KR100791794B1 - 코리네형 세균을 사용한 ｌ-아미노산의 발효적 생산 방법 - Google Patents

코리네형 세균을 사용한 ｌ-아미노산의 발효적 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자가 증폭되는 코리네형 세균을 사용한 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
L-아미노산, 코리네박테리움 글루타미쿰, 글루타메이트 데하이드로게나제, 플라스미드 벡터, 발효

Description

코리네형 세균을 사용한 Ｌ-아미노산의 발효적 생산 방법{Process for the fermentative production of L-amino acids using coryneform bacteria}
본 발명은 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자가 증폭되는 코리네형 세균을 사용한 L-아미노산의 발효적 생산 방법을 제공한다.
L-아미노산은 동물의 영양, 사람의 의약 및 제약 산업에서 사용된다.
L-아미노산은 L-아미노산을 생산하는 코리네형 세균 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 사용한 발효에 의해 생산된다. 이러한 생성물 그룹의 중요성으로 인해, 생산 방법을 개선시키려는 노력이 항상 수행되어 왔다. 상기 방법의 개선은 발효 기술에 관한 수단, 예를 들어 교반과 산소 공급, 또는 예를 들어 발효중의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유한 성능 특성과 관련될 수 있다.
이들 미생물의 성능 특성은 돌연변이유발, 선별 및 돌연변이체 선별 등의 방법을 사용하여 개선시킨다. 이 방법에 있어서, 예를 들어 리신 동족체 S-(2-아미 노에틸)시스테인과 같은 항대사물에 내성이 있거나 조절상 중요한 아미노산에 대해 영양요구성이고 L-아미노산을 생산하는 균주가 수득된다.
수년 동안, 또한 재조합 DNA 기술의 방법을 사용하여, 개개 생합성 유전자를 증폭시키고 L-아미노산 생산 효능을 조사함으로써 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 개선시켜 왔다. 이러한 주제에 대한 개괄적인 내용은 특히 문헌[참조: Kinoshita, "Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142, Hilliger, BioTec 2, 40-44(1991), Jetten and Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103(1995) 및 Sahm et al., Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39(1996)]에서 발견할 수 있다.
효소 글루타메이트 데하이드로게나제는 α-케토글루타르산의 환원적 아민화를 촉매하여 글루탐산을 생성시킨다. 프랑스 공개 특허원 제2 575 492호는 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자를 포함하는, 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (Corynebacterium melassecola) 801로부터의 DNA 단편을 기술한다. 이는 코리네박테리움 멜라쎄콜라의 발효시 글루탐산 생산을 증가시키기 위해 사용할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 문헌[참조: Bormann et al., Molecular Microbiology 6, 317-326(1992)]에 기재되어 있다. 펩토스트렙토코쿠스 아사카롤리티쿠스 (Peptostreptococcus asaccharolyticus)의 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 문헌[참조: Snedecor et al., Journal of Bacteriology 193, 6162-6167(1991)]에 언급되어 있다.
본 발명자들의 목적은 다른 L-아미노산의 개선된 발효적 생산을 위한 신규한 수단을 제공하는 것이다.
L-아미노산은 동물의 영양, 사람의 의약 및 제약 산업에서 사용된다. 따라서, L-아미노산의 개선된 생산 방법을 제공하는 것이 일반적 관심사이다.
하기에서 L-아미노산이 언급되는 경우, 이들은 단백질-형성 아미노산인 L-리신, L-트레오닌, L-이소루이신, L-발린, L-프롤린, L-트립토판 및 임의로 이의 염 및 또한 L-호모세린, 특히 L-리신, L-트레오닌 및 L-트립토판을 의미한다.
본 발명은 특히 상응하는 L-아미노산을 이미 생산하고 효소 글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증폭, 특히 과발현되는 코리네형 세균을 사용한, L-아미노산의 발효적 생산 방법을 제공한다.
바람직한 양태는 특허청구범위에 언급되어 있다.
이와 관련하여, 용어 "증폭"은, 예를 들어, 강력한 프로모터를 사용하거나 활성이 높은 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용하고 임의로 이들 수단을 함께 사용하여 유전자(들)의 복사체수를 증가시킴으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 미생물내에서 증가시키는 것을 기술한다.
본 발명에 의해 제공되는 미생물은 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 당밀, 전분, 셀룰로오스로부터 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산을 생산할 수 있다. 상기 미생물은 대표적인 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속을 포함할 수 있다. 코리네박테리움 속 중에서, 코리네박테리움 글루타미쿰이 특히 언급될 수 있으며, 당해 분야의 숙련가에게는 이의 L-아미노산 생산 능력이 공지되어 있다.
코리네박테리움 속의 적합한 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주에는 공지된 야생형 균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움 테르모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및 돌연변이체 또는 이로부터 생성된 균주, 예를 들면,
L-리신 생산 균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708 및 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712; 또는
L-트레오닌 생산 균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 5835, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 4164 및 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 4180; 또는
L-이소루이신 생산 균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 756, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 759 및 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 4192; 또는
L-발린 생산 균주로서 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 512 및 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1845; 및
L-트립토판 생산 균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-BP 478, 브레비박테리움 플라붐 FERM-BP 475 및 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 7127이 있다.
본 발명자들은 L-글루타메이트 데하이드로게나제의 과발현후 코리네형 세균이 개선된 방식으로 L-아미노산을 생산한다는 것을 발견하였다(여기서, L-글루탐산은 본원에서 청구하지 않는다).
문헌[참조: Bormann et al., Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)]에 기재된 씨. 글루타미쿰의 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 다른 미생물로부터의 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자, 예를 들어, 문헌[참조: Snedecor et al., Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)]에 기재된 펩토스트렙토코쿠스 아사카롤리티쿠스(Peptostreptococcus asaccharolyticus)로부터의 유전자가 또한 적합하다. 유전자 코드의 축퇴 또는 작용성 중성 센스 돌연변이로부터 유도되는 언급된 유전자의 대립인자를 또한 사용할 수 있다.
과발현은 상응하는 유전자의 복사체수를 증가시켜 달성하거나, 구조 유전자로부터 상부에 위치하는 프로모터와 조절 영역을 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상부에 삽입된 발현 카셋트는 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터는 추가로 발효에 의한 L-아미노산 생산중에 발현을 증가시킬 수 있다. mRNA의 수명을 연장시키는 수단이 또한 발현을 증가시킨다. 또한, 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 효소 활성이 향상된다. 상기 유전자 또는 유전자 작제물은 가변성 복사체수로 플라스미드에 존재하거나 염색체에 삽입되어 증폭될 수 있다. 다른 방법으로, 영양 배지의 조성과 배양 조건을 변형시킴으로써 당해 유전자의 과발현을 또한 달성할 수 있다.
당해 분야의 숙련가들은 이와 관련된 내용을 발견할 수 있는데, 특히 다음 문헌을 언급할 수 있다: 문헌[참조: Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146(1987), Guerrero et al., Gene 138, 35-41(1994), Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430(1988), Eikmanns et al., Gene 102, 93-98(1991), 유럽 특허 ESP 제0 472 869호, 미국 특허 제4,601,893호, Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87(1991), Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132(1994), LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(1993), 국제 특허원 제WO 96/15246호, Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195(1998), Makrides, Microbiological Reviews 60: 512-538(1996), 및 유전학 및 분자생물학에 대해 공지된 교재].
글루타메이트 데하이드로게나제를 과발현시킬 수 있는 플라스미드의 예는 균주 ATCC13032/pEK1.9gdh-1 및 DH5α/pEKExpgdh 내에 존재하는 pEK1.9gdh-1 및 pEKExpgdh이다. 플라스미드 pEK1.9gdh-1은 씨. 글루타미쿰의 NADP-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자를 함유하는 셔틀 벡터이다. 플라스미드 pEKExpgdh는 펩토스트렙토코쿠스 아사카롤리티쿠스의 NADP-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자를 함유하는 셔틀 벡터이다.
또한, 글루타메이트 데하이드로게나제 뿐만 아니라 특정한 아미노산 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 과발현시키기 위해 상응하는 L-아미노산을 생산하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 예를 들면,
ㆍ디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자를 과발현시켜 L-리신 생산 코리네형 세균을 증진시킬 수 있고(EP-B 0197335),
ㆍ아세토하이드록시 산 신타제를 암호화하는 유전자를 추가로 과발현시켜 L-발린 생산 코리네형 세균을 증진시킬 수 있으며(EP-B 0356739),
ㆍ안트라닐산 포스포리보실 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 추가로 과발현시켜 L-트립토판 생산 코리네형 세균을 증진시킬 수 있고(EP-B 0124048),
ㆍ호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 추가로 과발현시켜 L-호모세린 또는 L-트레오닌 또는 L-이소루이신을 생산하는 코리네형 세균을 증진시킬 수 있다(EP-A 0131171).
또한, 글루타메이트 데하이드로게나제를 과발현시키는 것 외에 목적하지 않는 2차 반응을 차단하기 위해 상응하는 L-아미노산을 생산하는 것이 유리할 수 있다[참조: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].
L-아미노산의 생산을 위해, 본 발명에 따른 미생물은 연속적으로 또는 불연속적으로 회분식 공정 또는 유가식(fed batch) 공정 또는 반복형 유가식 공정에 의해 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약 내용은 다음 문헌에서 제공된다: 문헌[참조: Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 또는 Storhas (Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))].
사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 다음 문헌에 기재되어 있다: 문헌[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]. 사용될 수 있는 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 당밀, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산)이다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원은 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염이다. 배양 배지는 또한 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유하여야 한다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.
배양물의 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절한다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성은 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들어, 항생제를 배지에 가하여 유지할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어, 공기를 배양물중으로 도입시켜 호기성 조건을 유지시킨다. 배양 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃ 및 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 최대량의 목적하는 L-아미노산이 형성될 때까지 계속한다. 이는 통상적으로 10시간 내지 160시간내에 달성된다.
L-아미노산은 문헌[참조: Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, 1190(1958)]에 기재된 바와 같이 후속 닌하이드린 유도체화와 함께 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 자동적으로 분석할 수 있다.
하기 미생물은 부다페스트 조약하에 수탁기관 [Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)(도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌, 독일 브라운슈바이그 소재)]에 기탁되었다:
DSM 12614로서 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032/pEK1.9gdh-1,
DSM 12613으로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K12 균주 DH5α/pEKExpgdh.
실시예
본 발명은 하기 실시예로 더욱 상세하게 설명된다.
이러한 목적을 위해, 하기 아미노산 생산 균주로 시험을 수행하였고, 청구된 방법의 우수성이 입증되었다:
(a) L-리신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715(EP-B-0435 132) 및 (b) L-트레오닌 및 L-이소루이신 생산 균주 브레비박테리움 플라붐 DSM5399(EP-B-0385 940) 및 (c) 부다페스트 조약하에 독일 브라운슈바이그 소재의 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌에 기탁번호 DSM12455로 기탁된 L-발린 생산, 이소루이신-요구성 균주 ATCC13032ΔilvA.
실시예 1
증폭된 글루타메이트 데하이드로게나제를 갖는 L-아미노산 생산자의 생산
플라스미드 pEK1.9gdh-1은 문헌[참조: Bormann et al., Molecular Microbiology 6, 317-326(1992)]에 기재된 플라스미드 pEK1.9gdh에 상응한다. 이는 ATCC13032/pEK1.9gdh-1으로부터 분리되었다. 펩토스트렙토코쿠스 아사카롤리티쿠스[참조: Snedecor et al., Journal of Bacteriology 173, 6162-6167(1991)]의 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자를 포함하는 공지된 플라스미드 pEKExpgdh[참조: Marx et al., Metabolic Engineering 1, 35-48(1999)]는 동일한 방식으로 이. 콜라이 균주 DH5α/pEKExpgdh로부터 분리되었다.
균주 DSM5715, DSM5399 및 ATCC13032ΔilvA를 문헌[참조: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 65, 299-304(1989)]에 기재된 바와 같이 플라스미드 pEK1.9gdh-1으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 카나마이신 50mg/L가 보충된 머크(Merck)(Darmstadt, Germany)로부터의 뇌/심장 아가상에서 선별하였다. 이러한 방식에서, 균주 DSM5715/pEK1.9gdh-1, DSM5399/pEK1.9gdh-1 및 ATCC13032ΔilvA/pEK1.9gdh-1이 수득되었다. 균주 DSM5715를 동일한 방식으로 플라스미드 pEKExpgdh로 형질전환시키고, 균주 DSM5715/pEKExpgdh를 수득하였다.
실시예 2
L-리신의 생산
균주 DSM5715/pEK1.9gdh-1을 트립톤 16g/L, 효모 추출액 10g/L 및 NaCl 5g/L로 이루어진 복합 배지 2TY에서 예비배양하였다. 이를 위해, 2개의 유동 스포일러를 갖는 500ml 엘렌마이어 플라스크에 함유된 배지 2TY 60ml를 균주의 접종 루프로 접종하고, 배양물을 12시간 동안 150rpm 및 30℃에서 배양하였다.
2개의 유동 스포일러를 갖는 500ml 엘렌마이어 플라스크에 함유된 생산 배지 60ml를 접종하기 위해, 예비 배양물을 세파테크 미니퓨지 RF(Sepatech Minifuge RF)(Heraeus, Hanau, Germany) 원심분리기에서 5000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 펠렛을 생산 배지 1ml에 재현탁시켰다. 이러한 세포 현탁액 분취량을 약 2.0의 OD600이 수득되도록 생산 배지에 가하였다. 사용된 생산 배지는 글루코오스 20g/L, 류신 350mg/L 및 카나마이신 모노설페이트 50mg/L가 보충된, 문헌[참조: Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)]에 기재된 pH 7.0의 배지 CGXII(표 1)이었다. 배양물을 72시간 동안 30℃ 및 150rpm에서 배양하였다.
성분 농도/L
(NH4)2ISO4 20g
우레아 5g
KH2PO4 1g
K2HPO4 1g
MgSO4·7H2O 0.25g
3-모르폴리노프로판설폰산 42g
FeSO4·7H2O 10mg
MnSO4·H2O 10mg
ZnSO4·7H2O 1mg
CuSO4 0.2mg
NiCl2·6H2O 0.02mg
CaCl2 10mg
프로토카테큐산 0.03mg
비오틴 200㎍
이어서, 광학 밀도(OD)(Biochrom Novaspec 4049, LKB Instrument GmbH, Grafelfing, Germany)를 측정 파장 600nm에서 측정하였는데, 이는 닌하이드린 검출과 함께 이온 교환 크로마토그래피 및 후-컬럼 반응에 의해 에펜도르프-바이오트로닉(Eppendorf-BioTronik)(Hamburg, Germany)사의 아미노산 분석기를 사용하여 형성된 L-리신의 농도를 측정하는 것이다.
균주 OD L-리신(g/L)
DSM5715 16.5 4.5
DSM5715/pEK1.9gdh-1 19.4 6.2
실시예 3
L-트레오닌 및 L-이소루이신의 생산
균주 DSM5399/pEK1.9gdh-1을 카나마이신 50㎍/ml가 포함된 완전 배지 CgIII (Kase & Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36(9) 1611-1621 (1972)]에서 예비배양하였다. 이를 위해, 4개의 유동 스포일러를 갖는 100ml 엘렌마이어 플라스크에 함유된 배지 CgIII 10ml를 균주의 접종 루프로 접종시키고, 배양물을 16시간 동안 240rpm 및 30℃에서 배양하였다.
4개의 유동 스포일러를 갖는 100ml 엘렌마이어 플라스크에 함유된 생산 배지 10ml를 접종하기 위해, 예비배양물의 OD(660nm)를 측정하였다. 주요 배양물은 0.1의 OD로 접종시켰다. 사용된 생산 배지는 문헌[참조: Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 1993, 175: 5595-5603]에 기재된 배지 CgXII이었다. 배지의 조성은 실시예 2에 제시되어 있다. 글루코오스 4% 및 카나마이신 설페이트 50mg/L를 가하였다. 세포를 48시간 동안 33℃, 250rpm 및 80% 대기 습도에서 배양하였다.
이어서, 660nm에서의 광학 밀도를 측정하였는데, 이는 실시예 2에 언급된 바와 같이 형성된 L-트레오닌 및 L-이소루이신의 농도를 측정하는 것이다. 표 3은 시험 결과를 나타낸다.
균주 OD L-트레오닌(g/L) L-이소루이신
DSM5399 10.5 1.77 1.05
DSM5399/pEK1. 9gdh-1 11.0 2.26 1.44
실시예 4
L-발린의 생산
균주 ATCC13032ΔilvA/pEK1.9gdh-1을 카나마이신 50㎍/ml가 포함된 완전 배지 CgIII (Kase & Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36(9) 1611-1621 (1972)]에서 예비배양하였다. 이를 위해, 4개의 유동 스포일러를 갖는 500ml 엘렌마이어 플라스크에 함유된 배지 CgIII 50ml를 균주의 접종 루프로 접종시키고, 배양물을 16시간 동안 140rpm 및 30℃에서 배양하였다.
4개의 유동 스포일러를 갖는 500ml 엘렌마이어 플라스크에 함유된 생산 배지 60ml를 접종하기 위해, 예비배양물의 OD(660nm)를 측정하였다. 주요 배양물을 원심분리하고, 상청액을 경사분리하였다. 펠렛을 생산 배지 5ml에 재현탁시키고, 주요 배양물을 0.3의 OD로 접종시켰다. 사용된 생산 배지는 실시예 3(4% 글루코오스 사용)에 기재된 배지 CgXII[참조: Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 1993 175: 5595-5603]었다. 세포를 48시간 동안 30℃, 150rpm에서 배양하였다.
이어서, 660nm에서의 광학 밀도를 측정하였는데, 이는 실시예 2에 언급된 바와 같이 형성된 L-발린의 농도를 측정하는 것이다. 표 4는 시험 결과를 나타낸다.
균주 OD L-발린(g/L)
ATCC13032ΔilvA 18.5 0.29
ATCC13032ΔilvA/pEK1.9gdh-1 17.6 0.45
실시예 5
L-리신, L-발린 및 L-알라닌의 생산
균주 C/pEKExpgdh를 트립톤 16g/L, 효모 추출액 10g/L 및 NaCl 5g/L로 이루어진 복합 배지 2TY에서 예비배양하였다. 이를 위해, 2개의 유동 스포일러를 갖는 500ml 엘렌마이어 플라스크에 함유된 배지 2TY 60ml를 균주의 접종 루프로 접종하고, 배양물을 12시간 동안 150rpm 및 30℃에서 배양하였다.
2개의 유동 스포일러를 갖는 500ml 엘렌마이어 플라스크에 함유된 생산 배지 60ml를 접종하기 위해, 예비 배양물을 세파테크 미니퓨지 RF(Heraeus, Hanau, Germany) 원심분리기에서 5000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 펠렛을 생산 배지 1ml에 재현탁시켰다. 이러한 세포 현탁액 분취량을 약 0.4의 OD600이 수득되도록 생산 배지에 가하였다. 사용된 생산 배지는 글루코오스 25g/L, 류신 350mg/L, 3-모르폴리노프로판설폰산 42g/L 및 카나마이신 모노설페이트 50mg/L가 보충된, 문헌[참조: Schrumpf et al., Journal of Bacteriology 173, 4510-4516(1991)]에 기재된 pH 7.0의 배지 CGC(표 5)였다. 배양물을 30시간 동안 30℃ 및 150rpm에서 배양하였다.
성분 농도/L
(NH4)2SO4 5g
우레아 5g
KH2PO4 0.5g
K2HPO4 0.5g
MgSO4·7H2O 0.25g
FeSO4·7H2O 10mg
MnSO4·H2O 10mg
ZnSO4·7H2O 1mg
CuSO4 0.2mg
NiCl2·6H2O 0.02mg
CaCl2·2H2O 10mg
비오틴 200㎍
이어서, 광학 밀도(OD)(Biochrom Novaspec 4049, LKB Instrument GmbH, Grafelfing, Germany)를 측정 파장 600nm에서 측정하였는데, 이는 닌하이드린 검출과 함께 이온 교환 크로마토그래피 및 후-컬럼 반응에 의해 에펜도르프-바이오트로닉(Hamburg, Germany)사의 아미노산 분석기를 사용하여 형성된 L-알라닌, L-리신 및 L-발린의 농도를 측정하는 것이다.
균주 OD L-알라닌 L-리신(g/L) L-발린(g/L)
DSM5715 29.4 미량 1.6 0.1
DSM5715/pEKExpgdh 19.4 0.6 2.1 0.6
본 발명에 따라, 동물의 영양, 사람의 의약 및 제약 산업에서 유용한 L-아미노산의 발효적 생산을 개선시킬 수 있다.

Claims (11)

  1. 글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질전환됨으로써 글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증폭되는 코리네형 세균을 사용함을 특징으로 하는, 코리네형 세균의 발효에 의한 L-리신, L-트레오닌, L-발린, L-이소루이신, L-알라닌 및 L-트립토판으로부터 선택된 L-아미노산의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 사용된 세균에서 생산된 글루타메이트 데하이드로게나제가 NADP 의존성임을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 형성을 위한 대사 경로중의 나머지 유전자가 추가로 증폭되는 코리네형 세균을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 목적하는 L-아미노산(들)의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 차단된 코리네형 세균을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 기탁번호 제DSM 12614호하에 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)내의 플라스미드 벡터 pEK1.9gdh-1로 형질전환된 코리네형 세균이 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 기탁번호 제DSM 12613호하에 기탁된 이 콜라이(E. coli)내의 플라스미드 벡터 pEKExpgdh로 형질전환된 코리네형 세균이 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  9. (a) 제1항, 제2항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 기재된 코리네형 세균을 발효시키는 단계;
    (b) 배지 또는 세균 세포내에 목적하는 L-아미노산(들)을 축적시키는 단계 및
    (c) 당해 L-아미노산(들)을 분리시키는 단계를 수행함을 특징으로 하는, L-리신, L-트레오닌, L-발린, L-이소루이신, L-알라닌 및 L-트립토판으로부터 선택된 L-아미노산의 발효적 생산 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 과발현되는 것인 방법.
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