MXPA00004870A - Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos utilizando bacterias corineformes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos utilizando bacterias corineformes, en los cuales se refuerza, en especial se sobre-expresa, la secuencia nucleótida que codifica a la subunidad de los dominios de biotina-carboxilo-proteína portadora y el dominio biotina-carboxilasa de la enzima aceril-CoA carboxilasa (gen accBC).

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN POR FERMENTACIÓN DE L-AMINOACIDOS UTILIZANDO BACTERIAS CORINEFORMES Campo de la Invención El objeto de la invención es un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina utilizando bacterias corineformes, en las cuales se refuerza el gen accBC. Antecedentes de la Invención Los L-aminoácidos, en especial L-lisina se utilizan en la alimentación animal en la medicina humana y en la industria farmacéutica. Se conoce que esos aminoácidos se producen por fermentación de cepas de bacterias corineformes en especial con Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia de ese grupo de productos se trabaja continuamente a la mejora de esos procedimientos de preparación. Las mejoras del procedimiento pueden consistir en medidas técnicas de fermentación como por ejemplo agitación y alimentación de oxígeno, o la composición de los medios nutritivos como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o la post-elaboración a la forma de un producto, por medio de cromatografía de intercambio de iones o por medio de propiedades intrínsecas propias de los microorganismos. Para mejorar las propiedades de rendimiento de esos microorganismos se utilizan métodos como mutagenesis, REF.: 119757 selección y selección de mutantes . De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra los antimetabolitos como por ejemplo el análogo de lisina S- (2-aminoetil) -cistenina o auxótropas para los aminoácidos regulatoriamente importantes y que producen L-aminoác¿dos . Desde hace algunos años se han utilizado métodos de técnica de recombinación de ADN para el mejoramiento de cepas, de cepas que producen L-aminoácidos de Corynebacterium glutamicum, en la cual genes de biosintesis individuales -se amplifican y se estudia su efecto sobre la producción de los L-aminoácidos. Un articulo sobre esto se encuentra entre otros el de Kinoshita ("Glutamicum Acid Bacteria" en Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, Londres, UK, 1985, 115-142) , Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Jetten y Sins ey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sahm et al., (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)). Tarea de la Invención Los inventores se propusieron la tarea de obtener nuevas medidas para mejorar la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina. Descripción Detallada de la Invención Los L-aminoácidos tienen aplicación en la alimentación animal, la medicina humana y la industria farmacéutica. Por lo tanto existe un interés general en un procedimiento nuevo y mejorado para la producción de esos compuestos . Cuando a continuación se mencionen L-lisina o lisina, se implican no solo las bases sino también las sales como por ejemplo monoclorhidrato de lisina o sulfato de lisina. El objeto de la invención es por lo tanto un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina utilizando bacterias corineformes que en especial ya produzcan los aminoácidos deseados y en los cuales se refuerza, en especial se sobre-expresa, la secuencia nucleótida que codifica a la subunidad de los dominios de biotina-carboxilo- proteína portadora y el dominio biotina-carboxilasa de la enzima acetil-CoA carboxilasa (gen accBC) . Formas de realización preferidas se encuentran en las reivindicaciones. El concepto "refuerzo" describe a este respecto el aumento de la accividad intraceluar de una o varias enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el ADN correspondiente, para lo cual por ejemplo se aumenta el número de copias del gen o de los genes, se utiliza un fuerte promotor o un gen que codifica a la enzima correspondiente con alta actividad, y eventualmente se combinan esas medidas. Los microorganismos que son objeto de la presente "" >««».--> ••»-' MM*^-« «asas invención pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones, celulosa o de glicerina y etanol. Puede tratarse de un representante de las bacterias corineformes en especial del genero Corynebacterium. En el genero Corynebacterium debe mencionarse en especial el tipo Corynebacterium glutamicum, que se conoce en la técnica por su capacidad de producir L-aminoácidos . Cepas adecuadas del genero Corynebacterium en especial del tipo Corynebacterium glutamicum, son las cepas tipo nativo conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020 y los mutantes o cepas preparados de ellas que produzcan L-aminoácidos en especial L-lisina, como por ejemplo Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, Brevibacterium flavum FERM-P 6463 y Brevibacterium flavum FERM-P 6464. ??m??i ¡ El gen accBC codifica a una subunidad de la acetil-CoA carboxilasa, que porta un dominio biotina-carboxilo-proteína portadora y un dominio de biotina-carboxilasa. La secuencia nucleótida del gen accBC de Corynebacterium glutamicum se determino por Jáger et al . (Archives of Microbiology 166, 76-82 (1996)) y esta disponible en el banco de datos de European Molecular Biology Laboratories (EMBK, Heidelberg, Alemania) bajo el número de acceso U35023. El gen accBC de C. glutamicum descrito por Jáger et al. (Archives of Microbiology 166, 76-82 (1996)) puede utilizarse de acuerdo con la invención. Además pueden usarse alelos del gen accBC, que se forman en la unidad degenerada del código genético o por medio de mutaciones de sentido (sense mutations) de función neutra. Para obtener la sobre-expresión puede aumentarse el número de copias del gen correspondientes o puede mutarse la región promotora y reguladora, que se encuentra corriente arriba del gen estructural . De igual manera sirven los cartuchos de expresión que se construyen corriente arriba del gen estructural. Por medio de promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción pro fermentación de L-lisina. Por medio de medidas para alargar la vida del m-RNA se mejora igualmente la expresión. Además evitando la reducción de la proteína enzimática se refuerza la actividad enzimática. Los genes o las construcciones genéticas pueden encontrarse en los plasmidos con diferentes números de copias o estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente puede obtenerse una sobre-expresión de los genes en cuestión por 5 medio de la modificación de la composición del medio y la realización del cultivo. Datos sobre esto los encuentra el técnico entre otros en los escritos de Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/technology 6, 428-430 (1988)) de Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el escrito de patente europeo EP-B 0 472 869, en la patente de US 4,601,893, de Schwarzer y Pühler (Bio/technology 9, 84-87 (1991), de Reinscheid et al. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud 'de patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134,15-24 (1993)), el la publicación japonesa JP-A-10-229891 DE Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), de Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996) ) y en los textos conocidos de Genética y Biología Molecular. Ejemplo del plasmido con cuya ayuda puede sobre- expresarse el gen accBC, es pZlaccBC (figura 1) , que esta contenido en la cepa MH20-22B/pZlaccBC. El plasmido ZlacBC es un vector péndulo de E.coli-C. glutamicum que se basa en el plasmido pZl (Menkel et al., Applied and Enviromental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)), que porta el gen accBC. Adicionalmente puede ser ventajoso para la 5 producción de los L-aminoácidos además de sobre-expresar el gen accBC también una o mas enzimas de la vía de biosintesis de aminoácido en cuestión. Así, en la preparación de L-lisina por ejemplo se puede • simultáneamente sobre-expresar el gen dapA codificante 10 a sintasa de dihidrodipicolinato (EP-B 0197335) , o • simultáneamente amplificar un fragmento de ADN que promueve la resistencia a S- (2-aminoetil) -cieteina (EP-A 0 088 166) . Además puede ser ventajoso para la producción de 15 los L-aminoácidos correspondientes además de la sobre- expresión del gen accBC, evitar reacciones secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms" , en: Overpoduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.); Academic Press, Londres, 20 UK, 1982), Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse continua o discontinuamente en procedimientos por lotes o en procedimiento de alimentación (fed batch) o procedimiento de alimentación repetitivo 25 (repeated fed batch) con el fin de producir L-aminoácidos. Un kudbaiiHi?iUililik-. ^^^ uá¿«M«Ad¡iMbJ^¡. MÍÉriÍH¡d¡É resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el texto de Chmiel (Bioprozestechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). El medio de cultivo utilizado debe de una forma adecuada ser suficiente para los requisitos de los microorganismos en cuestión. La descripción de medios de cultivo de diferentes microorganismos se encuentra en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., US, 1981) . Como fuente de carbono pueden utilizarse azucares y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, latosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones y celulosa, aceites y grasas como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como por ejemplo ácido palmitíco, ácido estearínico y ácido linoléico, alcoholes como por ejemplo glicerina y etanol y ácidos orgánicos como por ejemplo ácido acético. Esas substancias pueden utilizarse individualmente o en mezclas. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de soya y urea o compuesto inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de ^ÉUlilbiÉlilta^iMI- amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o como mezclas. Como fuentes de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe además contener sales de metales como por ejemplo sulfato de magnesio o de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente pueden utilizarse promotores del crecimiento como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las substancias mencionadas. Al medio de cultivo pueden agregarse precursores adecuados. Los aditivos mencionados pueden agregarse al cultivo en forma de una carga única o en un a forma adecuada agregarse durante el cultivo. Para controlar el pH del cultivo se utilizan compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico en forma adecuada. Para controlar Aa formación de espuma pueden utilizarse agentes anti-espumantes como por ejemplo poliglicoléster de ácido graso o aceites de silicona. Para mantener la estabilidad de los plasmidos pueden agregarse al medio substancias de efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas se introducen al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contengan oxígeno como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente a 20°C a 45°C y preferentemente a 25°C a 40°C. El cultivo se continua hasta que se ha formado una cantidad máxima de L-aminoácido. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 a 160 horas . El análisis de L-aminoácidos puede realizarse automáticamente en base a una cromatografía de intercambio de aniones con la subsecuente derivación de ninhidrina tal como lo describe Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190) . La cepa de Coryneacterium glutamicum DSM57l5/pZlaccBB se depositó bajo el número DSM12786 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado ' de Budapest . El procedimiento de acuerdo con la invención sirve para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en especial ácido L-asparagínico, L-asparagina, L-homoserina, L-treonina, L-isoleucina y L-metionina con bacterias corineformes, en espeical para la producción de L-lisina. Ejemplos La presente invención se explicara mas detalladamente con la ayuda de los ejemplos de realización. Para este fin se realizaron pruebas con la cepa de Corynebacterium glutamicum DSM5715 (EP-B-0 435 132) productora de L-lisina, en la cuales se demuestra la superioridad del procedimiento presentado: Ejemplo 1 Preparación del plasmido de expresión pZlaccBC y la cepa DSM57l5/pZlaccBC La construcción del plasmido de expresión pXlaccBC, el plasmido pWJ7i contenido en el gen accBC (Jáger et al., Archives of Microbiology (1996) 166:76-82) se digiere con las enzimas de restricción Pvul y Nael y a continuación se trata con polimerasa de Klenow y fosfatasa alcalina. Por medio del aislado preparativo de gel de agarosa, que se realizo de la forma que lo describe Sambrook et al . (Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories) , se aisló el fragmento de ADN que porta le gen accBc de 2.1 kpb de longitud, paralelamente a la preparación del gen accBC, se digirió el plasmido pZl (Menkel et al., Applied and Enviromental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)) con la enzima de restricción Scal, y subsecuentemente se realiza igualmente un tratamiento con polimerasa Klenow y fosfatasa alcalina. El gen accBC preparado y el vector pZl tratado como se describe antes se ligaron, la cepa DSM5715 se transforma con la mezcla de ligado como lo describe Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)) . La selección de los transformantes se realizo sobre agar de cerebro-corazón de la firma Merck (Darmstadt, Alemania), que se había suplementado con 50 mg/l de canamicina. Un transformante seleccionado fue denominado cepa DSM5715/pZlaccBC. El mapa de restricción del plasmido de expresión pXlaccBC, en la figura 1. Ejemplo 2 Preparación de L-lisina La cepa DSM57l5/pZlaccBC se precultivó en medio completo CglII (Kase y Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972)), que fue suplementado con 50µg/ml canamicina. Para esto se inocularon 10 ml del medio CglII, que se habían obtenido en un matraz Erlenmeyer con 4 bocas, con una unidad de inoculación de la cepa y el cultivo se fermento durante 16 horas a 240 rpm y 30°C. Para la inoculación de 20 ml de medio de producción, que se había obtenido en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con 4 bocas, se determinó la OD (660 NM) de precultivo. El cultivo principal contenido en el medio de producción se inoculó a una OD de 0.1. Como medio de producción se utilizo el medio CgXII descrito por Keilhauer et al., (Journal of Bacteriology 175:5595-5603 (1993)). Se agregaron 4% de glucosa y 50 mg/l de sulfato de canamicina. Se incubaron las células a 33°C, 250 rpm y una humedad del aire de 80% durante 48 horas. En el procedimiento con la cepa DSM5715 los medios correspondientes no contenían canamicina. A continuación la densidad óptica se determinó con a 660 nm y la concentración de L-lisina con un analizador de aminoácidos de la Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografía de intercambio de iones y reacción posterior a la columna con detección de ninhidrina. En la tabla 1 se dan los resultados de esta prueba . Tabla 1 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

1.- Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos por medio de la fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales la secuencia nucleótida que codifica al gen accBC o la secuencia nucleótida que lo porta, se refuerza, en especial se sobre-expresa .

2.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales adicionalmente se refuerzan los otros genes de la vía metabólica de la formación de los L-aminoácidos deseados.

3.- Procedimiento de acuerdo con a reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales las vías metabólicas que reducen la formación de los L-aminoácidos deseados, están por lo menos parcialmente desactivadas.

4. - Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utiliza una cepa transformada con un vector de plasmido y el vector de plasmido porta la secuencia nucleótida codificante al gen accBC .

5.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con el vector de plasmido pZiaccBC depositado en Corynebacterium glutamicum bajo el número DSM 12786 y representado en la figura 1.

6. - Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones, caracterizado porque a partir de bacterias corineformes se preparan ácido L-asparagínico, L-asparagina, L-homoserina, L-treonina, L-isoleucina y L-metionina.

7. - Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se utilizan bacterias corineformes que producen L-lisina.

8.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque simultáneamente se sobre-expresa el gen dapA codificante para la sintasa de dihidropicolinato.

9.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque simultáneamente se amplifica el fragmento de ADN que proporciona resistencia a S-(2-aminoetil) -cisteina.

10.- Procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se realizan los siguientes pasos: a) fermentación de las bacterias productoras de L- aminoácidos en las cuales cuando menos se refuerza el gen accBC; b) aumento de los L-aminoácidos deseados en el medio o en las células de las bacterias y c) aislado de los L-aminoácidos producidos. ?|¿ji¿...«a£fe. i.,.. ..i., .. . . y.:<» PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN POR FERMENTACIÓN DE L-AMINOACIDOS UTILIZANDO BACTERIAS CORINEFORMES RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos utilizando bacterias corineformes, en los cuales se refuerza, en especial se sobre-expresa, la secuencia nucleótida que codifica a la subunidad de los dominios de biotina-carboxilo-proteína portadora y el dominio biotma-carboxilasa de la enzima acetil-CoA carboxilasa (gen accBC) .