JP2000270888A - Ｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Ｌ−アミノ酸の製造方法

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JP2000270888A JP2000076497A JP2000076497A JP2000270888A JP 2000270888 A JP2000270888 A JP 2000270888A JP 2000076497 A JP2000076497 A JP 2000076497A JP 2000076497 A JP2000076497 A JP 2000076497A JP 2000270888 A JP2000270888 A JP 2000270888A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 発酵によるＬ−アミノ酸、特にＬ−リジンの
改善された生産のための利用可能な新しい基準をつく
る。 【解決手段】 マレート：キノン酸化還元酵素をコード
するヌクレオチド配列を増幅させ、特に過剰に発現させ
る細菌を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｍｑｏ遺伝子が増
幅されたコリネ型細菌を用いての発酵によって、Ｌ−ア
ミノ酸、特にＬ−リジンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンは動物の
飼料、ヒト医学および製薬産業において使用されてい
る。
【０００３】これらアミノ酸は、コリネ型細菌株、特に
コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium gl
utamicum）の発酵する菌株によって生産されることは公
知である。これら菌株の際立った重要性のために、研究
は生産方法を改善するために継続して行われている。方
法の改善は、発酵工程、例えば撹拌および酸素供給、あ
るいは栄養媒体の組成、例えば発酵中の糖濃度、あるい
は例えばイオン交換クロマトグラフィーによる生産物形
態の後処理、あるいは微生物自体の内在性の性能特性に
関する基準に関わるものであってもよい。
【０００４】これら微生物の性能特性の改善のために、
突然変異誘発法、選択法および突然変異体選択法が使用
される。この方法で、代謝拮抗阻害剤、例えばリジン類
似性のＳ−（２−アミノエチル）−システインに対して
耐性であるか、あるいは調節によって重要なアミノ酸の
栄養要求性であり、かつＬ−アミノ酸を生産する菌株が
得られる。
【０００５】数年来、組み換えＤＮＡ技術の方法は、ア
ミノ酸生合成の個々の遺伝子を増幅させ、かつＬ−アミ
ノ酸の生産の効果を研究することによって、コリネバク
テリウムグルタミクムのＬ−アミノ酸生産菌株を改善す
るために使用されている。この題目に関する一般的な論
文は、特にキノシタ（Kinoshita）（“Glutamic AcidBa
cteria ” in：Biology of Industrial Microorganism
s, Demain and Solomon (eds.), Benjamin Cummings, L
ondon, UK, 1985, 115-142 ）、ヒリガー（Hilliger）
（Biotec 2, 40-44 (1991) ）、エッジェリング（Eggel
ing）（Amino acids 6, 261-272(1994) ）、ジェッテン
とシンスキー（Jetten and Sinskey）（Crirical Revie
ws in Biotechnology 15, 73-103(1995)））およびサー
ン（Sahm）ら（Annuals of the NewYork Academy of Sc
ience 782, 25-39 (1996) ）で見出されるであろう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明には、発酵によ
るＬ−アミノ酸、特にＬ−リジンの改善された生産のた
めの利用可能な新しい基準をつくる課題が課せられた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この課題は、マレート：
キノン酸化還元酵素をコードするヌクレオチド配列を増
幅させ、特に過剰に発現させる細菌を使用することによ
って解決される。
【０００８】
【発明の実施の形態】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンは
動物の飼料、ヒト医学および製薬工業で使用されてい
る。したがって、新たに利用可能な、これら化合物の生
産のための改善された方法を作り出すことは概して重要
である。
【０００９】本明細書中下記のＬ−リジンまたはリジン
の任意の記載は、塩基ばかりでなく塩、例えばリジン塩
酸塩またはリジン硫酸塩の意味を補って解釈されるべき
である。
【００１０】本発明は、特にすでに望ましいアミノ酸を
生産し、かつこの場合、酵素、マレート：キノン酸化還
元酵素（ｍｑｏ遺伝子）をコードするヌクレオチド配列
が増幅され、特に過剰に発現されるコリネ型細菌を用い
て、発酵によってＬ−アミノ酸、特にＬ−リジンを生産
する方法を提供する。
【００１１】好ましい実施態様は、請求の範囲中に見出
される。
【００１２】これに関する「増幅（amplification）」
の用語は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させるこ
と、強いプロモーターを使用すること、あるいは高いレ
ベルの活性を有する相当する酵素をコードする遺伝子を
使用すること、かつ場合によってはこれらの基準を組み
合わせることによって、相当するＤＮＡでコードされた
微生物中の一つ以上の酵素の内細胞性活性の増加を表
す。
【００１３】本発明によって提供される微生物は、グル
コース、ショ糖、ラクトース、フルクトース、マルトー
ス、糖蜜、デンプン、セルロースまたはグリセロールお
よびエタノールから、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを
生産することができる。この微生物は、コリネ型細菌の
典型的なものであり、特にコリネバクテリウム属であ
る。コリネバクテリウム属中の具体的な記載は、そのＬ
−アミノ酸を生産する能力が自体公知である、コリネバ
クテリウムグルタミクム種から成っていてもよい。
【００１４】コリネバクテリウム属の適した菌株、特に
コリネバクテリウムグルタミクム種は公知の野生菌株、 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidphilum ） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス （Coryneb
acterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５
３９ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flav
um ） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム（Brevibac
terium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９および ブレビバクテリウム ジヴァリカタム（Brevibacterium
divaricatum ） ＡＴＣＣ１４０２０ であり、かつＬ−アミノ酸、特にＬ−リジンを生産する
突然変異体およびこれから作製される菌株、例えば、 コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ
−Ｐ １７１２ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ ６４６
３および ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ ６４６
４である。
【００１５】改善された方法において、コリネ型細菌
が、マレート：キノン酸化還元酵素の過剰な発現後に、
Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを生産することが見出さ
れた。
【００１６】ｍｑｏ遺伝子は酵素、マレート：キノン酸
化還元酵素（ ＥＣ1.1.99.16 ）をコードし、この場
合、この酵素は、ユビキノン−１への電子の移動を伴っ
て、オキサロ酢酸へのリンゴ酸の酸化を触媒する （Mol
enaar et al., European Journal of Biochemistry 25
4, 395-403 (1998) ）。コリネバクテリウムグルタミク
ムのｍｑｏ遺伝子のヌクレオチド配列は、同様にモレナ
ー（Molenaar）らによって決定されており（European J
ounal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)）、かつ
一般にアクセス番号ＡＪ２２４９４６で、国立バイオテ
クノロジー情報センター（National Center for Biotec
hnology Infomation (NCBI, Behesda,MD, USA) ）の
ヌクレオチド配列データバンクで入手可能である。
【００１７】モレナーらによって表されたＣ．グルタミ
クムのｍｑｏ遺伝子（European Journal of Biochemist
ry 254, 395-403(1998)、）は本発明によって使用され
てもよい。さらに、遺伝コードの縮重からであるか、あ
るいは機能的に中立なセンス突然変異（function-neutr
al sense mutations） によって生じるｍｑｏ遺伝子の
対立遺伝子を使用することも可能である。
【００１８】過剰な発現を達成するために、対応する遺
伝子のコピー数を増加させてもよいか、あるいは構造遺
伝子の前方に位置するプロモーターおよび調節領域の変
異を生じてもよい。構造遺伝子の前方に挿入された発現
カセットも同様の効果を有する。付加的に、誘導プロモ
ーターによって発酵によるＬ−リジンの生産の過程中に
発現を増加させることも可能である。発現は同様に、ｍ
−ＲＮＡの寿命を延ばすための基準によって改善され
る。また、酵素活性は、酵素タンパク質の縮重を防ぐこ
とによって増加する。遺伝子または遺伝子構築体（gene
constructss ）の双方は、どちらも異なるコピー数で
プラスミド中に存在していてもよいか、あるいは染色体
中に組み込まれ、増幅されていてもよい。また二者択一
的に、当該遺伝子の過剰な発現は、培地の組成および培
養を実施する方法を変更することによって達成されう
る。
【００１９】当業者は、特にマーティンら（Martin et
al）（Bio/Technology 5 , 137-146( 1987)）、ガリレ
オら（Guerrero et al）（Gene 138, 35-41(1994) ）、
ツチヤとモリナガ（Tsuchiya and Morinaga）（Bio/Tec
hnology 6, 428-430 (1988)）、エイクマンズら（Eikma
nns et al）（Gene 102, 93-98 (1991) ）、ヨーロッパ
特許出願公告第０４７２８６９号明細書、米国特許第４
６０１８９３号明細書、シュヴァルツアーとピューラー
（Schwarzer and Puehler）（Bio/Technology 9, 84-87
(1991) ）、ラインシャイトら（Reinscheid et al.）
（Applied andEnvironmental Microbiology 60, 126-13
2(1994) ）、ラバルレら（LaBarre etal.）（Journal o
f Bacteriology 175,1001-1007(1993) ）、Ｗ０９６／
１５２４６特許明細書、マランブレズら（Malumbres et
al.）（Gene 134, 15-24(1993) ）（sic）、ジェンセ
ンとハマー（Jensen and Hammer）（Biotechnology an
dBioengineering 58, 191-195(1998)、）、マクライズ
（Makrides）（Microbiological Reviews 60：512-538
(1996) ）および公知の遺伝子学および分子生物学の教
科書での教示を見出すであろう。
【００２０】マレート：キノン酸化還元酵素が過剰に発
現されてもよいことによるプラスミドの例は、ｐＲＭ１
７（Molennar et al., 1998, Eouropean Journal of Bi
ochemistry 254, 395-403）である。プラスミドｐＲＭ
１７はシャトルベクターｐＪＣ１を基とし、この場合、
これはクレマーら（Cremer et al.,）（Molecular and
General Genetics 220, 478-480）で記載されている。
【００２１】さらに、Ｌ−アミノ酸の生産のために、相
当する生合成経路の酵素一つまたはそれ以上ならびにマ
レート：キノン酸化還元酵素を発現させることは有利で
あってもよい。したがって、例えばＬ−リジンの生産
で、 ●ジヒドロジピコリネートシンターゼ（dihydrodipicol
inate synthase）をコードするｄａｐＡ遺伝子が同時に
過剰に発現されてもよい（ヨーロッパ特許出願公告第０
１９７３３５号明細書）か、あるいは、 ●Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン耐性を仲介す
るＤＮＡフラグメントが同時に増幅されてもよい（ヨー
ロッパ特許出願公開第００８８１６６号明細書）。
【００２２】また、Ｌ−アミノ酸を生産するために、マ
レート：キノン酸化還元酵素の過剰な発現の他の望まし
くない二次反応を除去することは有利であってもよい
（Nakayama：“Breeding of Amino Acid Producing Mic
roorganisms” in：Overproduction of Microbial Prod
ucts, Krumphanzl, Sikyta, Vanek(eds.), Academic P
ress, London, UK, 1982）。
【００２３】本発明によって調製された微生物は、 Ｌ
−アミノ酸を生産する目的のために、連続的にまたは非
連続的に、回分法または流加法または反復流加法で培養
されてもよい。公知の培養法の概要は、チミール（Chmi
el）（Bioprozesstechnik 1.Einfuehrung in die Biove
rfahrenstechnik （Gustav Fischer Verlag, Struttgar
t, 1991））またはストーハス （Storhas）（Bioreakto
ren und periphere Einrichtungen（ Vieweg Verlag, B
raunschweig/-Wiesbaden, 1994) ）による教科書中で記
載されている。
【００２４】用いられるべき培地は、適した方法で、当
該菌株の要求を満たすものでなければならない。種々の
微生物のための培地の詳細な説明は、米国細菌学協会
（American Society for Bacteriology ( Washington
D.C., USA, 1981) ） のハンドブック「Manual of Meth
ods for General Bacteriology 」中に含まれている。
炭素源として、糖および炭化水素、例えばグルコース、
ショ糖、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖
蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えば
大豆油、ひまわり油、落花生油およびヤシ油、脂肪酸、
例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノレン酸、
アルコール、例えばグリセロールおよびエタノール、お
よび有機酸、例えば酢酸が使用されてもよい。これらの
物質は単独してかまたは混合物の形で使用されてもよ
い。窒素源として、窒素含有有機化合物、例えばペプト
ン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーン浸漬水
剤、大豆粉および尿素、あるいは無機化合物、例えば硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが使用さ
れていてもよい。窒素源は単独でかまたは混合物の形で
使用されてもよい。リン源としてリン酸二水素カリウム
またはリン酸水素二カリウム、あるいは相当するナトリ
ウム含有塩が使用されてもよい。また、培地は成長に必
要な金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含
有する。最終的に、必須成長物質（essential growth s
ubstance）、例えばアミノ酸およびビタミンは、上記の
挙げられた物質に加えて使用されてもよい。さらに、適
した予備段階を培地に加えてもよい。挙げられた物質
は、シングルバッチ（single batch）の形で培養に添加
されてもよいか、あるいは適した方法で培養中に供給さ
れてもよい。
【００２５】培養のｐＨを調整するために、塩基性化合
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアまたは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸を適し
た方法で使用してもよい。起泡を調整するために消泡
剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルが使用されて
もよい。プラスミドの安定性を保持するために、淘汰作
用を有する適した物質、例えば抗生物質を培地に添加し
てもよい。好気条件の保持のために、酸素または酸素含
有ガス混合物、例えば空気を培養中に装入してもよい。
培養温度は通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４
０℃である。培養は望ましいＬ−アミノ酸の最大量が形
成されるまで続けられる。この方法は通常１０〜１６０
時間内に達成される。
【００２６】Ｌ−アミノ酸の分析は、スパックマンら
（Spackman et al.）（Analytical Chemistry, 30, (19
58),1190 ）に記載されているように、アニオン交換ク
ロマトグラフィー、その後のニンヒドリン誘導反応によ
って実施されてもよい。
【００２７】コリネバクテリウムグルタミクム菌株ＤＭ
２２／ｐＲＭ１７は、ドイチェ・ザンムルング・フォン
・ミクロオルガニスメン・ウント・ツエルクルトウーレ
ン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell
kulturen(Braunschweig, Germany) ）に、ブタペスト条
約に従ってＤＳＭ１２７１１で寄託された。
【００２８】本発明による方法は、コリネ型細菌を用い
て発酵によって、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−アスパラギン
酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−トレオニ
ン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニンの製造、特
にＬ−リジンの製造のために使用される。
【００２９】
【実施例】本発明は、以下の実施例によって詳細に説明
される。
【００３０】この目的のために、Ｌ−リジンを生産する
コリネバクテリウムグルタミクム菌株ＤＳＭ５７１５
（ヨーロッパ特許出願公告第０４３５１３２号明細書）
を用いて試験を実施し、この場合、請求項に記載された
方法の利点が明らかになった。
【００３１】例１ 増幅されたマレート：キノン酸化還元酵素を含有するＬ
−リジン生産体（producer）の作製 菌株ＤＳＭ５７１５を、プラスミドｐＲＭ１７（Molena
ar et al., 1998, European Journal of Biochemistry
254 (395-403) ）を用いてリーブルら（Lieblet al.（F
EMS Microbiology Letters 65, 299-304(1989)））のよ
うに形質転換した。形質転換体（transformant ）の選
択は、カナマイシン２５ｍｇ／ｌが添加されたＬＢＨＩ
Ｓアガー上で実施された。ＬＢＨＩＳアガーはメルク社
（Merck, Darmstadt, Garmany）の脳心臓浸出物３７ｇ
／ｌ、０．５Ｍソルビトールおよびアガーアガー１５ｇ
／ｌ（agar-agar）が添加されたＬＢ培地（Sambrook et
al.(Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) C
old Spring Harbour Laboratories) ）から成る。この
方法で菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＲＭ１７が形成された。
菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＪＣ１を同様の方法で作製し
た。
【００３２】例２ Ｌ−リジンの生産 最初に、菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＲＭ１７および菌株Ｄ
ＳＭ５７１５／ｐＪＣ１をカナマイシン（２５ｍｌ／
ｌ）が添加された脳心臓浸出物アガー上で、３３℃で２
４時間に亘って培養した。液体培地中での培養のため
に、カナマイシン（２５ｍｌ／ｌ）が付加的に添加され
たＣｇＩＩＩ培地（Kase ＆ Nakayama, Agricultural a
nd Biological Chemistry 36 (9) 1611-1621(1972) ）
を使用した。この目的のために、４つの邪魔板を備えた
１００ｍｌの三角フラスコ中に含まれた培地１０ｍｌを
菌株の接種材料で接種し、かつ培養を２４０ｒｐｍかつ
３０℃で１６時間に亘って培養した。後に培養を前培養
として別個に使用した。
【００３３】使用された生産培地または試験培地は、付
加的にカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が添加されたＭＭ
培地であった。
【００３４】菌株ＤＳＭ５７１５を用いての方法では、
相当する培地はカナマイシンを含まなかった。
【００３５】ＭＭ培地の成分および配合は次の通りであ
った。
【００３６】 コーン浸漬水剤（Corn Steep Liquor (CSL)） ５ｇ／ｌ ３−モルホリノ−プロパンスルホン酸（MOPS） ２０ｇ／ｌ グルコース ５０ｇ／ｌ （別々にオートクレーブ処理した） 塩： （ＮＨ4）2ＳＯ4） ２５ｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4 ０．１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 *７Ｈ2Ｏ １．０ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 *２Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ4 *７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ4 *Ｈ2０ ５．０ｍｇ／ｌ ビオチン ０．３ｍｇ／ｌ （濾過滅菌） チアミン*ＨＣｌ ０．２ｍｇ／ｌ （濾過滅菌） ＣａＣＯ3 ２５ｇ／ｌ ロイシン ０．１ｇ／ｌ アンモニア水を用いて、ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液
をｐＨ７に調整し、かつオートクレーブ処理した。その
後に、滅菌済みの物質およびビタミン溶液および乾式オ
ートクレーブ（dry autoclave）処理したＣａＣｏ3を添
加した。
【００３７】培養を、前記に記載の生産培地１０ｍｌで
装填された、邪魔板を備えた１００ｍｌの三角フラスコ
中で実施した。培養は、前培養で接種されたので、開始
時の光学密度は０．１であった。培養を３３℃で、かつ
８０％の湿度で行った。
【００３８】７２時間に亘る培養の後、培養懸濁液の光
学密度および形成されたＬ−リジンの濃度を測定した。
光学密度は、測定波長６６０ｎｍで、Ｄｒ．ラング（D
r.Lange Berlin, Garmany）によるＬＰ２Ｗ光度計（LP2
W photometer,）を用いて測定され、（ｓｉｃ）Ｌ−リ
ジンはエッペンドルフビオトロニク（Eppendorf BioTro
nik,Hamburg, Germany）のアミノ酸分析器を用いて、イ
オン交換クロマトグラフィーおよびニンヒドリン検出で
のポストカラム反応によって測定された。試験結果を表
１に示した。
【００３９】
【表１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 ミヒャエル エドゥアルト ファン デア レスト オランダ国 ヴェンロ アッカーヴィンデ 24アー (72)発明者 ベッティーナ メッケル ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト ミッ テルシュトラーセ 15

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 コリネ型細菌の発酵によってＬ−アミノ
    酸を製造する方法において、マレート：キノン酸化還元
    酵素をコードするヌクレオチド配列を増幅させ、特に過
    剰に発現される細菌を使用することを特徴とする、Ｌ−
    アミノ酸の製造方法。
  2. 【請求項２】 望ましいＬ−アミノ酸の生合成経路の別
    の遺伝子が付加的に増幅されている細菌を使用する、請
    求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 望ましいＬ−アミノ酸の形成を減少させ
    る、少なくとも幾つかの代謝経路が消失されている細菌
    を使用する、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 プラスミドベクターで形質転換させた菌
    株を使用し、かつプラスミドベクターがマレート：キノ
    ン酸化還元酵素をコードするヌクレオチド配列を有す
    る、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 コリネバクテリウムグルタミクム中で寄
    託されたＤＳＭ１２７１１の番号のプラスミドベクター
    ｐＲＭ１７で形質転換させた細菌を使用する、請求項４
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギ
    ン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシ
    ンまたはＬ−メチオニンを生産するコリネ型細菌を使用
    する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 Ｌ−リジンを生産するコリネ型細菌を使
    用する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 ジヒドロジピコリネートシンターゼをコ
    ードするｄａｐＡ遺伝子を同時に過剰に発現させる、請
    求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン
    耐性を仲介するＤＮＡフラグメントを同時に増幅させ
    る、請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 次の工程、 ａ）望ましいＬ−アミノ酸を生産する細菌の発酵、この
    場合、この細菌中で少なくともマレート：キノン酸化還
    元酵素遺伝子が増幅されており、 ｂ）培地中または細菌の細胞中でのＬ−アミノ酸の濃縮
    および ｃ）生産されたＬ−アミノ酸の分離、を実施することを
    特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項に記載
    された発酵によってＬ−アミノ酸を製造する方法。
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