KR20000076897A - 코리네형 박테리아를 사용하는 발효에 의한 ｌ-아미노산의생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 mqo 유전자가 증폭된 코리네형 박테리아를 사용하여 발효에 의해 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

코리네형 박테리아를 사용하는 발효에 의한 Ｌ-아미노산의 생산 방법{Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryneform bacteria}
본 발명은 mqo 유전자가 증폭된 코리네형 박테리아를 사용하는 발효에 의한 L-아미노산, 특히 L-리신의 생산 방법을 제공한다.
L-아미노산, 특히 L-리신은 동물의 사료, 사람의 의약 및 약제 산업에 사용된다.
이들 아미노산은 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의 발효 균주 의해 생산된다는 것이 공지되어 있다. 이들의 특별한 중요성 때문에, 생산 방법을 개선시키고자 하는 작업이 계속되어 왔다. 상기 방법에 대한 개선은, 발효 공정에 관한 수단, 예를 들면 교반 및 산소 공급; 영양 배지의 조성, 예를 들면 발효중의 당 농도; 예컨대 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태로의 후처리; 또는 미생물 자체의 고유 수행 특성에 관한 것이다.
이들 미생물의 수행 특성을 개선하기 위하여, 돌연변이유발 방법, 선택법 및 돌연변이체 선별법이 사용된다. 이러한 방법에서, 예를 들면 리신 동족체 S-(2-아미노에틸)-시스테인과 같은 항대사물에 내성을 갖거나, 또는 조절에 있어서 중요한 아미노산에 대해 자가영양성인 균주가 수득된다.
수년간, 재조합 DNA 기술의 방법을 사용하여 각 개체의 아미노산 생합성 유전자를 증폭하고 L-아미노산의 생산에 미치는 효과를 연구함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰의 L-아미노산-생산 균주를 개선하였다. 이러하 주제에 관한 참조 문헌으로는 특히 다음의 문헌을 예시할 수 있다: Kinoshita "Glutamic Acid Bacteria", in : Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (eds.), Benjamin Cumming, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6, 261-272 (1994)), Jetten and Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995) and Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).
발효를 통해 L-아미노산, 특히 L-리신의 생산을 개선하기 위한 새로운 이용가능한 수단을 개발하는 것이 본 발명자들의 연구 목적이다.
L-아미노산, 특히 L-리신은 동물의 사료, 사람의 의약 및 약제 산업에 사용된다. 따라서, 이들 화합물을 생산하기 위한 새로운 개선된 이용가능한 방법을 개발하는데 일반적으로 관심이 있어 왔다.
본원에서 후술되는 리신 또는 L-리신에 대한 언급은 염기만을 의미하는 것이 아니라, 예를 들면 리신 모노하이드로클로라이드 또는 리신 설페이트와 같은 염을 의미하는 것으로도 이해하여야 한다.
본 발명은, 특히 목적하는 아미노산을 생산하고 효소 말레이트:퀴논 산화환원효소를 암호화하는 뉴클레오티드(mqo 유전자)가 증폭, 특히 과발현되어 있는 코리네형 박테리아를 사용하여 발효에 의해 L-아미노산, 특히 L-리신을 생산하는 방법을 제공한다.
바람직한 태양은 청구범위에 제시될 것이다.
이러한 관점에서, 용어 "증폭"은 , 예를 들면 강한 프로모터를 사용하거나, 또는 고도의 활성을 갖는 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용하거나, 임의로 이들 모두를 함께 사용하여, 당해 유전자의 복사체 수를 증가시키는 방법으로, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는, 미생물내의 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 증가시킴을 의미한다.
본 발명에 의해 제공된 미생물은 글루코즈, 삭카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분, 셀룰로즈로 부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로 부터 L-아미노산, 특히 L-리신을 생산할 수 있다. 이들의 대표적인 예로는 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 박테리아를 들 수 있다. 코리네박테리움 속중에서, 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 특별이 언급될 수 있는데, 이는 L-아미노산을 생산할 수 있는 이의 능력이 당업자에게 공지되어 있기 때문이다.
코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주로 공지된 야생형 균주로는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(acetoglutamicum) ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(acetoacidophilum) ATCC 13870, 코리네박테리움 떠모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(lactofermentum) ATCC 13869 및 브레비박테리움 디바리카툼(divaricatum) ATCC 14020이 있으며; 이로 부터 생성된, L-아미노산-생산, 특히 L-리신-생산 돌연변이체 및 균주의 예로는 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 6463 및 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 6464이 있다.
본원의 발명자들은, 코리네형 박테리아가 말레이트:퀴논 산화환원효소의 과발현 후, 개선된 방식으로 L-아미노산, 특히 L-리신을 생산한다는 것을 밝혀내었다. mqo 유전자는 효소 말레이트:퀴논 산화환원효소(EC. 1.1.99.16)를 암호화하며, 이는 전자를 유비퀴논-1으로 전달하여 말레이트의 옥살아세테이트로의 산화를 촉매한다[Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)]. 코리네박테리움 글루타미쿰의 mqo 유전자의 뉴클레오티드 서열도 마찬가지로 상기 문헌[Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)]에 의해 판정되었고, 기관[National Center for Biotechnology Information (NCBI, Behesda, MD, USA)]의 뉴클레오티드 서열 데이타뱅크로 부터 수탁번호 제AJ 22 4946호로 일반적으로 구입할 수 있다.
상기 문헌[Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)]에 기술된 코리네박테리움 글루타미쿰의 mqo 유전자가 본 발명에 사용될 수 있다. 유전 암호의 축퇴(degeneracy) 또는 기능-비발현(functional-neutral sense) 돌연변이에 의해 생성되는 mqo 유전자의 대립유전자(allele)를 사용할 수도 있다.
상응하는 유전자의 복사체 수가 증가되거나, 또는 구조 유전자의 앞쪽에 위치한 프로모터 및 조절 영역이 돌연변이됨으로써 과발현이 달성될 수 있다. 구조 유전자의 앞쪽에 삽입된 발현 카세트는 동일한 효과를 발휘한다. 유도성 프로모터를 사용하여, 발효에 의한 L-리신 생산 과정의 발현을 추가로 증가시킬 수 있다. m-RNA의 수명을 연장시키는 방법을 통해서도 마찬가지로 상기 발현이 향상될 수 있다. 또한, 효소 활성은 효소 단백질의 분해를 예방함으로써 증가될 수 있다. 상기 유전자 작제물은 복사 수가 상이한 플라스미드내에 존재하거나, 또는 염색체내에 통합되어 증폭될 수 있다. 달리, 당해 유전자의 과발현은 배지의 조성 및 배양을 수행하는 방법을 변화시킴으로써 달성될 수 있다.
당업자는 특히 다음 문헌에서 이에 대한 교시를 발견할 수 있으며, 이는 유전학 및 분자생물학의 교과서에 공지되어 있다: Martin et al., (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)); Guerrero et al., (Gene 138, 35-41 (1994)); Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Elikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 명세서 EP-B 0 472 869; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)); Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)); LaBarre et al., (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 국제특허출원 제WO 96/15246호; Malumbers et al. (Gene 134, 15-24 (1993)); Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)); Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)).
말레이트:퀴논 산화환원효소의 과발현을 보조할 수 있는 플라스미드의 예로는 pRM17[참조문헌: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)]이 있다. 플라스미드 pRM17은 문헌[Cremer et al., Molecular and General Genetics 220, 478-480]에 기술된 왕복 벡터 pJC1을 기초로 한다.
또한, 말레이트:퀴논 산화환원효소 뿐 아니라 상응하는 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 과발현시키는 것이 L-아미노산의 생산에 유리할 수 있다. 따라서, 예를 들면, L-리신의 생산시에, i) 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자가 동시에 과발현될 수 있거나(EP-B 0 197 335), 또는 ii) S-(2-아미노에틸)-시스테인 내성을 매개하는 DNA 단편이 동시에 증폭될 수 있다(EP-A 0 088 166).
말레이트:퀴논 산화환원효소의 과발현외에 목적하지 않은 이차 반응을 배제하는 것이 L-아미노산의 생산에 유리할 수 있다[참조문헌: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].
본 발명에 따라 생성된 미생물을 배치 공정에서, 또는 공급 배치 또는 반복된 공급 배치 공정에서 연속 또는 불연속적으로 배양하여 L-아미노산을 생산할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약이 문헌[Chmiel (Bioprozesstechnik l. Einfuhrung in die Bioverhfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)); Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))]에 기술되어 있다.
사용되는 배양 배지는 적절한 방법으로 당해 균주의 요구물을 충족시켜 주어야 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지에 대한 내용이 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 기술되어 있다. 탄소원으로서, 당류 및 알코올, 예를 들면 글루코즈, 삭카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈; 오일 및 지방, 예를 들면 대두유, 해바리기 기름, 땅콩유 및 코코낫 지방; 지방산, 예를 들면 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산; 알코올, 예를 들면 글리세롤 및 에탄올; 및 유기산, 예를 들면 아세트산이 사용될 수 있다. 이들 물질은 독립적으로 또는 혼합물의 형태로 사용될 수 있다. 질소원으로서, 유기 질소-함유 화합물, 예를 들면 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물 및 옥수수 침지액, 대두분 및 요소; 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 사용될 수 있다. 상기 질소원은 독립적으로 또는 혼합물의 형태로 사용될 수 있다. 인의 공급원으로서, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 사용될 수 있다. 또한, 상기 배양 배지는 성장에 필수적인 금속 염, 예를 들면 황산마그네슘 또는 황산철을 함유하여야 한다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 위에서 언급된 물질외에 사용될 수 있다. 또한, 적절한 예비-단계가 배양 배지에 부가될 수 있다. 상기된 물질이 단일 배치의 형태로 상기 배지에 가해지거나, 또는 배양중에 적당한 방법으로 공급될 수 있다.
상기 배지의 pH를 조절하기 위하여, 염기성 화합물, 예를 들면 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 또는 산성 화합물, 예를 들면 인산 또는 황산이 적당한 방법으로 사용될 수 있다. 발포의 발생을 제어하기 위해, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제가 사용될 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 선별 작용을 하는 적당한 물질, 예를 들면 항생제를 상기 배지에 가할 수 있다. 호기성 상태를 유지하기 위해, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예컨대 공기를 상기 배지에 도입한다. 상기 배지의 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃이고, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 목적하는 L-아미노산이 최대로 형성될 때까지, 배양을 지속한다. 이러한 목적은 통상 10 시간 내지 160 시간내에 달성된다.
음이온 교환 크로마토그래피에 이은 닌하이드린 유도화를 이용하여 L-아미노산을 분석한다[참조 문헌: Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190].
코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DM22/pRM17은 부다페스트 조약에 따라, 독일 브라운쉬바이크에 소재하는 도이체 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 1999년 3월 4일자로 수탁 번호 제DSM 12711호로 기탁되었다.
코리네형 박테리아를 이용한 발효에 의한 본 발명에 따른 방법은 L-아미노산, 특히 L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-호모세린, L-트레오닌, L-이소루이신 및 L-메티오닌, 특별히 L-리신의 생산에 사용될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명된다.
이를 위해, L-리신-생산 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM 5715(EP-B-0 435 132)를 사용하는 시험을 수행하며, 이를 통해 청구된 방법의 이점이 명백해진다.
실시예 1
증폭된 말레이트:퀴논 산화환원효소를 포함하는 L-리신 생산자의 생성
균주 DSM 5715를 문헌[Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)]에서와 같이 플라스미드 pRM17[Molenaar et al., 1998, European Journal of Biochemistry 254 (395-403)]를 사용하여 형질전환시킨다. 카나마이신 25mg/l이 가해진 LBHIS 아가상에서 형질전환체의 선별을 수행한다. LBHIS 아가는, 독일 다름스타트(Darmstadt) 소재의 Merk사로 부터 판매되는 뇌 심장(brain heart) 부용 37g/l, 0.5M 소르비톨 및 아가-아가 15g/l가 첨가된 LB 배지[Sambrook et al. (Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories)]로 구성된다. 상기와 같은 방법에서, 균주 DSM 5715/pRM17이 형성된다. 균주 DSM 5715/pJC1을 동일한 방법으로 생성한다.
실시예 2
L-리신의 생산
먼저, 균주 DSM 5715/pRM17 및 DSM 5715/pJC1을 카나마이신(25mg/l)가 첨가된 뇌-심장 아가상에서 24시간 동안 33℃로 배양한다. 액체 배지에서의 배양을 위해, 카나마이신(25mg/l)이 추가로 첨가된 CgIII 배지[Kase ＆ Nakayama, Agricultural and Biologucal Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972)]를 사용한다. 이를 위해, 4개의 배플을 갖는 100ml 삼각 플라스크에 포함된 배지 10ml에 상기 균주의 접종물을 접종시키고, 240rpm 및 30℃에서 16시간 동안 배양한다. 후속적으로, 상기 배양물은 예비-배양물로서 사용된다.
사용된 생산 및 시험 배지는, 카나마이신(25mg/l)이 추가로 첨가된 MM 배지이다
DSM 5715 균주를 사용하는 경우. 상응하는 배지는 카나마이신을 함유하지 않는다.
MM 배지의 조성 및 제법은 다음과 같다:
옥수수 침지액(CSL) 5g/l
3-모르폴리노-프로판설폰산(MOPS) 20g/1
글루코즈 50g/l
(각각 오토클레이빙함)
염:
(NH4)2SO425g/l
KH2PO40.1g/l
MgSO4*7H2O 1.0g/l
CaCl2*2H20 10mg/l
FeSO4*7H2O 10mg/l
MnSO4*H2O 5.0mg/l
비오틴 0.3mg/l (여과로 멸균함)
티아민*HCl 0.2mg/l (여과로 멸균함)
CaCO325g/ㅣ
루이신 0.1g/l
암모니아수를 사용하여 CSL, MOPS 및 염 용액을 pH 7로 조정하고, 오토클레이빙한다. 이어서, 멸균 기질 및 비타민 용액 및 오토클레이빙된 무수 CaCO3를 가한다.
상기한 생산 배지 10ml를 충전시킨, 배플을 갖는 100ml 삼각 플라스크에서 배양을 수행한다. 출발시의 흡광도가 0.1이 되도록, 상기 배양물에 상기 예비-배양물을 접종시킨다. 33℃ 및 80% 상대 습도에서 배양을 수행한다.
72 시간 동안 배양한 후, 배양 현탁액의 흡광도 및 형성된 L-리신의 농도를 측정한다. 독일 베를린에 소재하는 Dr. Lange로 부터 구입한 LP2W 광도계를 660nm의 측정 파장에서 사용하여 흡광도를 측정한다. 이온-교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 이용한 칼럼-후(post-column) 반응에 의한 아미노산 분석기(독일 함부르크에 소재하는 Eppendorf-BioTronik로 부터 구입)를 사용하여 L-리신을 측정한다. 시험 결과를 표 1에 제시한다.
균주 OD L-리신(g/l)
DSM 5715 10.1 16.4
DSM 5715/pJC1 9.9 16.5
DSM 5715/pRM17 10.2 17.8
본 발명에 따르면, L-아미노산, 특히 L-리신의 생산이 개선된다

Claims (10)

  1. 말레이트:퀴논 산화환원효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증폭된, 특히 과발현된 코리네형 박테리아를 사용하는 발효에 의한 L-아미노산의 생산 방법
  2. 제1항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 다른 유전자가 추가로 증폭된 박테리아가 사용되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 형성을 감소시키는 대사 경로의 적어도 일부가 제거된 박테리아가 사용되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 말레이트:퀴논 산화환원효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 수반하는 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주가 사용되는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 수탁번호 제DSM 12711호로 기탁된, 코리네박테리움 글루타미쿰내 플라스미드 벡터 pRM17로 형질전환된 박테리아가 사용되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-호모세린, L-트레오닌, L-이소루이신 또는 L-메티오닌를 생산하는 코리네형 박테리아가 사용되는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, L-리신을 생산하는 코리네형 박테리아가 사용되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
  9. 제7항에 있어서, S-(2-아미노에틸)-시스테인 내성을 매개하는 DNA 단편이 동시에 증폭되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서,
    a) 적어도 말레이트:퀴논 산화환원효소 유전자가 증폭된, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 박테리아로 발효시키는 단계;
    b) 박테리아 세포내 또는 배지내에 상기 L-아미노산을 농축시키는 단계; 및
    c) 생산된 상기 L-아미노산을 분리하는 단계를 수행하여, 상기 박테리아를 사용하는 발효에 의해 L-아미노산를 생산하는 방법.
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