JP2000157267A - 変異型ｍｅｔＪ遺伝子及びＬ−メチオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物を育種
し、同微生物を用いて発酵法によりＬ−メチオニンを製
造する。 【解決手段】 配列番号３に示すアミノ酸配列を有し、
かつ５５番目のアミノ酸残基がセリン残基以外のアミノ
酸残基に置換されたＬ−メチオニン生合成系のリプレッ
サータンパク質をコードする遺伝子を保持する微生物を
培地に培養し、培地中にＬ−メチオニンを生成蓄積せし
め、これを該培地から採取することにより、Ｌ−メチオ
ニンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エシェリヒア・コ
リ由来のＬ−メチオニン生合成系のリプレッサータンパ
ク質をコードする変異型遺伝子、同ＤＮＡを保持する微
生物、及びＬ−メチオニンの製造法に関する。Ｌ−メチ
オニンは、医薬等として重要なアミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】メチオニンは、工業的には化学合成によ
り製造されるＤＬ体が中心となっている。Ｌ体が必要な
場合は、このＤＬ体をアセチル化してＮ−アセチル−Ｄ
Ｌ−メチオニンとし、酵素的にＬ体だけを脱アセチル化
することによって製造される。

【０００３】一方、発酵法によるＬ−メチオニンの製造
については、Ｌ−メチオニンアナログ耐性変異株を用い
る方法が報告されているが、生産量は少なく、またＬ−
メチオニン生産に影響を与える因子は明らかではないた
め、最も発酵生産が困難なアミノ酸の一つである。例え
ば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli（E. col
i））K-12株を用いる方法が、公開特許公報昭５６−３
５９９２あるいは文献（Chattapadhyay, M. K. et al.,
Med. Sci. Res. 23, 775 (1995)、Chattapadhyay, M.
K. et al., Biotechnol. Lett. 17, 567-570 (1995)）
に報告されているが、いずれもＬ−メチオニンの生産量
は工業的に用いるには不十分であった。

【０００４】Ｌ−メチオニンの直接発酵法が困難である
理由として、生合成経路の複雑さと、強い代謝調節が原
因として考えられている。ほとんどの微生物では、Ｌ−
メチオニンの生合成は他のアミノ酸に比較して厳格に制
御されている。エシェリヒア・コリにおいては、Ｌ−メ
チオニンの生合成経路は、Ｌ−スレオニンの生合成経路
と一部共通であり、Ｌ−ホモセリンが共通の中間体とな
っている。Ｌ−ホモセリンからＬ−メチオニンへの固有
経路の第一段階は、metKによりコードされるホモセリン
トランスサクシニラーゼによって触媒されるが、同酵素
は最終生産物であるＬ−メチオニンとＬ−メチオニンの
代謝物であるＳ−アデノシルメチオニンにより協奏的な
阻害を受けることが知られている（Lee, L.-W. et al.,
J. Biol. Chem. 241, 5479-5480 (1966)）。このホモ
セリントランスサクシニラーゼによる反応以降のＬ−メ
チオニンの固有生合成経路の酵素遺伝子の発現は、リプ
レッサーであるMetJタンパク質による抑制を受けること
が明らかとなっている（Greene, R. C., Biosynthesis
of Methionine.in "Escherichai coli and Salmonella
Cellular and Molecular Biology/Second Edition", e
d. Neidhardt, F. D., ASM Press, pp. 542-560 (199
6).）。また、この抑制には、Ｓ−アデノシルメチオニ
ンがコリプレッサーとして働いている。

【０００５】上記のように、Ｌ−メチオニン生合成の調
節は、ホモセリントランスサクシニラーゼのフィードバ
ック阻害と生合成系遺伝子の発現抑制によって行われて
いる。従来の研究から、Ｌ−メチオニンアナログ耐性株
は、上記調節が解除されることで耐性を獲得できること
が明らかにされており、それらの耐性に関与する変異遺
伝子としてmetJ変異及びmetK変異が知られている。そし
て、metJ変異はリプレッサーとしての機能を失ったもの
であり、metK変異はコリプレッサーであり協奏阻害因子
でもあるＳ−アデノシルメチオニンの合成能が低下した
ものであると考えられている。また、エシェリヒア・コ
リでは、野生型metJ遺伝子及び変異型metJ遺伝子の構造
及び機能の解析に関する研究もなされている（Liljestr
and-Golden, C.A. et al., , J. Bacteriol., 157, 413
-419 (1984), Rafferty, J.B. etal., Nature, 341, 70
5-710 (1989), Saint-Girons, I. et al., J. Biol. Ch
em., 259, 14282-14285 (1984), Adelberg, E.D., J. B
acteriol., 76, 326 (1958), Bala, G.A. et al., J. B
acteriol., 171, 4095-4099 (1989)）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、Ｌ−メ
チオニン生合成に関与する酵素やその遺伝子について、
ある程度の研究はなされているが、Ｌ−メチオニンの発
酵生産に直接結びつく知見はほとんど得られておらず、
MetJタンパク質の活性とＬ−メチオニン生産能との関係
については関心が払われていない。

【０００７】本発明は、上記現状に鑑みなされたもので
あり、Ｌ−メチオニン生産に影響を与える因子を明らか
にしてＬ−メチオニン生産菌を育種し、発酵法によるＬ
−メチオニンの生産を可能とすることを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ね、多数のＬ−メチオニ
ンアナログ耐性株の中からＬ−メチオニン生産能を有す
る変異株を単離することに成功し、それらの変異株がme
tJ遺伝子の特定の部位に変異を有することを見い出し、
本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の
とおりである。

【０００９】（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すエシェ
リヒア・コリ由来のＬ−メチオニン生合成系のリプレッ
サータンパク質をコードする遺伝子。 （Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を有し、かつ、５
５番目のアミノ酸残基がセリン残基以外のアミノ酸残基
であるタンパク質。 （Ｂ）配列番号４において、５５番目のアミノ酸残基以
外の位置の１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、配列番
号４に示すアミノ酸配列の５５番目のアミノ酸残基に相
当するアミノ酸残基がセリン残基以外のアミノ酸残基で
あり、かつ、メチオニン生合成を抑制する活性が低下し
たタンパク質。

【００１０】（２）前記セリン残基以外のアミノ酸残基
がアスパラギン残基である（１）の遺伝子。

【００１１】（３）染色体上のＬ−メチオニン生合成系
のリプレッサータンパク質をコードする遺伝子が（１）
又は（２）に記載の遺伝子である微生物。 （４）エシェリヒア属細菌である（３）の微生物。

【００１２】（５）前記（３）又は（４）の微生物を培
地に培養し、培地中にＬ−メチオニンを生成蓄積せし
め、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−メ
チオニンの製造法。

【００１３】本発明において「Ｌ−メチオニン生産能」
とは、微生物を培地に培養したときに、培地中にＬ−メ
チオニンを蓄積する能力をいう。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、エシェリヒア・コリ由来のＬ−メチ
オニン生合成系のリプレッサータンパク質をコードする
遺伝子（metJ）において、コードされるタンパク質の５
５番目のアミノ酸残基がセリン残基以外のアミノ酸残基
に変異したＤＮＡ（以下、「変異型metJ遺伝子」ともい
う）である。ここで「５５番目」とは、metJ遺伝子の開
始コドンによってコードされるメチオニンを含めて数え
たときの位置をいう。通常、タンパク質が翻訳された後
に、Ｎ末端のメチオニン又はフォルミルメチオニンは除
去されることが多いが、このメチオニン又はフォルミル
メチオニンを除いて数えた場合は、前記セリン残基は５
４番目のアミノ酸残基である。

【００１５】本発明のＤＮＡは、後記実施例に示すよう
に、エシェリヒア・コリのＬ−メチオニンアナログ耐性
株の中からＬ−メチオニン生産能を有する変異株を選択
し、同変異株からmetJ遺伝子を単離し、その構造を明ら
かにすることによって取得されたものである。

【００１６】具体的には、N−メチル−N'−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン（NTG）を用いて変異処理したエシ
ェリヒア・コリJM109株から、１ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／
ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌのＤＬ−エチオニン又はＤＬ−ノ
ルロイシンを含む最少培地プレートで生育する変異株を
選択し、それらの変異株から、ペディオコッカス・アシ
ディラクティシ（ロイコノストック・メセンテロイデ
ス）ＩＦＯ３０７６株を用いたマイクロバイオアッセイ
（Tsunoda, T. et al., Amino Acids, 3, 7-13 (1961)
参照）により、Ｌ−メチオニン生産能を有する変異株を
選択した。その結果、約４５００株のエチオニン耐性株
から１株、約１０００株のノルロイシン耐性株から３
株、Ｌ−メチオニン生産能を有する変異株が得られた。

【００１７】これらの４株の変異株からmetJ遺伝子を単
離し、それらの塩基配列を決定したところ、意外なこと
に、いずれもコード領域の１６４番目の塩基がＧからＡ
に置換されていた。この塩基置換により、コードされる
アミノ酸配列は、野生株ではセリン残基である５５番目
のアミノ酸残基がアスパラギン残基に置換される。この
変異型metJ遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。ま
た、この塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列
を配列番号４に示す。

【００１８】Ｌ−メチオニン生産能を有する変異株は、
上記のようにＬ−メチオニンアナログとして２種類の化
合物を用いて独立に得られた菌株であるので、それぞれ
の変異は異なるものであると当初は考えられたが、いず
れも同一の変異によるものであったことから、metJ遺伝
子の上記変異点はＬ−メチオニン生産に重要であること
が示唆された。

【００１９】本発明のＤＮＡは、上記のようにアナログ
耐性変異株から取得されたものであるが、本発明によ
り、Ｌ−メチオニン生産に有効な変異型metJ遺伝子の変
異の位置が明らかとなったので、野生株から野生型metJ
遺伝子を単離し、同遺伝子に部位特異的変異法（Krame
r, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 15
4,350 (1987)）によって所定の変異を導入することによ
っても、変異型metJ遺伝子を取得することができる。す
なわち、野生型metJ遺伝子では、配列番号４に示すアミ
ノ酸配列において、５５番目のコドンはセリン残基をコ
ードしているが、これを、セリン残基以外のアミノ酸残
基をコードするコドンに置換すればよい。セリン以外の
アミノ酸残基としては、５５番目のセリン残基をそのア
ミノ酸残基に変化させたときに、該変異を有するmetJ遺
伝子を保持する微生物がＬ−メチオニン生産能を有する
ものであれば特に制限されないが、好ましくは、塩基性
アミノ酸残基、より好ましくはアスパラギン残基が挙げ
られる。

【００２０】本発明の遺伝子は、配列番号３に示す塩基
配列を有するＤＮＡの他に、配列番号４に示すアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ、及び配列番号４に示すアミノ
酸配列において、５５番目のアスパラギン残基が、セリ
ンを除く他のアミノ酸残基に変化した配列をコードする
ＤＮＡを含む。また、上記ＤＮＡに、配列番号４に記載
のアミノ酸配列における５５番目のアミノ酸残基以外の
位置において、１若しくは複数のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を生じる変異が加わって
も、コードされるタンパク質のメチオニン生合成を抑制
する活性が低下し、その結果、同ＤＮＡを保持する微生
物がＬ−メチオニン生産能を有するものであれば、その
ようなＤＮＡは本発明の遺伝子に含まれる。導入される
変異の数は、タンパク質の立体構造における変異アミノ
酸の位置や種類によっても異なり、Ｌ−メチオニン生合
成を抑制する活性が低下するものである限り特に制限さ
れないが、通常、１〜２０個、好ましくは１〜１０個で
ある。

【００２１】metJ遺伝子のクローニング等に用いるベク
ターとしては、例えばエシェリヒア・コリ細胞内で自律
複製可能なプラスミド、具体的にはpUC19、pUC18、pBR3
22、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられ
る。

【００２２】本発明の変異型metJ遺伝子の一例として、
配列表配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡは、同
遺伝子を保持するエシェリヒア・コリＴＮ１株（AJ1354
3）の染色体ＤＮＡから、配列番号１及び２に示す塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするポ
リメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymera
se chain reaction； White,T.J. et al., Trends Gene
t., 5,185 (1989)参照）により単離することができる。
ＴＮ１株（AJ13543）は、1998年11月24日付で、工業技
術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P- 1706
0として寄託されている。

【００２３】染色体上のＬ−メチオニン生合成系のリプ
レッサータンパク質をコードする遺伝子が上記変異型me
tJ遺伝子である微生物（以下、「本発明の微生物」とも
いう）は、Ｌ−メチオニン生産株として、又はＬ−メチ
オニン生産株を育種する出発材料として利用することが
できる。本発明の微生物としては、metJ遺伝子がMetJタ
ンパク質の５５番目のアミノ酸残基がセリン以外のアミ
ノ酸残基に置換されるような変異を有する変異株であっ
てもよいし、変異型metJ遺伝子が導入されたものであっ
てもよい。前記変異株としては、実施例に示すエシェリ
ヒア・コリＴＮ１株（FERM P- 17060）が挙げられる。

【００２４】変異型metJ遺伝子を保持していても、野生
型metJ遺伝子を発現可能な形態で保持する微生物は、野
生型metJ遺伝子が変異型metJ遺伝子に対して優性に作用
するために、変異型metJ遺伝子の効果が期待できない。
したがって、本発明の微生物としては、野生型metJ遺伝
子が正常に機能せず、かつ、変異型metJ遺伝子を保持す
ることが好ましい。このような微生物は、metJ遺伝子が
正常に機能しない変異株に、変異型metJ遺伝子を保持す
る組換えプラスミドを導入することによって得られる。
metJ遺伝子が正常に機能しない変異株は、例えば、metJ
遺伝子を破壊するか、あるいはプロモーター等のmetJ遺
伝子の転写調節配列を改変し、転写が起こらないように
することによって取得することができる。

【００２５】また、本発明の微生物は、微生物の染色体
ＤＮＡ上のmetJ遺伝子を、変異型metJ遺伝子で置換する
ことによっても取得することができる。具体的には、例
えば、温度感受性複製起点と変異型metJ遺伝子と薬剤耐
性マーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、
この組換えＤＮＡで微生物を形質転換し、温度感受性複
製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いて
これを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤ
ＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られ
る。こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株
は、染色体上にもともと存在するmetJ遺伝子との組換え
を起こし、染色体上のmetJ遺伝子と変異型metJ遺伝子と
の融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター
部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟
んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この
状態では正常なmetJ遺伝子が優性であるので、形質転換
株は正常なMetJを発現する。

【００２６】次に、染色体ＤＮＡ上に変異型metJ遺伝子
のみを残すために、２個のmetJ遺伝子の組換えにより１
コピーのmetJ遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製
起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮ
Ａから脱落させる。その際、正常なmetJ遺伝子が染色体
ＤＮＡ上に残され、変異型metJ遺伝子が切り出される場
合と、反対に変異型metJ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残さ
れ、正常なmetJ遺伝子が切り出される場合がある。いず
れの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養
すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に
保持される。続いて、温度感受性複製起点が機能しない
温度で培養すると、変異型metJ遺伝子が染色体ＤＮＡ上
に残された場合は、正常なmetJ遺伝子を含むプラスミド
が細胞から脱落するため、Ｌ−メチオニン生産能を示す
が、正常なmetJ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残された場合
はＬ−メチオニン生産能を示さない。したがって、この
形質によって、染色体ＤＮＡ上のmetJ遺伝子が変異型me
tJ遺伝子で置換された株を得ることができる。

【００２７】変異型metJ遺伝子を導入する宿主微生物と
しては、Ｌ−メチオニン生合成系がエシェリヒア・コリ
と同様の抑制を受けるものであれば特に制限されない
が、具体的にはエシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属
細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等の
コリネ型細菌等が挙げられる。

【００２８】変異型metJ遺伝子を導入するためのベクタ
ーとしては、エシェリヒア属細菌では前述したプラスミ
ドが、コリネ型細菌では、以下のものが挙げられる。 ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照 ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照 ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照 ｐＡＪ ６１１ 同 上 ｐＡＪ １８４４ 同 上 ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照 ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照 ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照 ｐＣＧ １１ 同 上 ｐＨＫ４ 特開平５−７４９１号公報参照

【００２９】遺伝子断片とベクターを連結して組換えＤ
ＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制
限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。その
他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの
調製、ＤＮＡの切断及び連結、プライマーとして用いる
オリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知
られている通常の方法を採用することができる。これら
の方法は、Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning
A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)等に記載されている。

【００３０】組換えＤＮＡを微生物に導入するには、こ
れまでに報告されている形質転換法に従って行えばよ
い。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報
告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. et al.,
J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・
ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の
細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する
方法（Duncan, C. H. et al., Gene, 1, 153 (1977)）
がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及
び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細
胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストま
たはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮ
Ａ受容菌に導入する方法（Chang, S. et al., Molec. G
en. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J. et al., N
ature, 274, 398 (1978); Hinnen, A. et al., Proc. N
atl.Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。
また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（特開
平２−２０７７９１号公報参照）によって行うことがで
きる。

【００３１】本発明の微生物は、変異型metJ遺伝子を保
持することに加えて、Ｌ−メチオニン生合成系に関与す
る酵素の活性が高められていてもよい。Ｌ−メチオニン
生合成に関与する酵素としては、アスパルトキナーゼ、
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドナゲナーゼ、ホモ
セリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリントランスサクシニ
ラーゼ、シスタチオニンγ−シンテース、β−シスタチ
オニナーゼ等が挙げられる。

【００３２】また、本発明の微生物は、Ｌ−メチオニン
の生合成経路から分岐してＬ−メチオニン以外の化合物
を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠
損されていてもよい。そのような酵素しては、ホモセリ
ンキナーゼ、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ
が挙げられる。

【００３３】＜５＞Ｌ−メチオニンの製造 上記のようにして得られるＬ−メチオニン生産能を有す
る微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−メチオニンを
生産蓄積せしめ、これを該培地から採取することによ
り、Ｌ−メチオニンを製造することができる。

【００３４】使用する培地は、微生物に応じて従来より
用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つま
り、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他
の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施
するための特別な培地は必要とされない。

【００３５】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類等を用いることができる。

【００３６】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００３７】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

【００３８】培養は、利用される微生物に応じて従来よ
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するの
がよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５
〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を
使用することができる。

【００３９】培養終了後の培地液からのＬ−メチオニン
の採取は、本願発明において特別な方法が必要とされる
ことはない。すなわち、本発明は従来より周知となって
いるイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わ
せることにより実施できる。

【００４０】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００４１】＜１＞Ｌ−メチオニンアナログ耐性を有す
るエシェリヒア・コリ変異株の取得 Ｌ−メチオニン生産株を得るために、エシェリヒア・コ
リJM109株を親株として、Ｌ−メチオニンアナログ耐性
変異株を作製した。

【００４２】ＬＢ培地で対数増殖期後期まで培養したエ
シェリヒア・コリJM109株の細胞を、N−メチル−N'−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）を１００ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した溶液（０．５ｍｇ／
ｍｌ）で１０分間処理した。変異処理した細胞を、１ｍ
ｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌのＤＬ−エチ
オニン又はＤＬ−ノルロイシンを含むＭ９最少培地プレ
ートに蒔き、３７℃で７２時間インキュベートした後、
形成したコロニーのＬ−メチオニン生産性を調べた。

【００４３】Ｌ−メチオニン生産性は、ペディオコッカ
ス・アシディラクティシＩＦＯ３０７６株を用いたマイ
クロバイオアッセイにより分析した。すなわち、Ｌ−メ
チオニンアナログ耐性株を最少培地プレートに接種し、
コロニーを生育させた後に、メチオニンを含む多数アミ
ノ酸要求性のペディオコッカス・アシディラクティシＩ
ＦＯ３０７６株の培養液を含む軟寒天最少培地を重層
し、ハローを形成する位置のアナログ耐性株を選択し
た。

【００４４】その結果、約４５００株のエチオニン耐性
株から１株、約１０００株のノルロイシン耐性株から３
株、Ｌ−メチオニン生産能を有する変異株が単離され
た。

【００４５】Ｌ−メチオニン生産が認められた株をＬＢ
培地で３０℃、２４時間培養し、その培養液一白金耳
を、５００ｍｌフラスコ中の２０ｍｌのＭ１培地（１Ｌ
中、３０ｇグルコース、２ｇＫＨ₂ＰＯ₄、１０ｇ（ＮＨ
₄）₂ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１０ｍｇＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、１
０ｍｇＦｅＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ、２０ｇＣａＣＯ₃（別殺
菌）を含む。ｐＨ７．０（ＫＯＨで調整））に接種し、
３０℃で７２時間、１２０往復／分で振盪培養した。培
地中のＬ−メチオニンの量を、アミノ酸アナライザー
（日立製作所製、Ｌ−８５００Ａ）を用いて測定した。
結果を表１に示す。

【００４６】また、ＴＮ１株を０．１％酵母エキスを添
加したＭ１培地で培養した場合、培地中のＬ−メチオニ
ンの蓄積は培養７２時間後で最大となり、その量は約１
ｇ／Ｌであった。

【００４７】

【表１】

【００４８】＜２＞Ｌ−メチオニン生産株のＬ−メチオ
ニン生合成酵素の活性測定 上記で得られたＬ−メチオニン生産株について、Ｌ−メ
チオニン生合成系の抑制を調べるために、Ｌ−メチオニ
ン生合成に関与する酵素の活性を測定した。

【００４９】エシェリヒア・コリJM109株及びＴＮ１株
を、５０ｍｌのＭ９培地又は０．０１ＭのＬ−メチオニ
ンを含むＭ９培地で、３０℃で２４時間、対数増殖期後
期まで培養した。細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、２ｍＭジチオスライト
ールを含む同緩衝液４ｍｌに懸濁した。細胞を超音波破
砕し、30,000×ｇで遠心分離して得た上清を粗酵素液と
した。

【００５０】上記粗酵素液を用いて、シスタチオニン−
γ−シンターゼ（ＣＧＳ）及びシスタチオニン−β−リ
アーゼ（ＣＢＬ）の活性を測定した。これらの酵素の発
現は、Ｓ−アデノシルメチオニンによる抑制を受ける。

【００５１】ＣＧＳ活性はKaplanらの方法（Kaplan, M.
M. et al., J. Biol. Chem., 241,4463-4471 (1966)）
により、ＣＢＬ活性はGuggenheimの方法（Guggenheim,
S.,Methods in Enzymology, vol.XVII, Academic Press
Inc., NY, (1971) p.439-442）により、それぞれ測定
した。結果を表２に示す。

【００５２】野生株（JM109）では、Ｌ−メチオニンを
含む培地ではＣＧＳ及びＣＢＬともに活性の低下がみら
れたのに対し、Ｌ−メチオニン生産株では、Ｌ−メチオ
ニン非存在下で培養したときの活性自体が、野生株に比
べて著しく高く、Ｌ−メチオニンによる抑制も解除され
ていた。

【００５３】

【表２】 表２ ──────────────────────────── 菌株 Ｌ−メチオニン ＣＧＳ ＣＢＬ 添加（0.01M） (単位/mg) (単位/mg) ──────────────────────────── JM109 − 70.3±10.6 14.6±0.2 ＋ ＜2.0 6.6±0.1 ──────────────────────────── TN1 − 461.1±10.5 35.5±0.6 ＋ 431.0± 9.9 39.3±0.6 ────────────────────────────

【００５４】＜３＞metJ遺伝子の単離 上記＜２＞で観察された代謝調節の解除は、metJ又はme
tKの変異によるものと推定された。そこで、得られたす
べてのＬ−メチオニン生産株から、プロモーター領域及
びターミネーター領域を含むmetJ遺伝子をＰＣＲ法によ
り単離し、塩基配列を決定した。

【００５５】エシェリヒア・コリの野生株及び変異株４
株（ＴＮ１、ＴＮ５、ＴＮ６、ＴＮ７）の染色体ＤＮＡ
を鋳型とし、公知のmetJ遺伝子の外側の塩基配列（Sain
t-Girons, I. et al., J. Biol. Chem., 259, 14282-14
285）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、
Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）
ＰＣＲ反応を行った。これらのプライマーは、内部にKp
nI部位を有する。ＰＣＲ反応の条件は、９５℃３０秒、
５５℃３０秒、７２℃１分であり、これを２５サイクル
行った。

【００５６】７２５ｂｐの単一の増幅断片をKpnI及びXb
aIで消化し、pUC19のKpnI及びXbaI部位に連結した。増
幅断片の塩基配列をダイデオキシ・チェイン・ターミネ
ーション法により決定した。Ｔａｑポリメラーゼによる
読み誤りを防止するために、それぞれの株について独立
に３クローン塩基配列を決定した。

【００５７】その結果、得られたＬ−メチオニン生産株
のmetJ遺伝子は、プロモーター及びターミネーター領域
に変異はみられず、いずれも構造遺伝子の１６４番目の
塩基がＧからＡに置換されていた。この変異型metJ遺伝
子の構造遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。また、
この塩基配列によりコードされ得るアミノ酸配列を配列
番号３及び４に示す。前記の塩基置換により、５５番目
（開始のメチオニン残基を除くと５４番目）のアミノ酸
残基はセリン残基からアスパラギン残基に置換されてい
た。

【００５８】＜４＞Ｌ−メチオニン生産能に対する変異
型metJ遺伝子の効果の確認 上記のように、Ｌ−メチオニン生産能を有する変異株
は、metJの変異によりメチオニン生合成系の抑制が解除
された結果、Ｌ−メチオニン生産能を有することが示唆
された。しかし、この形質は、metKの変異によるもので
ある可能性も考えられたので、metJの変異によるもので
あることを確認した。

【００５９】metJ遺伝子産物であるMetJタンパク質はリ
プレッサーとして機能するため、野生型と変異型とでは
野生型が優性に作用する。したがって、Ｌ−メチオニン
生産能がmetJ遺伝子の変異によるものであれば、Ｌ−メ
チオニン生産株に野生型metJ遺伝子を導入すれば、元の
野生株の性質が戻ると予想される。

【００６０】前記の変異型metJ遺伝子と同様にして、エ
シェリヒア・コリJM109株から野生型metJ遺伝子を単離
した。野生型metJ遺伝子を含むプラスミドは、さらにEc
oRI及びHindIIIで消化して小断片を回収し、EcoRI及びH
indIIIで消化したpBR322の大断片に連結し、低コピー数
のプラスミドpWMJを得た。このプラスミドpWMJでＴＮ１
株を形質転換した。

【００６１】得られた形質転換株、エシェリヒア・コリ
JM109、及びＴＮ１株を、Ｌ−メチオニン存在下又は非
存在下で培養し、前記と同様にして粗酵素液を調製し、
ＣＧＳ及びＣＢＬの活性を測定した。結果を図１に示
す。その結果、ＣＧＳ及びＣＢＬは、野生型metJ遺伝子
を導入したＴＮ１株では野生株と同程度に抑制を受けた
のに対し、ＴＮ１株ではＬ−メチオニン存在下でも野生
株に比べて高い活性を示した。

【００６２】ＴＮ１株は、エシェリヒア・コリAJ13543
と命名され、1998年11月24日付で、工業技術院生命工学
工業技術研究所に、受託番号FERM P- 17060として寄託
されている。

【００６３】

【発明の効果】本発明により、Ｌ−メチオニン生産能を
有する微生物、及び同微生物の育種に利用することがで
きる変異型metJ遺伝子が提供される。

【００６４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Ltd） <120> 変異型metJ遺伝子及びＬ−メチオニンの製造法（Mutant metJ gene and M ethod for Producing L-Methionine） <130> P-6157 <141> 1998-11-24 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００６５】 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 cggggtacca cgcgtcatgt gatgaag 27

【００６６】 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 tgctctagat tatccggcct acaagtt 27

【００６７】 <210> 3 <211> 318 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(315) <400> 3 atg gct gaa tgg agc ggc gaa tat atc agc cca tac gct gag cac ggc 48 Met Ala Glu Trp Ser Gly Glu Tyr Ile Ser Pro Tyr Ala Glu His Gly 1 5 10 15 aag aag agt gaa caa gtc aaa aag att acg gtt tcc att cct ctt aag 96 Lys Lys Ser Glu Gln Val Lys Lys Ile Thr Val Ser Ile Pro Leu Lys 20 25 30 gtg tta aaa atc ctc acc gat gaa cgc acg cgt cgt cag gtg aac aac 144 Val Leu Lys Ile Leu Thr Asp Glu Arg Thr Arg Arg Gln Val Asn Asn 35 40 45 ctg cgt cac gct acc aac aac gag ctg ctg tgc gaa gcg ttt ctg cat 192 Leu Arg His Ala Thr Asn Asn Glu Leu Leu Cys Glu Ala Phe Leu His 50 55 60 gcc ttt acc ggg caa cct ttg ccg gat gat gcc gat ctg cgt aaa gag 240 Ala Phe Thr Gly Gln Pro Leu Pro Asp Asp Ala Asp Leu Arg Lys Glu 65 70 75 80 cgc agc gac gaa atc ccg gaa gcg gca aaa gag atc atg cgt gag atg 288 Arg Ser Asp Glu Ile Pro Glu Ala Ala Lys Glu Ile Met Arg Glu Met 85 90 95 ggg att aac ccg gag acg tgg gaa tac taa 318 Gly Ile Asn Pro Glu Thr Trp Glu Tyr 100 105

【００６８】 <210> 4 <211> 105 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Ala Glu Trp Ser Gly Glu Tyr Ile Ser Pro Tyr Ala Glu His Gly 1 5 10 15 Lys Lys Ser Glu Gln Val Lys Lys Ile Thr Val Ser Ile Pro Leu Lys 20 25 30 Val Leu Lys Ile Leu Thr Asp Glu Arg Thr Arg Arg Gln Val Asn Asn 35 40 45 Leu Arg His Ala Thr Asn Asn Glu Leu Leu Cys Glu Ala Phe Leu His 50 55 60 Ala Phe Thr Gly Gln Pro Leu Pro Asp Asp Ala Asp Leu Arg Lys Glu 65 70 75 80 Arg Ser Asp Glu Ile Pro Glu Ala Ala Lys Glu Ile Met Arg Glu Met 85 90 95 Gly Ile Asn Pro Glu Thr Trp Glu Tyr 100 105

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｌ−メチオニン存在下又は非存在下で培養し
たエシェリヒア・コリJM109、ＴＮ１株、及び野生型met
J遺伝子を導入したＴＮ１株の粗酵素液のシスタチオニ
ン−γ−シンターゼ（ＣＧＳ）及びシスタチオニン−β
−リアーゼ（ＣＢＬ）の相対活性を示す図。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すエシェリヒ
   ア・コリ由来のＬ−メチオニン生合成系のリプレッサー
   タンパク質をコードする遺伝子。 （Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を有し、かつ、５
   ５番目のアミノ酸残基がセリン残基以外のアミノ酸残基
   であるタンパク質。 （Ｂ）配列番号４において、５５番目のアミノ酸残基以
   外の位置の１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
   入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、配列番
   号４に示すアミノ酸配列の５５番目のアミノ酸残基に相
   当するアミノ酸残基がセリン残基以外のアミノ酸残基で
   あり、かつ、メチオニン生合成を抑制する活性が低下し
   たタンパク質。
2. 【請求項２】 前記セリン残基以外のアミノ酸残基がア
   スパラギン残基である請求項１記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 染色体上のＬ−メチオニン生合成系のリ
   プレッサータンパク質をコードする遺伝子が請求項１又
   は２に記載の遺伝子である微生物。
4. 【請求項４】 エシェリヒア属細菌である請求項３記載
   の微生物。
5. 【請求項５】 請求項３又は４に記載の微生物を培地に
   培養し、培地中にＬ−メチオニンを生成蓄積せしめ、こ
   れを該培地から採取することを特徴とするＬ−メチオニ
   ンの製造法。