MXPA04011410A - Metodo para la produccion de productos quimicos finos que contienen azufre mediante fermentacion. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con metodos para la produccion de quimicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina, mediante fermentacion utilizando bacterias en las que una secuencia de nucleotido que codifica un gene de sintasa de S-adenosilmetionina (metK) se expresa.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS FINOS QUE CONTIENEN AZUFRE MEDIANTE FERMENTACIÓN Descripción La invención se relaciona con un método novedoso para la producción por , fermentación ¦ de químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina y L-cisteina, que hace uso de bacterias en las que secuencias de nucleótido que codifican estos mutantes, a los microorganismos recombinantes transformados con los mismos, y con mutantes metK novedosos con actividad de enzima modificada Técnica Anterior Los químicos finos que contienen azufre tales como, por ejemplo, metionina, homo cisterna, S-adenosilmetionina, glutationa, cisteína, biotina, tiamina y ácido lipónico, se producen en células vía procesos metabólicos naturales y se usan en un gran número de industrias incluyendo las industrias alimenticia, de alimentos, cosmética y farmacéutica. Estas substancias, que se denominan genéricamente como "químicos finos que contienen azufre", abarcan ácidos orgánicos, aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, vitaminas y cofactores. De manera más expediente, se producen a escala industrial desarrollando bacterias que se han desarrollado para producir y secretar cantidades grandes de la substancia deseada en cuestión. Los organismo que son particularmente apropiados para este propósito son bacterias corineformes no patógenas, Gram-positivas . Se sabe que los aminoácidos se producen fermentando cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacteriunm glutamicum. - ¦ Debido ' a' su * elevada importancia, los métodos de producción se están mejorando constantemente. Las mejoras con respecto a los métodos de producción se pueden relacionar con aspectos de tecnología de fermentación, tales como por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o procesamiento corriente abajo, por ejemplo, mediante cromatogra ía de intercambio de iones, o los parámetros de funcionamiento intrínseco del propio microorganismo. La selección de cepa ha dado lugar a una serie de cepas mulantes que producen un grupo de compuestos deseables de la serie de químicos finos que contienen azufre. Los métodos aplicados para mejorar los parámetros de funcionamiento de estos microorganismos con respecto a la producción de una molécula particular son mutagenesis, selección y elección de mutantes. Sin embargo, este es un procedimiento difícil y que consume tiempo. De esta manera, se obtienen cepas que son, por ejemplo, resistentes a antimetabolitos, tales como por ejemplo, a oc-metilmetionina análogas de metionina, etionina, norleucina, n-acetilnorleucina, S-trifluorometilhomocisteína, ácido 2-amino-5-heptenóico, selenometionina, sulfoximina de metionina, metoxina o ácido 1-aminociclopentancarboxílico, o que son auxotróficos con respecto a metabolitos de importancia reguladora y que producen químicos finos que contienen azufre, tales como -por -ejemplo-, *L-metionina . Los métodos de tecnología de ADN recombinante también se han empleado durante algunos años para la mejora de cepa de cepas de Corynebacterium que producen L-aminoácido, en las que los genes de biosíntesis de aminoácido individuales se amplifican y el efecto sobre la producción de aminoácido se estudia. JP-A-06-020809 describe una secuencia de nucleótido para un gene de Brevibacterium flavum J-233, una bacteria corineforme, que codifica S-adenosilmetionina . La secuencia de aminoácido correspondiente abarca 412 ami oácidos. En cada una de las posiciones 24 y 94, entre otras, que se conservan en las enzimas correspondientes de un gran número de otras bacterias corineformes, la proteína tiene un residuo de cisteína. La secuencia de aminoácido descrita tiene un segmento de secuencia característica entre los residuos 137 y 154. La generación de mutantes y su uso en la producción mediante fermentación de químicos finos que contienen azufre no se describe en la misma. WO-A-01/ 00843 describe un gene metK de C glutamicum, que codifica una proteína con 407 aminoácidos y tiene una secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 16. Como regla, las ..mejoras en la producción mediante fermentación de químicos finos se correlacionan con flujos de substancia mejorados y rendimientos. Es importante prevenir, o reducir, - la - inhibición intermedia o inhibición" de" producto final de enzimas que son importantes para la síntesis. La prevención o reducción de diversiones del flujo de carbono hacia productos no deseados o productos secundarios es asimismo ventajosa. El efecto de metabolitos en las actividades enzimáticas de enzimas metabólicas se puede estudiar. Los ejemplos de dichas enzimas pueden ser metA, metB, mete, metY, metH, metE, metF y otras enzimas en el metabolismo de microorganismos. Un metabolito importante de metionina, y de esta manera una diversión importante, es S-adenosilmetionina. Sin embargo, la S-adenosilmetionina también es simultáneamente un regulador crucial de biosíntesis de metionina. Por ejemplo, se sabe que la biosíntesis de L-metiona en E coli se inhibe mediante S-adenosilmetionina. En este sistema, la S-adenosilmetionina actúa como un correpresor del represor metJ (Weissbach, H. Brot, N. (1991) Mol Microbiol. 5 (7), 1593-1597). Al mismo tiempo, la síntesis de S-adenosilmetionina es una diversión importante del producto deseado de interés, L-metionina. Reduciendo la cantidad de S-adenosilmetionina formada, por lo tanto, es deseable debido a diversas razones, a decir : (a) la cantidad de L-metionina formada se aumentaría, (b) la represión de genes de biosíntesis de metionina se reduciría, y - ·.. - -- · -· - (c) la inhibición de retroalimentación de enzimas de biosíntesis de metionina se reduciría. La omisión del gene metK sería la forma más sencilla de prevenir la formación de S-adenosilmetionina . En Wei, Y. Y Newman, E.B. (2002) Mol. Bimcrobiol . 43 (6), 1651-1656, sin embargo, metK se describe como un gene esencial y de esta manera parece al trabajador experto como un punto de partida para la producción mejorada por fermentación de químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina. Compendio de la Invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un método novedoso para la producción mejorada por fermentación de químicos finos que contienen azufre, en particular, L-metionina, y los medios requeridos para la misma. Sorprendentemente, se ha encontrado que este objeto se logra proporcionando un método para la producción por fermentación de un químico fino que contiene azufre, que comprende la expresión de una secuencia de nucleótido metK en una coryneform bacterium, la secuencia de nucleótido codificando un mutante de sintasa de S-adenosilmetionina cuya actividad se modifica, de preferencia reduce, sobre la enzima de tipo silvestre. Por ejemplo, el mutante de sintasa de S-adenosilmetionina se deriva de · Corynebacterium glutamicum y, medido en Corynebacterium glutamicum, muestra menos actividad que la enzima tipo silvestre. Un primera asunto materia de la invención se relaciona con un método para la producción por fermentación de cuando menos un químico fino que contiene azufre, que comprende los siguientes pasos: (a) fermentación de un cultivo bacterial corineforine que produce el químico fino que contiene azufre deseado, la bacteria corineforme que expresa por lo menos una secuencia de nucleótido que codifica una proteína con actividad de sintasa de S-adenosilmetionina modificada (metK) ; (b) enriquecimiento del químico fino que contiene azufre en un medio y/o en las células bacteriales y (c) aislamiento del químico fino que contiene azufre, que de preferencia comprende L-metionina. De conformidad con una modalidad preferida, la bacteria corineforme mutada adicionalmente tiene actividad metY mejorada y/o una cantidad de L-metionina aumentada en comparación con el' tipo silvestre no mutado (por ejemplo expresado en g/1 de licor de fermentación). La secuencia de codificación de metK que se utiliza en particular en el método de conformidad con la invención es una secuencia de -nucíeótido de- codificación que codifica una proteina con actividad metK reducida en la que cuando menos un residuo de cisteina de la proteina tipo silvestre se substituye . De preferencia, la secuencia de codificación de metK es una secuencia de nucleótido de codificación que codifica una proteina con actividad metK que tiene la siguiente secuencia parcial de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 23: G ( F/Y) (D/S)X¾2(S/T)X3(G/A)V en donde X1 y X2 independientemente uno del otro representan cualquier aminoácido; y X3 representa un aminoácido distinto a Cys. Es especialmente preferido un método de conformidad con la definición anterior en el que la secuencia de codificación metK codifica una proteina con actividad metK, la proteina abarcando una secuencia de aminoácido de Valí a Ala407 como se muestra en SEQ ID NO: 22 o una secuencia de aminoácido que es homólogo al mismo y que representa una proteina con equivalente funcional.

La secuencia de modificación de metK empleada de conformidad con la invención de preferencia comprende una secuencia de codificación como se muestra en SEQ ID NO: 21 o una secuencia de nucleótido que es homólogo a la misma y que codifica -una proteína con actividad metK.- - ¦ - ¦ La secuencia metK de codificación es de preferencia un ADN que es capaz de replicación en bacteria corineforma o integrada establemente hacia el cromosoma, o un RNA. De conformidad con una modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se lleva a cabo (a) utilizando una cepa bacterial que se ha transformado con un vector de plásmido y que lleva cuando menos una copia de la secuencia metK de codificación bajo el control de secuencias reguladoras, o (b) utilizar una cepa en la que la secuencia metK de codificación se ha integrado hacia el cromosoma bacterial. Son especialmente preferidas cepas como se define arriba en las que, adicionalmente, toda o parte de la actividad de la enzima tipo silvestre de metK se ha removido, tal como por ejemplo, mediante omisión de la secuencia de codificación de la enzima tipo silvestre. Además, puede ser deseable una bacteria de fermento en la que adicionalmente cuando menos un gene adicional de la trayectoria bíosintética del químico fino que contiene azufre deseado se mejora y/o en el que cuando menos una trayectoria metabólica que reduce la formación del químico fino que contiene azufre deseado se elimina cuando menos parcialmente. Esto es porque, de conformidad con una modalidad adicional del método de conformidad con la invención, las bacterias corineformes en- -las que cuando menos- uno - de -Ios- genes seleccionados de entre 1) el gene lisC, que codifica una quinasa de aspartato, 2) el gene asd, que codifica una dehidrogenasa de aspartato-semialdehído, 3) el gene gap, que codifica ' dehidrogenasa de gliceerinaldehído-3-fosfato, 4) el gene p k, que codifica quinasa de 3-fosfoglicerato, 5) el gene pyc, que codifica carboxilasa de piruvato, 6) el gene tpi, que codifica isomerasa de triosa-fosfato, 7) el gene metA, que codifica O-acetiltransferasa de homoserina, ¦ 8) el gene metB, que codifica sintasa de cistat ionina-gamma, 9) el gene metC, que codifica liasa de cistat ionina-gamma, 10) el gene metH, que codifica sintasa de metíonina, 11) el gene gliA, que codifica hidroximetiltransferasa de serina, 12) el gene metY, que codifica sulfhidrilasa de O-acetilhomoserina, 13) el gene metF, que codifica reductasa de metilcntetrahidrofolato, - - 14) el gene serC, que codifica aminotransferasa de fosfoserina, 15) el gene serB, que codifica fosfotasa de fosfoserina, 16) el gene cisE, que codifica aceiltransferasa de serina, 17) el gene cisK, que codifica sintasa de cisteina, 18) el gene hom, que codifica deihidrogenasa de homoserina, se sobreexpresa simultáneamente, se fermentan. De conformidad con otra modalidad del método de conformidad con la invención, las bacterias corineformes se fermentan en donde cuando menos uno de los genes seleccionados entre genes de los grupos 1) a 18) arriba mencionados se muta simultáneamente de tal manera que la actividad de las proteínas correspondientes influencias hasta un grado menor en comparación con proteínas no mutadas, o no afectadas por metabolitos y que en particular la producción de conformidad con la invención del químico fino no se afecta adversamente, o de tal manera que su actividad de enzima especifica se aumenta. De conformidad con otra modalidad del método de conformidad con la invención, se fermentan bacterias corineformes en las que simultáneamente cuando menos uno de los..genes seleccionados de entre— 19} el gene thrB, que codifica quinasa de homoserina, ) el gene ilvA, que codifica dehidratasa de treonina, 21) el gene thrC, que codifica sintasa de treonina, 22) el gene ddh, que codifica dehídrogenasa de meso-diaminopimelato D, 23) el gene pck,. que codifica carboxiquinasa de fosfoenol-piruvato, 24) el gene pgi, que codifica isomerasa de glucosa-6-fosfato- 6, 25) el gene poxB, qué codifica oxidasa de piruvato, 26) el gene dapA, que codifica sintasa de dihidrodipicolínato, 27) el gene dapB, que codifica reductasa de dihidrodipicolínato, o 28) el gene lysA, que codifica decarboxilasa de diaminopicolinato, se atenúa, en particular reduciendo el régimen de expresión del gene correspondiente. De conformidad con otra modalidad del método de conformidad con la invención, las bacterias corineformes se fermentan en donde cuando menos uno de los genes de los grupos anteriores 19) a 28) se muta simultáneamente de tal manera que la actividad de enzima de la proteina correspondiente se reduce en parte o completamente. Los microorganismos que se usan, de preferencia en el método de conformidad con la invención son aquellos de la especie Corynebacterium glutamicum. La invención se relaciona además con un método para producir aditivo de alimento animal que contiene L-metionina de caldos de fermentación, que comprende los siguientes pasos : (a) cultivo y fermentación de un microorganismo que produce L-metionina, de preferencia con una actividad metK reducida de conformidad con la definición anterior, en un medio de fermentación, (b) remoción de agua del caldo de fermentación que contiene L-metionina; (c) ¦ remoció de a 1005 en peso de la biomasa formada durante la fermentación; y (d) secado del caldo de fermentación obtenido de conformidad con b) y/o c) , a fin de obtener el aditivo de alimento animal en la forma de polvo o gránulo deseada. La invención se relaciona además con bacterias corineformes recombinantes que expresan un gene metK mutado de conformidad con la definición anterior, en particular aquellas bacterias corineformes recombinantes que ya no expresan la enzima tipo silvestre metK. En comparación con la cepa tipo silvestre correspondiente,- .las bacterias corineformes recombinantes preferidas muestran cuando menos uno de los siguientes rasgos : (a) titulo de S-adenosilmetionina intracelular inferior (b) concentración de sintasa de S-adenosilmetionina intracelular inferior, o (c) actividad de sintasa de S-adenosilmetionina inferior, determinada con referencia al régimen de formación de S-adenosilmetionina, y adicionalmente si es apropiado, cuando menos uno de los siguientes rasgos: (d) actividad metY mejorada o (e) cantidad aumentada de L-metionina. Descripción detallada de la invención a) Términos generales. El término proteínas con la actividad biológica de "sintasa de S-adenosilmetionina", también abreviada a metK (E.C.2.5.1.6) se refiere a aquellas proteínas que son capaces de convertir L-metionina y ATP en S-adenosilmetionina. El trabajador experto está familiarizado con otros detalles de la proteína metK. La actividad de enzima de metK se puede detectar mediante ensayos de enzima, protocolos para la cual se encuentran en: Merkham, G.D. y col. (1983) Methods in Enzymology 94:219-222. Dentro del alcance de la presente invención, el término "químico fino que . contiene - azufre" · abarca cualquier compuesto químico que contiene cuando menos un átomo de azufre ligado covalentemente y que se puede obtener mediante un método de fermentación de conformidad con la invención. Ejemplos no limitativos son metionina, homocisteína, S-adenosilmetionina, cisteína y en particular metionina y S-adenosilmetionina . Dentro del alcance de la presente invención, los términos "L-metionina", "metionina", "homocisteína" y "-adenosilmetionina" también abarcan las sales correspondientes tales como por ejemplo, clorhidrato de metionina o sulfato de metionina. "Polinucleótidos" generalmente se refiere a poliribonucleótidos (RNA) y polideoxiribonucleótidos (DNA), que pueden tomar la forma de RNA o DNA no modificados o RNA o DNA modificados. "Polipéptidos" se entiende como significando, de conformidad con. la invención, péptidos o proteínas que comprenden dos o más aminoácidos que están ligados a través de enlaces de péptido. El término "metabolito" se refiere a compuestos químicos que ocurren en el metabolismo de organismos como intermediarios o bien productos finales y que, además de su propiedad como unidades químicas, también pueden ejercer un efecto de modulación en enzimas y sus actividad catalítica, Se sabe de la literatura que .. dichos metabolitos pueden ..tener tanto efecto inhibitorio como estimulante sobre la actividad de enzimas ( Biochemistry, Stryer, Lubert, 1995 W. H. Freemen & Company, New York, New York) . La literatura también describe que es posible producir, mediante medidas tales como mutando el DNA genómico mediante radiación de UV, radiación de ionización o substancias mutagénicas y subsecuentemente seleccionar para fenotipos específicos, en organismos, aquellas enzimas en las que la influencia por metabolitos se ha modificado (Sahm H . , Eggeling L., de Graaf A. A. Biological Chemistry 381(9-10}:899-910, 2000; Eikmanns BJ. , Eggeling L., Sahm H. Antonie van Leeuwenhoek 64:145-63, 1993-94). Estas propiedades modificadas también se pueden obtener mediante medidas dirigidas. En este contexto, el trabajador experto también sabe modificar específicamente, en genes para enzimas, nucleótidos específicos del DNA que codifica la proteína de tal manera que la proteína que resulta de la secuencia de DNA expresada tiene características novedosas especificas. Por ejemplo, esto puede resultar en el efecto de modulación de metabolitos que se están modificando sobre la proteína no modificada.

Asimismo, la actividad de enzimas se puede afectar de tal manera que un régimen de reacción disminuido o un cambio en afinidad al substrato resulta. En el contexto de la invención, los términos "expresa" o "mejora" o "sobreexpresión" en.. el contexto,, de la invención describen la producción o aumento de la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo que se codifican mediante el DNA en cuestión. A esta fina, es posible, por ejemplo, introducir un gene hacia un organismo, para reemplazar un gene existente por otro gene, para aumentar el número de copia del gene o genes, para usar un promotor fuerte o para usar un gene que codifica una enzima en cuestión con actividad elevada; si es apropiado, estas medidas se pueden combinar. Dentro del contexto de la invención, los términos "atenuar" y "reducir" describen la atenuación o reducción de la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo que están codificadas por el DNA en cuestión. A este fina, es posible, por ejemplo, omitir un gene en un organismo, para reemplazar un gene existente por otro gene, para reducir el número de copia de una transcripción del gene o genes, para usar un/promotor débil o para usar un gene que codifica una enzima correspondiente con actividad baja; si es apropiado, estas medidas.se pueden combinar. La "actividad reducida" del mutante de sintasa de S-adenosilmetionina de conformidad con la invención o de un equivalente funcional se puede determinar mediante comparación con la actividad de la sintasa de S-adenosilmetionina nativa, tal como por ejemplo, de Corynebacterium .. glutamicum. tipo silvestre, ATCC ,13032. A este fin, los plásmidos que copian en Corynebacterium glutamicum y que llevan los genes para mutantes de sintasa de S-adenosilmetionina se introducen apropiadamente mediante transformación en, por ejemplo, Corynebacterium glutamicum tipo silvestre, ATCC 13032. Además, los plásmidos apropiados que expresan la sintasa de S-adenosilmetionina de enzima de tipo silvestre se introducen al Corynebacterium glutamicum tipo silvestre, ATCC 13032. Los transformantes de Corynebacterium glutamicum obtenidos se esta manera se desarrollan en medios apropiados y se cosechan durante la fase de crecimiento logarítmico en el mismo OD60o. A continuación, los extractos de proteína se preparan de las células cosechadas de los dos transformantes siguiendo protocolos conocidos. Cantidades idénticas de estos extractos de proteína (siguiendo la identificación de proteína) se emplean luego en un ensayo de sintasa de S-adenosilmetionina mediante el método de Markham, G.D. y col. (1983) ethods en Enzymology 94:219-222. La radioactividad de la S-adenosilmetionina formada se determina en un contador de centelleo. Tomando en consideración la actividad especifica de la L-metionina radioactiva y la cantidad de proteina empleada, se puede determinar el régimen de formación de S-adenosilmetionina del aumento en radioactividad incorporada por tiempo unitario. Tiene la unidad de proteína, de umol S-adenosilmetionina/min*mg . Este régimen se puede comparar entre enzima de tipo silvestre y enzima mutante. Empezando de otras enzimas de tipo silvestre con actividad de sintasa de S-adenosilmetionina, los imitantes que son útiles de conformidad con la invención se pueden generar por el mismo principio. Una "actividad reducida" está presente de conformidad con la invención en particular cuando la actividad especifica del mutante se reduce a una actividad residual de aproximadamente 1 a 90%, de preferencia 3 a 70%, tal como por ejemplo, 5 a 10% de la actividad de tipo silvestre . b) proteínas metK de conformidad con la invención Las secuencias de polinucleótido de conformidad con la invención codifican proteínas con actividad de sintasa de S-adenosilmetionina reducida particular como se define arriba . Los mutantes que son útiles de conformidad con la invención se obtienen de preferencia substituyendo uno o más residuos de cisteína conservados con la secuencia de aminoácido metK de Gram-positivo y/o Gram-negativo, o en particular bacterias corineformes . Los residuos de cisteina conservados se pueden identificar fácilmente con ayuda de los alineamientos de secuencia. Ejemplos no limitativos de residuos de Cys conservados en sintasas de S-adenosilmetonina bacteriana son Cys24 y Cys94^de la enzima de C. glutamicum, que se encuentran en una multiplicidad de bacterias. En un grupo preferido de mutantes de conformidad con la invención, Cys24 y/o Cys94, (de conformidad con C. glutamicum ATCC 13032 metK) se substituyen por un aminoácido distinto a Cys, de preferencia alanina, mediante lo cual la actividad de enzima se reduce de la manera anterior. "Equivalentes funcionales" o análogos de los polipéptidos específicamente descritos son, dentro del alcance de la presente invención, polipéptidos que difieren de los mismos pero que todavía retienen la actividad biológica deseada tal como por ejemplo, especificidad de substrato. De conformidad con la invención, "equivalentes funcionales" se entiende como significando, en particular, mutantes que tienen otro aminoácido distinto al aminoácido que se ha mencionado específicamente en cuando menos una de las posiciones de secuencia arriba mencionadas, pero que todavía retienen una de las actividades biológicas arriba mencionadas. De esta manera, "equivalentes funcionales" abarcan los mutantes obtenibles por una o más adiciones de aminoácidos, substituciones, omisiones y/o inversiones, siendo posible que las modificaciones arriba mencionadas estén colocadas en cualquier posición de secuencia en tanto den lugar a un mutante con el perfil de características de conformidad con la invención. En particular, la equivalencia funcional también existe cuando el patrón de reactividad entre mutante y polipéptido no modificado concuerdan en calidad, es decir, por ejemplo cuando substratos idénticos se convierten a regímenes diferentes. Naturalmente, los "equivalentes funcionales" también abarcan polipéptidos que se pueden obtener de otros organismos, y variantes que ocurren naturalmente. Por ejemplo, escalas de regiones de secuencia homologas se pueden identificar mediante secuencia, y enzimas equivalentes se pueden determinar con una vista a las metas específicas de la invención. Asimismo, "equivalentes funcionales" abarcan fragmentos, de preferencia dominios o motivos de secuencia individuales, o los polipéptidos de conformidad con la invención que tienen, por ejemplo, la función biológica deseada . Además, "equivalentes funcionales" son proteínas de fusión con una de las secuencias de polipéptido arriba mencionadas-, o equivalentes funcionales derivados de las mismas y cuando menos una funcionalidad adicional diferente, secuencia heteróloga en enlace N- o C-terminal funcional (es decir, sin las fracciones de proteina de fusión siendo substancialmente afectadas de manera adversa funcionalmente entre si) . Ejemplos no limitativos de dichas secuencias heterólogas son, por ejemplo, ..péptidos .de señal, _enzimas,_ inmunoglobulinas , antigenos superficiales, receptores o ligandos de receptor. "Equivalentes funcionales" que también están abarcados de conformidad con la invención son homólogos a las proteínas específicamente descritas. Estos homólogos tienen cuando menos 20%, 30% o por ejemplo 40%, 50%, de preferencia por lo menos aproximadamente 60%, 65%, 70% o 75%, en particular al menos 85%, tal como por ejemplo, 90%, 95% o 99%, de homología con una de las secuencias específicamente descritas, calculada usando el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci . (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Los mutantes y análogos funcionales que se prefieren especialmente son aquellos que contienen la secuencia parcial característica G ( F/Y) (D/S)X¾2 (S/T)X3(G/A)V como se define arriba, en donde X3 es un aminoácido introducido por mutación distinto a Cys, en particular alanina. X3 corresponde a Cys94 de la secuencia de tipo silvestre metK de C. glutamicum (SEQ ID NO:16). X2 de preferencia representa Ala, Glu, Asp, Asn o Arg, y X1 de preferencia representa Gly, Cys, Ser o Ala. Los homólogos de las proteínas o polipéptidos de conformidad con la invención se pueden generar mediante mutagenesis, por ejemplo mediante mutación de punto o truncado de la proteína. El término "homólogo" como se utiliza en el presente contexto se relaciona con una forma variante de la proteína que actúa como agonista o antagonista de la actividad de proteína. Los homólogos de las proteínas de conformidad con la invención se pueden identificar tamizando librerías de combinación de mutantes, tales como por ejemplo, mutantes truncados. Una librería variada de variantes de proteína se puede generar, por ejemplo, mediante mutagenesis de combinación en el nivel de ácido nucleico, tal como por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Una multiplicidad de métodos se encuentran disponibles que se pueden utilizar para generar librerías de homólogos potenciales de una secuencia de oligonucleótido degenerado. La secuencia de gene degenerado se puede sintetizar químicamente en un siñtetizador de DNA, y el gene sintético luego se puede ligar en un vector de expresión apropiado. El uso de un juego de genes degenerados hace posible proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el juego deseado de secuencias de proteína potenciales. Los métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados se conocen por el trabajador experto (por ejemplo Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y col., (1984) annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y col., (1984) Science 198:1056; Ike y col. (1983) Nucleic Acids- Res. 11 : 477) . - - ¦ - Las librerías de fragmentos del codón de proteína se pueden utilizar adicionalmente para generar una población diversificada de fragmentos de proteína para tamizar y subsecuentemente seleccionar homólogos de una proteína de conformidad con la invención. En una modalidad, una librería de fragmentos de secuencia de codificación se puede generar tratando un fragmento de PCR de doble hebra de una secuencia de codificación con una nucleasa bajo condiciones bajo las cuales el enmuescado solamente ocurre aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el DNA de doble hebra, renaturalizando el DNA con la formación de DNA de doble hebra que puede abarcar pares de sentido/antisentido de varios productos con muesca, removiendo segmentos de una sola hebra de duplicados recientemente formados mediante tratamiento con nucleasa SI, y ligando la librería de fragmento resultante hacia un vector de expresión. Este método permite una librería de expresión que codifica fragmentos N-terminales, C-terminales e internos con diversos tamaños de la proteína de conformidad con la invención que se van a generar. Una pluralidad de técnicas para la mutagenesis de genes se conoce en el ramo anterior: Coco, WM y col. 2001. Método de revolver DNA para generar genes altamente recombinados y enzimas desprendidas. Nature Biotechnol. 19:354-359; DE 19953854; Leung DW y col. 1989. Un método para mutagenesis al azar. de. un segmento ,de DNA definido usando una reacción en cadena de polimerasa modificada. Technique 1:11-15; Stemmer WPC 1994, Mezclado de DNA mediante fragmentación al azar y reensamblado: recombinación en vitro para evolución molecular. Proc. Nati. Acad. Sci EUA 91:10747-10751, y EUA 5811238. Estos métodos se pueden emplear para generar mutantes que son útiles de conformidad con la invención. Una pluralidad de técnicas para tamizar productos de gene de librerías de combinación que se han generado por mutaciones de punto o truncado y para tamizar librerías de cDNA para productos de gene con una característica seleccionada se conoce en el ramo anterior. Estas técnicas se pueden adaptar para tamizado rápido de las librerías de gene que se han generado mediante mutagenesis de combinación de homólogos de conformidad con la Invención. Las técnicas que se utilizan más frecuentemente para tamizar grandes librerías de gene que se someten a análisis de producción elevada incluyen clonar la librería de genes en vectores de expresión replicables, transformar las células apropiadas con la librería de vector resultante y expresar los genes de combinación bajo condiciones bajo las cuales la detección de la actividad deseada simplifica el aislamiento del vector que codifica el gene cuyo producto se ha detectado. La mutagenesis de conjunto recursivo (REM) , una técnica que -aumenta .-la frecuencia, de imitantes funcionales en las librerías, se puede utilizar en combinación con los ensayos de tamizado para identificar homólogos (Arkin y Yourvan 81992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave y col. (1993) Protein Engineering 6 ( 3 ) : 327-331. c) Polinucleotidos de conformidad con la invención Asimismo, la invención se relaciona con secuencias de ácido nucleico (secuencias de DNA de una sola y doble hebra y RNA tales como por ejemplo, cDNA y mRNA) que codifica una enzima metK de conformidad con la invención y sus equivalentes funcionales que se pueden obtener, por ejemplo, usando análogos de nucleótido sintéticos, entre otros. La invención se relaciona tanto con moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos o proteínas de conformidad con la invención, o segmentos biológicamente activos de estos, como con fragmentos de ácidos nucleicos que se pueden utilizar, por ejemplo, como sondas de hibridización o imprimadores para identificar o amplificar ácidos nucleicos de codificación de conformidad con la invención. Además, las moléculas de ácido nucleico de conformidad con la invención pueden contener secuencias no traducidas de 3'- y/o 5' -extremos de la región de codificación de genes. Una molécula de ácido nucleico "aislada" separada de otras - moléculas de - ácido nucleico -que están, presentes en la fuente natural del ácido nucleico y, si se prepara mediante técnicas recombinantes, puede estar adicionalmente libre de otro material celular o medio de cultivo, o, si está químicamente sintetizada, libre de precursores químicos u otros químicos. La invención además abarca las moléculas de ácido nucleico que son complementarias a las secuencias de nucleótido descritas específicamente, o un segmento de las primeras . Las secuencias de nucleótido de conformidad con la invención hacen posible la generación de sondas e imprimadores que se pueden utilizar para identificar y/o clonar secuencias homologas en otros tipos de célula y organismos. Estas sondas o imprimadores usualmente abarcan una región de secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones estrictas a cuando menos aproximadamente 12, de preferencia al menos aproximadamente 25, tal .como por ejemplo, aproximadamente 40, 50 o 75, nucléotidos consecutivos de una hebra de sentido de una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención o de una hebra de antisentido correspondientes. Además, secuencias de ácido nucleico de conformidad con la invención se derivan de SEQ ID NO: 21 y difieren de las mismas mediante la adición, substitución, inserción u omisión de nucleótidos individuales o varios, pero continúan codificando polipéptidos con el perfil deseado de características. Pueden tomar la forma de polinucleótidos que son idénticos con las secuencias anteriores en cuando menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80% o 90%, de preferencia cuando menos en aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las posiciones de secuencia. También abarcadas de conformidad con la invención se encuentran aquellas secuencias de ácido nucleico que abarcan lo que se conoce como mutaciones silenciosas o que se modifican en comparación con una secuencia específicamente mencionada de conformidad con el uso de codón de un organismo específico de origen, u organismo huésped, como son variantes que ocurren naturalmente, tales como por ejemplo, variantes alélicas, de los mismos. Otro objeto son secuencias que se pueden obtener mediante substituciones de nucleótido conservativo (es decir, el aminoácido en cuestión se reemplaza por un aminoácido de la misma carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad) . Otro objeto de la invención son las moléculas derivadas de los ácidos nucleicos específicamente descritos por medio de polimorfismos de secuencia. Estos polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población debido a variación natural. Estas variaciones naturales usualmente ocasionan una variación de 1 a 5% en la .secuencia de nucleótido de un gene. La invención además también abarca secuencias de ácido nucleico que se hibridizan con secuencias de codificación arriba mencionadas o son complementarias a las mismas. Estos polinucleotidos se pueden encontrar cuando se tamizan librerías genómicas o de cDNA y, si es apropiado, se amplifican de las mismas con imprimadores apropiados por medio de PCR y subsecuentemente se aislan, por ejemplo usando sondas apropiadas. Otra posibilidad es la transformación de microorganismos apropiados con polinucleotidos de conformidad con la invención, o vectores, la multiplicación de los microorganismos, y de esta manera la amplificación de los polinucleotidos, y su aislamiento subsecuente. Además, los polinucleotidos de conformidad con la invención también se pueden sintetizar químicamente. La característica de ser capaz de "hibridizarse" con polinucleotidos se entiende como significando la capacidad del polinucleótido u oligonucleótido de ligarse a una secuencia virtualmente complementaria bajo condiciones estrictas, mientras que en enlace no específico entre socios no complementarios no ocurre bajo estas condiciones. A este fin, las secuencias deben mostrar 70-100%, de preferencia 90-100% de capacidad complementaria. La característica de secuencias complementarias de ser capaces de ligarse específicamente entre sí se explota, por ejemplo en la técnica de mancha de Norte o _de Sur, o en la hibridización de imprimador en PCR o RT-PCR. Usualmente los oligonucleótidos de una longitud de 30 pares de base se utilizan. Las condiciones estrictas se entienden como que significan, por ejemplo, en le técnica de mancha de Norte, el uso de una solución de lavado, de preferencia 0.1 x tampón SSC con 0.1% de SDS (20x SSC: 3M NaCl, 0.3M Na citrato, pH 7.0} a una temperatura de 50 - 70°C, de preferencia 60-65°C, para la elución de sondas u oligonucleótidos de cDNA hibridizados no específicamente. Como se mencionó arriba, solamente aquellos ácidos nucleicos permanecen ligados entre sí que muestran una alto grado de capacidad complementaria. El ajuste de condiciones estrictas se conoce por el trabajador experto y se describe, por ejemplo, en Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biológy, John wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.2.1-6.3.6. d) Aislamiento de los genes metK de codificación y de otros genes Los genes metK que codifican la enzima de sintasa de S-adenosilmetionina (EC 2.5.1.6) se pueden aislar de una manera en sí conocida.

Para aislar los genes metK, o bien otros genes de otros organismos, una librería de genes de este organismo en Escherichia coli (E. coli) se establece como el primer paso. Establecer librerías de gene se describe con detalle en libros ^de textos o libros de referencia generalmente conocidos. Los ejemplos que se pueden mencionar son el libro de texto de Winnacker: Gene and Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie [Genes and clones, An introduction to genetic engineering] (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990), o el libro de referencia por Sambrook y col: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Una librería de genes muy bien conocida es aquella de E. coli K-12 cepa W3110, que se ha establecido por Kohara y col. (Cell 50, 495-508 (198)) en vectores ?. Los cósmidos, tales como el vector cósmido SuperCos I (Wahl y col. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 84: 2160-2164), pero también plásmidos tales como pBR322 (Bolívar; Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o püC9 (Vieira y col., 1982, Gene, 19: 259-268), se pueden utilizar para establecer una librería de genes en E. coli. Las cepas de E. coli que son particularmente apropiadas como huéspedes son aquellas que son deficientes en restricción y deficientes en recombinación. Un ejemplo es la cepa DH5 mcr, que se ha descrito por Gran y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences EUA, 87 (1990) 4645-4649). Los fragmentos de DNA largos que se clonan con. ayuda -de cósmidos, a su vez, se pueden subclonar subsecuentemente hacia vectores acostumbrados que son apropiados para hacer secuencia y subsecuentemente se hacen secuencia, como " se describe por ejemplo por Sanger y col. ( Proceedi ngs of , the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977) . Las secuencias de DNA resultantes luego se pueden estudiar con algoritmos o programas de análisis de secuencia conocidos, tales como por ejemplo, el programa por Staden (Nucleic Acids Research 81986) 14,217-232), el programa por Marck (Nucleic Acids Research 81988) 16, 1829-1836) o el programa de Butler GCG (Methos of Biochemical Analysis (1998) 39, 74-97). El trabajador experto encontrará protocolos para identificar secuencias de DNA por medio de hibridización en, entre otros, el libro de referencia "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" por Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Lieble y col. (International Journal of Systematic Bacteriology 81991) 41:255-260). El trabajador experto encontrará protocolos para amplificar secuencias de DNA con ayuda de la reacción de cadena de polimerasa (PCR) en, entre otros, el libro de referencia por Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y en Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelger, Alemania, 1994). Además es sabido que modificaciones de los términos N y/o C de una proteína no afectan substancialmente la función de la última; en realidad, son aún capaces de estabilizarla. El trabajador experto encontrará información sobre este asunto, entre otros, en Ben-Bassat y col. (1987) Journal of Bacteriology 169: 751-757, en 0' Regan y col. (1989) Gene 77: 237-251, en Sahin-Toth y col. (1994) Protein Sciences 3: 240-247, en Hochuli y coi. (1988) Biotechnology 6: 1321-1325 y en libros de texto conocidos de biología genética y molecular. e) Células huésped usadas de conformidad con la invención Las células huésped que se utilizan para el método de ¦ conformidad con la invención son, de preferencia, bacterias corineformes cuya actividad metK reducida se puede detectar a través de cuando menos una de las siguientes características : (a) un título de S-adenosilmetionina intracelular que se reduce en comparación con la cepa de tipo silvestre, (b) una concentración de sintasa de S-adenosilmetionina intracelular reducida (menos sintasa de S-adenosilmetionina basada en la proteína total), o (c) una actividad de sintasa de S-adenosilmetionina intracelular reducida (menos actividad de enzima de sintasa de S-adenosilmetionina basada en el contenido de proteina de sintasa de S-adenosilmetionina . Todas estas características se pueden determinar por el trabajador experto de una manera simple, si es apropiado, tomando en consideración la descripción anterior. La invención se relaciona además en particular con microorganismos que actúan como células huésped, en particular bacterias corineformes que contienen un vector, en particular vector mezclado o vector de plásmido qúe contiene cuando menos un gene metK como se define de conformidad con la invención, o bacteria corineforme en la que un gene metK de conformidad con la invención con actividad reducida se expresa . Estos microorganismos son capaces de producir químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina, de glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidón, celulosa o de glicerol y etanol . De preferencia son bacterias corineformes, en particular del género Corynebacterium. Entre el género Corynebacterium, la especie Corynebacterium glutamicum, que se conoce en círculos expertos por su capacidad de producir L-aminoécidos , se debe mencionar en particular. Los ejemplos que se deben mencionar de cepas apropiadas para bacterias corineformes son aquellas del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), tales como Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,' Corynebacterium acetoacidophilum ATCCF 13870, Corynebacterium melassecola ATCC 17965 o del género Brevibacterium, tales como Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, o cepas derivadas de los mismos, tales como Corynebacterium glutamicum KFCC10065 Corynebacterium glutamicum ATCC21608 que asimismo producen el químico fino deseado o su precursor (KFCC = Federación Coreana de Colección de cultivo, ATCC = Colección de Cultivo de Tipo Americano) . f) Llevar a cabo la fermentación de conformidad con la invención Se ha encontrado de conformidad con la invención que la bacteria corineforme, después de expresar un gene metK de conformidad con la invención, producen químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina, de una manera venta osa . Se pueden tomar varias medidas por el trabajador experto, ya sea individualmente o en combinación, a fin de reducir la actividad o cantidad de una enzima, por ejemplo sintasa de S-adenosilmetíonina, metK. La concentración de la proteina en cuestión se puede reducir reduciendo la frecuencia de transcripción del gene que codifica la proteina de conformidad con la invención. Esto se puede lograr por el trabajador experto modificando o substituyendo la región de promotor, la región reguladora, o bien el sitio de enlace de ribosoma del gene de codificación. Corriente abajo de la región de codificación, el 'trabajador experto puede modificar terminadores o insertar secuencias que conducen a estabilidad reducida de la transcripción. Estas medidas, que reducen la expansión de vida del mRNA, hace posible disminuir la expresión de la proteina correspondiente y de esta manera su concentración . En el nivel de la enzima expresada, las secuencias fundidas pueden conducir a un régimen de interrupción aumentado y de esta manera, asimismo, a una concentración reducida de la proteina. Además, el trabajador experto puede modificar la actividad, afinidad de substrato y la especificidad de substrato sometiendo el gene de codificación a mutagenesis dirigida o no dirigida. La actividad de enzimas se puede influenciar por mutaciones en los genes correspondientes de tal manera que el resultado es un grado de, o completa, reducción del régimen de reacción de la reacción de enzima. Ejemplos de estas mutaciones se conocen por el trabajador experto (Motoyama H. Yano H. Teresaki Y. Anaza a H. Applied & Environmental Microbiology. 67:3064-70, 2001, Eikmanns BJ. Eggeling -L. Sahm H". Antonie van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94). Los mutantes de la proteina también pueden conducir a homo- o heteromulti erización reducida o impedida de complejos de enzima y de esta manera nuevamente a un deterioro de las propiedades enzimáticas. Los genes que se han modificado de esta manera pueden estar presentes ya sea en plásmidos o, de preferencia, integrados al cromosoma. El gene original, que no se ha modificado de esta manera, adicionalmente puede estar presente, pero de preferencia está substituido por el gene modificado. A fin de reducir la actividad de una enzima, por ejemplo sintasa de S-adenosilmetionina (metK) , como se mide en una bacteria corineforme, puede ser suficiente para expresar genes que codifican equivalentes funcionales, tales como mutantes artificialmente generados u homólogos naturales de otros organismos. El gene original puede estar presente adicionalmente, pero de preferencia está substituido por el gene modificado u homólogo. Cuando se producen químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina en bacterias corineformes por medio de fermentación, puede ser adicionalmente ventajoso no solamente expresar un gene metK de conformidad con la invención, sino también mejorar una o más enzimas de la trayectoria biosintética en cuestión, de la trayectoria metabólica de cisteina, de la síntesis de semialdehído de aspartato, de glicólisis, de anapleróticos , del metabolismo de pentosa- fosfato, del ciclo de citrato o de la exportación de aminoácido. De esta manera, uno o más de los siguientes genes se puede mejorar para la producción de químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina: - el gene lysC, que codifica una quinasa de aspartato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281), - el gene asd, que codifica un semialdehído de aspartato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 282), el gene gap que codifica deshidrogenasa de glicerinaldehído-3-fosfato (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-608.6), el gene pgk, que codifica quinasa de 3-fosfoglicerato (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - el gene pyc, que codifica carboxilasa de piruvato (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), el gene tpi, que codifica isomeraza de triosa-fosfato (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - el gene metA, que codifica O-acetiltransferasa de homoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 725), - el gene metB, que codifica sintasa de cistationina-gamma (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3491), - el gene metC, que codifica liasa de cistat ionina-gamma (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061), - el gene mett, que codifica metionina-sintasa (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663), el gene glyA, que codifica hidroximetiltransferasa de serina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1110), el gene metY, que codifica sulfhidrilasa de O-acetilhomoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726), - el gene metF, que codifica aminotransferasa de fosfoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379), - el gene serC, que codifica aminotransferasa de fosfoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 928) - un gene serB que codifica fosfoserina-fosfotasa (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. .334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767) - el gene cysE, que codifica transferasa de serina acetilo (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818) - el gene cysK, que codifica sintasa de cisteina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817), - el gene om, que codifica una deshidrogenasa de homoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1306) . De esta manera, puede ser ventajoso para la producción de químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina en bacterias coxineformes simultáneamente mutar cuando menos uno de los siguientes genes de modo que las proteínas correspondientes se afecten menos o nada en absoluto por un metabolito con respecto a su actividad con comparación con proteínas no imitadas, o de manera que se mejore su actividad específica. - el gene lysC, que codifica una quinasa de aspartato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281), - el gene pyc, que codifica carboxilasa de piruvato (Eikmanns (1992), journal of Bacteriology 174: 6076-6086), el gene metA, que codifica O-acetiltransferasa de homoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 725), - el gene metB, que codifica sintasa de cistationina-gamma (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3491), - el gene mete, que codifica liasa de cistationina-gamma (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061), - el gene metH, que codifica sintasa de metionina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663), el gene glyA, que codifica hidroximetiltransferasa de serina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1110), el gene metY, que codifica sulfhidrilasa de O-acetilhomoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726), - el gene metF, que codifica reductasa de tetrahidrofolato de metileno (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379), - el gene serC, que codifica aminotransferasa de fosfoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 928), - el gene serB que codifica fosfoserina-fosfatasa (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767) - el gene cysE, que codifica acetiltransferasa de serina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818) - el gene cysK, que codifica sintasa de cisteina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817), - el gene hom, que codifica des idrogenasa de homoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1306) Además, puede ser ventajoso para la producción de químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina, adicionalmente a la expresión de uno de los genes met de conformidad con la invención, atenuar uno o más de los siguientes genes, en particular para reducir o cambiar su expresión: - el gene thrB, que codifica quinasa de homoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453) - el gene ilvA, que codifica deshidratasa de treonina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328) - el gene thrC, que codifica sintasa de treonina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486) el gene den, que codifica D-deshidrogenasa de meso-diaminopimelato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494) el gene pck, que codifica carboxiquinasa de fosfoenolpiruvato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQNO. 3157) - el gene pgi, que codifica 6-isomerasa de glucosa-6-fosfato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 950) - el gene poxB, que codifica oxidasa de piruvato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873) .. . - ¦ - el" gene dapA, que codifica sintasa de dihidrodipicolinato (EP 1 108 790 A2; DNBA-SEQ NO. 3476) - el gene dapB, que codifica reductasa de dihidrodipicolinato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3477) el gene lysA, que codifica dicarboxilasa de diaminopicolinato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3451) Además, puede ser ventajoso para la producción de químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina, adicionalmente a la expresión de uno de los genes metK de conformidad con la invención en bacterias corineformes simultáneamente para mutar cuando menos uno de los siguientes genes de tal manera que la actividad de enzima de la proteína correspondiente se reduce a un grado o completamente: - el gene thrB, que codifica quinasa de homoserina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453) - el gene ilvA, que codifica dehidratasa de treonina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328) - el gene thrC, que codifica sintasa de trionina (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3486) - el gene ddh, que codifica D-dehidrogenasa de meso-diamino- pimelato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ. NO . 3494) .el gene pck, que codifica carboxiquinasa de fosfoenolpiruvato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157) - el gene pgi, que codifica 6-isomerasa de glucosa-6-fosfato " (EP G 108 790 A2;'DNA-SEQ NO. 950) - el gene poxB, que codifica oxidasa de piruvato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873) - el gene dapA, que codifica sintasa de dihidrodipicolinato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476} - el gene dapB, que codifica reductasa de dihidrodipicolinato (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3477) el gene lyzA, que codifica decarboxiiasa de diaminopicolinato (EP 1 108 790 A2, DNA-SEQ NO. 3451) Adicionalmente, puede ser ventajoso para la producción de químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina, además de la expresión de un gene metK de conformidad con la invención para eliminar reacciones secundarias no deseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, Rü, 1982) . El trabajador experto puede tomar varias medidas, individualmente o en combinación, a fin de lograr la sobreexpresión . De esta manera, el número de copia de los genes en cuestión se puede aumentar, o la región de promotor y la región reguladora o el sitio de enlace de ribosoma que está colocado corriente arriba del gene estructural se puede mutar. Los cassettes de expresión que se introducen corriente arriba del gene estructural actúan de la misma manera. Además, los promotores inducibles hacen posible aumentar la expresión durante la producción de L-metionina mediante fermentación. La expresión también se mejora mediante medidas que prolongan la vida de mRNA. Además, la actividad de enzima también se aumenta evitando la degradación de la proteina de enzima. Los genes o construcciones de gene pueden estar presentes en plásmidos con diferentes números de copia o bien integrarse y amplificarse en el cromosoma. Como una alternativa, la sobreexpresión de los genes en cuestión se puede lograr adicionalmente modificando la composición de medio y proceso de fermentación. El trabajador experto encontrará información sobre el objeto, entre otros, en Martin y col. (Biotechnology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero y col. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikamnns y col. (Gene 102, 93-98 (1991)), en EP 0472869, en EUA 4,601,893, en Schwarzer y Pühler (Biotechnology 9, 84-87 (1991), en Remscheid y col. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 ( 1994 ) , en LaBarre y col. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 81993)), en O 96/15246, en Malumbres y col. (Gene 134, 15-24 (1993)), en JP-A-10-229891 , en Jennsen and . Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en akrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular. La invención, por lo tanto, también se relaciona con construcciones de expresión que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de conformidad con la invención bajo el control genético de secuencias de ácido nucleico reguladoras, y con vectores que abarcan cuando menos una de estas construcciones de expresión. De preferencia, estas construcciones de conformidad con la invención comprenden un promotor 5' -corriente arriba de la secuencia de codificación en cuestión y, 3' -corriente abajo, una secuencia de terminación y, si es apropiado, elementos reguladores acostumbrados adicionales, en cada caso en enlace operativo con la secuencia de codificación. "Enlace operativo" se entiende que significa la disposición en secuencia de promotor, secuencia de codificación, terminador y, si es apropiado, elementos reguladores adicionales de tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueden llenar su función pretendida durante expresión de la secuencia de codificación. Los ejemplos de secuencia capaces de enlace operativo son secuencias de activación y me oradores y lo semejante. Los elementos reguladores adicionales abarcan marcadores selecciónateles, señales de amplificación, orígenes de réplica y lo semejante. Las secuencias reguladoras apropiadas se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . La secuencia reguladora natural todavía puede estar presente corriente arriba del gene estructural real, además de las secuencias reguladoras artificiales. Si es apropiado, esta regulación natural se puede eliminar mediante modificación genética, y la expresión de gene se puede aumentar o reducir. Sin embargo, la construcción de gene puede ser más sencilla, es decir, no se insertan señales reguladoras adicionales antes del gene estructural, y el promotor natural con su regulación no se remueve. En su lugar, la secuencia reguladora naturales se muta de tal manera que la regulación ya no ocurre, y la expresión de gene se aumenta o reduce. Una o más copias de las secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes en la construcción de gene. Ejemplos de promotores útiles son: los promotores ddh, amy, lysC, dapA, lysA de Corinebacterium glutamicum, pero también promotores Gram-positivos SP02 como se describen en Bacillus Subtilis and its Closest Relatives, Sonenshein, Abraham L., Hoch, James A., Loick, Richard; ASM Press, District of Columbia, Washington y Patek M. Eikemanns BJ.

Patek J. Sahm H. Microbiology . 142 13297-309, 1996, o bien eos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal tre, ara, SP6, I-PR o promotores I-PL, que se usan ventajosamente en bacterias Gram-negativas . También se prefiere el uso " de promotores inducibles, tales como por ejemplo, promotores inducibles de luz, y en particular, inducibles de temperatura, tales como promotor PrPi- En principio, todos los promotores naturales junto con sus secuencias reguladoras se puedan usar. Además, también se pueden utilizar ventajosamente promotores sintéticos. Las secuencias reguladoras arriba mencionadas se pretenden para hacer posible la expresión dirigida de las secuencias de ácido nucleico y de expresión de proteína. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar, por ejemplo, que el gene se expresa o sobreexpresa solamente después de inducción, o que se expresa y/o sobreexpresa inmediatamente . En este contexto, las secuencias reguladoras o factores pueden tener de preferencia un efecto adverso en la expresión, reduciéndola de esta manera. De esta manera, la disminución puede ocurrir en el nivel de transcripción utilizando señales de transcripción débil tales como promotores y/o mej oradores. Sin embargo, la disminución de traslación también es posible, por ejemplo reduciendo la estabilidad de mRNA.

En este contexto, las secuencias reguladoras o factores pueden tener de preferencia un efecto positivo en expresión aumentándola o reduciéndola de esta manera. De esta manera, una mejora de los elementos reguladores puede ocurrir venta osamente en* el nivel de transcripción usando señales de transcripción fuertes tales como promotores y/o mejoradores. Sin embargo, la mejora de traslación también es posible, por ejemplo aumentando la estabilidad de mRNA. Un cassette de expresión se genera fundiendo un promotor apropiado, una secuencia Shine-Dalgarno apropiada con una secuencia de nucleótido metK y una señal de terminación apropiada. Las técnicas de recombinación y clonación acostumbradas son como se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, 1993, John iley & Sons, Incorporated, New York, New York, PCR Methods, Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sinsky, John J. 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego, PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser., Vol . 192, 2a. Ed. , Humana Press, New Jersey, Totwa, T. Maniatis, E.F. Firtsch and J. Sambrook Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y en T.JU. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) se utilizan para este propósito. - - ¦ Para expresión en un organismo huésped apropiado, la construcción de ácido nucleico recombinante o construcción de gene se "inserta "venta osamente en un vector especifico de huésped que hace posible la expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores son bien conocidos al trabajador experto y se pueden encontrar, por ejemplo, en "cloning Vectors" (Pouwels P. H. Y col., ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1 85) . Además de plásmidos, los vecotres también se entienden como significando todos los otros vectores con los que está familiarizado el trabajador experto, tales como por ejemplo, fagos, transposones, elementos IS, fagémidos, cósmidos, y DNA lineal o circular. Estos vectores se pueden duplicar de manera autónoma en el organismo huésped o bien duplicarse cromosomalmente. Los genes metK de conformidad con la invención se expresan, por ejemplo, con ayuda de plásmidos episomales. Los plásmidos apropiados son aquellos que se duplican en bacterias corineformes . Un gran número de vectores de plésmido conocidos, tales como por ejemplo, pZl (Menkel y col., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), ePKExl (Eikmanns y col., Gene 102: 93-98 (1991)) o pHS2-l (Sonnen y coll, Gene 107: 69-74 (1991)), se basan en los plásmidos crípticos pHMl519, pBLl o pGAl . Otros vectores de plásmido, tales como por ejemplo, pCLiK5MCS, SEQ ID NO: 9, o aquellos que se basan en pCG4 (US-A 4,489, 160) o pNG2 (Serwold-Davis y col., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAGl (US-A 5,158,891) se pueden usar también. Otros vectores de plásmido apropiados son aquellos con ayuda de los cuales el método de amplificación de gene mediante integración hacia el cromosoma se puede aplicar, se ha descrito, por ejemplo, por Remscheid y col. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para duplicar o amplificar el operón hom-thrB. En este método, el gene completo se clona hacia un vector de plásmido que es capaz de réplica en un huésped (típicamente E. coli), pero no en C. Glutamicum. Los vectores apropiados son, por ejemplo, pSÜP301 (Simón y col., Bio/Technology 1,784-791 (1983)), pKISmob o pK19mob (Scháfer y col., Gene 145, 69-73 (1994)), Bernard y col., ' Journal of Molecular Biology, 234:523-541 (1993)), pEMl (Schrumpf y col. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) o pBGS8 (Spratt y col., 1986, Gene 41: 337.342). Otros vectores de plásmido, tales como por ejemplo, pCLiK5MCS sacB integrante, SEQ ID NO: 12; se pueden utilizar asimismo. El vector de plásmido que contiene el gene que se va a amplificar se transfiere subsecuentemente hacia la cepa de C. Glutamicum deseada mediante transformación. Los métodos de transformación se describen, por ejemplo, por Thierbach y col. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shlvnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch y coi. (FEMS Microbiologicai Letters' 123, 343-347 (1994)). El medio de cultivo a utilizar debe llenar apropiadamente las necesidades de las cepas en cuestión. Las descripciones de medios de cultivo para una variedad de microorganismos se encuentran en el manual "Manual of Methods für General Bacteriology" de la American Society ofor Bacteriology (Washington, D.C., EUA, 1981). Estos medios que se pueden emplear de conformidad con la invención usualmente abarcan una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o elementos de vestigio. Las fuentes de carbono preferidas son azúcares tales como como-, di- o pol isacáridos . Los ejemplos de muy buenas fuentes de carbono son glucosa, fructosa, mañosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sucrosa, rafinosa, almidón o celulosa. Los azúcares también se pueden añadir a los medios a través de compuestos complejos, tales como melazas, u otros productos secundarios de refinación de azúcar. También puede ser ventajoso añadir mezclas de diversas fuentes de carbono. Otras fuentes de carbono posibles son aceites y grasas tales, como por ejemplo, aceite de soya, aceite de girasol, aceite de maní y aceite de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmitico, ácido esteárico o ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol, metanol o etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ejemplo, ácido acético o ácido láctico. - Las fuentes de nitrógeno son usualmente compuestos de nitrógeno orgánicos o inorgánicos o materiales que comprenden estos compuestos. Los. ejemplos de fuentes de nitrógeno abarcan gas de amoníaco o sales de amonio tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes de nitrógeno complejo tales como licor de maíz, harina de soya, proteína de soya, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno se pueden usar individualmente o como una mezcla. Los compuestos de sal inorgánica que pueden estar presentes en el medio abarcan el cloruro, sales de calcio fosforosas o de sulfato, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro. Los compuestos que contienen azufre inorgánico tales como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditíonitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros, pero también compuestos de azufre orgánicos, tales como mercaptanos y tioles se pueden utilizar como fuente de azufre para la producción de químicos finos que contienen azufre, en particular de metionina . El ácido fosfórico, dihidrogenfos'fato de potasio o nidrogenfosfato de dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes se pueden utilizar como fuente de fósforo. - Secuestradores se pueden añadir al medio a fin de mantener los iones de metal en solución. Los secuetradores particularmente apropiados abarcan dihidrofenoles, tales como catecol o protocatecuato, o ácidos orgánicos tales como ácido cítrico . Usualmente, el medio de fermentación empleado de conformidad con la invención también comprende otros factores de crecimiento tales como vitaminas o promotores de crecimiento, que incluyen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y sales se obtienen frecuentemente de los componentes de medio de complejo tales como levadura, extracto, melazas, licor de maíz y lo semejante. Además, se pueden añadir precursores apropiados al medio de cultivo. La composición exacta de los compuestos en los medios depende grandemente del experimento en cuestión y se decidirán individualmente para cada caso individual. La información sobre la optimización de medios se puede encontrar en el libro de texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pág. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).

Los medios de crecimiento también se pueden obtener de fuentes comerciales tales como Standard 1 (Merck) o BHI (infusión de corazón cerebro, DIFCO) y lo semejante. Todos los componentes de medio están esterilizados, ya- sea por medio de calor (20 minutos a 1.5 bar y 121 °C) o mediante esterilización por filtro. Los componentes pueden esterilizarse juntos, o, si es apropiado, separadamente. Todos los componentes de los medios pueden estar presentes al principio de la fermentación o bien añadirse continuamente o por lotes, como se desee. La temperatura de cultivo es normalmente entre 15°C y 45°C, de preferencia 25°C a 40°C, y se puede mantener constante durante el experimento o bien variarse. El pH del medio debe estar en la escala de 5 a 8.5, de preferencia alrededor de 7.0. El pH para la fermentación se puede controlar durante la fermentación mediante adición de compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o agua de amoniaco, o compuestos acidicos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Los agentes antiespuma tales como, por ejemplo, ésteres de poliglicol de ácido graso se pueden emplear para controlar el desarrollo de espuma. Para mantener estabilidad de plásmido, substancias que actúan selectivamente apropiadas, tales como por ejemplo, antibióticos se pueden añadir al medio. Para mantener condiciones aeróbicas, oxigeno o mezclas de gas que contiene oxigeno, por ejemplo aire ambiental, se hacen pasar hacia el cultivo. La temperatura de cultivo es normalmente 20°C a 45°C, de preferencia 25°C a 40°C. La fermentación se continúa hasta que se ha formado un máximo del producto deseado. Esta meta se logra normalmente dentro de 10 horas a 160 horas. Los caldos de fermentación obtenidos de esta manera, en particular caldos de fermentación que comprenden L-metionina, usualmente contienen una biomasa seca de 7.5 a 25% en peso. Una ventaja adicional es llevar a cabo la fermentación bajo condiciones de limitación de azúcar, cuando menos al final, pero en particular durante cuando menos 30% del periodo de fermentación. Esto significa que durante este tiempo la concentración de azúcar utilizable en el medio de fermentación se mantiene a o se reduce a >. 0 a 3 g/1. El caldo de fermentación luego se procesa adicionalmente . De conformidad con el requerimiento, todo o parte de la biomasa se puede remover del caldo de fermentación mediante métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de estos métodos, o bien dejarse completamente en el caldo. Subsecuentemente, el caldo de fermentación se puede espesar o concentrar con ayuda de métodos conocidos, tales como por ejemplo, con ayuda de un evaporador giratorio, un evaporador de película delgada, mediante " osmosis invertida o mediante nanofiltración . Este caldo de fermentación concentrado luego se puede trabajar mediante secado por congelación, secado por" aspersión, granulación por aspersión o por otros métodos. Sin embargo, también es posible purificar los químicos finos que contienen azufre, en particular L-metionina. A este fin, el caldo que contiene producto, después de remover la biomasa, se somete a una cromatografía utilizando una resina apropiada, con todo o parte del producto deseado o contaminantes siendo retenidos en la resina de cromatografía. Estos pasos de cromatografía se pueden repetir, si es necesario, utilizando las mismas u otras resinas de cromatografía. El trabajador experto está familiarizado con la selección de resinas de cromatografía apropiadas y su uso más efectivo. El producto purificado se puede concentrar mediante filtración o ultrafiltración y almacenarse a una temperatura a la que la estabilidad del producto es la mayor. La identidad y pureza de los compuestos aislados se puede determinar mediante técnicas del ramo. Estas incluyen cromatografía líquida de alto funcionamiento (HPLC), métodos espectroscópicos , métodos de manchado, cromatografía de capa delgada, NIRS, ensayo de enzima o ensayos microbiologicos.

Estos métodos analíticos se resumen en: Patek y col. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova y col". (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; y Schmidt y col. (1998) Bioprocess Engineer, 19:67-70. Ulmann' s Encyclopedia of Industrial chemistry 81996) vol . A27, VCH; Weinheim, pág . 89-90, pág. 521-540, pág. 540-547, pág. 559-566, 575-581 y pág. 5871-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallón A., y col. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volumen 17. Los siguientes ejemplos no limitativos describen la invención cón mayor detalle: La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo de metK radioactivo utilizando enzima de tipo silvestre y mutantes C94A> respectivamente. Ejemplo 1 Construcción del vector pCLiK5MCS La primera resistencia de ampicilina y origen de réplica del vector pBR322 se amplificaron utilizando los imprimadores de oligonucleótido SEQ ID N0:1 y SEQ ID NO: 2 con ayuda de la reacción de cadena de polimerasa (PCR) . SEQ ID NO:l 5 ' -CCCGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGATGAAATACCGCACAG-3 ' SEQ ID NO:.2 ' -TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAATTGAAGACGAAAGGGCCTGCG-3 ' Además de las secuencias complementarias a pBR322, el imprimador de oligonucleótido SEQ ID N0:1 contiene en la dirección 5' -3' los sitios de disociación para las nucleasas de restricción Smal, BámHI, Nhel y Ascl y el imprimador de oligonucleótido SEQ ID NO: 2 contiene en la dirección 5' -3'-los sitios de disociación para las endonucleasas de restricción Xbal, Xhol, Not6i y Dral . La reacción de PCR se llevó a cabo de conformidad con un método convencional tal. como aquel por Innis y col. (PCR Protocols. A Guide to ethods and Applicatiosn, Academic Press (1990)) utilizando polimeraza PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, EUA) . El fragmento de DNA obtenido de aproximadamente 2.1 kb en tamaño se purificó utilizando GFX^PCR, DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los extremos romos del fragmento de DNA se ligaron entre si utilizando el juego de ligado de DNA rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de conformidad con las instrucciones del fabricante y la mezcla de ligado se transformó en el E. coli XL-IBlue competente (Stratagene, La Jolla, EUA) de conformidad con métodos convencionales, como se describe en Sambrook y col. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), Las células portadoras de plásmido se seleccionaron cubriendo sobre agar de ampicilina (50 ul/ml)-gar que contiene LB {Lennox, 1955, Virology, 1:190). El DNA de plásmido de un clón individual se aisló utilizando el juego Qiaprep spin miniprep (Qiagen, Hilden) de conformidad con las instrucciones del fabricante y se comprobaron- mediante digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se denotó pCLiKl. Empezando el plásmido pWLTl (Lieble y col., 1992) una plantilla para una reacción de PCR, un cassette de resistencia de canamicina se amplificó usando los imprimadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 3: 5 ' -GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3 ' SEQ ID NO: 4: 5 ' -GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3' Además de las secuencias complementarias a pWLTl, el imprimador de oligonucleótido SEQ ID NO: 3 contiene en la dirección 5' -3' los sitios de disociación para las endonucleasas de restricción Xbal, Smal, BamHI, Nhel y el imprimador de oligonucleótido SEQ ID NO: 4 contiene en la dirección 5' -3' los sitios de disociación para las endonucleasas de restricción Ascl y Nhel. La reacción de PCR se llevó a cabo usando polimeraza PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, EUA) de conformidad con un método convencional tal como aquel de Innis y col. (PCR Protocols. Aguide to Methods and Applications, Academic Press 81990) ) . El fragmento de.

DNA obtenido dé aproximadamente 1.3 kb en tamaño se purificó usando el GFX'^PCR, DNA y uego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El fragmento de DNA se disoció con endonucleasas de restricción Xbal y *~Asc'l * (New England Biolabs, Beverly, EUA) y, después de eso, se purificó nuevamente usando GFX^PCR, DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Él vector pCLiKl asimismo se disoció con las endonucleasas de restricción Xbal y Ascl y se desfoforiló utilizando fosfatasa 1 alcalina (Roche Diagnostics, Mannheim) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después de electroforesis e[n un gel de agarosa de 0.8% de resistencia, el vector linealizado (aproximadamente 2.1 kb) se aisló usando el GFC^PCR, DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante y la mezcla de ligado se transformó en E.coli XL-lBlue3 competente (Stratagene, La Jolla, EUA) de conformidad con métodos convencionales, como se describen en Sambrook y col. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Las células portadoras de plásmido se seleccionar cubriendo hacia ampicilina (50 ug/ml) y canamician (20 ug/ml)-agar que contiene LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190).

El DNA de plásmido en el clón individual se aisló utilizando Qiaprep spin miniprep kit (Qiagen, Hilden) de conformidad con las instrucciones del fabricante y se comprobó mediante digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se denotó' pCLiK2.' El vector pCLiK2 se disoció con la endonucleasa de restricción Dral (New England Biolabs, Beverly, EUA) . Después de electroforesis en gel de agarosa de 0.8% de resistencia, se aisló un fragmento de vector de aproximadamente 2.3 kb usando GFX^PCR, DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante y la mezcla de ligado se transformó en E.coli XL-IBlue (Stratagene, La Jolla, EUA) de conformidad con métodos convencionales, como se describen en Sambrook y col.

(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Las células portadoras de plásmido se seleccionaron chapando hacia agar de LB que contiene kanamicina (20 ug/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El DNA de plásmido del clón individual se aisló utilizando el Qiaprep Spin miniprep kit (Qiagen, Hilden) de conformidad con las instrucciones del fabricante y se comprobó mediante digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se denotó pCLi 3. Emepzando del plásmido pWLQ2 (Liebl y col., 1992) como plantilla para una reacción de PRC, el origen de réplica pHM1519 se amplificó utilizando . los imprimadores de oligonucleotido SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 5: 5' -GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3r SEQ ID NO: 6: 5 ' -GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3 ' Aparte de las secuencias complementarias a p LQ2, los imprimadores de oligonucleotido SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 contienen sitios de disociación para la endonucleasa de restricción Notl. La reacción de PCR se llevó a cabo usando polimeraza PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, EUA) de conformidad con un método convencional tal como aquel de Innis y col. (PCR Protocols. A Guide to ethods and Applications, Academic Press (1990)). El fragmento de DNA obtenido aproximadamente 2.7 kb en tamaño se purificó usando el GFX^PCR, DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El vector pCLiK3 se disoció asimismo con la endonucleasa de restricción Notl y se desfosforiló usando fosfatasa 1 alcalina (Roche Diagnostics, Mannheim) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después de electroforesis en un gel de agarosa de 0.8% de resistencia, el vector linealizado (aproximadamente 2.3 kb) se aisló usando el GFX^PCR, DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante y la mezcla de ligado se transformó en E.coli XL-IBlue competente (Stratagene, La Jolla, EUA) de conformidad con métodos convencionales, como se describe en Sambrook y col. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Las células portadoras de plásmido se seleccionaron chapando hacia agar LB que contiene canamicina (20 ug/ml) (Lennox, 1955, Virogoly, 1:190). El DNA de plásmido de un clón individual se aisló usando el Qiaprep spin minoprep kit (Qiagen, Hilden) de conformidad con las instrucciones del fabricante y se comprobó mediante digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se denotó pCLiK5. El pCLiKS se extendió en un sitio de clonación múltiple (MCS) combinando los dos oligonucleótidos esencialmente complementarios sintéticos SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, que contienen sitios de disociación para las endonucleasas de restricción S al, Xhol, Aatl, Apal, Asp718, Mlul, Ndel, Spel, EcoRV, Salí, Clal, BamHl, Xbal y Smal para proporcionar un fragmento de DNA de doble hebra calentándolos juntos a 95 °C seguido mediante enfriamiento lento. SEQ ID NO: 7: 5 ' -TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACT AGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGG ATCCTCTAGACCCGGGATTTAAA-3' SEQ ID NO: 8 : . ¦ 5 ' -GAT'CATTT AA CCCGGGTCTAGAGGA CCCAA TGTTAA AACGCAGAAGAGCA C GATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGA CGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3'- · - El vector pCLiK65 se disoció con las endonucleasas de restricción Xhol y BamHl (New England Biolabs, Beverly, EUA) y se desfosforiló utilizando fosfatada 1 alcalina (Roche Diagnostics, Mannheim) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después de electroforesis en gel de agarosa de 0.8% de resistencia, el vector linealizado (aprox. 5.0 kb) se aisló usando GFX^-PCR; DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Este fragmento de vector se ligó con el fragmento de DNA de doble hebra sintético con ayuda de un juego de ligado de DNA rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de conformidad con las instrucciones del fabricante y la mezcla de ligado se transformó en E.coli XL-lBiue competente (Stratagene, La Jolla, EUA) de conformidad con métodos convencionales como se describen en Sambrook y col. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring ffarbor, (1989)). Las células portadoras de plásmido se seleccionado chapando hacia agar LB que contiene canamicina (20 ug/ml) (Lennox, 1955, Virology, 1:190). El DNA de plásmido del clón individual se aisló utilizando el Qiaprep spin miniprep kit (Qiagen, Hilden) de conformidad con las instrucciones del fabricante y se comprobó mediante digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se denoto pCLiK5MCS . Las reacciones de secuencia se llevaro a" cabo" de-conformidad con Sanger y col. (1977) Proceedings of the National Academy os Sciences EUA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionaron y analizaron por medio de ??G Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido resultante pCLiK5MCS se enumera como SEQ ID NO: 9. Ejemplo 2 Construcción del vector pCLiK5MCS integrativo de sacB Empezando del plásmido pK19mob (Schafer y col., Gene 145, 69-73 (1994)) como plantilla para una reacción de PCRm, el gene de Bacillüs subtilis sacB se amplificó usando los imprimadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 10: 5' -GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3' SEQ ID NO: 11: 5 ' -AGGAGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3 ' Aparte de las secuencias complementarias a p 19mobsac, los imprimadores de oligonucleótido SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 contienen sitios de disociación para la endonucleasa de restricción Notl . La reacción de PCR se llevó a cabo usando polimeraza PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, EUA) de conformidad con un método convencional tal como aquel de Innis y col. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)). El fragmento de DNA obtenido de aproximadamente 1.9 kb en tamaño se purificó usando el GFX^PCR, DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El fragmento de DNA se disoció con la endonucleasa de restricción Notl (New England Biolabs, Beverly, EUA) y después de eso, se purificó nue\^amente utilizando el GFX^PCR, DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El vector pCLiK5MCS se disoció asimismo con la endonucleasa de restricción Notl y se desfosforiló usando fosfatasa 1 alcalina (Roche Diagnostics, Mannheim) de conformidad con las - instrucciones del fabricante. Después de electroforesis en un gel de agarosa de 0.8% de resistencia, se aisló un fragmento de vector de aproximadamente 2.4 kb de tamaño usando el GFX^PCR, DNA y juego de purificación de banda de gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Este fragmento de vector se ligó con el fragmento de PCR disociado con ayuda del juego de ligado de DNA rápido (Roche Diagnostics, Mannheim) de conformidad con las instrucciones del fabricante y la mezcla de ligado se transformó en E.coli XL-IBlue competente (Stratagene, La Jolla, EUA) de conformidad con métodos convencionales, como se describen en Sambrook y col. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Las células portadoras de plásmido se seleccionaron chapando hacia agar de LB que contiene canamicina (20 ug/ml) (Lennox, 1955, Virogolgy, 1:190). El DNA de plásmido de un clón individual se aisló usando el Qiaprep spin miniprep kit (Qiagen, Hilden) de conformidad con las instrucciones del fabricante y se comprobó mediante digestiones de restricción. El plásmido obtenido de esta manera se anota pCLiK5MCS integrativ sacB. Las reacciones de secuencia se llevaron a cabo de conformidad con Sanger y col. 81977) Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se fraccionaron y analizaron por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido resultante pCLiK5MCS integrativo sacB se enumeró como SEQ ID NO: 12.. E ijemplo 3 Aislamiento y clonación del gene metK de C. glutamicum C. glutamicum cromosomal ATCC 13032 DNA se preparó usando el método de Tauch y col. 81995) Plásmido 33:168-179 o Eikmann y col. (1994) Mibriobiology 140:1817-1828. Los siguientes imprimadores de oligonucleótido se sintetizaron empezando de la secuencia de metK de Brossmann y col. (2000) FEMS Microbiology Letters 193:99-103: SEQ ID NO: 13 5 ' -GAGAGCCCGGGAAGAAGGGC.TGCGACCTCCTCAT-3' - ¦--y SEQ ID NO: 14 5 ' -CTCTCACGCGTCATATGCAGGTGAGGTAACCCCA-3' Un fragmento de DNA de par de base 1640 se amplificó del DNA de C. glutamicum genómico usando métodos convencionales como se describe por Innis y col. (1990} PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press utilizando los imprimadores de oligonucleótido arriba mencionados y polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) . El fragmento se disoció con las enzimas de restricción Mili y Smal (Roche Diagnostics, Mannheim) que se habían introducido a través de los imprimadores de oligonucleótido PCR y se separaron mediante electroforesis de gel. El fragmento de DNA se aisló subsecuentemente de la agarosa usando GFX^CPR, DNA y Juego de Purificación de Banda de Gel (Amersham Pharmacia, Freiburg) . El vector pCLiK5MCS, SEQ ID NO: 9 se disoció asimismo con las enzimas de restricción Sma y Mull y se desforforiló con fosfatasa 1 alcalina (Roche Diagnostics, Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante. El vector y el fragmento de DNA se ligaron con ligasa T4 DNA (Amersham Pharmacia, Freiburg) y se transformó en E.coli XL-IBlue (Stratagene) usando métodos convencionales como se describen por Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor . . , El DNA de plásmido se preparó mediante métodos y materiales de Quiagen. Las reacciones se secuencia se llevaron a cabo como se describe por Sanger y col. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 74:5463-5467. Las reacciones de secuencia se separaron y evaluaron por medio de ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . El plásmido resultante pCLiK5MCS/metKwt se enumera como SEQ ID NO: 15. Ejemplo 4 Mutagenesis del gene metK de C.glutamicum La mutagenesis dirigida del gene metK de C.glutamicum se llevó a cabo usando el QuickChange Kit (Stratagene) , siguiendo las instrucciones del fabricante. La mutagenesis se llevó a cabo en plásmido cCLiK5MCS/metKwt , SEQ ID NO: 15. Los siguientes imprimadores de oligonucleotido se sintetizaron substituyendo cisteina 94 de SEQ ID NO: 16 por alanina 94 : SEQ ID NO: 17 5 ' -GATTCGACGGACGCACCGCTGGCGTCTCAGTATCCATC-3 ' y SEQ ID NO: 18 5' -GATGGATACTGAGACGCCAGCGGTGCGTCCGTCGAATC-3 ' El uso 'de estos imprimadores de oligonucleótido resultó en, SEQ ID NO: 15 en una substitución de. los nucleótidos en posición 1056 (C se substituyó por G) y 1057 (A se substituyó por C) . La substitución de aminoácido resultante Cys94Ala en el gene metK se confirmó mediante reacciones de secuencia siguiendo la transformación y preparación de plásmido. El plásmido se denotó pCLiK5MCS/metKC94A y se enumeró como SEQ ID NO: 19. Ensayo de sintasa (metKI) SAM Cepas de C.glutamicum que se habían transformado ya sea con el plásmido pCLiK5MCS/metKwt, SEQ ID NO: 15 o con el plásmido pCLiK5MCS/metKC94A, SEQ ID NO: 19 se desarrollaron en medio de BHI/glucosa (37 g/1 preparado en medio de infusión de cerebro corazón, Difco, 10 mM (NH4)2S04, 4% glucosa) a 30°C y un OD6oo de 20. Las células de hilaron a 4°C y el gránulo se lavó con salina fisiológica fría. Después de centrifugación, 0.25 g de gránulo de célula húmedo se resuspendió en 1 mi de tampón de disrupción (50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM Kcl, 1 mM DTT) a 4°C. La suspensión bacteriana se lisó tres veces para en cada caso 30 segundos en un Ribolyser de Hybaid y en tubos Ribolyzer azules de Hybaid y un ajuste de rotación de 6.0. El lisado se aclaró mediante centrifugación durante 45 minutos en una centrifuga Eppendorf a 13,, 000 rpm, y el sobrenadante se diluyó con agua 1:10. El contenido de proteina se determinó mediante el método de Bradford, M. M. 81976) Anal. Biochem. 72:248-254. _ 5__ La actividad de .enzima de sintasa SAM.,se determinó mediante el método de Markham, G.D. Y col. (1983) Methods in Enzymology 94:219-222, con las siguientes modificaciones: Las mezclas de reacción de 100 ul conteniendo 100 mM Tris pH 8.0, 100 mM Ckl, 20 mM de gCl2, 1.2 mM de L-metionina, 10 mM de ATP, 1 ul de 35S-L-metionina, correspondiente a 15.15 uCi (Amersham SJ204, actividad especifica 1 Ci/umol) y ¾0 a 100 ul se iniciaron con 100 ug de los lisados de proteina en cuestión y se incubaron a 37 °C. Después de 0, 5, 10, 20, 30 y 60 minutos, alícuotas de 10 ul de la mezcla de reacción se removieron y se detuvieron eñ hielo usando 20 ul de 50 mM de EDTA. 20 ul de la reacción detenida se colocaron en unidades de filtro de fosfocelulosa (Pierce, No. 29520) y se hilaron durante 1 minuto en una centrífuga Eppendorf a 6000 rpm. El filtro se lavó dos veces con 500 ul de 75 mM de ácido fosfórico y luego se colocó en un tubo de conteo que contiene líquido de centelleo. La radioactividad de la S-adenosilmetionina formada se determina en un contador de centelleo (Beckman) . 25 Los datos se muestran en la Figura 1 anexa.

Tomando en consideración la actividad especifica de la L-metionina radioactiva, y la cantidad de proteina empleada, el régimen de formación de S-adenosilmetionina se puede determinar del aumento en radioactividad incorpora por tiempo unitario. Su. unidad es umul ,de. S-adenosilmetionina/ min*mg proteína. Este régimen se puede comparar entre enzima tipo silvestre y enzima mutante. Ejemplo 6 Determinación del título S-adenosilmetionina celular en G. glutamicum Para determinar los títulos de S-adenosilmetionina celular en cepas de C. glutamicum que se han transformado ya sea con pCLiK5CS/metKwt (SEQ ID NO: 15) o p-CLiK5MCS/metKC94A (SEQ ID N0:19), se usó el siguiente procedimiento. Un gránulo de célula obtenido como se describió en el ejemplo 5 que se había lavado con salina fisiológica enfriada con hielo se resuspendio en ácido tricloracético (200 ul de TCA por 0.5 g de gránulo húmedo) . Después de 5 minutos en hielo, la suspensión se clarificó durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a 4°C y 13000 rpm. El contenido de S-adenosilmetionina en el sobrenadante se determinó por medio de HPLC (columna de intercambio de catión Ionospher 5C, volumen de inyección 10 ul, fase móvil: 70% vol/vol 0.2M de formato de amonio pH 4.3 30% vol/vol de metanol; detección de UV 260 nm; 40°C; tiempo de retención 8.5 minutos).

Cuadro 1. Títulos de S-Adenosilmetionina Mg/1 ATCC 13032 + metK 73.94 ATCC13032 + metK C94A 47.36 Ejemplo 7 Substitución de gene metKwt en C. glutamicum para metK C94A Para la substitución alélica del gene metK tipo silvestre en C. glutamicum KFCC10065 por el metK C94A mutante, la secuencia de metK C94A de SEQ ID NO: 19 se clonó primero hacia pCLiK5MCS integrativo sacB (SEQ ID NO:12). A este fin, el plásmido pCLiK5MCS/metKC94A (SEQ ID NO: 19) se disoció con la endonucleasas de restricción Bgl II y Xholl (NEB, Schwalbach) . El fragmento de par de base 1962 resultante se purificó como se describe en el Ejemplo 3. El vector pCLiK5MCS integrativo sacB se disoció asimismo asimismo bon Bgl II y Xhol y se purificó como se describe en el ejemplo 3. El vegor y fragmento se ligaron y transformaron en E.coli XL-IBlue como se describió en el Ejemplo 3. El plásmido se purificó y, después de secuencia se conformó. El plásmido resultante pCLiK5MCS integrativo sacB/metKC94A se enumeró como SEQ ID NO: 20. El plásmido pCLiK5MCS integrativo saB,/metKC94A se transformó en C. glutamicum KFCC10065 mediante electroporación como se describió por Lieble, y col (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303. Las modificaciones del protocolo se describen en DE 10046870. La disposición cromosomal de la ubicación de metK de transformantes individuales se verificó mediante métodos convencionales por manches del Sur e hibridización como se describen por Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. Se aseguró de esta manera que los transformantes fueron aquellos que tienen el plásmido transformado integrado en la ubicación de metK mediante recombinación homologa. Después de que estas colonias se desarrollaron durante la noche en medios sin antibiótico, estos transformantes se chaparon luego hacia un medio de agar de sucrosa CM (10% de sucrosa) y se incubó durante 24 horas a 30°C. Puesto que el gene sacB, que está presente en el vector pCLiK5MCS integrativo sacB/metKC94A, convierte la sucrosa en un producto tóxico, solamente aquellas colonias que tienen el gene sacB omitido por un segundo paso de recombinación homologa entre el gene metK tipo silvestre y el gene metKC94A mutado fueron capaces de crecer. Ya sea el gene tipo silvestre o el gene mutado junto con el gene sacB se pueden omitir mientras que la recombinación homologa ocurre. Si el gene sacB junto con el gene tipo silvestre se remueve, resulta un transformante mutante. Las colonias en desarrollo se recogieron, se preparó su DNA genómico, y el gene metK se analizó mediante dos métodos. En primer lugar, la substitución de dos 60 g/1 de melazas El medio preparado de esta manera se llevó a un pH de 7.8 con NH4OH y se esterilizó durante 30 minutos a 120°C. Medio IIB: 0.3 mg/1 de tiamina*HCl , .. .. 1 mg/1 de biotina 2 mg/1 de FeS04 2 mg/1 de MnS04 0.1 mg/1 de vitamina B12 El medio IIB se preparó separadamen e, se esterilizó por filtro y se añadió al medio IIA. Los dos componentes lia y IIB juntos forman el medio II. 10 mi de medio II (= IIA+B) se trataron, en un frasco Erlenmyer de 100 mi gue contiene 0.5 g de CaC03 esterilizado, con células de la cepa arriba mencionada y se incubaron durante 72 horas en un agitador orbital a 30 °C a 200 rpm. Metionina formada en el caldo de cultivo se determinó con ayuda del método de determinación de aminoácido de Agilent en un Agüen 1100 Serie LC system HPLC. La derivación de pre-columna con orgo-ftalaldehído permite la cuantificación del aminoácido formado, mientras que la mezcla de aminoácido se separa en una columna Hypersil AA (Agilent).

LISTADO DE SECUENCIAS <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Método para la producción de productos, químicos finos que contienen azufre mediante fermentación '<130> M/43138 <160> 23 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> . . <223> primer o cebador de PCR <400> 1 cccgggatcc gctagcggcg cgccggccgg cccggtgtga aataccgcac ag <210> 2 <211> 53 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> primer o cebador de FCR <400> 2 tctagactcg agcggccgcg gccggccttt aaattgaaga cgaaagggcc tcg <210> 3 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> primer o cebador de PCR <400> 3 gagatctaga cccggggatc cgctagcggg ctgctaaagg aagcgga <210> 4 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> primer o cebador de PCR <400> 4 gagaggegog ccgctagcgt - gggegaagaa ctecagca - ¦ · .. -'- -- <210> 5 <211> 34 <212> ADN <2_13> Secuencia artificial , . ... <220> <223> primer o cebador de PCR <400> 5 gagagggcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaa <210> 6 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> primer o cebador de PCR <400> 6 gagagggcgg ccgctcaagt cggtcaagcc acgc <210> 7 <211> 140 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> sitio de clonación múltiple <400> 7 tcgaatttaa atctcgagag gcctgacgtc gggcccggta ccacgcgtca tatgactagt tcggacctag ggatatcgtc gacatcgatg ctcttctgcg ttaattaaca attgggatcc tctagacccg ggatttaaat <210> 8 <211> 140 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> sitio de clonación múltiple <400> 8 gatcatttaa atcccgggtc tagaggatcc caattgttaa ttaacgcaga agagcatcga tgtcgacgat atccctaggt ccgaactagt catatgacgc gtggtaccgg gcccgacgtc aggcctctcg agatttaaat <210> 9 <211> 5091 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> plásmido . <400> 9 tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac cacgcgtcat atgactagtt 60 cggacctagg gatatcgtcg acatcgatgc tcttctgcgt taattaacaa ttgggatcct 120 ctagacccgg gatttaaatc gctagcgggc tgctaaagga agcggaacac gtagaaagcc 180 , agtccgcaga aacggtgctg accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg 240 gaaaacgcaa gcgcaaagag aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta 300 gactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt 360 aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg 420 cgcaggggat caagatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 480 gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 540 gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 600 ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 660 gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 720 actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 780 tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 840 acgcttgatc cggctacctg cccattcgác caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 900 cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 960 ctcgcgccag ccgaactgtt gccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc 1020 gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 1080 ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 1G40 acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 1200 ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 1260 tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 1320 atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 1380 ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc cacgctagcg 1440 gcgcgccggc ccgcccggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 1500 aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 1560 gcggtatcag ctcactcaaa- ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 1620 ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 1680 ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 1740 cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 1800 ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 1860 Lcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 1920 gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 1980 tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 2040 gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 2100 tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 2160 ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 2220 agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 2280 gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 2340 attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ggccggccgc 2400 ggccgcgcaa agtcccgctt cgtgaaaatt ttcgtgccgc gtgattttcc gccaaaaact 2460 ttaacgaacg ttcgttataa tggtgtcatg accttcacga cgaagtacta aaattggccc 2520 gaatcatcag ctatggatct ctctgatgtc gcgctggagt ccgacgcgct cgatgctgcc 2580 gtcgatttaa aaacggtgat cggatttttc cgagctctcg atacgacgga cgcgccagca 2640 tcacgagact gggccagtgc cgcgagcgac ctagaaactc tcgtggcgga tcttgaggag 2700 ctggctgacg agctgcgtgc tcggccagcg ccaggaggac gcacagtagt ggaggatgca 2760 atcagttgcg cctactgcgg tggcctgatt cctccccggc ctgacccgcg aggacggcgc 2820 gcaaaatatt gctcagatgc gtgtcgtgcc gcagccagcc gcgagcgcgc caacaaacgc 2880 cacgccgagg agctggaggc ggctaggtcg caaatggcgc tggaagtgcg tcccccgagc 2940 gaaattttgg ccatggtcgt cacagagctg gaagcggcag cgagaattat cgcgatcgtg 3000 gcggtgcccg caggcatgac aaacatcgta aatgccgcgt ttcgtgtgcc gtggccgccc 3060 aggacgtgtc agcgccgcca ccacctgcac cga¾tcggca gcagcgtcgc gcgtcgaaaa 3120 agcgcacagg cggcaagaag cgataagctg cacgaatacc tgaaaaatgt tgaacgcccc 3180 gtgagcggta actcacaggg cgtcggctaa cccccagtcc aaacctggga gaaagcgctc 3240 aaaaatgact ctagcggatt cacgagacat tgacacaccg gcctggaaat tttccgctga 3300 tctgttcgac acccatcccg agctcgcgct gcgatcacgt ggctggacga gcgaagaccg 3360 ccgcgaattc ctcgctcacc tgggcagaga aaatttccac- ggcagcaaga cccgcgactt 3420 cgccagcgct tggatcaaag acccggacac ggagaaacac agccgaagtt ataccgagtt 3480 ggttcaaaat cgcttgcccg gtgccagtat gttgctctga cgcacgcgca gcacgcagcc 3540 gtgcttgtcc tggacattga tgtgccgagc caccaggccg gcgggaaaat cgagcacgta 3600 aaccccgagg tctacgcgat tttggagcqc tgggcacgcc tggaaaaagc gccagcttgg 3660 atcggcgtga atccactgag cgggaaatgc cagctcatct ggctcattga tccggtgtat 3720 gccgcagcag, gcatgagcag .cccgaatatg cgcctgctgg ctgcaacgac cgaggaaatg 3780 acccgcgttt tcggcgctga ccaggctttt tcacataggc tgagccgtgg ccactgcact 38 ' ctccgacgat cccagccgta ccgctggcat gcccagcaca atcgcgtgga tcgcctagct 3900 gatcttatgg aggttgctcg catgatctca ggcacagaaa aacctaaaaa acgctatgag 3960 caggagtttt ctagcg.gacg ggcacgtatc gaagcggcaa gaaaagccac tgcggaagca 4020 aaagcacttg ccacgcttga agcaagcctg ccgagcgccg ctgaagcgtc tggagagctg 4080 atcgacggcg tccgtgtcct ctggactgct ccagggcgtg ccgcccgtga tgagacggct 4140 tttcgccacg ctttgactgt gggataccag ttaaaagcgg ctggtgagcg cctaaaagac 4200 accaagggtc atcgagccta cgagcgtgcc tacaccgtcg ctcaggcggt cggaggaggc 4260 cgtgagcctg atctgccgcc ggactgtgac cgccagacgg attggccgcg acgtgtgcgc 4320 ggctacgtcg ctaaaggcca gccagtcgtc cctgctcgtc agacagagac gcagagccag 4380 ccgaggcgaa aagctctggc cactatggga agacgtggcg gtaaaaaggc cgcagaacgc 4440 tggaaagacc 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aggagcggcc gccatcggca ttttcttttg cg 32 <210> 12 <211> 4323 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> plásmido <400> 12 tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60 tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120 tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180 cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240 gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt "" 300 ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360 ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420 agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480 gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 540 atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600 gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660 tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720 agggactggc tgctattggg cgaagtgccg 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tgtttgccgt aatgtttacc ggagaaatca 3300 gtgtagaata aacggatttt tccgtcagat gtaaatgtgg ctgaacctga ccattcttgt 3360 gtttggtctt ttaggataga . atcatttgca tcgaatttgt cgctgtcttt aaagacgcgg 3420 ccagcgtttt tccagctgtc aatagaagtt tcgccgactt tttgatagaa catgtaaatc 3480 gatgtgtcat ccgcattttt aggatctccg gctaatgcaa agacgatgtg gtagccgtga 3540 tagtttgcga cagtgccgtc agcgttttgt aatggccagc tgtcccaaac gtccaggcct 3600 tttgcagaag agatattttt aattgtggac gaatcaaatt cagaa cttg atatttttca 3660 tttttttgct gttcagggar ttgcagcata tcatggcgtg taatatggga aatgccgtat 3720 gtttccttat atggcttttg gttcgtttct ttcgcaaacg cttgagttgc gcctcctgcc 3780 agcagtgcgg tagtaaaggt taatactgtt gcttgttttg caaacttttt gatgttcatc 3340' gttcatgtct ccttttttat gtactgtgtt agcggtctgc ttcttccagc cctcctgttt 3900 gaagatggca agttagttac gcacaataaa aaaagaccta aaatatgtaa ggggtgacgc 3960 caaagtatac actttgccct ttacacattt taggtcttgc ctgctttatc agtaacaaac 4020 ccgcgcgatt tacttttcga cctcattcta ttagactctc gtttggattg caactggtct 4080 attttcctct tttgtttgat agaaaatcat 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ggacgattcc ggtggtgacc acagtttcca 1200 ctgcgacgcg cgactgcgga tctttttcga gcagcgcgtc caaaatggta tcggaaatag 1260 catcacatat tttgtctgga tgtccctcag ttacagattc actggtgaac aaacggacgg 1320 cggttggctg agccacaaat acccttcttt cgaagaagtt gagaataaat agtcttaaat 1380 acaaaaaacc aatatagacc aagctgtcta aaactgcaat gtcagtggtc tagctggatt 1440 tttctagact tcgcgatacg ccagtgccgc gtcccaaatt tgcgcagcaa cctcgatttt 1500 gctgccgcgc tccacatcga ctaccccacc gtgagcatcc aaaatccagc cctcattgtg 1560 cttttgccca aacactttgc ccatgcccac ctcattacac atgaggaggt cgcagccctt 1620 cttcccggga tttaaatcgc tagcgggctg ctaaagqaag cggaacacgt agaaagccag 1680 tccgcagaaa cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga 1740 aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc. gatagctaga 1800 ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa 1860 ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg 1920 caggggatca agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 1980 tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 2040 acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 2100 cgttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 2160 gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 2220 tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 2280 tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 2340 gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 2400 tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 2460 cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 2520 cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 2580 attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 2640 cc'gtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 2700 tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 2760 agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat 2820 ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg 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Gly Val 85 . 9.0 , 95. Ser Val Ser lie Gly Glu Gln Ser Gln Glu lie Ala Asp Gly" al Asp " 100 105 110 Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg 115 120 125 Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu 130 135 140 Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro lie Ala Leu Ala His Arg Leu Ser 145 150 155 160 Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly lie Val Pro His Leu Arg 165 170 175 Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg 180 185 190 Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val lie Ser Thr Gln His Asp Pro Glu 195 200 205 Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val lie Asp 210 ' 215 220 Trp Val lie Lys Asp Ala Gly lie Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu lie 225 230 235 240 Thr Val Leu lie Asn Pro Ser Gly Ser Phe lie Leu Gly Gly Pro Met 245 250 255 Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys lie lie Val Asp Thr Tyr Gly' 260 265 - 270 Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser 275 280 285 Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn 290 295 300 lie Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr 305 310 315 320 Ala lie Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp . 325 330 335 Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln lie Gln Ala Ala Val Leu 340 345 350 Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala lie lie Arg Glu Leu Asp Leu 355 360 365 Leu Arg Pro lie Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg 370 375 380 Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala lie Asp Arg Val Asp Glu Leu 385 ' . 390 395 400 Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala 405 <210> 17 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ' <223> primer o cebador de PCR <400> 17 gattcgacgg acgcaccgct ggcgtctcag. tatccatc. <210> 18 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> primer o cebador de PCR <400> 18 gatggatact gagacgccag cggtgcgtcc gtcgaatc <210> 19 <211> 6631 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> plásmido <400> 19 cgcgtcatat gcaggtgagg taaccccaaa agaggtaaaa cccgcgccac cgacttttca 60 ggagcgggga cgcgggtttt tgccatgaat ccgaagatac tacatcagat ttttaggcca 120 acttgagggc tgcgcgaagt tcatcaacgc ggtcgatagc ctcccaagga aggtccaaat 180 cagtgcgacc aaagtggccg taggcagcag tgtcagcgta gatcggacga agcagatcaa 240 gctcacggat aattgctgct ggacgcaggt caaagacctc caacacggca gcctgaatct 300 gctcgtcgct caggccttcc ttgttggtgt caaaggtttc aacgtaaagt ccgactggct 360 ttgcgcgtcc aatggcgtat gcaacctgaa cttcagcgcg atcagcaagg cctgctgcca 420 cgatgttctt tgctacccaa cgcatggcgt atgcagcaga gcggtccacc ttgcttggat 480 ccttaccgga gaatgctcca ccaccatggc gagccatgcc accgtaggta tccacgatga 540 tcttgcggcc ggtcagaccc gcatcaccca tggggccacc cagaatgaag gaacctgaag 600 ggttgatcaa cacggtgatc. tcaccggttg ccagatcctc aatgcctgcg tctttgatta 660 cccaatcaat gacgtgttcg cgcagttggg tttccaacca tgcacggtca acttctgggt 720 cgtgctgggt ggagatgaca acggtatcca ggtggctagg gcggtcttgc gcatcgtatg 780 cgaaggtgac ctgggttttt ccgtctggac gcaggtgagg aacgatgccc tctttacgaa 840 cctgggtcag acgacgtgac agtcggtgcg ccaacgcgat aggaagaggc atgtactctt 900 cggtttcgtt ggtggcgtag ccgaacatca ggccctggtc gccagcacct 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(1224 ) <223> <400> 21 gtg gct cag cca acc gcc gtc cgt ttg ttc acc agt gaa tct gta act 48 Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr 1 5 10 15 gag gga cat cca gac aaa ata tgt gat gct atz tec gat acc att ttg 96 Glu Gly His Pro Asp Lys lie Cys Asp Ala lie Ser Asp Thr lie Leu 20 25 30 gac gcg ctg etc gaa aaa gat ceg cag teg cgc gtc gca gtg gaa act 144 Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr 35 40 45 gtg gtc acc acc gga ate gtc cat gtt gtt ggc gag gtc cgt acc age 192 Val Val Thr Thr Gly lie Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser 50 55 60 gct tac gta gag ate ect caá tta gtc cgc aac aag etc ate gaa ate 240 Ala Tyr Val Glu lie Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu lie Glu lie 65 70 75 80 gga ttc aac tec tct gag gtt gga ttc gac gga cgc acc gct ggc gtc 288 Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Ala Gly Val 85 90 95 tea gta tec ate ggt gag cag tec cag gaa ate gct gac ggc gtg gat 336 Ser Val Ser lie Gly Glu Gln Ser Gln Glu lie Ala Asp Gly Val Asp 100 105 110 aac tec gac gaa gcc cgc acc aac ggc gac gtt gaa gaa gac gac cgc 384 Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg 115 120 125 gca ggt gct ggc gac 'cag ggc ctg atg ttc ggc tac gcc acc aac gaa 432 Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu 130 135 140 acc gaa gag tac atg cct ctt cct atc gcg ttg gcg cae cga ctg tea Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro lie Ala Leu Ala His Arg Leu Ser 145 150 155 160 cgt cgt ctg acc cag gtt cgt aaa gag ggc atc gtt cct cae ctg cgt Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly lie Val Pro His Leu Arg 165 170 175 cea gac gga aaa acc cag gtc acc ttc gca. tac gat gcg caá gac cgc Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg 180 185 190 cct age cae ctg gat acc gtt gtc atc tec acc cag cae 'gac cca gaa Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val lie Ser Thr Gln His Asp Pro Glu 195 200 205 gtt .gac cgt gca tgg ttg gaa acc caá ctg cgc gaa cae gtc att gat Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg' Glu' His Val He Asp 210 215 220 tgg gta atc aaa gac gca ggc att gag gat ctg gca acc ggt gag atc Trp Val lie Lys Asp Ala Gly lie Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu lie 225 230 235 240 acc gtg ttg atc aac cct tea ggt tec ttc att ctg ggt ggc ecc atg Thr Val Leu lie Asn Pro Ser Gly Ser Phe lie Leu Gly Gly Pro Met 245 250 255 ggt gat gcg ggt ctg acc ggc cgc aag atc atc gtg gat acc tac ggt Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys lie lie Val Asp Thr Tyr Gly 260 265 270 ggc atg gct cgc cat ggt ggt gga gca ttc tec ggt aag gat cca age Gly et Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser 275 280 285 aag gtg gac cgc tet gct gca tac gee atg cgt tgg gta gca aag aac Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn 290 295 300 atc gtg gca gca ggc ctt gct gat cgc gct gaa gtt cag gtt gca tac lie Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr 305 310 315 320 gee att gga cgc gca aag cca gtc gga ctt tac gtt gaa acc ttt gac Ala lie Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp 325 330 335 acc aac aag gaa ggc ctg age gac gag cag att cag gct gee gtg ttg Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln lie Gln Ala Ala Val Leu 340 345 350 gag gtc ttt gac ctg cgt cca gca gca att atc cgt gag ctt gat ctg Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala lie lie Arg Glu Leu Asp Leu 355 360 365 ctt cgt ceg atc tac gct gac act gct gee tac ggc cae ttt ggt cgc Leu Arg Pro lie Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg 370 375 380 act gat ttg gac ctt cct tgg gag gct atc gac cgc gtt gat gaa ctt Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala lie Asp Arg Val Asp' Glu Leu 385 390 395 400 cgc gca gee etc aag ttg gee taa Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala 405 <210> 22 <211> 407 <212> PRT <213> Secuencia arti ficial <220> <223> plásmido <400> 22 Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr 1 5 10 15 Glu Gly His Pro Asp Lys lie Cys Asp Ala lie Ser Asp Thr lie Leu 20 .25 30 Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr 35 40 45 Val Val Thr Thr Gly lie Val His Val Val Gly Glu Val' Arg Thr Ser ¦50 55 60 Ala Tyr Val Glu lie Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu lie Glu lie 65 70 75 80 Gly Phe Asn Ser Ser Glu' Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr* Ala " Gly Val 85 90 95 Ser Val Ser lie Gly Glu Gln Ser Gln Glu lie Ala Asp Gly Val Asp 100 105 110 Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg 115 120 125 Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu 130 135 140 Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro lie Ala Leu Ala His Arg Leu Ser 145 150 155 160 Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly lie Val Pro His Leu Arg 165 170 175 Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Ásp Ala Gln Asp Arg 180 185 190 Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val lie Ser Thr Gln His Asp Pro Glu 195 200 205 Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val lie Asp 210 215 220 Trp Val lie Lys Asp Ala Gly lie Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu lie 225 230 235 240 Thr Val Leu lie Asn Pro Ser Gly Ser Phe lie Leu Gly Gly Pro Met 245 250 255 Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys lie lie Val Asp Thr Tyr Gly 260 265 270 Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser 275 280 285 Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn 290 295 300 lie Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr 305 310 315 320 Ala lie Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp 325 330 335 Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln lie Gln Ala Ala Val Leu 340 345 350 Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala lie lie Arg Glu Leu Asp Leu 355 360 365 Leu Arg Pro lie Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg 370 375 380 Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala lie Asp Arg Val Asp Glu Leu 385 390 395 400 Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala 405 <210> <211> <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia parcial variable <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) .. (2) <223> Xaa=Phe o Tyr <220> <221> ISC_FEATURE <222> (3) .. (3) <223> Xaa=Asp o Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) .. (4) <223> Xaa= cualquier aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <22?> (5) .. (5) <223> Xaa= cualquier aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7).. !7) <223> Xaa= aminoácido diferente de Cys <220> <221> MI SC_FEATURE <222> (6) .. (6) <223> Xaa= Ser o Thr <220> <221> ?I SC_FEATURE <222> (8) .. (8) <223> Xaa= Gly o Ala <400> 23 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val 1 5

Claims (21)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. - Un método para la producción por fermentación de cuando menos un químico fino que contiene azufre, que comprende los siguientes pasos: (a) fermentación de un cultivo bacterial corineforme que produce el químico fino que contiene azufre deseado, la bacteria corineforme expresando cuando menos una secuencia de nucieótido que codifica una proteína con actividad de sintasa de S-adenosilmetionina (metK) modificada; (b) enriquecimiento del químico fino que contiene azufre en el medio y) en las células bacterianas y (c) aislamiento del químico fino que contiene azufre .
2. 2. - Un método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el químico fino que contiene azufre comprende L-metionina .
3. 3. - Un método de conformidad con una de las reivindicaciones anteriores, en donde las bacterias corineformes mutadas se utilizan cuya actividad metK se reduce en comparación con el tipo silvestre no mutado.
4. 4. - Un método de conformidad» con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la bacteria corineforme mutada tiene adicionalmente una actividad metY mejorada y/o una cantidad de L-metionina aumentada en comparación con el tipo silvestre no mutado.
5. 5. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia que codifica metK es una secuencia de nucleótido de codificación que - codifica una . proteina con actividad metK reducida en la que cuando menos un residuo de cisteina de la proteina de tipo silvestre se substituye.
6. 6. - Un método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la secuencia de codificación de metK es una secuencia de nucleótido de codificación que codifica una proteina con actividad metK que tiene la siguiente secuencia parcial de aminoácido: G(F/H) (D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V en la que X1 y X2 independientemente uno del otro representan cualquier aminoácido; y X3 representa un aminoácido distinto a Cys.
7. 7. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia que codifica metK codifica una proteina con actividad metK, la proteina abarcando una secuencia de aminoácido de Valí a Ala407 como se muestra en SEQ ID NO: 22 o una secuencia de aminoácido que es homologa a la misma y que representa una proteina con equivalencia funcional.
8. 8.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia metK de codificación es un DNA que es capaz de réplica en bacterias corineformes o integrado establemente hacia el cromosoma, o un RNA. •
9. 9.- -Un. método de- conformidad,. con. cualquiera._de las reivindicaciones anteriores, en donde (a) una cepa bacteriana que se ha transformado con un vector de plásmido y que lleva cuando menos una copia de la secuencia de metK mutada bajo el control de secuencias reguladoras se utiliza, o (b) una cepa en la que la secuencia metK mutada se ha integrado en el cromosoma bacteriano se usa.
10. 10. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las bacterias se fermentan y que adicionalmente cuando menos un gene adicional de la trayectoria biosintética del químico fino que contiene azufre deseado se mejora.
11. 11. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las bacterias se fermentan en donde cuando menos una trayectoria metabólica que reduce la formación del químico fino que contiene azufre deseado se cambia cuando menos parcialmente.
12. 12. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las bacterias corineformes en las que cuando menos uno de los genes seleccionados de entre (a) el gene lisC, que codifica una quinasa de aspartato, (b) un gene ask, que codifica una dehidrogenasa de :" ' " ' ' 'aspartato-semialdehído, — (c) el gene gap, que codifica dehidrogenasa de glicerinaldehido-3-fosfato, (d) el gene pgk, que codifica quinasa de 3- fosfoglicerato, (e) el gene pyc, que codifica carboxilasa de piruvato, (f) el gene tpi, que codifica isomerasa de triosa- fosfato, (g) el gene metA, que codifica O-acetiltransferasa de homoserina, (h) el gene metB, que codifica sintasa de cistationina-gamma, (i) el gene metC, que codifica liasa de cistationina-gamma, (j) el gene metH, que codifica sintasa de metionina, (k) el gene glyA, que codifica hidroximetiltransferasa de serina, (1) el gene metY, que codifica sulfhidrilasa de O- acetilhomoserina , (m) el gene metF, que codifica reductasa de metilentetrahidrofolato, (n) el gene serC, que codifica aminotransferasa de fosfoserina, -¦(o) · el gene ¦ serB,' - que - codifica fosfatasa · de- fosfoserina , (p) el gene cysE, que codifica acetiltransferasa.de serina, (q) el gene cysK, que codifica sintasa de cisteina, (r) el gene hom, que codifica dehidrogenasa de homoserina, se sobreexpresa simultáneamente se fermentan y/o en donde cuando menos uno de estos genes se muta simultáneamente de tal manera que la activad de la proteina correspondiente, en comparación con la proteina no mutada, se influencia hasta un grado menor o ya no por un metabolito, o de tal manera que su actividad especifica se aumenta.
13. 13.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las bacterias corineformes se fermentan en las que simultáneamente cuando menos uno de los genes seleccionados entre (a) el gene thrB, que codifica quinasa de homoserina , (b) el gene ilvA, que codifica dehidratasa de treonina, (c) el gene thrC, que codifica sintasa de treonina, (d) el gene ddh, que codifica D dehidrogenasa de i meso-diaminopimelato, (e) el gene pck, que co-difica carboxiquinasa de fosfoenol-piruvato, " * * ' '' (f) el gene pgi, que codifica isomerasa de glucosa- 6-fosfato-6, (g) el gene poxB, que codifica oxidasa de piruvato, (h) el gene dapA, que codifica sintasa de dihidrodipicolinato, (i) el gene dapB, que codifica reductasa de dihidrodipicolinato, o (j) el gene lysA, que codifica decarboxilasa de diaminopicolinato, se atenúa; y/o en donde las bacterias corineformes se fermentan en las que cuando menos uno de estos genes se muta simultáneamente de tal manera que la actividad de enzima de la proteina correspondiente se reduce en parte o completamente .
14. 14. - Un método de conformidad con una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde se utilizan microorganismos de la especia Corynebacterium glutamicum.
15. 15. - Un método para producir un aditivo de alimento animal que contiene L-metionina de caldos de fermentación, que comprende los siguientes pasos: (a) cultivo y fermentación de un microorganismo que produce L-metionina como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un medio de -fermentación; - * (b) remoción de agua del caldo de fermentación que contiene L-metionina; (c) remoción de 0 a 100% en peso de la biomasa formada durante la fermentación; y (d) secado del caldo de fermentación obtenido de conformidad con (b) y/o (c) , a fin de obtener el aditivo de alimentación animal en la forma deseada de polvo o gránulo.
16. 16. - Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 de una bacteria corincforme que codifica un polipéptido con actividad metK reducida.
17. 17. - Un mutante de metK con actividad reducida que se codifica mediante un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 16.
18. 18. - Una bacteria corineforme recombinante que expresa un gene metK mutado que abarca una secuencia de polinucleótido como define en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
19. 19. - Una bacteria corineforme recombinante de conformidad con la reivindicación 18 que ya no expresa la enzima tipo silvestre metK.
20. 20. - Una bacteria corineforme recombinante de conformidad con la reivindicación 19 que, en comparación con la cepa de tipo silvestre- correspondiente, -tiene, cuando .menos uno de los siguientes trazos: (a) titulo ' de S-adenosilmetionina intracelular inferior; (b) concentración de sintasa de S-adenosilmetionina intracelular inferior, o . (c) actividad de sintasa de S-adenosilmetionina inferior, determinada con referencia al régimen de formación de S-adenosilmetionina; y adicionalmente, si es apropiado, cuando menos uno de los siguientes trazos: (d) actividad metY mejorada o (e) cantidad aumentada de L-metionina.
21. 21. - Una construcción de expresión que contiene la secuencia de codificación de un mutante de metK de una bacteria corineforme de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 bajo el- control de una secuencia de nucleótido reguladora.