JP2005533490A - 硫黄含有ファインケミカルの発酵による製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)L-メチオニンの生成量が増加する;
b)メチオニン生合成の遺伝子の抑制が軽減される;および
c)メチオニン生合成の酵素のフィードバック阻害が軽減される;
と考えられる。
本発明の目的は、発酵による硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの改良された新規製造方法を提供することである。
a)目的の硫黄含有ファインケミカルを産生するコリネ型細菌培養物を発酵させる工程、ここにおいて、該コリネ型細菌は、改変されたS-アデノシルメチオニンシンターゼ(metK)活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を発現するものであること、
b)該培地内および/または該細菌細胞内の硫黄含有ファインケミカルを濃縮する工程、
c)好ましくはL-メチオニンを含む硫黄含有ファインケミカルを単離する工程、
を含んでなる、少なくとも1つの硫黄含有ファインケミカルの発酵による製造方法に関する。
G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V
(ここで、X1およびX2は、互いに独立して、任意のアミノ酸を表し、X3はCys以外のアミノ酸を表す)。
a)プラスミドベクターで形質転換されており、調節配列の制御下でmetKコード配列の少なくとも1つのコピーを保持する細菌株を使用する、または
b)metKコード配列が該細菌染色体内に組み込まれている株を使用する、
ことにより行う。
1)アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC、
2)アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子asd、
3)グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap、
4)3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk、
5)ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc、
6)トリオース-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi、
7)ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA、
8)シスタチオニン-γシンターゼをコードする遺伝子metB、
9)シスタチオニン-γリアーゼをコードする遺伝子metC、
10)メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH、
11)セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA、
12)O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY、
13)メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF、
14)ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC、
15)ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB、
16)セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE、
17)システインシンターゼをコードする遺伝子cysK、
18)ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に過剰発現されるコリネ型細菌を発酵させる。
19)ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB、
20)トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA、
21)トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC、
22)メソ-ジアミノピメリン酸Dデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh、
23)ホスホエノール-ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck、
24)グルコース-6-リン酸-6イソメラーゼをコードする遺伝子pgi、
25)ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB、
26)ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA、
27)ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB、または
28)ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に、特に対応遺伝子の発現率を減少させることにより、弱められているコリネ型細菌を発酵させる。
a)L-メチオニン産生微生物(好ましくは、前記の定義に従う減少したmetkを有するもの)を発酵培地内で培養し、発酵させる工程、
b)L-メチオニン含有発酵ブロスから水を除去する工程、
c)発酵中に生成したバイオマスの0〜100重量%を除去する工程、
d)工程b)および/またはc)により得られた発酵ブロスを乾燥させて、所望の粉末または顆粒形態で動物飼料添加物を得る工程、
を含んでなる、発酵ブロスからのL-メチオニン含有動物飼料添加物の製造方法に関する。
a)より低い細胞内S-アデノシルメチオニン力価、
b)より低い細胞内S-アデノシルメチオニンシンターゼ濃度、または
c)S-アデノシルメチオニン生成の速度に関して測定した場合の、より低いS-アデノシルメチオニンシンターゼ活性、
の少なくとも1つを示し、さらに、適当な場合には、以下の形質:
d)改善されたmetY活性、または
e)増加したL-メチオニン量、
の少なくとも1つを示す。
a)一般的用語
「S-アデノシルメチオニンシンターゼ」の生物活性を有するタンパク質なる語は、metK(E.C.2.5.1.6)とも略称され、L-メチオニンおよびATPをS-アデノシルメチオニンに変換しうるタンパク質を意味する。metKタンパク質のその他の詳細は当業者によく知られている。metKの酵素活性は酵素アッセイにより検出することが可能であり、そのプロトコールはMarkham, G.D.ら (1983) Methods in Enzymology 94:219-222に記載されている。
本発明のポリヌクレオチド配列は、前記のとおりの改変された(特に減少した)S-アデノシルメチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする。
G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V
を含有するものである。ここにおいて、X3は、突然変異により導入された、Cys以外のアミノ酸、特にアラニンである。X3は、コリネバクテリウム・グルタミカム(C. glutamicum)のmetK野生型配列(配列番号16)のCys94に対応する。X2は、好ましくは、Ala、Glu、Asp、AsnまたはArgを表し、X1は、好ましくは、Gly、Cys、SerまたはAlaを表す。
同様に、本発明は、例えばとりわけ合成ヌクレオチド類似体を使用して得られる、本発明のmetK酵素およびその機能的等価体をコードする核酸配列(一本鎖および二本鎖のDNAおよびRNA配列、例えばcDNAおよびmRNA)に関する。
酵素S-アデノシルメチオニンシンターゼをコードするmetK遺伝子(EC 2.5.1.6)は自体公知の方法で単離することができる。
本発明の方法に使用する宿主細胞は、好ましくは、減少したmetK活性が以下の特性の少なくとも1つにより検出されうるコリネ型細菌である:
a)野生型株と比較して減少した細胞内S-アデノシルメチオニン力価、
b)減少した細胞内S-アデノシルメチオニンシンターゼ濃度(全タンパク質に対して、より少ないS-アデノシルメチオニンシンターゼ)、または
c)減少した細胞内S-アデノシルメチオニンシンターゼ活性(S-アデノシルメチオニンシンターゼタンパク質含量に対して、より少ないS-アデノシルメチオニンシンターゼ酵素活性)。
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806、
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539、
コリネバクテリウム・メラッセコラ(Corynebacterium melassecola)ATCC 17965、
または
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属のもの、例えば、
ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869および
ブレビバクテリウム・ジバリカタム(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020、
または、それらに由来する株、例えば、
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)KFCC10065、
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC21608、
(これらは同様に、所望のファインケミカルまたはその前駆体を産生する)を挙げる必要がある(KFCC = Korean Federation of Culture Collection; ATCC = American Type Culture Collection)。
コリネ型細菌は、本発明のmetK遺伝子を発現した後、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを有利に産生することが、本発明において判明した。
・アスパラギン酸-セミアルデヒドをコードする遺伝子asd(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号282)、
・グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)、
・3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)、
・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)、
・トリオース-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)、
・ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号725)、
・シスタチオニン-γシンターゼをコードする遺伝子metB(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3491)、
・シスタチオニン-γリアーゼをコードする遺伝子metC(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3061)、
・メチオニンシンターゼをコードする遺伝子mett(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1663)、
・セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1110)、
・O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号726)、
・メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2379)、
・ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号928)、
・ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号334, DNA-配列番号467, DNA-配列番号2767)、
・セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2818)、
・システインシンターゼをコードする遺伝子cysK(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2817)、
・ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1306)。
・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)、
・ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号725)、
・シスタチオニン-γシンターゼをコードする遺伝子metB(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3491)、
・シスタチオニン-γリアーゼをコードする遺伝子metC(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3061)、
・メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1663)、
・セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1110)、
・O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号726)、
・メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2379)、
・ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号928)、
・ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号334, DNA-配列番号467, DNA-配列番号2767)、
・セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2818)、
・システインシンターゼをコードする遺伝子cysK(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2817)、
・ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1306)。
・トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2328)、
・トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3486)、
・メソ-ジアミノピメリン酸Dデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3494)、
・ホスホエノール-ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3157)、
・グルコース-6-リン酸-6イソメラーゼをコードする遺伝子pgi(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号950)、
・ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2873)、
・ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3476)、
・ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3477)、
・ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3451)。
・トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2328)、
・トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3486)、
・メソ-ジアミノピメリン酸Dデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3494)、
・ホスホエノール-ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3157)、
・グルコース-6-リン酸6イソメラーゼをコードする遺伝子pgi(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号950)、
・ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2873)、
・ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3476)、
・ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3477)、
・ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA(EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3451)。
まず、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号1および配列番号2を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、ベクターpBR322のアンピシリン耐性配列および複製起点を増幅した。
配列番号1
5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3’
配列番号2
5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3’
配列番号3:
5'-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3’
配列番号4:
5'-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3’
配列番号5:
5'-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3’
配列番号6:
5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3’
配列番号7:
5'-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3’
配列番号8:
5'-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3’
PCR反応用の鋳型としてのプラスミドpK19mob(Schaferら, Gene 145,69-73(1994))から、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号10および配列番号11を使用して枯草菌(Bacillus subtilis)sacB遺伝子を増幅した。
配列番号10:
5'-GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3’
配列番号11:
5'-AGGAGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3’
Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828の方法を用いて、染色体コリネバクテリウム・グルタミカム(C. glutamicum)ATCC 13032 DNAを調製した。Grossmannら (2000) FEMS Microbiology Letters 193:99-103のmetK配列から出発して、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号13
5'-GAGAGCCCGGGAAGAAGGGCTGCGACCTCCTCAT-3’
および
配列番号14
5'-CTCTCACGCGTCATATGCAGGTGAGGTAACCCCA-3’
QuickChangeキット(Stratagene)を製造業者の指示に従い使用して、コリネバクテリウム・グルタミカム(C. glutamicum)metK遺伝子の特異的突然変異誘発を行った。突然変異誘発は、プラスミドpCLiK5MCS/metKwt(配列番号15)において行った。配列番号16のシステイン94をアラニン94に置換するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号17
5'- GATTCGACGGACGCACCGCTGGCGTCTCAGTATCCATC-3’
および
配列番号18
5'-GATGGATACTGAGACGCCAGCGGTGCGTCCGTCGAATC-3’
プラスミドpCLiK5MCS/metKwt(配列番号15)またはプラスミドpCLiK5MCS/metKC94A(配列番号19)で形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム(C. glutamicum)株を、BHI/グルコース培地(37g/l調製された脳心臓浸出液培地, Difco, 10 mM (NH4)2SO4, 4%グルコース)内で30℃で、OD600が20になるまで増殖させた。該細胞を4℃で遠心沈降させ、ペレットを冷生理食塩水で洗浄した。再遠心分離後、0.25gの湿潤細胞ペレットを4℃で1mlの破砕バッファー(50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM DTT)に再懸濁させた。この細菌懸濁液をHybaidのRibolyser中およびHybaidの青色Ribolyserチューブ中、回転設定6.0で3回(各回、30秒間)細胞溶解した。溶解産物をEppendorf遠心機による13000rpmでの遠心分離により45分間清澄化し、上清を水で1:10希釈した。Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254に記載の方法によりタンパク質含量を測定した。
pCLiK5MCS/metKwt(配列番号15)またはpCLiK5MCS/metKC94A(配列番号19)で形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム(C. glutamicum)株における細胞性S-アデノシルメチオニン力価を測定するためには、以下の方法を用いた。実施例5に記載のとおりに得て、氷冷生理食塩水で洗浄した細胞ペレットをトリクロロ酢酸(0.1gの湿潤ペレット当たり200μlのTCA)に再懸濁させた。氷上で5分後、懸濁液をEppendorf遠心機中、4℃、13 000rpmで5分間清澄化した。上清中のS-アデノシルメチオニン含量をHPLCにより測定した(Ionospher 5C陽イオン交換カラム、注入容量10μl、移動相: 70% vol/vol 0.2M ギ酸アンモニウム pH 4.0、30% vol/vol メタノール; UV検出 260nm; 40℃; 保持時間8.5分)。
コリネバクテリウム・グルタミカム(C. glutamicum)KFCC10065におけるmetK野生型遺伝子の、突然変異型metK C94Aによる対立遺伝子置換のために、まず、配列番号19からのmetK C94A配列をpCLiK5MCS integrativ sacB(配列番号12)内にクローニングした。この目的には、プラスミドpCLiK5MCS/metKC94A(配列番号19)を制限エンドヌクレアーゼBglIIおよびXhoI(NEB, Schwalbach)で切断した。得られた1962塩基対の断片を実施例3に記載のとおりに精製した。ベクターpCLiK5MCS integrativ sacBを同様にBglIIおよびXhoIで切断し、実施例3に記載のとおりに精製した。実施例3に記載のとおりに、ベクターと断片とを連結し、大腸菌(E. coli)XL-1 Blue内に形質転換した。該プラスミドを精製し、配列決定後に確認した。得られたプラスミドpCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94Aを配列番号20に記載する。
実施例6で得た株KFCC10065metKC94Aを、BHI培地(Difco)を含有する寒天プレート上で30℃で2日間増殖させた。増殖した細胞を該寒天プレートから食塩水に懸濁させ、1.5のOD 600nmにおいて培地IIに移した。培地IIは以下の組成を有していた。
0.6g/l KH2PO4
0.4g/l MgSO4 *7H2O
25g/l (NH4)2SO4
40g/l 粗糖
60g/l 糖蜜
このようにして調製した培地をNH4OHでpH 7.8にし、120℃で30分間滅菌した。
0.3mg/l チアミン*HCl
1mg/l ビオチン
2mg/l FeSO4
2mg/l MnSO4
0.1mg/l ビタミンB12
培地IIBは別個に調製し、濾過滅菌し、培地IIAに加えた。それらの2つの成分IIAおよびIIBは一緒になって培地IIを構成する。
Claims (21)
- a)目的の硫黄含有ファインケミカルを産生するコリネ型細菌培養物を発酵させる工程、ここにおいて、該コリネ型細菌は、改変されたS-アデノシルメチオニンシンターゼ(metK)活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を発現するものであること、
b)該培地内および/または該細菌細胞内の硫黄含有ファインケミカルを濃縮する工程、
c)硫黄含有ファインケミカルを単離する工程、
を含んでなる、少なくとも1つの硫黄含有ファインケミカルの発酵による製造方法。 - 硫黄含有ファインケミカルがL-メチオニンを含む、請求項1記載の製造方法。
- 非突然変異野生型と比較してmetK活性が減少した突然変異コリネ型細菌を使用する、請求項1または2記載の製造方法。
- 突然変異コリネ型細菌が更に、非突然変異野生型と比較して改良されたmetY活性および/または増加したL-メチオニン量を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の製造方法。
- metKコード配列が、野生型タンパク質の少なくとも1つのシステイン残基が置換されている減少したmetK活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列である、請求項1〜4のいずれか1項記載の製造方法。
- metKコード配列が、以下のアミノ酸部分配列:
G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V
(ここで、X1およびX2は、互いに独立して、任意のアミノ酸を表し、X3はCys以外のアミノ酸を表す)
を有するmetK活性のあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列である、請求項5記載の製造方法。 - metKコード配列が、metK活性を有するタンパク質をコードし、該タンパク質が、配列番号22に示すVal1からAla407までのアミノ酸配列、またはそれに相同でありかつ機能的に等価なタンパク質を表すアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法。
- metKコード配列が、コリネ型細菌内で複製可能であるか又は染色体内に安定に組み込まれるDNA、またはRNAである、請求項1〜7のいずれか1項記載の製造方法。
- a)プラスミドベクターで形質転換されており、調節配列の制御下で突然変異metK配列の少なくとも1つのコピーを保持する細菌株を使用する、または
b)突然変異metK配列が細菌染色体内に組み込まれている株を使用する、請求項1〜8のいずれか1項記載の製造方法。 - 目的の硫黄含有ファインケミカルの生合成経路の少なくとも1つの別の遺伝子が更に増強されている細菌を発酵させる、請求項1〜9のいずれか1項記載の製造方法。
- 目的の硫黄含有ファインケミカルの生成を減少させる少なくとも1つの代謝経路が少なくとも部分的にスイッチオフされている細菌を発酵させる、請求項1〜10のいずれか1項記載の製造方法。
- a)アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC、
b)アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子asd、
c)グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap、
d)3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk、
e)ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc、
f)トリオース-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi、
g)ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA、
h)シスタチオニン-γシンターゼをコードする遺伝子metB、
i)シスタチオニン-γリアーゼをコードする遺伝子metC、
j)メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH、
k)セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA、
l)O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY、
m)メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF、
n)ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC、
o)ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB、
p)セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE、
q)システインシンターゼをコードする遺伝子cysK、
r)ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に過剰発現されるコリネ型細菌を発酵させる、および/または、これらの遺伝子の少なくとも1つが同時に突然変異していて、結果的に対応するタンパク質の活性が、非突然変異タンパク質と比較して低い程度に代謝産物により影響されるか若しくはもはや影響されない、あるいはその比活性が増強しているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜11のいずれか1項記載の製造方法。 - a)ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB、
b)トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA、
c)トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC、
d)メソ-ジアミノピメリン酸Dデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh、
e)ホスホエノール-ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck、
f)グルコース-6-リン酸-6イソメラーゼをコードする遺伝子pgi、
g)ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB、
h)ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA、
i)ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB、または
j)ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に弱められているコリネ型細菌を発酵させる、および/または、これらの遺伝子の少なくとも1つが同時に突然変異していて、結果的に対応するタンパク質の酵素活性が部分的もしくは完全に減少しているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜12のいずれか1項記載の製造方法。 - コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)種の微生物を使用する、請求項1〜13のいずれか1項記載の製造方法。
- a)請求項1〜14のいずれか1項に定義されるL-メチオニン産生微生物を発酵培地内で培養し、発酵させる工程、
b)L-メチオニン含有発酵ブロスから水を除去する工程、
c)発酵中に生成したバイオマスの0〜100重量%を除去する工程、
d)工程b)および/またはc)により得られた発酵ブロスを乾燥させて、所望の粉末または顆粒形態の動物飼料添加物を得る工程、
を含んでなる、発酵ブロスからのL-メチオニン含有動物飼料添加物の製造方法。 - 減少したmetK活性を有するポリペプチドをコードする、請求項5〜7のいずれか1項に定義される単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項16記載のポリヌクレオチドによりコードされる、減少した活性を有するmetK突然変異体。
- 請求項5〜7のいずれか1項に定義されるポリヌクレオチド配列を含む突然変異metK遺伝子を発現する組換えコリネ型細菌。
- もはやmetK野生型酵素を発現しない、請求項18記載の組換えコリネ型細菌。
- 対応する野生型株と比較して、以下の形質:
a)より低い細胞内S-アデノシルメチオニン力価、
b)より低い細胞内S-アデノシルメチオニンシンターゼ濃度、または
c)S-アデノシルメチオニン生成の速度に関して測定した場合の、より低いS-アデノシルメチオニンシンターゼ活性、
の少なくとも1つ、さらに、適当な場合には、以下の形質:
d)改善されたmetY活性、または
e)増加したL-メチオニン量、
の少なくとも1つを有する、請求項19記載の組換えコリネ型細菌。 - 請求項5〜7のいずれか1項に定義されるmetK突然変異体のコード配列を調節ヌクレオチド配列の制御下で含有する発現構築物。
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