DE112009000453T5 - Vektor zur Transformation unter Verwendung von Transposons, durch den Vektor transformierte Mikroorganismen und Verfahren zum Herstellen von L-Lysin unter Verwendung derselben - Google Patents

Vektor zur Transformation unter Verwendung von Transposons, durch den Vektor transformierte Mikroorganismen und Verfahren zum Herstellen von L-Lysin unter Verwendung derselben Download PDF

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Abstract

Vektor zur Transformation, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Transposongen und eine Multicloning-Stelle aufweist, die von einem Mikroorganismus Corynebacterium sp. stammen.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Vektor zur Transformation unter Verwendung eines Transposongens, auf einen Mikroorganismus, der mit dem Vektor transformiert ist, und auf ein Verfahren zur Gewinnung von Lysin unter Verwendung des Mikroorganismus.
  • Stand der Technik
  • Corynebacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum ist ein Gram-positiver Mikroorganismus, der zur Produktion von L-Aminosäure verwendet wird. L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, sind weithin zur Produktion von Tierfutter, humanen Arzneimitteln und Kosmetika verwendet worden. Diese Aminosäure wird durch Fermentation unter Verwendung von Corynebacterium erzeugt.
  • Das herkömmliche Verfahren zur Produktion von L-Lysin hat ein Corynebacterium verwendet, das ein Gen aufweist, das mit einer verstärkten L-Lysin-Biosynthese im Zusammenhang steht. Beispielsweise beschreibt das US-Patent Nr. 6,746,855 ein Verfahren zur Produktion von L-Lysin durch Kultivieren von Corynebacterium sp., bei dem das Lysin freisetzende Trägergen lysE verstärkt war und in das ein zusätzliches Gen eingeführt war, das ausgewählt war aus der Gruppe, bestehend aus dapA, das Dihydrodipicolinatsynthase kodiert, lysC, das Aspartatkinase kodiert, pyc, das Pyruvatcarboxylase kodiert, und dapB, das Dihydropicolinatreduktase kodiert. Und das US-Patent Nr. 6,221,636 beschreibt Corynebakterien, die mit rekombinanter DNA transformiert sind, welche die DNA-Sequenz enthält, die Diaminopimelatdicarboxylase kodiert, und die DNA-Sequenz, die Aspartokinase kodiert, die im Wesentlichen gegenüber einer Produkthemmung durch L-Lysin und L-Threonin unempfindlich ist.
  • Um das mit der L-Lysin-Biosynthese im Zusammenhang stehende Gen ohne eine Antibiotikaresistenz verleihende Sequenz zu verstärken, wird entweder die Anzahl an Genkopien erhöht oder die Enzymaktivität wird durch Mutation erhöht. Bisher wurde über zwei Verfahren zum Erhöhen der Anzahl an Genkopien berichtet.
  • Eines der beiden Verfahren zum Erhöhen der Anzahl an Kopien ist „Tandem repeat”, wodurch ein zusätzliches Gen direkt neben dem intrinsischen Gen eingefügt wird. Das andere Verfahren hat das Ziel, ein zusätzliches Gen in eine oder mehrere chromosomale Regionen von Corynebacterium sp. einzufügen ( US-Patent Nr. 7,160,711 ). Diese Verfahren sind jedoch beschränkt hinsichtlich der Gen-Insertionsstellen, was zeigt, dass es sehr schwierig ist, multiple Gene einzufügen. Um dieses Problem zu überwinden, ist versucht worden, Zielgene in der Region von multiplen Kopien von rDNA in dem Genom einzufügen. Es wurde berichtet, dass dieses Verfahren erfolgreicher war als die vorherigen. Dennoch weist dieses Verfahren eine Einschränkung auf, da die Zerstörung von zwei oder mehreren rDNA-Kopien das Wachstum des Mikroorganismus beeinflussen kann.
  • Ein Transposon wird auch als einfügbares Sequenzelement (insertional sequence element) bezeichnet, wobei es sich um die Sequenz handelt, die sich auf einem Chromosom oder Plasmid bewegen kann. Ein Transposon schließt eine Transposase ein, welche die Aktivität zeigt, eine spezifischen Sequenz für die Insertion zu erkennen. Bis heute ist über hunderte von Transposons in einer Vielfalt von Bakterien berichtet worden (Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics (2003) Annual Review of Genetics 37: 3–29 Finbarr Hayes).
  • Offenbarung der Erfindung
  • Technische Aufgabe
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben versucht, einen Stamm zu entwickeln, der Lysin in hoher Konzentration produzieren kann, indem sie einen Vektor zur Transformation, der für die Insertion von zwei oder mehreren Kopien eines Zielgens, unabhängig von dessen Lage, verfügbar ist, verwendet haben, ohne das Wachstum des Mikroorganismus zu hemmen. Schließlich vervollständigten die Erfinder die vorliegenden Erfindung, indem bestätigt wurde, dass der Vektor zur Transformation unter Verwendung eines Transposongens sehr nützlich war für die Insertion eines Fremdgens.
  • Deshalb ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Vektor zur Transformation unter Verwendung eines Transposongens bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Mikroorganismus Corynebacterium sp. bereitzustellen, der eine verbesserte Lysinproduktivität aufweist, indem er mit dem Vektor zur Transformation transformiert ist.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung von Lysin aus der Kulturlösung des Mikroorganismus Corynebacterium sp. bereitzustellen.
  • Technische Lösung
  • Um Lösungen für die oben genannten Aufgaben zu erzielen, stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor zur Transformation bereit, der ein Transposongen und eine Multicloning-Stelle enthält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Mikroorganismus Corynebacterium sp. bereit, der eine verbesserte Lysinproduktivität aufweist, indem er mit dem Vektor zur Transformation transformiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung von Lysin aus der Kulturlösung des Mikroorganismus Corynebacterium sp. bereit.
  • Vorteilhafte Wirkung
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Mikroorganismus Corynebacterium sp. bereit, der in der Lage ist, Lysin in hoher Konzentration zu produzieren, und der durch serielles Einfügen eines Aspartatkinasegens (lysC), Aspartatsemialdehyddihydrogenasegens (asd), Dihydrodipicolinatsynthasegens (dapA) und Dihydropicolinatreduktasegens (dapB) in die Region eines Transposongens, das als multiple Kopien in dem Genom des Mikroorganismus Corynebacterium sp. vorliegt, eine verbesserte endogene Aktivität aufweist und der gleichzeitig mit einer neuen Aktivität durch die zusätzliche Insertion eines Fructokinasegens (srk), das bei Corynebakterien in der Region des Transposongens nicht existiert, ausgestattet worden ist.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • Die oben genannten und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungen zusammen mit den begleitenden Zeichnungen offensichtlich werden.
  • 1 ist ein Schaubild, welches den Corynebacterium Chromosomen-Insertionsvektor pDZTn veranschaulicht.
  • 2 ist ein Schaubild, welches den Corynebacterium Chromosomen-Insertionsvektor pDZTn-lysC/asd veranschaulicht.
  • 3 ist ein Schaubild, welches den Corynebacterium Chromosomen-Insertionsvektor pDZTn-dapA/dapB veranschaulicht.
  • 4 ist ein Schaubild, welches den pDZTn-srk-Vektor veranschaulicht.
  • Ausführung der Erfindung (Best Mode)
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Vektor zur Transformation bereit, der ein Transposongen und eine Multicloning-Stelle enthält.
  • Das Transposongen kann aus Corynebacterium sp. stammen. Der Mikroorganismus Corynebacterium sp. weist viele verschiedene Arten von Transposons auf. Beispielsweise enthält Corynebacterium glutamicum ATCC13032 vierundzwanzig Transposons, die in neun Gruppen eingeteilt werden (The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of aspartate-derived amino acids and vitamins (2003) Journal of Biotechnology 104, 5–25 Jorn Kalinowski et al.). Von diesen enthalten ISCg1 und ISGg2 vier bzw. fünf Kopien und jede Kopie zeigt eine Homologie von mindestens 99%.
  • Das Transposongen der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Mitglied der Gruppe von ISCg1 (SEQ ID. NO: 22) unter Transposons, die von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (GenBank-Zugangsnummer NC_003450, NCgl1021) stammen und insbesondere dasjenige, das die Nukleotidsequenzen, die durch SEQ ID. NO: 1 und 2 dargestellt werden, aufweist.
  • Die Multicloning-Stelle ist die Nukleotidsequenz, die künstlich eingefügt ist, um die Erkennung durch viele Restriktionsenzyme zu erleichtern, was nahelegt, dass sie die Insertion eines Zielgens erleichtert.
  • Die Gene, die in die Multicloning-Stelle eingefügt werden können, sind aspB (Gen, das Aspartataminotransferase kodiert), lysC (Gen, das Aspartatkinase kodiert), asd (Gen, das Aspartatsemialdehyddihydrogenase kodiert), dapA (Gen, das Dihydrodipicolinatsynthase kodiert), dapB (Gen, das Dihydropicolinatreduktase kodiert) und lysA (Gen, das Diaminopimelatdicarboxylase kodiert), wobei es sich um endogene Gene von Corynebacterium sp. Mikroorganismen handelt, die an der Produktion von L-Aminosäuren beteiligt sind. Zusätzlich kann das exogene srk (Gen, das Fructokinase kodiert) eingefügt sein.
  • Es ist zu bevorzugen, ein oder mehrere Gene in die Multicloning-Stelle einzufügen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus aspB, lysC, asd, dapA, dapB und lysA. Es ist auch möglich, die oben ausgewählten endogenen Gene und ein exogenes Gen gemeinsam in die Multicloning-Stelle seriell einzufügen. Es ist stärker bevorzugt, lysC/asd und dapA/dapB in die Multicloning-Stelle einzufügen, oder möglicherweise wird das exogene srk-Gen, das in Corynebacterium sp. Mikroorganismen nicht gefunden wird, eingefügt.
  • In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung weisen die Gene lysC, asd, dapA und dapB die Nukleotidsequenzen auf, die durch SEQ ID. NOs: 17, 18, 19 bzw. 20 dargestellt werden, und die aus Corynebacterium glutamicum KCCM 10770Pb stammen (Gen-Bank-Zugangnummer: NC_003450, NCgl0247~0248 und NCgl1896~1898). Das fremde Gen srk kann dasjenige sein, welches die in SEQ ID. NO: 21 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist, die aus Clostridium acetylbutyricum ATCC 824 (GenBank-Zugangsnummer: NP_347064) stammt.
  • Die Gene, die in den Vektor zur Transformation gemäß der vorliegenden Erfindung eingefügt sind, können in das Chromosom des Mikroorganismus Corynebacterium sp. durch sekundäres Crossover integriert sein.
  • Der Vektor zur Transformation unter Verwendung des Transposongens der vorliegenden Erfindung ist nicht nur fähig, mindestens zwei Kopien des endogenen Gens zu amplifizieren, sondern ist dank der multiplen Transposons auch zur Insertion eines Gens durch Crossover mit hoher Effizienz geeignet. Dieser Vektor kann auch beim Produzieren eines Stamms wirkungsvoll sein, der verschiedene Gene in Serie mit demselben Vektor amplifizieren kann. Das Transposon ist das Gen, welches das Wachstum eines Mikroorganismus nicht beeinflusst und ist stattdessen hilfreich, um die Gen-Instabilität zu reduzieren. Darüber hinaus erleichtert es die Insertion eines fremden Gens selbst ohne eine spezifischen Zielstelle, und es kann ebenfalls in Serie gewonnen werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Mikroorganismus Corynebacterium sp. bereit, der eine verbesserte Lysinproduktivität aufweist, indem er mit dem Vektor zur Transformation transformiert ist.
  • Bei dieser Erfindung kann der Mikroorganismus, der Lysinproduktivität aufweist und der durch den Vektor zur Transformation der vorliegenden Erfindung transformiert werden kann, jeder der Mikroorganismen von Corynebacterium sp. sein. Beispielsweise ist der Mikroorganismus Corynebacterium sp., der für diese Erfindung verfügbar ist, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 oder Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539. Daneben sind die L-Aminosäure produzierenden Mutanten oder Stämme, die daraus erzeugt werden, z. B. Corynebacterium glutamicum KFCC10881, Corynebacterium glutamicum KFCC 11001 und Corynebacterium glutamicum KCCM 10770, ebenfalls verfügbar. Am meisten bevorzugt ist der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum KCCM 10770P.
  • In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung kann der Mikroorganismus Corynebacterium sp. durch den Vektor zur Transformation pDZTn-lscC/asd, pDZTndapA/dapB oder pDZTn-crk, welcher die in 2, 3 bzw. 4 gezeigte Restriktionskarte aufweist, transformiert sein. Der Vektor zur Transformation kann in den Mikroorganismus Corynebacterium sp. in einer Reihenfolge oder gleichzeitig eingefügt werden. Die Insertion des Vektors in das Chromosom kann durch ein Verfahren durchgeführt werden, das Fachleuten gut bekannt ist, wie etwa homologe Rekombination.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung von Lysin aus der Kulturlösung des Mikroorganismus Corynebacterium sp. bereit.
  • Die Kultivierung des Mikroorganismus Corynebacterium sp. zur Gewinnung von L-Lysin kann durch das herkömmliche Verfahren, das Fachleuten gut bekannt ist, durchgeführt werden. Beispielsweise kann die hier beschriebene Kultur durch „Fed batch”- oder wiederholtes „Fed batch”-Verfahren durchgeführt werden.
  • Das für die hier beschriebene Kultur verwendete Medium muss die Bedingungen erfüllen, die durch den spezifischen Stamm und ein erforderliches Verfahren gestellt werden. Das Kulurmedium für den Stamm Corynebacterium sp. ist gut bekannt (z. B. Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D. C., USA, 1981).
  • Beispielhaft für das verwendbare Glycogen sind Kohlenhydrate, wie etwa Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Stärke, Cellulose; Öl und Fett, wie etwa Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Rizinusöl und Kokosnussöl; Fettsäuren wie etwa Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure; Alkohol, wie etwa Glyzerin und Ethanol; und organische Säuren, wie etwa Essigsäure. Es kann eine dieser Verbindungen oder eine Mischung davon verwendet werden.
  • Beispielhaft für die verwendbare Stickstoffquelle ist eine solche organische Stickstoffquelle wie Pepton, Hefeextrakt, Fleischsaft (gravy), Malzextrakt, Flüssigkeit von gewässertem Getreide und Bohnenmehl, und eine solche anorganische Stickstoffquelle wie Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat. Es kann eine dieser Verbindungen oder eine Mischung davon als Stickstoffquelle verwendet werden.
  • Das hier beschriebenen Medium kann zusätzlich Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat und korrespondierende Natrium enthaltende Salze als Phosphatquelle enthalten. Das Medium kann auch ein Metallsalz, wie etwa Magnesiumsulfat oder Eisensulfat enthalten. Zusätzlich können auch Aminosäuren, Vitamine und geeignete Vorläufer zugegeben werden. Das Medium oder der Vorläufer kann der Kultur nach Art des Batch-Verfahrens oder kontinuierlich zugegeben werden. Der pH-Wert der Kultur kann während der Kultivierung durch Zugeben einer solchen Verbindung wie Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak, Phosphorsäure und Schwefelsäure eingestellt werden. Die Erzeugung von Luftblasen kann während der Kultivierung durch Verwendung eines Antischaummittels, wie etwa Fettsäurepolyglykolester, gehemmt werden. Um in der Kultur aerobe Bedingungen aufrecht zu erhalten, kann Sauerstoff oder Sauerstoff enthaltendes Gas (z. B. Luft) in die Kultur eingeleitet werden. Die Temperatur der Kultur beträgt vorzugsweise 20–45°C, stärker bevorzugt 25–40°C. Die Kultivierung kann fortgeführt werden, bis die Produktion von L-Aminosäuren ein gewünschtes Ausmaß erreicht, und die bevorzugte Kulturzeit beträgt 10–160 Stunden. Das L-Lysin wird in das Kulturmedium freigesetzt oder kann in den Zellen eingeschlossen sein.
  • Durchführbare und derzeit bevorzugte Ausführungen der vorliegenden Erfindung, wie in den folgenden Beispielen gezeigt, dienen der Veranschaulichung.
  • Allerdings wird anzuerkennen sein, dass Fachleute bei Berücksichtigung dieser Offenbarung Modifikationen und Verbesserungen vornehmen können, die dem Geist der vorliegenden Erfindung entsprechen und von deren Umfang umfasst sind.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Konstruktion des Vektors (pDZTn), in den ein Transposongen eingeführt ist, und Verfahren zur Gen-Insertion unter Verwendung des Vektors
  • Bei diesem Beispiel wurde ein pDZ-Vektor zur Insertion eines Chromosoms des Mikroorganismus Corynebacterium sp. als Basisvektor verwendet, um den Vektor pDZTn zu konstruieren, in den das Transposongen von Corynebacterium sp. eingeführt ist. Das Konstruktionsverfahren ist wie folgt.
  • Um das Transposongen zu erhalten, wurde die Nukleotidsequenzinformation über das Transposongen (NCBI-Zugangnummer NC_003450, NCgI1021) in der von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 stammenden Gesamtnukleotidsequenz von der NIH GenBank erhalten, und auf der Grundlage dieser Information wurden zwei Paare von Primern (Tabelle 1, SEQ ID. NO: 3 bis 6) synthetisiert.
  • Unter Verwendung der chromosomalen DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 als Matrize und unter Verwendung der Oligonukleotide als Primer, die durch SEQ ID. NO: 3 bis 6 dargestellt sind, wurde eine PCR durchgeführt. „PfuUltraTM high-confident DNA polymerase” (Stratagene) wurde als Polymerase verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: Denaturierung bei 96°C für 30 Sekunden, Annealing bei 58°C für 30 Sekunden, Polymerisation bei 72°C für eine Minute, und 30 Zyklen von der Denaturierung bis zur Polymerisation. Tabelle 1
    Figure 00090001
  • Als Ergebnis wurden zwei Paare von Transposongenen (Tn-A, Tn-B) mit einer ungefähr 500 bp langen Promotorregion erhalten. Tn-A (SEQ ID. NO 1) wurde unter Verwendung der Sequenzen als Primer, die durch SEQ ID. NO: 3 und 4 dargestellt werden, amplifiziert, während Tn-B (SEQ ID. NO: 2) unter Verwendung der Sequenzen als Primer, die durch SEQ ID. NO: 5 und 6 dargestellt werden, amplifiziert wurde. Die amplifizierten Produkte wurden in den pDZ-Vektor, der mit einem SalI-Restriktionsenzym vorbehandelt war, unter Verwendung des „BD in-Fusion kit” (BD) kloniert, was zu der Konstruktion des pDZTn-Vektors führte. Es gibt eine Reihe von Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, die künstlich während der Primer-Konstruktion zwischen die beiden amplifizierten Produkte eingefügt werden.
  • 1 ist ein Schaubild, welches den Corynebacterium Chromosomen-Insertionsvektor pDZTn veranschaulicht.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, der patentgeschützte, Lysin produzierende Stamm, wurde mit dem pDZTn-Vektor transformiert, der durch Einfügen des Zielgens (Tn-A und Tn-B) konstruiert wurde (unter Verwendung des Transformationsverfahrens nach Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541–545). Dann wurde der Stamm, der das Zielgen durch Genhomologie in das Chromosom eingefügt aufweist, aus dem Selektionsmedium, das 25 mg/l Kanamycin enthielt, isoliert. Die erfolgreiche Insertion des Vektors in das Chromosom wurde durch Beobachten, ob die Kolonie auf dem Festmedium, das X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) enthielt, blau gefärbt war, bestätigt. Der primäre Stamm mit dem eingefügten Chromosom wurde durch Schüttelkultur in einem Nährmedium kultiviert (30°C, 8 Stunden), wobei das Nährmedium dann 10–4 bis 10–10-fach verdünnt wurde, gefolgt durch Ausbringen auf das X-gal enthaltende Festmedium. Während die meisten Kolonien blau gefärbt waren, gab es einige Kolonien, die weiß waren. Diese wenigen weißen Kolonien wurden zur weiteren Selektion des Stamms, dessen in das Chromosom eingefügte Vektorsequenz durch sekundäres Crossover eliminiert war, ausgewählt.
  • Beispiel 2: Klonieren von lysC/asd, das von dem Lysin produzierenden Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P stammt, Konstruktion des rekombinanten Vektors (pDZTn-lysC/asd) und Entwicklung des Stamms mit dem eingefügten lysC/asd
  • Um das Gen lysC/asd, das von Corynebacterium glutamicum KCCM10770P stammt, zu erhalten, wurde die Nukleotidsequenzinformation von lysC/asd (NCBI-Zugangsnummer NC_003450, Ncgl0247~0248) von der NIH GenBank erhalten, auf deren Grundlage ein Paar von Primern (Tabelle 2, SEQ ID. NO: 7 und 8) synthetisiert wurde.
  • Unter Verwendung der chromosomalen DNA von Corynebacterium glutamicum KCCM10770P als Matrize und unter Verwendung der durch SEQ ID. NO: 7 und 8 dargestellten Oligonukleotide als Primer wurde eine PCR durchgeführt. „PfuUltraTM high-confident DNA polymerase” (Stratagene) wurde als Polymerase verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wir folgt: Denaturierung bei 96°C für 30 Sekunden, Annealing bei 52°C für 30 Sekunden, Polymerisation bei 72°C für drei Minuten, und 30 Zyklen von der Denaturierung bis zur Polymerisation. Tabelle 2
    Figure 00100001
  • Als Ergebnis wurde ein Gen lysC/asd mit einer 2.805 bp langen Promotorregion isoliert. Das amplifizierte Produkt wurde in einen pDZTn-Vektor, der mit SpeI und XhoI vorbehandelt war, unter Verwendung des „BD in-Fusion kit” kloniert, was zu der Konstruktion des rekombinanten Vektors pDZTn-lysC/asd führte. 2 ist ein Schaubild, welches den Corynebacterium Chromosomen-Insertionsvektor pDZTn-lysC/asd veranschaulicht.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, der patentgeschützte, Lysin produzierende Stamm, wurde mit dem konstruierten Vektor pDZTn-lysC/asd transformiert. Nach dem sekundären Crossover wurde eine Kopie des Gens lysC/asd zusätzlich zwischen Transposons in dem Chromosom eingefügt. Als Ergebnis wurde der Lysin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ1, der drei Kopien des Gens aufweist, gewonnen. Um den Stamm zu bestätigen, wurde eine PCR unter Verwendung von Primer 9 und Primer 10 (Tabelle 3) durchgeführt, was die Amplifikation der verbindenden Region zwischen dem Transposon und dem Gen lysC/asd erleichterte. Tabelle 3
    Figure 00110001
  • Beispiel 3: Klonierung von dapA/dapB, das von dem Lysin produzierenden Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P stammt, Konstruktion des rekombinanten Vektors (pDZTn-dapA/dapB) und Entwicklung des Stamms mit dem eingefügten dapA/dapB
  • Um das Gen dapA/dapB, das von Corynebacterium glutamicum KCCM10770P stammt, auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben zu erhalten, wurde die Nukleotidsequenzinformation von dapA/dapB (NCBI-Zugangsnummer NC_003450, Ncgl1896~1898) von der NIH GenBank erhalten. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass dapA zusammen mit dapB, zwischen denen sich ein ORF (Ncgl1987) befand, dessen Funktionen bisher noch nicht offenbart worden sind, ein Operon bildeten. Um das gesamte Gen dapB-ORF (Ncgl1897)-dapA mit dapB-Promotorregion zu amplifizieren, wurden deshalb zwei Paare von Primern (Tabelle 4, SEQ ID. NO: 11 bis 12) synthetisiert.
  • Unter Verwendung der chromosomalen DNA von Corynebacterium glutamicum KCCM10770P als Matrize und unter Verwendung der durch SEQ ID. NO: 11 bis 12 dargestellten Oligonukleotide als Primer wurde eine PCR durchgeführt. „PfuUltraTM high-confident DNA polymerase” (Stratagene) wurde als Polymerase verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: Denaturierung bei 96°C für 30 Sekunden, Annealing bei 52°C für 30 Sekunden, Polymerisation bei 72°C für drei Minuten, und 30 Zyklen von der Denaturierung bis zur Polymerisation. Tabelle 4
    Figure 00120001
  • Als Ergebnis wurde das Gen dapA/dapB mit einer 3.210 bp langen Promotorregion isoliert. Das amplifizierte Produkt wurde in einen pDZTn-Vektor, der mit SpeI und XhoI vorbehandelt war, unter Verwendung des „BD in-Fusion kit” kloniert, was zu der Konstruktion des Rekombinationsvektors pDZTn-dapA/dapB führte.
  • 3 ist ein Schaubild, das den Corynebacterium Chromosomen-Insertionsvektor pDZTn-dapA/dapB veranschaulicht.
  • Der in Beispiel 2 gewonnene Lysin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ1 wurde mit dem konstruierten Vektor pDZTn-dapA/dapB transformiert. Nach dem sekundären Crossover wurde eine Kopie des Gens dapA/dapB zusätzlich zwischen Transposons in dem Chromosom eingefügt. Als Ergebnis wurde der Lysin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ2, der drei Kopien des Gens aufwies, gewonnen. Um den Stamm zu bestätigen, wurde eine PCR unter Verwendung von Primer 9 und Primer 13 (Tabelle 5) durchgeführt, was die Amplifikation der verbindenden Region zwischen dem Transposon und dem Gen dapA/dapB erleichterte.
  • Der Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ2 wurde bei dem „Korean Culture Center of Microorganisms”, einer international anerkannten Hinterlegungsstelle mit der Adresse 361-221, Hongje-1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea, am 31. März 2008 unter der Zugangsnummer KCCM10939P hinterlegt. Tabelle 5
    Figure 00130001
  • Beispiel 4: Klonierung von srk, dass von Clostridium acetobutylicum stammt, Konstruktion des rekombinanten Vektors (pDZTn-srk) und Entwicklung des Stamms mit dem eingefügten srk
  • Die Nukleotidsequenz des Fructokinasegens, das von Clostridium acetobutylicum ATCC 824 stammt, ist gut bekannt gewesen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung erhielten die Gen-Information über die Fructokinase, die von Clostridium acetobutylicum ATCC 824 stammt, von der NIH GenBank (Zugangsnummer NP_347064). Es wurde ein Paar von Primern (Tabelle 6, SEQ ID. NO: 14 und 15) gemäß der erhaltenen Nukleotidsequenz synthetisiert. Unter Verwendung der chromosomalen DNA von Clostridium acetobutylicum ATCC 824 als Matrize wurde eine PCR durchgeführt, um das Gen zu amplifizieren. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Annealing bei 52°C für 20 Sekunden, Polymerisation bei 72°C für eine Minute und 10 Sekunden, und 30 Zyklen von der Denaturierung bis zur Polymerisation. Tabelle 6
    Figure 00130002
  • Als Ergebnis wurde das Gen srk mit einer 1.200 bp langen Promotorregion isoliert. Das amplifizierte Produkt wurde in einen pDZTn-Vektor, der mit SpeI und XhoI vorbehandelt war, unter Verwendung des „BD in-Fusion kit kloniert”, was zu der Konstruktion des Re kombinationsvektors pDZTn-srk führte. 4 ist ein Schaubild, das den Corynebacterium Chromosomen-Insertionsvektor pDZTn-srk veranschaulicht.
  • Der patentgeschützte, Lysin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P wurde mit dem konstruierten Vektor pDZTn-srk transformiert. Nach dem sekundären Crossover wurde eine Kopie des Gens srk zwischen Transposons in dem Chromosom eingefügt. Als Ergebnis wurde der Lysin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ3 gewonnen. Um den Stamm zu bestätigen, wurde unter Verwendung von Primer 9 und Primer 16 (Tabelle 7) eine PCR durchgeführt, was die Amplifikation der verbindenden Region zwischen dem Transposon und dem Gen srk erleichterte. Tabelle 7
    Figure 00140001
  • Beispiel 5: Messung der Aspartatkinaseaktivität des Stamms mit dem mehrfach eingefügten L-Lysin-Biosynthese-Gens
  • Die Aspartatkinaseaktivität des L-Lysin produzierenden Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ2 wurde unter Verwendung von Aspartylhydroxamat (Pecher J-F, Capony J-P (1968) On the colorimetric determination of acyl phosphates. Anal Biochem 22: 536–539) gemessen. Als Ergebnis zeigte Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ2 eine um das 2,1-fach höhere Aspartatkinaseaktivität als der Mutterstamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P. Tabelle 8
    Aktivität Steigerungsfaktor
    KCCM10770P 26,77 1-fach
    KCCM10770P-CJ2 56,25 2,1-fach
  • Beispiel 6: Messung der Fructokinaseaktivität des Stamms mit dem eingefügten Gen srk
  • Durch die bekannte Methode (Adreas Pikis et al., Microbiology, 148, 843–852 (2002)) wurde untersucht, ob Fructokinase in den Zellen aufgrund des Fructokinase-Expressionsvektors exprimiert wurde und ob eine Fructokinaseaktivität vorhanden war oder nicht. Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ3 wurde in LB für einen Tag kultiviert, gefolgt durch Zentrifugation, um die Zellen zu erhalten. Die erhaltenen Zellen wurden in einem geeigneten Puffer suspendiert, gefolgt durch Ultraschallbehandlung bis zur Lyse der Zellen. Es wurde eine Ultrazentrifugation durchgeführt, um einen Überstand zu erhalten. Der erhaltene Überstand wurde mit der Reaktionslösung, die Fructose, Phosphoglucose, Isomerase, Glucose-6-Phosphat-Dihydrogenase, ATP und NADP+ enthielt, reagieren gelassen. Das erzeugte NADPH wurde durch Messen bei OD340 mit einem Spektralphotometer quantifiziert, woraus die Fructokinaseaktivität indirekt berechnet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt. Wie in Tabelle 11 gezeigt, zeigte Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ3 eine Fructokinaseaktivität, die mindestens doppelt so hoch war wie die Aktivität des Mutterstamms Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, was nahe legt, dass das Fructokinasegen darin exprimiert wurde. Tabelle 9
    Teststamm KCCM10770P KCCM10770P-CJ3
    Aktivitäta 5,14 12,13
    • anmol (erzeugtes Fructose-6-phosphat) min–1mg (Protein)–1
  • Beispiel 7: Produktion von L-Lysin in dem Stamm mit dem mehrfach eingefügten L-Lysin-Biosynthese-Gen
  • Der in Beispiel 3 gewonnene L-Lysin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ2 wurde für die Produktion von L-Lysin wie folgt kultiviert.
  • Das Medium in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen (corner-baffled flask), der 25 ml eines Aussaatkulturmediums enthielt, wurde mit Corynebakterium glutamicum KCCM10770P-CJ2 bzw. dem Mutterstamm Corynebacterium glutamicum KCCM10770P beimpft, gefolgt durch eine Schüttelkultur bei 30°C für 20 Stunden mit 200 Upm. Das Medi um in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, der 24 ml Produktionsmedium enthielt, wurde mit 1 ml des Aussaatkulturmediums beimpft, gefolgt durch Schüttelkultur bei 30°C für 120 Stunden mit 200 Upm.
  • Nach Beendigung der Kultur wurde die L-Lysin-Produktion durch ein HPLC-Verfahren gemessen. Die Mengen an L-Lysin in den Kulturlösungen von Corynebakterium glutamicum KCCM10770P und Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ2 werden in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10
    Stamm Lysin (g/l)
    Batch 1 Batch 2 Batch 3
    KCCM10770P 46,1 45,8 45,4
    KCCM10770P-CJ2 51,8 51,2 51,7
    • Saatkulturmedium (pH 7,0): Rohzucker 20 g, Pepton 10 g, Hefeextrakt 5 g, Harnstoff 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0,5 g, Biotin 100 μg, Thiamin-HCl 1000 μg, Calcium-Pantothenat 2000 μg, Nicotinamid 2000 μg (in 1 l destilliertem Wasser).
    • Produktionsmedium (pH 7,0): Glucose 100 g, (NH4)2SO4 40 g, Sojabohnenprotein 2,5 g, Feststoffe von gewässertem Getreide 5 g, Harnstoff 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0,5 g, Biotin 100 μg, Thiamin-Hydrochlorid 1000 μg, Calcium-Pantothenat 2000 μg, Nicotinamid 3000 μg, CaCO3 30 g (in 1 l destilliertem Wasser).
  • Wie in Tabelle 10 gezeigt, war die Lysinproduktion durch Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ2, bei dem zwei Lysin-Biosynthesegene eingefügt waren, um 10% gegenüber der des Mutterstamms KCCM10770P gesteigert.
  • Fachleute werden anerkennen, dass die Konzepte und speziellen Ausführungen, die in der vorangehenden Beschreibung offenbart werden, leicht als Grundlage zum Modifizieren oder Entwerfen anderer Ausführungen zum Ausführen der gleichen Zwecke wie die der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Fachleute werden ebenfalls anerkennen, dass solche gleichartigen Ausführungen sich nicht vom Geist und Umfang der Erfindung, wie in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt, entfernen.
  • Zusammenfassung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Vektor zur Transformation unter Verwendung eines Transposongens, auf einen Mikroorganismus, der mit dem Vektor transformiert ist, und auf ein Verfahren zur Gewinnung von Lysin unter Verwendung des Mikroorganismus.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (10)

  1. Vektor zur Transformation, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Transposongen und eine Multicloning-Stelle aufweist, die von einem Mikroorganismus Corynebacterium sp. stammen.
  2. Vektor zur Transformation nach Anspruch 1, wobei das Transposongen die Nukleotidsequenzen aufweist, die durch SEQ ID. NO: 1 oder SEQ ID. NO: 2 dargestellt werden.
  3. Vektor zur Transformation nach Anspruch 1, wobei eines oder mehrere Gene, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus dem Gen lysC, das Aspartatkinase kodiert, dem Gen asd, das Aspartatsemialdehyddihydrogenase kodiert, dem Gen dapA, das Dihydrodipicolinatsynthase kodiert, und dem Gen dapB, das Dihydropicolinatreduktase kodiert, die von dem Mikroorganismus Corynebacterium sp. stammen, in die Multicloning-Stelle eingefügt ist.
  4. Vektor zur Transformation nach Anspruch 1, wobei das Gen srk, das eine fremde Fructokinase kodiert, zusätzlich in die Multicloning-Stelle eingefügt ist.
  5. Vektor zur Transformation nach Anspruch 4, wobei das Gen srk von Clostridium acetobutylicum ATCC 824 stammt.
  6. Corynebacterium glutamicum mit L-Lysin-Produktivität, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus mit einem Vektor zur Transformation nach einem der Ansprüche 1 bis 5 transformiert ist.
  7. Corynebacterium glutamicum mit L-Lysin-Produktivität nach Anspruch 6, wobei der transformierte Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum KCCM10770P ist.
  8. Corynebacterium glutamicum nach Anspruch 6, wobei der transformierte Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum KCCM10770P-CJ2 (Zugangsnummer: KCCM10939P) ist.
  9. Corynebacterium glutamicum mit L-Lysin-Produktivität nach Anspruch 6, wobei das Gen, das in die Multiclonig-Stelle des Vektors zur Transformation eingefügt ist, in das Chromosom durch sekundäres Crossover integriert ist.
  10. Verfahren zum Produzieren von L-Lysin, das die Schritte eines Kultivierens eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 6 bis 9, um L-Lysin in den Zellen oder der Kultur zur produzieren, und eines Gewinnens von Lysin aus den Zellen oder aus der Kultur umfasst.
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