MXPA00002332A - Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos utilizando bacterias coreniformes - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación por fermentación de L- aminoácidos utilizando bacterias corineformes, en las cuales se refuerza el gen de mgo.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN POR FERMENTACIÓN DE L-AMINOACIDOS UTILIZANDO BACTERIAS CORINEFORMES Campo de la Invención El objeto de la invención es un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial Lrlisina utilizando bacterias corineformes , en las cuales se refuerza el gen mqo. Antecedentes de la Invención Los L-aminoácidos, en especial L-lisina se utilizan en la alimentación animal en la medicina humana y en la industria farmacéutica. Se conoce que esos aminoácidos se producen por fermentación de cepas de bacterias corineformes en especial con Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia de ese grupo de productos se trabaja continuamente a la mejora de esos procedimientos de preparación. Las mejoras del procedimiento pueden consistir en medidas técnicas de fermentación como por ejemplo agitación y alimentación de oxigeno, o la composición de los medios nutritivos como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o la post-elaboración a la forma de un producto, por medio de cromatografía de intercambio de iones o por medio de propiedades intrínsecas propias de los microorganismos . Para mejorar las propiedades de rendimiento de esos microorganismos se utilizan métodos como mutagenesis, REF. 32804 selección y selección de mutantes . De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra los antimetabolitos como por ejemplo el análogo de lisina S- (2-aminoetil) -cistenina) o auxótropas para los aminoácidos regulatoriamente importantes y que producen L-aminoácidos . Desde hace algunos años se han utilizado métodos de técnica de recombinación de ADN para el mejoramiento de cepas, de cepas que producen L-aminoácidos de Corynebacterium glutamicun, en la cual genes de biosintesis individuales se amplifican y se estudia su efecto sobre la producción de los L-aminoácidos . Un articulo sobre esto se encuentra entre otros el de Kinoshita ("Glutamicum Acid Bacteria" en Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, Londres, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Jetten y Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sahm et al., (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)) . Tarea de la Invención Los inventores se propusieron la tarea de obtener nuevas medidas para mejorar la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina. Descripción Detallada de la Invención Los L-aminoácidos tienen aplicación en la alimentación animal, la medicina humana y la industria farmacéutica. Por lo tanto existe un interés general en un procedimiento nuevo y mejorado para la producción de esos compuestos . Cuando a continuación se mencionen L-lisina o lisina, se implican no solo las bases sino también las sales como por ejemplo monoclorhidrato de lisina o sulfato de lisina. El objeto de la invención es por lo tanto un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina utilizando bacterias corineformes que en especial ya produzcan los aminoácidos deseados y en los cuales se refuerza la secuencia nuclestida que codifica a la enzima oxidoreductsa de malatoiquinona (gen qo) en especial se sobre-expresa. Formas de realización preferidas se encuentran en las reivindicaciones . El concepto "refuerzo" describe a este respecto el aumento de la actividad intraceluar de una o varias enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el ADN correspondiente, para lo cual por ejemplo se aumenta el numero de copias del gen o de los genes, se utiliza un fuerte promotor o un gen que codifica a la enzima correspondiente con alta actividad, y eventualmente se combinan esas medidas. Los microorganismos que son objeto de la presente invención pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones, celulosa o de glicerina y etanol. Puede tratarse de un representante de las bacterias corineformes en especial del genero Corynebacterium. En el genero Corynebacterium debe mencionarse en especial el tipo Corynebacterium glutamicum, que se conoce en la técnica por su capacidad de producir L-aminoácidos . Cepas adecuadas del genero Corynebacterium en especial del tipo Corynebacterium glutamicum, son las cepas tipo nativo conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavu ATCCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium di aricatum ATCC14020 y los mutantes o cepas preparados de ellas que produzcan L-aminoácidos en especial L-lisina, como por ejemplo Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, Brevibacterium flavum FERM-P 6463 y Brevibacterium flavum FERM-P 6464. De esto los inventores encontraron como las bacterias corineformes después de la sobre-expresión de la oxidoreductasa de malato:quinona producen L-aminoácidos de forma mejorada, en especial L-lisina. El gen mqo codifica a la oxidoreductasa de malato:quinona (EC 1.1.99.16) el cual cataliza la oxidación de malato a acetato de oxalo bajo la transmisión de electrones de la ubiquinona 1 (Molenaar et al . European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)). La secuencia nucleótida del gen mqo de Corynebacterium glutmicum fue determinada igualmente por Molenaar et al . (European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)) y esta disponible en el banco de datos de secuencias nucleótidas del National center for Biotechnology Information (NCBI, Behesda, MD, US) bajo el numero de acceso AJ 22 4946. El gen mqo de C-glutamicum descrito por Molenaar et al. (European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), puede utilizarse de acuerdo con la invención. Además pueden utilizarse los alelos del gen mqo, que se forman por medio de la degeneración del código genético o también por mutaciones de sentido (Sense mutation) de función neutra. Para obtener la sobre-expresión puede aumentarse el numero de copias del gen correspondientes o puede mutarse la región promotora y reguladora, que se encuentra corriente arriba del gen estructural . De igual manera sirven los cartuchos de expresión que se construyen corriente arriba del gen estructural . Por medio de promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción pro fermentación de L-lisina. Por medio de medidas para alargar la vida del m-RNA se mejora igualmente la expresión. Además evitando la reducción de la proteína enzimática se refuerza la actividad enzimática. Los genes o las construcciones genéticas pueden encontrarse en los plasmidos con diferentes números de copias o estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente puede obtenerse una sobre-exprésion de los genes en cuestión por medio de la modificación de la composición del medio y la realización del cultivo. Datos sobre esto los encuentra el técnico entre otros en los escritos de Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/technology 6, 428-430 (1988)) de Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el escrito de patente europeo EP 0 472 869, en la patente de US 4,601,893, de Schwarzer y Pühler (Bio/technology 9, 84-87 (1991) , de Reinscheid et al. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud de patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134,15-24 (1993)), Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), de Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) y en los textos conocidos de Genética y Biología Molecular. Ejemplo del plasmido con cuya ayuda puede sobre-expresarse la oxidoreductasa de malatorquinona es pRM17 (Molenaar et al., 1998, European Journal of Biochemistry 245, 395-403) . El plasmido pRMlV, se basa en el vector péndulo, como el descrito por Cremer et al . (Molecular and General Genetics 220, 478-480) . Adicionalmente puede ser ventajoso para la producción de los L-aminoácidos además de sobre-expresar la dioxidoreductasa de malatorquinona también una o mas enzimas de la vía de biosintesis de aminoácido en cuestión. Así, en la preparación de L-lisina por ejemplo se puede • simultáneamente sobre-expr sar el gen dapA codificante a sintasa de dihidrodipicolinato (EP-B 0197335) , o • simultáneamente amplificar un fragmento de ADN que promueve la resistencia a S- (2-aminoetil) -cisteina (EP-A 0 088 166) . Además puede ser ventajoso para la producción de los L-aminoácidos correspondientes además de la sobre-expresión de dioxidoreductasa de malato :quinona evitar reacciones secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms" , en: Overpoduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.); Academic Press, Londres, UK, 1982), Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse continua o discontinuamente en procedimientos por lotes o en procedimiento de alimentación (fed batch) o procedimiento de alimentación repetitivo (repeated fed batch) con el fin de producir L-aminoácidos. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el texto de Chmiel (Bioprozestechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) . El medio de cultivo utilizado debe de una forma adecuada ser suficiente para los requisitos de los microorganismos en cuestión. La descripción de medios de cultivo de diferentes microorganismos se encuentra en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., US, 1981) . Como fuente de carbono pueden utilizarse azucares y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, latosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones y celulosa, aceites y grasas como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como por ejemplo ácido palmitíco, ácido estearínico y ácido linoléico, alcoholes como por ejemplo glicerina y etanol y ácidos orgánicos como por ejemplo ácido acético. Esas substancias pueden utilizarse individualmente o en mezclas. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como pep ona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de soya y urea o compuesto inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o como mezclas . Como fuentes de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe además contener sales de metales como por ejemplo sulfato de magnesio o de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente pueden utilizarse promotores del crecimiento como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las substancias mencionadas . Al medio de cultivo pueden agregarse etapas previas adecuadas . Los aditivos mencionados pueden agregarse al cultivo en forma de una carga única o en un a forma adecuada agregarse durante el cultivo. Para controlar el pH del cultivo se utilizan compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico en forma adecuada. Para controlar la formación de espuma pueden utilizarse agentes anti-espumantes como por ejemplo poliglicsléster de ácido graso o aceites de silicona. Para mantener la estabilidad de los plasmidos pueden agregarse al medio substancias de efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas se introducen al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contengan- oxígeno como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente a 20°C a 45°C y preferentemente a 25°C a 40°C. El cultivo se continua hasta que se ha formado una cantidad máxima de L-aminoácido. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 a 160 horas . El análisis de L-aminoácidos puede realizarse automáticamente en base a una cromatografía de intercambio de aniones con la subsecuente derivación de ninhidrina tal como lo describe Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190) . La cepa de Coryneacterium glutamicum DM22/pRM17 se deposito bajo el numero DSM12711 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest . El procedimiento de acuerdo con la invención sirve para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en especial ácido L-asparagínico, L-asparagina, L-homoserina, L-treonina, L-isoleucina y L-metionina con bacterias corineformes, en espeical para la producción de L-lisina. Ejemplos La presente invención se explicara mas detalladamente con la ayuda de los ejemplos de realización.

Para este fin se realizaron pruebas con la cepa de Corynebacterium glutamicum DSM5715 (EP-B-0 435 132) productora de L-lisina, en la cuales se demuestra la superioridad del procedimiento presentado: Ejemplo 1 Preparación de productores de L-lisina con dioxidoreductasa de malato :quinona reforzada La cepa DSM5715, se transformo como lo describe Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)) con el plasmido pRM17 (Molenaar et al., 1998, European Journal of Biochemistry 254 (395-403)) . La selección de los transformantes se realizó sobre agar LBHIS, el cual fue suplementado con 25- mg/1 kanamicina. El agar LBHIS consiste de un medio LB (Sambrook et al. (Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories)), que fue suplementado con 37 g/1 de caldo de corazón cerebro de la firma Merck /Darmstadt, Alemania), 0.5 M sorbitol y 15 g/1 agar-agar. De esta manera se formo la cepa DSM5715/pRM17. La cepa DSM5715/pJCVl se preparo de la firma forma. Ejemplo 2 Preparación de L-lisina Las cepas DSM5715/pRM17 y DSM5715/pJCl se incubó primero sobre agar de cerebro corazón el cual había sido suplementado con kanamicina (25 mg/1) , se incubó durante 24 horas a 33°C. Para el cultivo en medio líquido se utilizó medio CglII (Kase y Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972)), que adicionalmente fue suplementada con kanamicina (25 mg/1) . Para esto se inocularon 10 ml del medio que se habían obtenido en un matraz Erlenmeyer de lOOml con 4 bocas, ocn tra uririaflde inoculación de la cepa y el cultivo se fermento durante 16 horas a 240 rp_m y 30°C. Ese cultivo se utilizó a continuación como precultivo. Como medio de producción o prueba se utilizó el medio MM, que adicionalmente se había suplementado con kanamicina (25 mg/1) . En el procedimiento con la cepa DSM5715 los medios correspondientes no contenían kanamicina . La composición y preparación del medio MM fueron los siguientes: Licor de remojo de maíz (Corn Steep Liquor CSL) 5 g/1 Acido 3-morfolino-propansulfónico (MOPS) 20 g/1 Glucosa 50 g/1 (sometida a autoclave por separado) Sales : (NH 2S04 25 g/1 KH2P04 0 . 1 g/1 Mg20,*7H20 1 . 0 g/1 CaCl2*2H20 10 mg/1 FeS04*7H20 10 mg/1 MnS04* H20 5. Omg./l biotina (filtrada estéril) 0.3mg/l Tiamina*HCl (filtrada estéril) 0.2mg/l CaC03 25 g/1 Leucina O.ig/1 CSL, MOPS y la solución de sal se ajusto a un pH con amoníaco acuoso y se sometió a autoclave . A continuación se agregaron el substrato estéril y la soluciones de vitaminas asi como el CaC03 sometido a autoclave seco. El cultivo se realizó en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con bocas, que fueron recubiertas con 10 ml del medio de producción antes descrito. Los cultivos se inocularon con el precultivo de tal forma que la densidad óptica inicial fue de 0.1. El cultivo se realizó a 35°C y 80% de humedad del aire. Después de 72 horas de incubación se determinó la densidad óptica de la suspensión de cultivo y la concentración de L-lisina. La densidad óptica se determinó con un fotómetro LP2W de la firma Dr. Lange (Berlín, Alemania) a una longitud de onda medida de 660 nm, la L-lisina se determinó con un analizador de aminoácidos de la Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografía de intercambio de iones y reacción posterior a la columna con detección de ninhidrina. En la tabla 1 se dan los resultados de esta prueba.

Tabla 1 E emplo 3 Preparación de productores de treonina con oxidoreductasa de malato :quinona reforzada El plasmido pRMl7 (Molenaar et al. 1998, European Journal of Biochemistry 254 (395-403)) de acuerdo con el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) se electroporificó en Corynebacterium glutamicum DSM 5399. La cepa DSM 5399 es una productora de treonina que se describe en EP-B-0358949. La selección de los transformante se realizó por trasplantado del producto de electroporación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N:Y:, 1989), que fue suplementado con 25 mg/1 de kanamicina. De esa forma se obtuvo la cepa DSM5399/pRMl7.

Ejemplo 4 Preparación de treonina La cepa de C.glutamicum obtenida en el ejemplo 3 DSM5399/pRM17 se cultivó en un medio nutritivo adecuado para la producción de treonina y se determinó el contenido de treonina en el residuo del cultivo. Para estro primero se incubó la cepa sobre la placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/1) durante 24 horas a 33°C. A partir de ese cultivo de placas de agar se inoculó un precultivo (10 ml de medio en un matraz Erlenmeyer de 100 ml) . Como medio del precultivo se utilizó el medio completo CglII (Kase & Nakayama, Agricultural and biological Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972)). A este se le agregó kanamicina (25 mg/1) . El precultivo se incubó durante 24 horas a 33°C a 240 rpm. en un agitador. De este precultivo se inoculó un cultivo principal, de tal forma que el OD inicial (660 nm) del cultivo principal fue de 0.1. Para el cultivo principal se utilizó el medio MM-treonina: Medio MM-treonina: Licor de remojo de maíz (Corn Steep Liquor CSL) 5 g/1 MOPS (Acido 3-morfolino-propansulfónico) 20 g/1 Glucosa 50 g/1 (sometida a autoclave por separado) Sales: (NH4) 2S04 25 g/1 KH2P04 0.1 g/1 Mg204*7H20 1.0 g/1 CaCl2*2H20 10 mg/1 FeS04 *7H20 10 mg/1 MnS04* H20 5. Omg/1 Biotina (filtrada estéril) 0.3mg/l Tiamina*HCl (filtrada estéril) 0.2mg/l CaCO, 25 g/1 CSL, MOPS y la solución salina se ajustaron a un pH de 7 con amoniaco acuoso y se sometieron a autoclave. A continuación se agregaron las soluciones estériles de substrato y vitaminas, así como el CaC03 seco sometido a autoclave . El cultivo se realizó en un volumen 10 ml en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con bocas. Se agregó kanamicina (25 mg(l) . El cultivo se realizó a 33°C y 80% de humedad en el aire. Después de 48 horas se determinó OD a una longitud de onda medida de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La concentración de la treonina formada se determinó con un analizador de la firma Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografía de intercambio de iones y derivatización posterior de columna con detección de ninhidrina.

En la tabla 2 se representan los resultados de esa prueba . Tabla l

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes : 1.- Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos por medio de la fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales la secuencia nucleótida que codifica a dioxidoreductasa de malatorquinona se refuerza, en especial se sobre-expresa.
2. 2.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales adicionalmente se refuerzan los otros genes de la vía metabólica de la formación de los L-aminoácidos deseados.
3. 3.- Procedimiento de acuerdo con a reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales las vías metabólicas que reducen la formación de los L-aminoácidos deseados, están por lo menos parcialmente desactivadas .
4. 4. - Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utiliza una cepa transformada con un vector de plasmido y el vector de plasmido porta la secuencia nucleótida codificante a dioxidoreductasa de malato :quinona.
5. 5.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con el vector de plasmido pRM17 depositado en Corynebacterium glutamicum bajo el numero DSM 12711.
6. 6. - Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones, caracterizado porque a partir de bacterias corineformes se preparan acido L-asparagínico, L-asparagina, L-homoserina, L-treonina, L-isoleucina y L-metionina.
7. 7. - Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones l a 5, caracterizado porque se utilizan bacterias corineformes que producen L-lisina.
8. 8.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque simultáneamente se sobre-expresa el gen dapA codificante para la sintasa de dihidropicolinato.
9. 9.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque simultáneamente se amplifica le fragmento de ADN que proporciona resistencia a S- (2-aminoetil) -cisteina.
10. 10.- Procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se realizan los siguientes pasos : a) fermentación de las bacterias productoras de L- aminoácidos en las cuales cuando menos se refuerza el gen de dioxidoreductasa de malato :quinona, b) aumento de los L-aminoácidos deseados en el medio o en las células de las bacterias y c) aislado de los L-aminoácidos .