DE10254074A1

DE10254074A1 - Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Stoffwechselprodukten

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Publication number: DE10254074A1
Application number: DE10254074A
Authority: DE
Inventors: Axel Niebisch; Michael Prof. Dr. Bott
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2002-11-19
Filing date: 2002-11-19
Publication date: 2004-06-17
Also published as: WO2004046366A2; WO2004046366A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Stoffwechselprodukten. DOLLAR A Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es nunmehr möglich, die Synthese von ATP gezielt zu beeinflussen und damit auch die Synthese von Stoffwechselprodukten zu steuern. DOLLAR A Die Erfindung betrifft ein für Cytochrom aa¶3¶ Oxidase kodierendes Gen ctaF aus Corynebacterium glutamicum. Das ctaF Gen kodiert für ein Protein, welches die Funktion einer vierten Untereinheit der Cytochrom aa¶3¶ Oxidase aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Stoffwechselprodukten.
Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), ein gram positives Bodenbakterium mit einem hohen G+C Gehalt (54 mol%), wird für die industrielle Produktion von Aminosäuren, insbesondere zur Produktion von L-Glutamat und L-Lysin eingesetzt. Der Syntheseweg dieser Aminosäuren, der Zentralstoffwechsel, welcher die relevanten Vorstufen bereitstellt sowie der Kohlenstoff-Fluss und der Stickstoff-Fluss dieses Organismus ist intensiv untersucht worden [1].
Die Zusammensetzung und ernergetische Effizienz der Atmungskette bei coryneformen Bakterien wurde in den letzten Jahren sowohl genetisch als auch biochemisch intensiv untersucht.
Atmende Organismen können ATP durch oxidative Phosphorylierung synthetisieren. Dabei werden die bei der Oxidation von Substraten enstehenden Reduktionsäquivalente (H oder Elektronen) in die membranständige Atmungskette eingeschleust und die Elektronen letztendlich auf Sauerstoff oder andere terminale Elektronen-Akzeptoren übertragen. Energieerzeugende und energieverbrauchende Stoffwechselwege sind über ATP und das elektrochemische Protonenpotential bzw. das elektrochemische Natriumionen-Potential als universelle zelluläre Energieformen miteinander gekoppelt. Die Synthese von ATP kann entweder über Substratstufenphosphorylierung oder durch Elektronentransportphosphorylierung erfolgen. Der Aufbau des elektrochemischen Protonenpotentials erfolgt durch die Atmungskette oder die Hydrolyse von ATP durch die membranständige F₀F₁-ATP-Synthase. Die Komponenten der Atmungskette sind Enzyme, die i.d.R. kovalent oder nicht-kovalent gebundene niedermolekulare Gruppen enthalten, z. B. Flavine (Flavoproteine), Eisen-Schwefel-Zentren (Eisen-Schwefel-Proteine) und Häm-Gruppen (Cytochrome). Ein weiterer essentieller Bestandteil von Atmungsketten sind Chinone, d. h. niedermolekulare, membranständige Elektronen- und Protonenüberträger, wie z. B. Ubichinon und Menachinon.
Die Atmungskette von C. glutamicum weist mehrere Dehydrogenasen auf, die für den Elektronentransfer zum Intermembranpool des Menachinon-9 [2] verantwortlich sind sowie mindestens zwei Wege für die Reoxidation des Menachinons aufweist, wobei ein Weg der Reoxidation mit Hilfe der Cytochrom bd-Oxidase erfolgt und der zweite Weg mit Hilfe des Cytochrom bc_l Komplexes und der Cytochrom aa₃ Oxidase erfolgt. Letztere spielen eine bedeutende Rolle für das Wachstum der Organismen, da Mutanten mit fehlendem bc₁-Komplex oder fehlender Cytochrom aa₃ Oxidase deutliche Wachstumsdefekte aufweisen [2].
Der Cytochrom bc₁ Komplex wird durch die Gene gcrCAB kodiert [2,3]. Dem gcrC Gen vorgeschaltet sind die Gene für die Untereinheit II (ctaC) und III (ctaE) der Cytochrom aa₃ Oxidase [2,3], wobei der Cytochrom bc₁ Komplex und die Cytochrom aa₃ Oxidase, codiert durch ctaCDE, vermutlich einen Superkomplex bilden [2]. Einzelheiten betreffend die Atmungskette in C. glutamicum mit den entsprechenden Genen sind auch der WO 02/22799 A2 zu entnehmen.
Das u.a. durch die Reaktionen der Atmungskette gewonnene ATP ist der universelle Überträger chemischer Energie zwischen energieerzeugenden und energievebrauchenden Reaktionen und bedient so heterogene Prozesse wie die Synthese von Bausteinen und Makromolekülen. Energieerzeugende und energieverbrauchende Stoffwechselwege können u. a. über den Energiehaushalt der Zelle bzw. ihren ATP-Gehalt gesteuert werden und damit über die Funktionen der Atmungskette.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem der Stoffwechsel von Zellen reguliert werden kann.
Den Erfindern ist es in überraschender Weise gelungen, das Gen zu identifizieren, das für eine bisher unbekannte vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃-Oxidase codiert. Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung Mikroorganismen bereit zu stellen, deren Stoffwechsel gezielt regulierbar ist.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 7 wird die Aufgabe weiterhin erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 7 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird ebenso ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 8 und 9 erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 8 und 9 angegebenen Merkmalen.
Durch das Verfahren ist es nunmehr möglich, die Synthese von ATP durch Elektronentransportphosphorylierung sowie den Aufbau des elektrochemischen Protonenpotentials über die Atmungskette gezielt zu beeinflussen und damit eine Steuerung der Synthese von Stoffwechselprodukten zu ermöglichen. So kann beispielsweise die mikrobielle Produktion von Stoffwechselprodukten wie beispielsweise Aminosäuren (L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin), organischen Säuren (Essigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Ketoglutarsäure, Brenztraubensäure, Äpfelsäure), Vitaminen, Nukleosiden, Nukleotiden und ein- oder mehrwertiger Alkohole durch Einstellung einer geeigneten Energieladung positiv beeinflußt werden. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Polynukleotide als Hybridisierungssonden zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA sowie zur Isolation von Nukleinsäuren, Polynukleotiden oder Genen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation der das gewünschte Stoffwechselprodukt produzierenden Bakterien, in denen man die für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa₃ Oxidase codierende Gensequenz ctaF abschwächt oder zusammen mit einem Gen oder mehreren Genen aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, gcrA, gcrB, gcrC verstärkt.
b) Anreicherung des gewünschten Stoffwechselprodukts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
c) Isolieren des entsprechenden Stoffwechselprodukts.

Die Bezeichnung „abgeschwächt" beinhaltet die Abschwächung der Synthese und der Expression im Vergleich zur natürlichen Synthese bzw. Expression der für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa₃ Oxidase codierenden Gensequenz (ctaF). Der verwendete Begriff „natürlich" soll dabei die Eigenschaften umfassen, die genetisch nicht veränderte Mikroorganismen, d.h. Wildtypstämme aufweisen. Weiterhin ist unter der Bezeichnung „abgeschwächt" die vollständige Deletion der für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa₃ Oxidase codierenden Gensequenz ctaF zu verstehen.
Durch die „Abschwächung" der ctaF Gensequenz kann keine aktive Cytochrom aa₃ Oxidase gebildet werden. Die Reoxidation des Menachinons über den Weg des Cytochrom bc₁ Komplexes und die Cytochom aa₃ Oxidase ist damit nicht mehr möglich. Die Reoxidation kann nur noch über den Weg der Cytochrom bd-Oxidase erfolgen. Durch diese „Abschwächung" kann die Funktion der Atmungskette gezielt gesteuert werden und so auch der davon abhängige Stoffwechsel in gewünschter Weise beeinflußt werden.
Unter dem Begriff „verstärkt" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Erhöhung der Genexpression eines Gens oder mehrerer Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF , gcrA, gcrB, grcC gegenüber dem entspre chend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus zu verstehen. Eine besonders vorteilhafte Ausführung des Verfahrens umfaßt dabei die Verstärkung aller Gene der vorgenannten Gruppe.
Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen Herstellung der Stoffwechselprodukte zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Weiterhin kann auch die Stabilität der exprimierten Polypeptide selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus des Proteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. [17], bei Guerrero et al. [18], oder Tsuchiya und Morinaga [19].
Durch die Verstärkung eines Gens oder mehrerer Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF , gcrA, gcrB, grcC wird eine positive Beeinflussung der Atmungskette, insbesondere der durch das ctaF codierten Cytochtom aa₃ Oxidase erreicht. Diese wird sowohl in ihrer Stabilität als auch in ihrer Wirkungsweise zusammen mit anderen Komponenten der Atmungskette durch die Ausbildung ihrer vierten Untereinheit beeinflußt. So kommt es, wie weiter unten beschrieben, beispielsweise zu deutlichen Wachstumsdefekten, wenn das ctaF Gen deletiert wird. Durch die „Verstärkung" der Gene aus der oben genannten Gruppe kann gezielt die Reoxidation des Menachinons über den Cytochrom bc₁ Komplex und die Cytochrom aa₃ Oxidase gefördert werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten genetisch veränderten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Herstellung der Stoffwechselprodukte kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel [20] oder im Lehrbuch von Storhas [21] beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind beispielsweise in [22] enthalten.
Unter „produzierenden Bakterien" sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Corynebacterium glutamicum-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese der gewünschten Stoffwech selprodukte läuft. Beispielsweise sind bei diesen Bakterien ein oder mehrere Gen e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen, in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannten Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder homologer Organismen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Übertragung eines Gens oder mehrerer Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF , gcrA, gcrB, grcC in ein Wirtssystem. Dies schließt auch die Übertragung eines erfindungsgemäßen Genkonstrukts oder Vektors in ein Wirtssystem ein. Diese Übertragung von DNA in eine Wirtszelle erfolgt nach gentechnischen Methoden. Als bevorzugtes Verfahren sei hier die Transformation und besonders bevorzugt die Übertragung von DNA durch Elektroporation genannt.
Als besonders geeignet haben sich homologe Mikroorganismen erwiesen. Unter homologen Mikroorganismen sind Organismen zu verstehen, die alle einer verwandten Familie angehören. Erfindungsgemäß sind hierunter Corynebacterianeae zu verstehen, in die die aus coryneformen Bakterien isolierten Gensequenzen der oben beschriebenen Gruppe eingebracht werden bzw. in denen das ctaF Gen abgeschwächt wird. Stellvertretend für einen geeigneten homologen Mikroorganismus sei das Bakterium Corynebacterium glutamicum und bevorzugt der Stamm ATCC13032 genannt. Als Kulturmedium ist je nach Anforderungen ein Komplexmedium wie z. B. LB Medium oder auch ein Mineralsalzmedium, wie z. B. CGXII-Medium geeignet. Nach entsprechender Kultivierung kann die Bakteriensuspension geerntet und zur weiteren Untersuchung, beispielsweise zur Transformation oder zur Isolierung von Nukleinsäuren nach gängigen Methoden eingesetzt werden. Diese Vorgehensweise kann analog auch auf andere coryneforme Bakterienstämme angewendet werden. Dabei werden als Wirtssysteme Bakterien der Gattung Corynebacterium bevorzugt. Innerhalb der Gattung Corynebacterium wird besonders die Art Corynebacterium glutamicum und innerhalb der Gattung Brevibacterium besonders die Art Brevibacterium flavum bevorzugt. Zu den Vertretern dieser Gattungen zählen zum einen Stämme, die in ihren Eigenschaften als Wild Typ charakterisiert sind. Hier sind beispielsweise Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, zu nennen.
Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung auch produzierende Bakterienstämme ein, die sich beispielsweise als Aminosäureproduktionsstämme auszeichnen. Diese können z. B. ausgehend von Wildtypstämmen durch klassische (chemische oder physikalische) oder gentechnische Methoden hergestellt werden. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Stämme sind u. a. Corynebacterium glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032ΔpanBC. Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produktionsstämme geeignet, die dem Fachmann allgemein aus mikrobiellen Herstellungsverfahren bekannt sind. Die vorliegende Erfindung wird durch die ausgewählten Beispie le an Mikroorganismen näher charakterisiert, jedoch nicht limitiert.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase codierende Gensequenz ctaF als Hybridisierungssonde einsetzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen genetisch veränderten Mikroorganismus in dem die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase (ctaF) codierende Gensequenz abgeschwächt ist.
Ebenso umfaßt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus enthaltend ein Gen oder mehrere Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF , gcrA, gcrB, grcC in replizierbarer Form, welche im Vergleich zum Wild Typ Mikroorganismus verstärkt sind.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die Figuren zeigen modellhaft die, an der Atmungskette beteiligten Komponenten, mit den zugehörigen Genen sowie experimentelle Ergebnisse der durchgeführten Methoden mit dem ctaF Gen:
Es zeigt:
1. Darstellung der Genomregion von C. glutamicum mit der Genregion für den bc₁ Komplex (gcrABC) und die Cytochrom aa₃ Oxidase (ctaCE) und dem ctaF Gen ohne ctaD. Die DNA Regionen, die in den Stämmen 13032Δgcr und 13032ΔctaF deletiert wurden, sind ebenso eingezeichnet wie die Fragmente in den Plasmiden pJC1gcrB_St und den entsprechenden Derivaten sowie im Plasmid pBM20-QXA.
2: SDS-Polyacrylamid Gel Analyse des Cytochrom bc₁ Komplexes und des Cytochrome aa₃ Einzel Komplexes sowie des Superkomplexes aus C. glutamicum, aufgereinigt durch Affinitäts Chromatographie mit StrepTactin Sepharose mittels QcrB_St (Derivat des Cytochrom b mit C-terminaler Strep-Tag II) oder CtaD_St (Derivat der Untereinheit I der Cytochrom aa₃ Oxidase mit einem C-terminalen Strep-Tag II). Die Proteine wurden denaturiert, mit Hilfe eines 8-16% Tris-HCl Gradienten-Gels (Biorad) aufgetrennt und mit Coomassie Blau gefärbt. Spur 1, Cytochrom aa₃ Oxidase (7.2 μg Protein) aufgereinigt aus Stamm ΔQ-D_St; Spur 2, Cytochrome bc₁-aa₃ Superkomplex aufgereinigt aus Stamm ΔC-D_St (4.7 μg); Spur 3, Cytochrom bc₁-aa₃ Superkomplex aufgereinigt aus Stamm ΔQ-B_St (5.7 μg); Spur 4, Cytochrome, bc₁ Komplex aufgereinigt aus Stamm ΔC-B_St (4.3 μg).
3: Absolute Redox-Differenzspektren von reduzierten intakten Zellen von C. glutamicum ATCC13032 (Wild Typ), 13032ΔctaD, und 13032ΔctaF. Die Zellen wurden vor Aufnahme der Spektren bei Raumtemperatur in 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7.5) resuspendiert, auf eine optische Dichte von 200 bei 600 nm eingestellt und durch Zugabe von Dithionit reduziert. Relevante Unterschiede der einzelnen Cytochrom-Muster sind durch Pfeile markiert. X = Wellenlänge (nm); Y = Absorption
4: Sequenzvergleich des CtaF Proteins mit unterschiedlichen Spezies anderer Actinomyceten. Mutmaßliche Transmembran Helices werden durch Linien und Ziffern markiert. Aminosäuren, die in mindestens 5 Sequenzen identisch sind, werden mit schwarzer Schattierung markiert. Konservierte Aminosäure-Austauschbereiche werden grau schattiert dargestellt. Die Bezeichnungen der Bakterien wurden wie folgt abgekürzt: Cgl, C. glutamicum (NCgl2114); Cdi, C. diphtheriae (NC_002935); Mtu, Mycobacterium tuberculosis (Rv2199c); Mbo, M. bovis (NC_002945); Mle, M. leprae (ML0876); Sco, Streptomcyces coelicolor (NP_626410); Tfu, Thermobifida fusca (Tfus_p_278).
Im Folgenden sollen die verwendeten Methoden beschrieben werden.
1. Kultivierung der verwendeten Mikroorganismen
In Tab. 1 und Tab. 2 sind die verwendeten Organismenstämme und Plasmide aufgelistet.
Corynebacterium glutamicum wurde bei 30°C entweder in Luria Bertani (LB) Medium (Sambrook et al. 1989) oder in Brain Heart Infusion (BHI) Medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) mit 2% (w/v) Glucose oder in CGXII Minimal Medium mit 4% Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle (Keilhauer et al. 1993) kultiviert. Falls erforderlich wurde Kanamycin (25 μg/ml) zugegeben. Escherichia coli (E. coli) wurde bei 37°C in LB Medium kultiviert. Gegebenenfalls wurde Kanamycin (50 μg/ml) oder Ampicillin (100 μg/ml) zugegeben.
Für die Präparation rekombinanter DNA wurde Enzyme der Firma Roche Diagnistics oder New England Biolabs eingesetzt. Die eingesetzten Oligonukleotide wurde von MWG Biotech (Ebersber) bezogen und sind in Tab. 2 aufgelistet. Klonierungsverfahren wurden nach bekannten Standardverfahren durchgeführt [8].
2. Aufreinigung des Cytochrom bc₁ Komplexes
Die Aufreinigung des Cytochrom bc₁ Komplexes, ein QcrB Derivat mit C-terminaler Strep Tag II [6] wurde wie folgt durchgeführt: Das gesamte ctaE-gcrCAB Genkluster mit der vermeintlichen Promotorregion wurde mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifiziert (Expand High Fidelity PCR System, Roche Diagnostics). Dabei wurde ein reverser Primer mit Codons für StrepTag II (WSHPQFEK) und zwei vorangestellten Alanin Codons eingesetzt. Das daraus erhaltene 5,0-kb Fragment wurde in den E.coli-C.glutamicum Shuttle Vektor pJC1 hineinkloniert, wobei die durch Primer induzierten XbaI und SalI Restriktionsschnittstellen verwendet wurden. Das resultierende Plasmid pJC1-gcrB_St kodiert für ein QcrB Derivat mit zehn zusätzlichen Resten am C-Terminus (berechnetes Molekulargewicht 61,1 kDa). Zur Aufreinigung des Cytochrom aa₃ Komplexes wurde in ähnlicher Weise ein CtaD Derivat mit einem C-terminalen StrepTag II hergestellt mit dem Unterschied, daß nur die monocistronischen ctaD Gene mit ihrem nativen Promotor mittels PCR amplifiziert wurden. Das resultiernde 2,0-kb Fragment wurde über die XbaI Schnittstelle in den Vektor pJC1 hineinkloniert, so daß daraus das pJC1-ctaD_St Plasmid resultierte. Das modifizierte CtaD Protein enthielt zehn zusäzliche Reste am C-Terminus (berechnetes Molekulargewicht 66,3 kDA). Jedes der beiden Plasmide wurde in C. glutamicum 13032ΔctaD und 13032Δgcr mittels Elektroporation [8] eingebracht.
3. Membran-Isolation
10 g Zellmasse (Feuchtgewicht) wurden in 15 ml 100 mM Tris/HCl, pH 7,5 mit 5 mM MgSO₄ und 10 mg/l Lysozyme suspendiert. Nach 45 min Inkubation bei 37°C wurde der Protease Inhibitor Phenylmethansulfonylfluorid (1 mM) zugegeben. Es wurde ein Zellaufschluß durchgeführt, in dem die Suspension 5 mal bei 207 MPa durch eine French-Press (SLM Aminco) geleitet wurde. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 27000 × g für 20 min entfernt. Der Überstand (zellfreier Extrakt) wurde für 90 min bei 150000 × g erneut zentifugiert. Der Rückstand mit der Cytoplasmamembran wurde in 10 mM Tris/HCl bei pH 7,5 resuspendiert (60-80 mg Protein/ml) und erneut für 90 min bei 150000 × g zentrifugiert. Die Membransubstanz wurde in einem kleinen Volumen des verwendeten Puffers mit 10% (v/v) Glycerin resuspendiert und bei –20°C gelagert.
4. Aufreinigung der Protein Komplexe
Die gewaschene Membransubstanz wurde auf eine Proteinkonzentration von 5 mg/ml in 100 mM Tris-HCl, enthaltend 50 μg/ml Eiweiß Avidin (Sigma), eingestellt. Zur Isolation der Membranproteine wurde eine 10%ige (w/v) wässrige Lösung von n-Dodecyl-β-D-Maltosid (Biomol) zugegeben, so daß sich eine Endkonzentration von 2 g Dodecylmaltosid/g Protein einstellte. Nach 45 Minuten Inkubation auf Eis unter langsamem Rühren wurde die Probe für 20 min bei 180000 × g ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine StrepTactin Sepharose Säule gegeben mit einem Säulenvolumen von 2 ml (IBA, Göttingen) und mit 100 mM Tris-HCL Puffer (pH 7,5) und 0,025% (W/v) Dodecylmaltosid equilibriert. Die Säule wurde mit 9 ml eines Puffers aus 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5), 100 mM NaCl, 2 mM MgSO4 und 0,025% (w/v) Dodecylmaltosid gewaschen. Spezifisch gebundene Proteine wurden mit dem selben Puffer und zusätzlich 2,5 mM D-Desthiobiotin (Sigma) und 10% (v/v) Glycerin eluiert.
5. Protein Identifizierung durch Peptid-Massen-Fingerprinting
Die durch SDS-PAGE aufgetrennten und mit Coomassie Blue gefärbten Proteine wurden nach bekannter Methode [9] durch Peptid-Massen-Fingerprinting nach Verdau mit Trypsin (Promega) oder mit Cyanogen Bomid [10] identifiziert. Peptidmassen Datenbanken wurden eingesetzt, um lokal einen Ausschnitt des 3312 C. glutamicum Poteins zu suchen. Diese Datenbank wurde durch die Degussa AG (Frankfurt) zur Verfügung gestellt.
6. Enzym Untersuchung
Die N,N,N',N'-Tetramethyl-p-Phenylendiamin (TMPD) Oxidase Aktivität wurde spektrophotometrisch bei 562 nm in Luft gesättigtem 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5), der 200 μM TMPD enthielt, bei 25°C gemessen. Für die Berechnung der Aktivität wurde ein Extinktions Koeffizient von 10, 5 mM^–1cm^–1 eingesetzt [4] . Eine Einheit der Enzymaktivität entspricht der Menge von 1 μmol TMPD welches in einer Minute oxidiert wird.
7. Differenz-Spektroskopie
Dithionit-reduzierte minus Ferricyanid-oxidierte Differenzspektren wurden bei Raumtemperatur mit einem Jasco V560 Spektrophotometer, welches mit einem Silicium-Photodioden- Detektor für trübe Proben ausgestattet war, durchgeführt [11]. Dabei wurde eine Küvette mit einem 5 mm breiten Detektionsfenster eingesetzt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay [14] und Rinderserum-Albumin als Standard durchgeführt. Der Häm-Gehalt wurde aus den Differenz Spektren durch folgende Wellenlängepaare und Absorptionskoeffizienten (mM^–1cm^–1) bestimmt: Häm a, Δε _630-600nm = 11,6 [12] ; Häm b, Δε_562-577nm = 22; Häm c Δε _552- _540nm = 19,1 [13].
Ausführungsbeispiele:
a. Isolation des Cytochrom bc₁-aa₃ Superkomplexes Zur Aufreinigung des bc₁ Komplexes und der Cytochrom aa₃ Oxidase wurden Membranen der komplementierten Stämme ΔQ-B_St und ΔC-D_ST isoliert und die nach Solubilisierung mit Dodecylmaltosid erhaltenen Proteine der Affinitätschromatographie mit StrepTactin Sepharose unterzogen. Nach dem Waschen wurden die spezifisch gebundenen Proteine mit Desthiobiotin eluiert und mittels SDS-Page analysiert. Überraschenderweise wiesen die Proteinmuster der beiden Stämme ΔQ-B_St (2, Spur 3) und ΔC-D_ST (2, Spur 2) eine hohe Ähnlichkeit auf mit 8 Proteinbanden und scheinbar identischem Molekulargewicht. Die in 2 bis auf das 17-kDA-Protein (P17) dargestellte Identität der Proteine wurde mit Hilfe des Peptid-Mass-Fingerprinting wie oben beschrieben und ei ner MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization)-TOF (time of flight) Massensprektrometrie nachgewiesen. Für die Proteinbanden mit einem Molekulargewicht von 52 kDa bzw. 29 kDa wurde nachgewiesen, daß sie aus jeweils zwei unterschiedlichen Proteinen bestehen. Insgesamt konnten 10 Proteine nachgewiesen werden. Neben den bereits bekannten Untereinheiten des bc₁ Komplexes (QcrA, QcrB, QcrC) bzw. der Cytochrom aa₃ Oxidase (CtaC, CtaD, CtaE) wurden 4 weitere Proteine mit einem Molekulargewicht von 29 kDa (P 29), 24 kDa (P24), 20 kDa (P20) und 19 kDa (P19) nachgewiesen. Diese können jeweils den Proteinen NCgl2611 (Cgl2664), NCgl2177 (Cgl2226), NCgl1970 (Cgl2017) und NCgl2114 (Cgl2194) zugeordnet werden. Diese NCgl-Nummern entsprechen der Nomenklatur der öffentlich zugänglichen NCBI (National Center for Biotechnology Information) bzw. die in den Klammern verwendeten Nummern der Nomenklatur der DDBJ (DNA Data Bank of Japan) Datenbanken. Der Fachmann weiß, daß das komplette Genom von C. glutamicum aus allgemein zugänglichen Datenbanken identifizierbar ist (wie z. B. NCBI) und durch Techniken der Genklonierung, z. B. unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion (PCR) klonierbar ist.
b. Aufreinigung der Cytochrom aa₃ Oxidase als Einzelkomplex
Um die Cytochrom aa₃ Oxidase als Einzelkomplex und nicht als Superkomplex zusammen mit dem bc₁ Komplex aufzureinigen, wurde das Plasmid pJC1-ctaD_st in C. glutamicum 13032Δgcr transferiert. Der daraus resultierende ΔQ-D_St-Stamm wies infolge der fehlenden Qcr Gene dieselben Wachstumsdefekte wie der 13032Δgcr Stamm auf und bildete sowohl Wild-Typ CtaD als auch Strep-Tagged CtaD. Das Eluat der StrepTactin Affinitätschromatographie enthielt vier Proteine (2, Spur 1), die als CtaD, CtaC, CtaE und P19 identifiziert wurden. Es wurde eine TMPD Oxidaseaktivität der isolierten Cytochrom aa₃ Oxidase von 0,34 U/mg ermittelt sowie ein Turn-Over Wert von 1,1 TMPD oxidiert/aa₃ s^–1. In Folge des fehlenden Cytochrom c₁ wurde eine 10-fach geringere Oxidaseaktivität gegenüber der Aktivität des Superkomplexes ermittelt.
c. Beweis der vierten Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase
Um die Bedeutung der Proteine P29, P24, P20 und P19 für die Atmungskette und die Bildung des bc₁-aa₃-Superkomplexes nachzuweisen, wurden die entsprechenden Gene aus dem Chromosom von C. glutamicum deletiert. Die daraus entstandenen Stämme wurden mit ΔC2611, ΔC2177, ΔC1970 und ΔC2114 bezeichnet. Die ersten drei Stämme wiesen keine deutlichen Unterschiede im Wachstumsverhalten oder in der Bildung des a-, b-, und c-Typ Cytochroms auf. Offenbar sind die Proteine P29, P24, und P20 nicht essentiell für die Bildung und die Aktivität des bc₁-aa₃-Abzweigs der Atmungskette bzw. die Funktion und die Interaktion des bc₁-aa₃ Superkomplexes.
Im Gegensatz dazu führte die Deletion des Gens NCgl2114, welches für das P19 Protein codiert, zum Phänotyp des 13032ΔctaD Stammes. So war das Wachstum deutlich beeinträchtigt, Cytochrom a war nahezu nicht im Spektrum der Dithionit-reduzierten Zellen vorhanden und der Gehalt an Cytochrom war deutlich geringer als im Wild Typ (3). Das P19 Protein ist daher essentiell für die Bildung einer aktiven Cytochrom aa₃ Oxidase. Das Protein P19 wurde nur bei der Aufreinigung des Superkomplexes oder der isolierten Cytochrom aa₃ Oxidase nachgewiesen, nicht jedoch bei der Aufreinigung des isolierten bc₁ Komplexes (2). Das Protein P19 wird auf Grund der Interaktion mit den Untereinheiten der Cytochtom aa₃ Oxidase mit aufgereinigt und kann daher zur bisher noch nicht bekannten vierten Untereinheit der Cytochtom aa₃ Oxidase aus C. glutamicum gezählt werden.
Das Protein P19 besteht aus 143 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 15,5 kDA. Es weist drei hydrohobe Regionen auf, und zwar im Bereich der Aminosäuren 7-27, 40-60, sowie 97-130, wodurch drei oder vier Transmembranhelices gebildet werden. Die erste Transmembranhelix dient vermutlich als Teil eines Signalpeptids. Der in 4 dargestellte Sequenzvergleich zeigt, daß das für das P19 Protein codierende Gen ctaF mit korrespondierenden Genen aus der Gruppe der Actinomycetales Homologien aufweist: C. diphtheriae 68% Identität; Mycobakterien 38-39% Identität; S. coelicolor 39% Identität und Thermobifida fusca 33% Identität. Bei all diesen Organismen sind die korrenpondierenden Gene den Genclustern des ctaC oder des ctaD nachgeschaltet. Im Fall von S. coelicolor und T. fusca werden diese korrenspondierenden Gene zusammen transkribiert. Daraus kann geschlossen werden, daß die mit dem P19 Protein homologen Sequenzen die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase in Actinomyceten repräsentieren.
Tab. 1: Verwendete Bakterienstämme und Plasmide
Tab. 2: Verwendete Oligonucleotide
Tab. 3: Aufreinigung des Cytochrom bc₁-aa₃-Superkomplexes aus Membranen von C. glutamicum ΔQ-Bst und ΔC-D_St
Die Chinol Oxidase Aktivität wurde mittels DMNH₂ (2,3-Dimethyl-1,4-Naphtoquinone in reduzierter Form) als Substrat durch Messung der Sauerstoffaufnahme mittels einer Clark-Sauerstoffelektode bestimmt. Eine Einheit (U) entspricht 1 μmol O₂_Aufnahme pro Minute. Die Turnover Nummer (TN) wurden berechnet als Elektronentransfer pro Cytochrom aa₃ pro Sekunde. Die in den Klammern angegebenen Werte wurde berechnet als Elektronentransfer pro Cytochrom b pro Sekunde. N.d. = nicht bestimmt
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Claims

Verfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt: d) Fermentation der das gewünschte Stoffwechselprodukt produzierenden Bakterien, in denen man die für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa₃ Oxidase codierende Gensequenz ctaF abschwächt oder zusammen mit einem Gen oder mehreren Genen aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, gcrA, gcrB, gcrC verstärkt. e) Anreicherung des gewünschten Stoffwechselprodukts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und f) Isolieren des entsprechenden Stoffwechselprodukts.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffwechselprodukt eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffwechselprodukt eine organische Säure vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Essigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, Milchsäure, Bern steinsäure, Fumarsäure, Ketoglutarsäure, Brenztraubensäure und Äpfelsäure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffwechselprodukt ein Vitamin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffwechselprodukt ein Nukleosid oder Nukleotid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffwechselprodukt ein ein- oder mehrwertiger Alkohol ist.
Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase codierende Gensequenz ctaF einsetzt.
Mikroorganismus in dem die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase codierende Gensequenz (ctaF) abgeschwächt ist.
Mikroorganismus enthaltend ein oder mehrere Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF, gcrA, gcrB, gcrC in replizierbarer Form, welche im Vergleich zum Wild Typ Mikroorganismus verstärkt sind.