY
(1) Construção da cepa de E. coli produtora de cisteína Com o objetivo de conceder capacidade de produção de cisteína a uma cepa de E. coli deficiente em ydjN e/ou em fliY, foi construído um plasmídeo contendo um cysE mutante codificador de uma serina-acetil- transferase mutante para a qual retro-inibição por L-cisteína foi reduzida (Pedido Publicado de Patente U.S. N0 2005/0112731(Al)). Especificamente, um plasmídeo pACYC-DEl foi construído de acordo com o método para a construção de pACYC-DES descrito em Patente Japonesa Publicada N0 2005- 137369 (Pedido Publicado de Patente U.S. N0 2005/0124049(A1), EP 152S108(A1)) desde que fosse omitida a etapa de incorporação de um gene mutante serA 5 codificador de uma fosfo-glicerato-desidrogenase dessensibilizada para retro-inibição por serina (descrito em Patente U.S. N0 6.180.373). Embora pACYC-DES transportasse o serA5 mutante acima mencionado, o gene codificador de SAT mutante dessensibilizada para a retro-inibição, o gene cysEX, e o gene ydeD codificador de L-cisteína e fator de secreção de acetil-serina (Patente U.S. N0 5,972,663), pACYC-DEl construído acima não contêm serA5 mencionado acima, mas continham cysEX e ydeD. Para expressão de todos os genes, o promotor ompA foi usado. Então, pACYC-DEl foi digerido com Mnul e auto-ligado para construir um plasmídeo no qual cerca de 330 pb da seqüência interna do gene ydeD ORF foram deletados. Este plasmídeo obtido como descrito acima não expressando YdeD funcionando como um fator de secreção de cisteína, mas transportando apenas cysEX foi chamado pACYC-El, e usado para os seguintes experimentos. Com isto pACYC-El, 5 tipos de cepas, E. coli MG1655, MG1655∆fliY, MG1655∆fliY::Km, MG1655∆ydjN::Km e MG1655∆fliY∆ydjN::Km, foram transformadas para conceder capacidade de produção de cisteína a cada cepa.
(2) Investigação do efeito de deficiência de ydjN e de deficiência de fliY em E. coli sobre a produção de cisteína Com o propósito de investigar o efeito de deficiência de ydjN e de deficiência de fliY sobre a produção de cisteína e de compostos relacionados com cisteína por fermentação, cultura para produção fermentativa foi conduzida com bactérias produtoras de cisteína obtidas pela introdução de pACYC-El na cepa MGl655, cepas deficientes em ydjN ou fliY, e cepa duplamente deficiente em ydjN q fliY derivada de cepa MG1655, e quantidades de produção de cisteína e de compostos relacionados com cisteína foram comparadas. Para a cultura, um meio para produção de cisteína por E. coli tendo a seguinte composição foi usado.
Meio para a produção de cisteína por E. coli (concentrações dos componentes são concentrações finais):
Componente 1:
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Para estes componentes, soluções de estoque de concentração de100/47,5-vezes (Componente 1), 100/47,5-vezes (Componente 2), 50-vezes (Componente 3), e 1.000-vezes (Componente 4) foram preparadas, e misturadas quando usadas, e o volume da mistura foi ajustado para um volume predeterminado com água esterilizada para obter as concentrações finais. Esterilização foi realizada por autoclavagem a IlO0C por 30 minutos (Componentes 1 e 2), esterilização com ar quente a 180°C por 5 horas ou mais (Componente 5), e esterilização por filtração (Componentes 3 e 4).
A cultura de produção de cisteína foi conduzida de acordo com os seguintes procedimentos. As cepas produtoras de cisteína foram cada uma aplicadas e espalhadas sobre meio ágar LB, e pré-cultivadas durante a noite a 37°C. Então, as células correspondendo a cerca de 7 cm sobre a placa foram raspadas duas vezes com uma alça de inoculação de tamanho de 10 μΐ (Β Iue Loop, NUNC), e inoculadas em 2 ml do meio de produção de cisteína por E. coli anteriormente mencionado contido em um tubo de ensaio grande (diâmetro interno: 23 mm, comprimento: 20 cm). As quantidades de células inoculadas foram ajustadas de modo que as quantidades de células no momento do início da cultura devessem ser substancialmente iguais. A cultura foi realizada a 32°C com agitação, e terminada após 40 horas. A cisteína acumulada no meio foi quantificada pelo método descrito por Gaitonde, M.K. (Biochem. J., 1967 Aug., 104(2):627-33). Cisteína quantificada acima continha cistina, seus derivados tal como S -sulfo-cisteína, derivados de tiazolidina e hemi-tio-cetais, ou uma mistura deles, em adição à cisteína, e o mesmo deve se aplicar à cisteína quantificada abaixo como descrito acima, a não ser que especialmente especificado. Cisteína e outros compostos quantificados como descrito acima podem ser descritos como compostos relacionados com L-cisteína. O experimento foi realizado seis vezes para cada uma das cepas, e as médias e os desvios padrão dos resultados são mostrados em Tabela 2.
Tabela 2
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Como mostrado em Tabela 2, foi verificado que a deficiência de fliY e a deficiência de ydjN foram eficazes para aumentar o acúmulo dos compostos relacionados à cisteína. Além disso, foi verificado que a deficiência dupla de fliY e ydjN exerceu um efeito sinérgico de aumento notável dos compostos relacionados à cisteína em comparação com a deficiência de cada gene sozinho.
Exemplo 3: Produção de cisteína por P. ananatis deficiente em ydjN e/ou fliY
(1) Preparação de P. ananatis cepa EYPS1976(s) produtora de cisteína
Uma bactéria de P. ananatis produtora de cisteína foi construída pela introdução de cysE5 codificador de uma serina-acetil- transferase mutante (Pedido Publicado de Patente U.S. N° 2005/0112731), e serA348 codificador de uma 3-fosfo-glicerato-desidrogenase mutante (J. Biol. Chem., 1996, 271 (38):23235-8), e pela intensificação dQyeaS codificador de um fator de secreção para vários aminoácidos (Patente Japonesa Publicada N° 2000-189180) e do grupo cysPTWA codificador de um fator de absorção de fonte de enxofre. Os detalhes do método de construção são descritos abaixo.
(1-1) Introdução de CysE5 e YeaS em P. ananatis cepa SC17
Primeiro, um plasmídeo para construir a cepa anteriormente mencionada foi construído.
O método para isto é descrito abaixo.
Por PCR usando o DNA cromossômico de E. coli MG165 5 (ATCC N0 47076) como um modelo bem como Pl (agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac, SEQ ID NO. 30) e P2 (agctgagcat gcttccaact gcgctaatga cgc, SEQ ID NO: 31) como iniciadores, foi obtido um fragmento de DNA contendo uma região de promotor do gene nlpD (PnlpO) de cerca de 300 pb. Nas extremidades 5' e 3' dos iniciadores anteriormente mencionados, sítios para as enzimas de restrição SalI e PaeI foram planejados, respectivamente. O ciclo de PCR foi como segue: 950C por 3 minutos, então 2 ciclos de 950C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 12°C por 40 segundos, 25 ciclos de 94°C por 20 segundos, 55°C por 20 segundos, e 72°C por 15 segundos, e 12°C por 5 minutos como o ciclo final. O fragmento obtido foi tratado com Sall e PaeI e inserido em pMIV-5JS (Patente Japonesa Publicada N0 2008- 99668) no sítio SaR-Paei para obter um plasmídeo pMIV-PnlpO. A seqüência de nucleotídeos do fragmento Pael-Sall do promotor PnlpO inserido neste plasmídeo pMIV-PnlpO foi como mostrada em SEQ ID NO: 27.
Então, por PCR usando o DNA cromossômico de MGl655 como um modelo, bem como P3 (agctgatcta gaaaacagaa tttgcctggc ggc, SEQ ID NO: 32) e P4 (agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc, SEQ ID NO: 33) como iniciadores, foi obtido um fragmento de DNA contendo uma região de terminador do gene rrnB de cerca de 300 pb. Nas extremidades 5' dos iniciadores acima mencionados, foram planejados sítios para as enzimas de restrição Xbal e BamHÍ, respectivamente. O ciclo de PCR foi como segue: 95°C for 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C for 60 segundos, 50°C for 30 segundos, e 72°C por 40 segundos, 25 ciclos de 94°C por 20 segundos, 59°C por 20 segundos, e 72°C por 15 segundos, e 72°C por 5 minutos como o ciclo final. O fragmento obtido foi tratado com Xbal e BamHl, e inserido em pMIV-PnlpO no sítio Xbal -BamHl para obter um plasmídeo pMIV-PnlpO-ter.
Então, por PCR usando o DNA cromossômico da cepa MG1655 como modelo, bem como P5 (agctgagtcg acgtgttcgc tgaatacggg gt, SEQ ID NO: 34) e P6 (agctgatcta gagaaagcat caggattgca gc, SEQ ID NO: 35) como iniciadores, foi obtido um fragmento de DNA de cerca de 700 pb contendo o gene yeaS. Nas extremidades 5' dos iniciadores anteriormente mencionados, foram planejados os sítios para as enzimas de restrição Sall e Xbal, respectivamente. O ciclo de PCR foi como segue: 950C por 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos, 25 ciclos de 94°C por 20 segundos, 55°C por 20 segundos, e 72°C por 15 segundos, e 72°C por 5 minutos como o ciclo final. O fragmento obtido foi tratado com Sall e Xbal, e inserido em pMIV-PnlpO-ter no sítio Slal-Xbal para obter um plasmídeo pMIV-Pnlp0-YeaS3. Como descrito acima, foi construída uma unidade de expressão de yeaS compreendendo o vetor pMTV-5JS no qual o promotor nlpD, o gene yeaS, e o terminador rrnB estavam ligados nesta ordem.
Com o objetivo de modificar a região -10 do promotor nlpD para torná-lo um promotor forte, a região -10 foi randomizada pelo seguinte método. A região do promotor nlpD contém duas regiões presumidamente funcionando como promotores (Fig. 8), e são indicadas como pnlpl e pnlp2, respectivamente, no desenho. Por PCR, usando o plasmídeo pMIV-PnlpO como um modelo bem como Pl e P7 (atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatna ngtcactgg ("n" significa que o resíduo correspondente pode ser qualquer um de a, t, g e c), SEQ ID NO: 36) como iniciadores, foi obtido um fragmento de DNA no qual a região -10 contida na seqüência da extremidade 3' do promotor nlpD (chamado de -IO(Pnlpl)) foi randomizada. O ciclo de PCR foi como segue: 95°C por 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos, 25 ciclos de 94°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos, e 72°C por 15 segundos, e 72°C por 5 minutos como o ciclo final.
Ademais, por PCR usando o plasmídeo pMIV-PnlpO como um modelo bem como P2 e P8 (tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg eg ("n" significa que o resíduo correspondente pode ser qualquer um de a, t, g e c), SEQ ID NO: 37) como iniciadores, foi similarmente obtido um fragmento de DNA no qual a região -10 contida na seqüência de extremidade 5' do promotor nlpD (chamado de -10(Pnlp2)) foi randomizada (Fig. 1). O ciclo de PCR foi como segue: 95°C por 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos, 25 ciclos de 94°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos, e 72°C por 15 segundos, e 72°C por 5 minutos como o ciclo final.
Os fragmentos de extremidades 3' e 5' obtidos puderam ser ligados usando os sítios BglII planejados nos iniciadores P7 e P8, e o comprimento total do promotor nlpp no qual as duas regiões -10 foram randomizadas pôde ser construído por tal ligação. Por PCR usando este fragmento como um modelo bem como Pl e P2 como iniciadores, foi obtido um fragmento de DNA correspondendo a um promotor nlpD do tipo modificado do comprimento total. O ciclo de PCR foi como segue: 95°C por 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos, 12 ciclos de 94°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos, e 12°C por 15 segundos, e 72°C por 5 minutos como o ciclo final.
O fragmento amplificado foi tratado com as enzimas de restrição Sall e PaeI para as quais os sítios foram planejados nas extremidades 5' dos iniciadores, e inserido no plasmídeo pMIV-Pnlp0-YeaS3 similarmente tratado com Sali e Pael para substituir o Pnlp mutante no lugar da região de promotor nlpD de tipo selvagem (PnlpO) no plasmídeo. De tais plasmídeos, um tendo a seqüência de promotor (PnlpS) mostrada em SEQ ID NO: 28 foi selecionado, e, chamado pMIV-Pnlp8-YeaS7 (a seqüência de nucleotídeos do fragmento Pael-Sali do promotor Pnlp8 inserido neste plasmídeo foi como mostrada em SEQ ID NO: 28). Na mesma maneira, um fragmento de DNA da região de promotor nlpD contendo uma mutação foi inserido no plasmídeo pMTV-PnlpO-ter tratado com SalI e PaeI para substituir o Pnlp mutante no lugar da região de promotor nlpD (região de Pnlp0) no plasmídeo. Um deles foi chamado pMIV-Pnlp23-ter. A seqüência de nucleotídeos do fragmento Pael-SaH do promotor Pnlp23 inserido neste plasmídeo foi como mostrada em SEQ ID NO: 29.
Então, de pMW-Pomp-cysE5 (W02005/007841), a porção de cassete Pomp-cysE5 foi excisada com Pael e Sacl e inserida no mesmo sítio de pMIV-5JS para construir pMIV-Pomp-CysE5. pMW-Pomp-cysE5 foi um plasmídeo obtido pela inserção do gene cysE5 codificador de SAT mutante ligada com o promotor de gene ompC no pMWl 18. Do pACYC184 (Número de Acesso no GenBank/EMBL de X06403, disponível em NIPPON GENE), o gene de resistência à tetraciclina foi excisado com XBaI e £co88I, e este fragmento de gene foi tratado com o fragmento de Klenow, e então inserido em pMIV-Pomp-CysE5 no sítio PvuI para construir pMT-Pomp-CysE5. Então, pMIV-Pnlp8-YeaS7 foi digerido com HindIII, sua extremidade foi cegada com o fragmento de Klenow, e então digerido com Ncol para excisar um fragmento contendo o cassete do terminador Pnlp8-YeaS-rrnB e o marcador de resistência a cloranfenicol. Este fragmento foi ligado com um fragmento de digestão com Smal e Ncol de pMT-Pomp-CysE5 similarmente 25 tendo pMIV-5JS como a estrutura principal {backbone) para construir pMT- EY2. pMT-EY2 é um plasmídeo tendo o cassete terminador Pnlp8-YeaS-rra£ e o cassete Pomp-CysE5 em um plasmídeo.
pMT-EY2 descrito acima tem os sítios de ligação de fago Mu originados de pMIV-5JS (Patente Japonesa Publicada N0 2008-99668). Pela permissão deste plasmídeo coexistir com o plasmídeo auxiliar pMHIO tendo Mu transposase (Zimenkov D. et al., Biotechnologiya e (em russo), 6, 1-22 (2004)) na mesma célula, o cassete de terminador PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS- rrnB incluindo o marcador de resistência a cloranfenicol localizado entre os sítios de ligação de fago Mu neste plasmídeo pMT-EY2 pode ser inserido no cromossomo de P. ananatis cepa SC17 (Patente U.S. N0 6,596,517). Ademais, visto que o marcador de resistência a cloranfenicol no plasmídeo pMT-EY2 existe entre dois sítios de ligação de fago λ ^ttR e AattL), o marcador de resistência a cloranfenicol pode ser excisado e removido pelo método descrito mais adiante.
Primeiro, uma cepa SC17 introduzida com pMHO por eletroporação foi selecionada por cultura durante a noite a 3O0C sobre um meio de ágar LB contendo 20 mg/L de canamicina. O transformante obtido foi cultivado a 30°C, e pMX-EY2 foi posteriormente introduzido nesta cepa por eletroporação. Esta cepa transformada com ambos pMHIO e pMT-EY2 recebeu um choque térmico com as condições de 42°C por 20 minutos, e colônias de cepas resistentes a cloranfenicol foram selecionadas sobre o meio de ágar LB contendo 20 mg/L de cloranfenicol. A temperatura da cultura para esta seleção foi 39°C. Como descrito acima, cerca de 50 clones foram obtidos, e cura de pMHIO e pMT-EY2 foi realizada pela cultura de cada clone a 39°C por 48 horas sobre o meio de ágar LB. Foi obtida uma cepa mostrando resistência a cloranfenicol devido à inserção do cassete no cromossomo e mostrando sensibilidades à canamicina e à ampicilina devido à cura de ambos os plasmídeos. Ademais, foi confirmado que o cassete desejado foi inserido no cromossomo da cepa obtida por PCR usando o DNA cromossômico desta cepa como um modelo bem como P1 e P6 como iniciadores. Todos os clones obtidos foram chamados de EYOl a EY50, respectivamente, e a cultura de produção de L-cisteína foi realizada pelo uso das cepas EYOl a EY50 como descrito abaixo. A cepa EY19 foi selecionada, a qual foi um clone que produziu L-cisteína na quantidade mais alta como um resultado da cultura.
Um meio de produção de L-cisteína (composição: 15 g/L de sulfato de amônio, 1,5 g/L de di-hidrogeno-fosfato de potássio, 1 g/L de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 0,1 g/L de triptona, 0,05 g/L de extrato de levedo, 0,1 g/L cloreto de sódio, 20 g/L de carbonato de cálcio, 40 g/L de glicose, e 20 mg/L de tetraciclina) foi usado para a cultura.
A cultura de produção de L-cisteína foi realizada pelo seguinte procedimento. A cepa SC17/pMT-PompCysE5 e a cepa SC17/pMT-EY2 foram cada uma aplicadas sobre o meio de ágar LB para realizar a cultura durante a noite a 34°C então as células correspondendo a 1/8 da placa foram raspadas com uma alça de inoculação, inoculados para dentro de 2 ml do meio de produção de L-cisteína contido em um tubo de ensaio grande (diâmetro interno: 23 mm, comprimento: 20 cm), e cultivadas a 32°C com agitação a de 220 a 230 rpm, e a cultura foi terminada após dois dias.
O marcador de resistência a cloranfenicol introduzido na cepa EY19 foi removido com um sistema de excisão derivado de fago λ. Especificamente, a cepa EY19 foi transformada com pMT-Int-Xis2 (W02005/010175) trazendo o gene pMT-Int-Xis2 de fago λ, e uma cepa EYl 9(s) mostrando sensibilidade a cloranfenicol foi obtida dos transformantes produzidos. Exemplos de remoção de um marcador usando o sistema de excisão derivado de fago λ são descritos em detalhe em Patente Japonesa Publicada N0 2005-058227, W02007/119880, e assim por diante.
(1-2) Preparação de cepa intensificada em expressão de gene cysPTWA a partir da cepa EY19(s)
Então, com o propósito de intensificar a expressão do gene cysPTWA, o promotor localizado a montante do grupo de genes cysPTWA no cromossomo foi substituído pelo promotor potente anteriormente mencionado Pnlp8. Um fragmento de DNA contendo o promotor nlp8 de cerca de 300 pb foi obtido por PCR usando pMIV-Pnlp8-YeaS7 como um modelo bem como Pl e Ρ2 como iniciadores. O ciclo de PCR foi como segue: 95°C por 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos, 20 ciclos de 94°C por 20 segundos, 59°C por 20 segundos, e 72°C por 15 segundos, e 72°C por 5 minutos como o ciclo final.
O fragmento de DNA amplificado contendo o promotor nlp8 foi tratado com fragmento de Klenow, inserido no plasmídeo pMW 118- (λttL-KmR-λattR) (W02006/093322A2) digerido com Xbal e então tratado com o fragmento de Klenow para obter um plasmídeo pMW-Km-Pnlp8. Por PCR usando pMW-Km-Pnlp8 como um modelo bem como P9 (tccgctcacg atttttttca tcgctggtaa ggtcatttat cccccaggaa aaattggtta, SEQ ID NO: 38) e PlO (tttcacaccg ctcaacegca gggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg, SEQ ID NO: 39) como iniciadores, foi amplificado um fragmento de DNA de cerca de 1,6 kb contendo o cassete Km-Pnlp8. O ciclo de PCR para esta amplificação foi como segue: 95°C por 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 12°C por 40 segundos, 30 ciclos de 94°C por 20 segundos, 54°C por 20 segundos, e 12°C por 90 segundos, e 72°C por 5 minutos como o ciclo final. Em ambos os iniciadores, foi planejada uma seqüência servindo como um alvo no cromossomo para inserção de um fragmento desejado por integração λ-dependente (o método chamado "integração acionada por Red " (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, vol. 97, N° 12, pp.6640-6645)) (neste caso, uma seqüência próxima do promotor de cysPTWÁ). Portanto, se o fragmento de DNA obtido é inserido na cepa desejada por esta integração λ-dependente, é obtida uma estrutura na qual Km-Pnlp8 está inserido imediatamente antes do gene cysPTWA mo cromossomo, e o gene cysPTWA é ligado com o promotor nlp8. A seqüência de nucleotídeos do grupo de genes cysPTWA é mostrada em SEQ ID NO: 19, e as seqüências de aminoácidos codificadas pelos genes cysP, cysT e cysW são mostradas em SEQ ID NOS: 20 a 22, respectivamente. A seqüência de nucleotídeos do gene cysA e a seqüência de aminoácidos codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOS: 23 e 24, respectivamente.
A P. ananatis cepa SC17(0)/RSF-Red-TER é uma cepa hospedeira para eficientemente realizar a integração λ-dependente, e ela é uma cepa obtida pela introdução do plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER que expressa genes gam, bei e exo de λ (doravante chamados de "genes λ Red ") na cepa SC 17(0), que é uma cepa de P. ananatis resistente ao produto de gene λ Red (W02008/075483). Um método para construir o plasmídeo RSF-Red- TER é revelado em detalhe em W02008/075483.
A cepa SC17(0)/RSF-Red-TER anteriormente mencionada foi cultivada com adição de EPTG para induzir expressão de genes λ Red para preparar as células para eletroporação. O fragmento de DNA desejado acima mencionado foi introduzido nestas células por eletroporação, e uma cepa recombinante na qual o promotor nlp8 fora inserido a montante do gene cysPTWA por integração λ-dependente foi obtida pelo uso da resistência à canamicina como um marcador. Por PCR usando o DNA cromossômico da cepa obtida como um modelo, bem como Pll (ctttgtccctttagtgaagg, SEQ ID NO: 40) e P12 (agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac, SEQ ID NO: 41) como iniciadores, foi confirmado que a estrutura desejada, Km- Pnlp8-cysPTWA, foi formada, e esta cepa foi chamada de cepa SC 17(0)- Pnlp8-PTWA.
Então, o DNA cromossômico da cepa SC17(0)-Pnlp8-PTWA foi purificado, e 10 μg deste DNA cromossômico foram introduzidos na cepa EY19(s) por eletroporação para obter uma cepa resistente à canamicina. Amplificação foi conduzida por PCR usando o DNA cromossômico da cepa obtida como um modelo bem como Pll e P12 como iniciadores para confirmar que a estrutura de Km-Pnlp8-cysPTWA havia sido introduzida no cromossomo da cepa EYl9(s). A cepa obtida como descrito acima foi chamada de cepa EYP197. Ademais, o marcador de resistência à canamicina foi removido do cromossomo pelo uso de pMT-Int-Xis2 como descrito acima, e a cepa que se tornou sensível à canamicina foi chamada de cepa EYP197(s).
(1-3) Preparação de cepa trazendo gene (serA348) de 3-fosfo- glicerato-desidrogenase mutante de cepa EYP197(s)
Como um gene de 3-fosfo-glicerato-desidrogenase a ser introduzido na bactéria produtora de L-cisteína, o gene serA348 que é um gene codificador de 3-fosfo-glicerato-desidrogenase de Pantoea ananatis e codificador de uma enzima mutante incluindo uma mutação para substituição de um resíduo de alanina no lugar do resíduo de asparagina na 348a posição (N348A) (J. Biol. Chem., 1996,271 (38):23235-8) foi construído pelo seguinte método.
A seqüência do gene serA de tipo selvagem derivado de Pantoea ananatis e a seqüência de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOS: 17 e 18, respectivamente. Com o propósito de obter um fragmento de DNA de lado de extremidade-3' do gene serA no qual a mutação anteriormente mencionada foi introduzida, PCR foi realizada pelo uso de DNA cromossômico da cepa SC17 como um modelo bem como P13 (agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactg gaa, SEQ ID NO: 42) e P14 (gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc, SEQ ID NO: 43) como iniciadores (95°C por 3 minutos, então 2 ciclos de 950C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos, 25 ciclos de 94°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos, e 72°C por 60 segundos, e 12°C por 5 minutos como o ciclo final). Então, com o propósito de obter o fragmento de DNA de lado de extremidade-5' no qual a mutação foi introduzida, PCR foi realizada na mesma maneira pelo uso do DNA cromossômico da cepa SC17 como um modelo bem como Pl5 (agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg, SEQ ID NO: 44) e Pl6 (aaaaccgccc gggcgttctc ac, SEQ ID NO: 45) como iniciadores (95°C por 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 12°C por 40 segundos, 20 ciclos de 94°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos, e 110°C por 20 segundos, e 110°C por 5 minutos como o ciclo final). Ambos os fragmentos de PCR obtidos foram tratados com a enzima de restrição SmaI, e ligados pelo uso de uma DNA ligase para obter um fragmento de DNA correspondendo a um gene serA mutante de comprimento total incluindo a mutação desejada (N348A). Este fragmento de DNA foi amplificado por PCR usando o como um modelo bem como P13 e Pl5 como iniciadores (95°C por 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C por 60 segundos, 50°C por 30 segundos, e 72°C por 40 segundos, 15 ciclos de 94°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos, e 72°C por 75 segundos, e 12°C por 5 minutos como o ciclo final). Os sítios de enzima de restrição SalI e Xbal planejados nos iniciadores Pl3 e Pl5 foram tratados com SalI e Xbal, e o fragmento foi inserido em pMIV-Pnlp8-ter similarmente tratado com SalI e Xbal para preparar pMIV-Pnlp8-serA348.
O pMIV-Pnlp8-serA348 construído transportava o sítio de ligação de Mu originando em pMIV-5JS (Patente Japonesa Publicada N0 2008-99668). Pelo uso deste plasmídeo junto com o plasmídeo auxiliar pMHIO tendo Mu transposase, o cassete de terminador Pnlp8-serA348-rrnB incluindo o marcador de resistência a cloranfenicol pode ser inserido no cromossomo da P. ananatis cepa SC17, como descrito acima. O plasmídeo pMIV-Pnlp8-scrA348 e pMH10 foram introduzidos na cepa SC 17(0) para obter uma cepa na qual o cassete de terminador Pnlp8-serA348-rrnB foi inserido no cromossomo. Por PCR usando os iniciadores Pl e P15, foi confirmado que o cassete desejado existia nas células. A atividade de 3-fosfo- gliceraldeído-desidrogenase em extratos celulares de cerca de 50 dos clones obtidos foi medida, e uma cepa que mostrou a atividade mais alta foi selecionada, e chamada de cepa SC17int-serA348. Então, 10 μg de DNA cromossômico da cepa SC17int-serA348 foram introduzidos na cepa EYP197(s) por eletroporação para obter uma cepa resistente a cloranfenicol, e por PCR usando os iniciadores P1 e P15, foi confirmado que a estrutura de Pnlp8-serA348 havia sido introduzida junta com o marcador de resistência a cloranfenicol no cromossomo da cepa EYP197(s). A cepa obtida como descrito acima foi chamada de cepa EYPS1976. Pelo método anteriormente mencionado para remover o marcador usando pMT-Int-Xis2, o marcador de resistência a cloranfenicol foi removido, e a cepa que se tornou sensível a cloranfenicol foi chamada de cepa EYPS1976(s).
(2) Construção da bactéria produtora de cisteína deficiente em ydjN e/ou fliY
Cepas deficientes em ydjN e/ou fliY foram construídas a partir da cepa EYPS1976(s). Uma cepa deficiente em gene ydjN e uma cepa deficiente em região fliY foram preparadas pela integração λ-dependente usando a P. ananatis cepa SC17(0)/RSF-Red-TER anteriormente mencionada como uma bactéria hospedeira.
O gene yecS gene (seqüência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 11, seqüência de aminoácidos: SEQ ID NO: 12) e o gene yecC (seqüência de nucleotídeos: SEQ ID NO: 13, seqüência de aminoácidos: SEQ ID NO: 14) são apresentados a jusante do gene fliY, e estes podem possivelmente formar um operon e funcionar como um transportador de ABC (informação de que yecS e yecC podem formar uma unidade de transcrição é mencionada em um banco de dados aberto ao público em um website na internet (http://ecocyc.org/))- Portanto para a deficiência em fliY, foi decidido deletar todos estes três genes (regiões flanqueando fliY).
Para obter um fragmento de DNA para uma cepa deficiente em gene ydjN, um iniciador DydjN(Pa)-F (acctctgctg ctctcctgac cagggaatgc tgcattacat cggagttgct tgaagcctgc ttttttatac taagttggca, SEQ ID NO: 46) e um iniciador DydjN(Pa)-R (agacaaaaac agagagaaag acctggcggt gtacgccagg tctggcgtga cgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga, SEQ ID NO: 47) foram usados, e para obter um fragmento de DNA para uma cepa deficiente em região fliY, um iniciador DfliY-FW (atggctttct cacagattcg tcgccaggtg gtgacgggaa tgatggcggt tgaagcctgc ttttttatac taagttggca, SEQ ID NO: 48) e um iniciador DyecC-RV (ttacgccgcc aacttctggc ggcaccgggt ttattgatta agaaatttat cgctcaagtt agtataaaaa agctgaacga, SEQ ID NO: 49) foram utilizados. Como um modelo, pMWn8- (ÀattL-Kmr-XattR)(W02006/093322A2) mencionado acima foi usado, e PCR foi realizada a 94°C por 5 minutos, seguidos por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por 2 minutos e 30 segundos para obter um fragmento de DNA compreendendo Kmr entre as seqüências homólogas cada uma usada para a recombinação.
Cada um dos fragmentos de DNA obtidos foram introduzidos em P. ananatis cepa SC17(0)/RSF-Red-TER por eletroporação para construir a cepa SC17(0)AdjN: :Km (o fragmento λattL-Kmr-λattR foi inserido na região ydjN de gene) e cepa SC17(0)AfliY: :Km (o fragmento XattL-Kmr- XattR foi inserido na região fliY de gene). Então, a cepa EYPS1976(s) foi transformada com os DNAs cromossômicos preparados da cepa 3C17(0)AydjN::Km e da cepa SC17(0)AfliY::Km para obter cepas deficientes em cada gene, cepa EYPSAydjN: :Km e cepa EYPSAfliY: :Km, a partir da cepa EYPS1976(s). Ademais, pMT-Int-Xis2 (W02005/010175) mencionado cima foi introduzido na cepa EYPSAfliY: :Km, e o gene de resistência à canamicina foi excisado pelo uso do sistema de excisão derivado de fago λ para obter a cepa EYPSAfliY sensível à canamicina. Então, a cepa EYPSAfliY foi transformada com o DNA cromossômico preparado da cepa SC17(0)AydjN::Km para obter uma cepa duplamente deficiente, cepa EYPSAfliYAydjN: :Km. Em uma tal maneira, foram construídas a cepa deficiente em gene ydjN, as cepas deficientes em região fliY, e a cepa duplamente deficiente para estes genes baseadas na bactéria produtora de cisteína, cepa EYPS1976(s).
(3) Investigação do efeito da deficiência de ydjN e da deficiência de fliY em P. ananatis sobre a produção de cisteína
Cultura para produção fermentativa foi realizada com a cepa deficiente em gene ydjN, as cepas deficientes em região fliY, e a cepa duplamente deficiente para estes genes obtidas acima, e quantidades de produção dos compostos relacionados com cisteína foram comparadas. Para a cultura, um meio de produção de cisteína por P. ananatis tendo a seguinte composição foi usado.
Meio de produção de cisteína por P. ananatis (concentração dos componentes são concentrações finais):
<table>table see original document page 57</column></row><table>
Para estes componentes, foram preparadas soluções de estoque de concentração de 10-vezes (Componente 1), 1000-vezes (Componente 2), 100/6-vezes (Componentes), 100-vezes (Componente 5), 350/6-vezes (Componente 6), 1.000-vezes (Componente 7) e 10-vezes (Componente 8), e misturados durante o uso, e o volume da mistura foi ajustado para um volume predeterminado com água esterilizada para obter as concentrações finais. Esterilização foi realizada por autoclavagem a IlO0C por 30 minutos (Componentes 1, 2, 3, 5 e 8), esterilização com ar quente a 180°C por 5 horas ou mais (Componente 4), e esterilização por filtração (Componentes 6 e 7).
A cultura de produção de cisteína foi conduzida de acordo com os seguintes procedimentos. As cepas produtoras de cisteína foram cada uma aplicadas e espalhadas sobre meio ágar LB5 e pré-cultivadas durante a noite a 34°C. Então, as células correspondendo a cerca de 7 cm sobre a placa foram raspadas duas vezes com uma alça de inoculação de tamanho de 10 μΐ (Blue Loop, NUNC), e inoculadas em 2 ml do meio de produção de cisteína por P. ananatis anteriormente mencionado contido em um tubo de ensaio grande (diâmetro interno: 23 mm, comprimento: 20 cm). As quantidades de células inoculadas foram ajustadas de modo que as quantidades de células no momento do início da cultura devessem ser substancialmente iguais.
A cultura foi realizada a 32°C com agitação, e terminada após 43 horas. Neste momento, o consumo completo de glicose no meio foi confirmado. A quantificação de cisteína acumulada no meio foi realizada pelo método descrito por Gaitonde, M.K. (Biochem. J., 1967 Aug., 104(2):627- 33). O experimento foi conduzido seis vezes para cada uma das cepas, e as médias e os desvios padrão dos resultados são mostrados em Tabela 3. Para a cepa deficiente em apenas fliY, aumento dos compostos relacionados à cisteína não foi observado, e para a cepa deficiente em apenas ydjN, os compostos relacionados à cisteína aumentaram levemente. Ademais, para a cepa duplamente deficiente para fliY e ydjN, aumento dos compostos relacionados à cisteína foi observado em um grau muito mais alto comparado com aquele obtenível com deficiência de um dos genes. Foi verificado que deficiência de ydjN em P. ananatis foi eficaz para a produção dos compostos relacionados à cisteína, e combinação adicional de deficiência de fliY exerceu um efeito sinérgico.
Tabela 3
<table>table see original document page 59</column></row><table>
Explicação da listagem de seqüências
SEQ ID NO: 1: Seqüência de nucleotídeos de gene ydjN de
Escherichia coli
SEQ ID NO: 2: Seqüência de aminoácidos de YdjN de
Eseheriehia coli
SEQ ID NO: 3: Seqüência de nucleotídeos de gene ydjN de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 4: Seqüência de aminoácidos de YdjN de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 5: Seqüência de nucleotídeos de gene fliY de Eseheriehia coli
SEQ ID NO: 6: Seqüência de aminoácidos de FliY de
Escheriehia coli
SEQ ID NO: 7: Seqüência de nucleotídeos de gene fliY de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 8: Seqüência de aminoácidos de FliY de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 9: Seqüência de nucleotídeos de gene eysE de
Eseheriehia coli
SEQ ID NO: 10: Seqüência de aminoácidos de SAT codificada pelo gene eysE de Eseheriehia coli
SEQ ID NO: 11: Seqüência de nucleotídeos de gene yecS de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 12: Seqüência de aminoácidos codificada pelo gene yecS de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 13: Seqüência de nucleotídeos de gene yecC de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 14: Seqüência de aminoácidos codificada pelo gene yecC de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 15: Seqüência de nucleotídeos de gene yeaS de Escherichia eoli
SEQ ID NO. 16: Seqüência de aminoácidos codificada pelo gene yeaS de Escheriehia eoli
SEQ ID NO: 17: Seqüência de nucleotídeos de gene serA de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 18: Seqüência de aminoácidos codificada pelo gene serA de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 19: Seqüência de nucleotídeos de grupo de genes eysPTWA
SEQ ID NO: 20: Seqüência de aminoácidos codificada pelo gene cysP
SEQ ID NO: 21: Seqüência de aminoácidos codificada pelo gene eysT
SEQ ID NO: 22: Seqüência de aminoácidos codificada pelo gene cysW
SEQ ID NO: 23: Seqüência de nucleotídeos de gene eysA
SEQ ID NO: 24: Seqüência de aminoácidos codificada pelo gene cysA
SEQ ID NO: 25: Seqüência de nucleotídeos de gene cysM
SEQ ID NO: 26: Seqüência de aminoácidos codificada pelo gene cysM
SEQ ID NO: 27: Seqüência de nucleotídeos de PnlpO SEQ ID NO: 28; Seqüência de nucleotídeos de Pnlp8
SEQ ID NO: 29: Seqüência de nucleotídeos de Pnlp23
SEQ ID NOS: 30 to 45: Iniciadores Pl a Pl6
SEQ ID NO: 46: Seqüência de nucleotídeos de iniciador DydjN(Pa)-F
SEQ ID NO: 47: Seqüência de nucleotídeos de iniciador DydjN(Pa)-R
SEQ ID NO: 48: Seqüência de nucleotídeos de iniciador DfliY-FW
SEQ ID NO: 49: Seqüência de nucleotídeos de iniciador DyecC-RV
SEQ ID NO: 50: Iniciador DcysE(Ec)-F
SEQ ID NO: 51: Iniciador DcysE(Ec)-R
SEQ ID NO: 52: Iniciador DydjN(Ec)-F
SEQ ID NO: 53: Iniciador DydjN(Ec)-R
SEQ ID NO: 54: Iniciador ydjN(Ec)-SalIFW2
SEQ ID NO: 55: Iniciador ydjN(Ec)-xbaIRV2
SEQ ID NO: 56: Iniciador ydjN2(Pa)-SalIFW
SEQ ID NO. 57: Iniciador ydjN2(Pa)-xbaIRV
SEQ ID NO: 58: Iniciador DfliY(Ec)-FW
SEQ ID NO: 59: Iniciador DfliY(Ec)-RV
SEQ ID NO: 60: Iniciador AiY(Ec)SalI-F
SEQ ID NO- 61: Iniciador AiY(Ec)XbaI-R
SEQ ID NO: 62: Seqüência de nucleotídeos do promotor Pnlp.
Claims (12)
1. Bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae, caracterizada pelo fato de ser capaz de produzir L-cisteína, e tem sido modificada para decrescer a atividade da proteína YdjN.
2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína YdjN tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: -2 ou 4, ou uma sua variante.
3. Bactéria de acordo com a reivindicação 1 ou 3 caracterizada pelo fato de que tem sido adicionalmente modificada para decrescer a atividade da proteína FliY.
4. Bactéria de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a proteína FliY tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou 8, ou uma sua variante.
5. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -4, caracterizada pelo fato de que a atividade da proteína YdjN ou FliY tem sido decrescida pela redução da expressão do gene ydjN ou gene fliY codificador da proteína, ou por rompimento do gene.
6. Bactéria de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o gene ydjN é selecionado do grupo consistindo de: (a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 3, (b) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou uma sonda que é preparada a partir da seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes, (c) um DNA que tem uma homologia de 95% ou maior com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 3.
7. Bactéria de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que o gene fliY é selecionado do grupo consistindo de: (d) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou 7, (e) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou 7, ou uma sonda que é preparada a partir da seqüência de nucleotídeos sob condições estringentes, (f) um DNA que tem uma homologia de 95% ou maior com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou 1:
8. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -7, caracterizada pelo fato de que adicionalmente tem pelo menos uma das seguintes características: i) tem sido modificada para aumentar a atividade de serina- acetil-transferase, ii) tem sido modificada para aumentar a expressão do gene yeaS, iii) tem sido modificada para aumentar a atividade de 3-fosfo- gliceraldeído-desidrogenase, iv) tem sido modificada para intensificar a atividade do sistema de transporte de sulfato/tiossulfato
9. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -8, caracterizada pelo fato de que pertence ao gênero Pantoea.
10. Bactéria de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é Pantoea ananatis.
11. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é Escherichia eoli.
12. Método para produzir L-cisteína, L-cistina, um derivado ou precursor das mesmas, ou uma mistura dos mesmos, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a bactéria como definida em qualquer uma das reivindicações Iall em um meio e colher L-cisteína, L-cistina, um derivado ou precursor das mesmas, ou uma mistura dos mesmos do meio.
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