DE60032046T2

DE60032046T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure

Info

Publication number: DE60032046T2
Application number: DE60032046T
Authority: DE
Inventors: Ajinomoto Co. Eiichiro Kawasaki-ku Kawasaki-shi Kimura; Ajinomoto Co. Tsuyoshi Kawasaki-ku Kawasaki-shi Nakamatsu; Ajinomoto Co. Osamu Kawasaki-ku Kawasaki-shi Kurahashi; Ajinomoto Co. Hiromi Kawasaki-ku Kawasaki-shi Ohtaki
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-03-25
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2020-03-25
Also published as: EP1038970A2; EP1038970A3; ATE346948T1; PE20001595A1; JP4061769B2; JP2000270872A; CN1271018A; DE60032046D1; EP1038970B1; BR0001421A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein L-Glutaminsäure-erzeugendes Bakterium und ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter Verwendung des Bakteriums. L-Glutaminsäure ist eine Aminosäure, die für Lebensmittel, medizinische Versorgung usw. wichtig ist.
VERWANDTER STAND DER TECHNIK
Bisher wurde L-Glutaminsäure durch ein Fermentationsverfahren unter Verwendung von coryneformen L-Glutaminsäure-erzeugenden Bakterien, die zu der Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, S. 195–215, 1986) gehören, hergestellt. Als solch coryneformen Bakterien werden wilde Stämme, die aus der Natur isoliert wurden, oder Mutanten davon verwendet, um die Produktivität zu verbessern.
Darüber hinaus wurden auch verschiedene Techniken für die Förderung der L-Glutaminsäure-erzeugenden Fähigkeit durch Verstärkung von Genen für Enzyme, die in das biosynthetische L-Glutaminsäure-System involviert sind, durch rekombinante DNA-Techniken offenbart. Z.B. offenbart die japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 63-214198 eine Technik für die Steigerung der L- Glutaminsäure-erzeugenden Fähigkeit durch Verstärkung eines Glutamatdehydrogenasegens, Isocitratdehydrogenasegens, Aconitathydratasegens und Citratsynthasegens.
Auf der anderen Seite war, wie für L-Threonin, eine Unterbrechungstechnik eines Aufnahmesystems der Aminosäure bekannt, um die Erzeugung der Aminosäure zu steigern (Okamoto, K. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61 (11), 1877–1882 (1997)).
Für L-Glutaminsäure war die Struktur des Genclusters des Aufnahmesystems für L-Glutaminsäure (gluABCD-Operon) in Corynebacterium glutamicum bekannt (Kronemeyer, W. et al., J. Bacteriol., 177 (5), 1152–1158 (1995)). Darüber hinaus stellten Kronemeyer et al. einen Stamm her, in dem das L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem, das durch das gluABCD-Operon kodiert wurde, deletiert war, und untersuchten die Ausscheidung der L-Glutaminsäure unter Verwendung diese Stammes. Bei dieser Studie kamen sie zu dem Schluss, dass die Ausscheidung von L-Glutaminsäure von Corynebacterium glutamicum nicht von gluABCD abhing und von anderen Aufnahme- und Ausscheidungsmechanismen abhing. Darüber hinaus wurde auch über ein anderes Aufnahmesystem von L-Glutaminsäure als das, das durch gluABCD kodiert wird, berichtet (Burkovski, A. et al., FEMS Microbiology Letters, 136, 169–173 (1996)). Diese Berichte legen nahe, dass die Akkumulationsmenge von L-Glutaminsäure in dem Medium nicht beeinträchtig wird, sogar wenn mindestens das L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem, das durch das gluABCD-Operon kodiert wird, deletiert wird. Daher wurde nicht versucht, die L-Glutaminsäure-erzeugende Fähigkeit durch Unterbrechung des Aufnahmesystems von L-Glutaminsäure, das durch gluABCD kodiert wird, zu verbessern.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Bakterienstamm mit einer hohen L-Glutaminsäure-erzeugenden Fähigkeit zu züchten und dadurch ein Verfahren für eine effizientere Herstellung von L-Glutaminsäure bei niedrigen Kosten bereitzustellen, um auf den weiteren Anstieg bei der Nachfrage nach L-Glutaminsäure zu antworten.
Um die zuvor erwähnte Aufgabe zu erreichen, untersuchten die Erfinder der vorliegenden Erfindung gewissenhaft. Als ein Ergebnis fanden sie heraus, dass ein L-Glutaminsäure-erzeugendes Bakterium von coryneformen Bakterien, deren gluABCD-Operon deletiert war, eine hohe L-Glutaminsäure-erzeugende Fähigkeit besaßen, was zu dem Vorschlag des zuvor erwähnten früheren Fachwissens im Gegensatz steht, und erreichten so die vorliegende Erfindung.
Das bedeutet, die vorliegende Erfindung stellt das folgende bereit.

(1) Ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, umfassend die Schritte der Kultivierung eines coryneformen Bakteriums, das eine L-Glutaminsäure-erzeugende Fähigkeit besitzt, in einem Medium, um L-Glutaminsäure in dem Medium zu erzeugen und zu akkumulieren, und Sammeln der L-Glutaminsäure aus dem Medium, wobei ein L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem in dem coryneformen Bakterium deletiert oder vermindert wird.
(2) Das Verfahren gemäß (1), wobei das L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem durch das gluABCD-Operon kodiert wird.
(3) Das Verfahren gemäß (2), wobei mindestens eines der Expressionsprodukte des gluABCD-Operons in dem coryneformen Bakterium deletiert ist.
(4) Das Verfahren gemäß (3), wobei mindestens gluA in dem coryneformen Bakterium deletiert ist.
(5) Das Verfahren gemäß (4), wobei sowohl gluA, wie auch gluB, gluC und gluD in dem coryneformen Bakterium deletiert sind.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann L-Glutaminsäure in einem Medium erzeugt werden, das hohe Konzentrationen von L-Glutaminsäure in einem höheren Ertrag als im Vergleich mit konventionellen Techniken enthält.
Für die vorliegende Erfindung bezeichnet der Begriff "L-Glutaminsäure-erzeugende Fähigkeit" eine Fähigkeit eines coryneformen Bakteriums, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um L-Glutaminsäure in einem Medium zu akkumulieren, wenn das Bakterium in dem Medium kultiviert wird.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detailliert erklärt werden.
Das coryneforme Bakterium, das für die vorliegende Erfindung verwendet wird, ist ein coryneformes Bakterium mit einer L-Glutaminsäure-erzeugenden Fähigkeit, in dem ein L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem deletiert oder vermindert ist.
Bakterien, die zu der Gattung Corynebacterium gehören, auf die hier Bezug genommen wird, sind eine Gruppe von Mikroorganismen, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, S. 599 (1974) definiert werden.
Die Bakterien sind aerob, Gram-positiv, nichtsäurefeste Bazillen, die nicht die Fähigkeit der Sporenbildung besitzen und beinhalten Bakterien, die als Bakterien klassifiziert wurden, die zu der Gattung Brevibacterium gehören, die aber nun in der Gattung Corynebacterium vereinheitlicht wurden [siehe Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (19981)], und beinhalten auch Bakterien der Gattung Brevibacterium und Microbacterium, die mit der Gattung Corynebacterium nahe verwandt sind. Beispiele für coryneforme Bakterien, die für die Erzeugung von L-Glutaminsäure bevorzugt verwendet werden, beinhalten die folgenden.
Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
Corynebacterium alkanolyticum
Corynebacterium callunae
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium melassecola
Corynebacterium thermoaminogenes
Corynebacterium herculis
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium immariophilum
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium roseum
Brevibacterium saccarolyticum
Brevibacterium thiogenitalis
Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes)
Brevibacterium album
Brevibacterium cerinum
Microbacterium ammoniaphilum
Spezifischer werden die folgenden Stämme dieser Bakterien beispielhaft dargestellt:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511
Corynebacterium callunae ATCC15991
Corynebacterium glutamicum ATCC13020, 13032, 13060
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC15990
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 FERM BP-1539
Corynebacterium herculis ATCC13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13826, ATCC14067
Brevibacterium immariophilum ATCC14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13665, ATCC13869
Brevibacterium roseum ATCC13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240
Corynebacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes) ATCC6871
Brevibacterium album ATCC15111
Brevibacterium cerinum ATCC15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354
Die zuvor erwähnte Deletion oder Verminderung eines L-Glutaminsäure-Aufnahmesystems der coryneformen Bakterien kann durch Mutation oder Unterbrechung eines Gens, das das Aufnahmesystem kodiert, unter Verwendung einer Mutagenesebehandlung oder einer genetischen Rekombinationstechnik erreicht werden. Die Bezeichnung "das L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem wird deletiert oder vermindert" bedeutet, dass das Aufnahmesystem dazu gebracht wird, nicht normal zu funktionieren, und sie beinhaltet, dass zumindest eines der Proteine, das das Aufnahmesystem bildet, deletiert oder die Aktivität des Proteins vermindert wird, und das zwei oder mehr der Proteine deletiert oder die Aktivitäten der Proteine vermindert werden. Darüber hinaus beinhaltet die Bezeichnung "ein Protein wird deletiert", wie sie hier verwendet wird, sowohl einen Fall, bei dem das Protein überhaupt nicht exprimiert wird, wie auch einen Fall, bei dem ein Protein, das nicht normal funktioniert, exprimiert wird.
Das Gen, das das L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem kodiert, kann durch Gensubstitution unter Verwendung homologer Rekombination unterbrochen werden. Ein Gen auf einem Chromosom eines coryneformen Bakteriums kann durch Transformation des coryneformen Bakteriums mit DNA, die ein Gen enthält, das durch Deletion seiner inneren Sequenz modifiziert wurde (Deletionstypgen), unterbrochen werden, so dass das Aufnahmesystem nicht normal funktionieren sollte, um die Rekombination zwischen dem Deletionstypgen und einem normalen Gen auf dem Chromosom hervorzurufen. Eine solche Genunterbrechung unter Verwendung homologer Rekombination wurde bereits etabliert und es waren Verfahren bekannt, die dafür lineare DNA, Plasmid, das einen Temperatur-empfindlichen Replikationsursprung enthält, usw. verwenden. Ein Verfahren, das ein Plasmid verwendet, das einen Temperatur-empfindlichen Replikationsursprung enthält, wird bevorzugt.
Als ein Gen, das ein L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem kodiert, war das gluABCD-Operon bekannt (Kronemeyer, W., et al., J. Bacteriol., 177 (5), 1152–1158 (1995)). Darüber hinaus war auch ein anderes L-Glutaminsäure-Aufnahmesytem als dasjenige, das durch das gluABCD-Operon kodiert wird, bekannt (Burkovski, A. et al., FEMS Microbiology Letters, 136, 169–173 (1996)). Obwohl irgendeines dieser Gene unterbrochen werden kann, wird es vorgezogen, dass das Aufnahmesystem, das durch das gluABCD-Operon kodiert wird, unterbrochen wird.
Da die Nucleotidsequenz dieses Operons bekannt war (GenBank/EMBL/DDBJ Accession X81191), kann dieses Operon oder jedes strukturelle Gen in dem gluABCD-Operon von der chromosomalen DNA von coryneformen Bakterien durch PCR unter Verwendung von Primern, die basierend auf der Nucleotidsequenz hergestellt werden, isoliert werden. Von dem so erhaltenen Genfragment kann mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen ein bestimmter Bereich ausgeschnitten werden und es kann zumindest ein Teil der Kodierungsregion oder eine Expressionskontrollsequenz, wie ein Promotor, deletiert werden, um ein Deletionstypgen herzustellen.
Weiter kann ein Deletionstypgen auch durch Durchführung von PCR unter Verwendung von Primern, die so konstruiert sind, dass ein Teil eines Gens deletiert werden sollte, erhalten werden. Z.B. kann unter Verwendung der Primer mit den Nucleotidsequenzen, die als SEQ ID Nr. 1 und 2 im Sequenzprotokoll gezeigt werden, ein gluD-Gen mit einer Deletion eines Teiles der 5'-Sequenz erhalten werden. Weiter kann unter Verwendung der Primer mit den Nucleotidsequenzen, die als SEQ ID Nr. 3 und 4 gezeigt werden, ein gluA-Gen mit einer Deletion eines Teiles der 3'-Sequenz erhalten werden. Wenn die Gensubstitution unter Verwendung des Deletionstyp-gluA-Gens oder -gluD-Gens, die unter Verwendung dieser Primer erhalten werden, durchgeführt wird, kann das gluA-Gen oder das gluD-Gen unterbrochen werden. Weiter können, wenn dieses Deletionstyp-gluA-Gen und Deletionstyp-gluD-Gen verbunden werden, und das erhaltene Fusionsgen für die Gensubstitution verwendet wird, alle von gluA, gluB, gluC und gluD unterbrochen werden. Darüber hinaus kann, wenn die PCR unter Verwendung eines Plasmids, das ein gluA-Gen enthält, das unter Verwendung von Primern mit den Nucleotidsequenzen, die als SEQ ID Nrn. 3 und 5 gezeigt werden, als eine Matrize und Primern mit den Nucleotidsequenzen, die als SEQ ID Nrn. 6 und 7 gezeigt werden, erhalten wurde, durchgeführt wird, und das Amplifikationsprodukt zyklisiert wird, ein Plasmid erhalten werden, das ein gluA-Gen enthält, das eine Deletion einer inneren Sequenz und eine Verbindung der 5'-Region und 3'-Region, ligiert in-frame, einschließt. Wenn die Gensubstitution unter Verwendung dieses Plasmids durchgeführt wird, kann nur das gluA-Gen unterbrochen werden.
Darüber hinaus können auch andere Primer, als diejenigen, die oben beispielhaft dargestellt werden, durch die Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, konstruiert werden und es kann ein zufälliges Strukturgen in dem gluABCD-Operon unter Verwendung solcher Primer unterbrochen werden. Alternativ kann das Aufnahmesystem durch Deletion einer Expressionskontrollsequenz des gluABCD-Operons, wie z.B. einem Promotor, deletiert werden, so dass das Gen nicht exprimiert werden kann.
Während die Gensubstitution des gluABCD-Genclusters (im folgenden einfach als "gluABCD-Gen" bezeichnet) unten erklärt werden wird, kann ein zufälliges Strukturgen oder eine Expressionskontrollsequenz ähnlich deletiert werden.
Das gluABCD-Gen auf einem Wirt-Chromosom kann mit einem Deletionstyp-gluABCD-Gen wie folgt ersetzt werden. Das bedeutet, eine rekombinante DNA wird durch Insertion eines Temperatur-empfindlichen Replikationsursprunges, eines Deletionstyp-gluABCD-Gens und eines Markergens, das Widerstandsfähigkeit gegenüber einem Medikament, wie Chloramphenicol, Tetracyclin und Streptomycin, exprimiert, konstruiert und ein coryneformes Bakterium wird mit dieser rekombinanten DNA transformiert. Dann wird der transformierte Stamm bei einer Temperatur kultiviert, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung nicht funktioniert und dann in einem Medium kultiviert, das ein korrespondierendes Medikament enthält, um einen Transformantenstamm zu erhalten, in dem die rekombinante DNA in die chromosomale DNA integriert ist.
Bei einem solchen Stamm, bei dem eine rekombinante DNA, wie oben beschrieben, in ein Chromosom integriert ist, wurde die Rekombination der gluABCD-Gensequenz, die ursprünglich auf dem Chromosom vorlag, hervorgerufen und zwei Fusionsgene des chromosomalen gluABCD-Gens und des Deletionstyp-gluABCD-Gens werden in das Chromosom inseriert, zwischen denen die anderen Teile der rekombinanten DNA (der Vektoranteil, der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung und ein Medikamenten-Widerstandsfähigkeitsmarker) vorliegen. Daher exprimiert der Transformantenstamm, da das normale gluABCD-Gen in diesem Zustand dominant ist, das L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem.
Dann wird, um nur das Deletionstyp-gluABCD-Gen auf der chromosomalen DNA übrig zu lassen, eine Kopie des gluABCD-Gens aus der chromosomalen DNA zusammen mit dem Vektoranteil (einschließlich Temperatur-empfindlichen Replikationsursprung und Medikamenten-Widerstandsmarker) durch Rekombination der zwei gluABCD-Gene eliminiert. Bei der Rekombination kann das normale gluABCD-Gen auf der chromosomalen DNA verbleiben und das Deletionstyp-gluABCD-Gen kann ausgeschnitten werden oder das Deletionstyp-gluABCD-Gen kann auf der chromosomalen DNA verbleiben und das normale gluABCD-Gen kann ausgeschnitten werden. In beiden Fällen wird die ausgeschnittene DNA auf dem Plasmid in einer Zelle zurückgehalten, wenn die Zelle bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung funktioniert. Solche DNA auf dem Plasmid wird aus der Zelle eliminiert, wenn die Zelle bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung nicht funktioniert. Es kann bestätigt werden, welche Gene auf der chromosomalen DNA zurückbleiben, indem die Struktur des gluABCD-Gens auf dem Chromosom durch PCR, Hybridisierung oder dgl. untersucht wird.
Wenn solch ein gluABCD-Gen-unterbrochener Stamm, der wie oben beschrieben hergestellt wurde, bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung funktioniert (z.B. bei niedriger Temperatur), wird das gluABCD-Gen in seiner Zelle zurückgehalten werden. Wenn er bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung nicht funktioniert (z.B. bei erhöhter Temperatur), wird das gluABCD-Gen aus der Zelle eliminiert werden.
Beispiele für das Plasmid, das einen Temperatur-empfindlichen Replikationsursprung aufweist, der in coryneforme Bakterienzellen funktioniert, beinhalten pHS4, pHSC4, pHS22, pHSC22, pHS23, pHSC23 (für diese, siehe japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 7-108228) usw. Diese Temperatur-empfindlichen Plasmide können bei einer Temperatur von ungefähr 10 bis 32°C autonom replizieren, aber können bei einer Temperatur von ungefähr 34°C oder mehr in einer coryneformen Bakterienzelle nicht autonom replizieren.
Nachdem das gluABCD-Gen auf dem Chromosom, wie oben beschrieben, unterbrochen wurde, wird der Gen-unterbrochene Stamm vorzugsweise mit recA^– eingeführt, da eine solche Einführung von recA^– verhindert, dass das gluABCD-Gen auf dem Plasmid wieder in das Chromosom während der Kultivierung bei niedriger Temperatur integriert wird.
Das coryneforme Bakterium, das für die vorliegende Erfindung verwendet wird, kann eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms für die Katalysierung der Biosynthese von L-Glutaminsäure zusätzlich zu der Deletion oder der Verminderung des L-Glutaminsäure-Aufnahmesystems aufweisen. Veranschaulichende Beispiele des Enzyms für die Katalysierung der Biosynthese von L-Glutaminsäure beinhalten Glutamatdehydrogenase, Glutaminsynthetase, Glutamatsynthase, Isocitratdehydrogenase, Aconitrathydratase, Citratsynthase, Pyruvatcarboxylase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Phosphoenolpyruvatsynthase, Enolase, Posphoglyceromutase, Phosphoglyceratkinase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Fructosebisphosphataldolase, Phosphofructokinase, Glucosephosphatisomerase und dgl.
Weiter kann bei dem coryneformen Bakterium, das für die vorliegende Erfindung verwendet wird, ein Enzym, das eine Reaktion für die Erzeugung einer anderen Verbindung als L-Glutaminsäure durch Abzweigung von dem Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure katalysiert, vermindert oder deletiert werden. Veranschaulichende Beispiele für das Enzym, das eine Reaktion für die Erzeugung einer anderen Verbindung als L-Glutaminsäure durch Abzweigung von dem Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure katalysiert, beinhalten α-Ketoglutaratdehydrogenase, Isocitratlyase, Phosphatacetyltransferase, Acetatkinase, Acetohydroximatsynthase, Acetolactatsynthase, Formatacetyltransferase, Lactatdehydrogenase, Glutamatdecarboxylase, 1-Pyrrolindehydrogenase und dgl.
Darüber hinaus wird das Bakterium durch Einführung einer thermosensitiven Mutation für eine Biotin-Aktivitäts-inhibierende Substanz, wie oberflächenaktive Wirkstoffe, in ein coryneformes Bakterium mit L-Glutaminsäure-erzeugender Fähigkeit in die Lage versetzt, L-Glutaminsäure in einem Medium, das eine Überschussmenge an Biotin enthält, in der Abwesenheit einer Biotin-Aktivitäts-inhibierenden Substanz zu erzeugen (siehe WO 96/06180). Als ein solches coryneformes Bakterium kann der Brevibacterium lactofermentum AJ13029-Stamm, der in WO 96/06180 offenbart wird, erwähnt werden. Der AJ13029-Stamm wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology am 2. September 1994 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-14501. Dann wurde er in eine internationale Hinterlegung unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 1. August 1995 transferiert und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-5189.
Wenn ein coryneformes Bakterium mit einer L-Glutaminsäure-erzeugenden Fähigkeit, in dem das L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem deletiert oder vermindert ist, in einem geeigneten Medium kultiviert wird, wird L-Glutaminsäure in dem Medium akkumuliert. Wegen der Deletion oder Verminderung des L-Glutaminsäure-Aufnahmesystems in dem coryneformen Bakterium, das für die vorliegende Erfindung verwendet wird, wird verhindert, dass die L-Glutaminsäure, die aus der Zelle sezerniert wird, wieder in die Zelle aufgenommen wird. Als ein Ergebnis wird die Akkumulierungsmenge der L-Glutaminsäure in dem Medium gesteigert. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine Verbesserung des Intervallertrages (Verhältnis der Akkumulierungsmenge der L-Glutaminsäure zu dem Verbrauch an Sacchariden in einem bestimmen Kultivierungszeitraum) erwartet werden, wenn die L-Glutaminsäurekonzentration in dem Medium besonders hoch wird. Besonders wenn ein hochproduktiver Stamm, der eine hohe L-Glutaminsäurekonzentration in einem Medium während der Fermentation zeigt, verwendet wird, kann ein merkbarer Effekt erhalten werden.
Das Medium, das für die Erzeugung von L-Glutaminsäure durch Verwendung des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein gewöhnliches Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Spurenelemente, wie erforderlich, enthält. Als die Kohlenstoffquelle ist es möglich, Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Stärkehydrolysat und Melasse oder dgl.; Alkohole, wie Ethanol, Inositol oder organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure oder dgl. zu verwenden.
Als die Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Ammoniak, organischer Stickstoff, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser und Sojabohnenhydrolysate, Ammoniakgas, wässriges Ammoniak und usw. verwendet werden.
Als anorganische Ionen (oder Quellen davon) werden in einer kleinen Menge Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen usw. zugegeben. Als organische Mikronährstoffe ist es erwünscht, erforderliche Substanzen, wie Vitamin B1, Hefeextrakt usw. in einer passenden Menge, wie erforderlich, zuzugeben.
Die Kultur wird vorzugsweise unter einer aeroben Bedingung durchgeführt, was durch Schütteln, Rühren für die Belüftung oder dgl. für 16 bis 72 Stunden erreicht wird. Die Kulturtemperatur wird so kontrolliert, dass sie bei 30°C bis 45°C liegt und der pH wird kontrolliert, dass er bei 5 bis 9 während der Kultivierung liegt. Für eine solche Einstellung des pHs können anorganische oder organische saure oder alkalische Substanzen, Ammoniakgas und dgl. verwendet werden.
Das Sammeln von L-Glutaminsäure aus der Fermentationsbrühe kann z.B. durch Verfahren erreicht werden, die Ionenaustauschharz, Kristallisierung und usw. verwenden. Insbesondere kann L-Glutaminsäure durch ein Anionenaustauschharz adsorbiert oder isoliert oder durch Neutralisation kristallisiert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Schema der Konstruktion eines Plasmids pTΔAD für die Unterbrechung des gluABCD-Gens.
2 zeigt das Schema der Konstruktion eines Plasmids pTΔA für die Unterbrechung von gluA.
BESTES VERFAHREN FÜR DIE DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird weiter spezifisch im folgenden mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt werden.
<1> Konstruktion eines Plasmids für die Unterbrechung von gluABCD-Gen
Um einen gluABCD-Gen-unterbrochenen Stamm eines coryneformen Bakteriums durch homologe Rekombination unter Verwendung eines Temperatur-empfindlichen Plasmids zu erzeugen, wurde ein Plasmid für die Unterbrechung des gluABCD-Gens konstruiert.
Zuerst wurde ein Deletionstyp-gluABCD-Gen durch Klonen eines gluD-Gens mit einer Deletion der 5'-Sequenz und Ligation davon mit einem gluA-Gen mit einer Deletion der 3'-Sequenz konstruiert. Spezifisch wurde ein Fragment von ungefähr 300 bp von einem in gluD vorliegenden BamHI-Ort bis zu einem Ort ungefähr 270 bp stromabwärts von gluD aus chromosomaler DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 amplifiziert, das ein Wildtypstamm von coryneformen Bakterium war, indem PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden mit den Nucleotidsequenzen, die als SEQ ID Nrn. 1 und 2 dargestellt werden, als Primer verwendet wurde. Dieses amplifizierte Fragment wurde mit BamHI und XbaI verdaut und das erhaltene Fragment wurde mit pHSG299 (hergestellt durch Takara Shuzo), verdaut mit BamHI und XbaI, unter Verwendung von T4-Ligase (hergestellt durch Takara Shuzo), verbunden, um ein Plasmid pHSGΔgluD zu erhalten.
Dann wurde ein Fragment von ungefähr 300 bp von einem Ort ungefähr 180 bp stromaufwärts von gluA bis zum dem BamHI-Ort, der in gluA vorliegt, aus chromosomaler DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 amplifiziert, indem PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden mit den Nucleotidsequenzen, die als SEQ ID Nrn. 3 und 4 dargestellt werden, als Primern verwendet wurde. Dieses amplifizierte Fragment wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und das erhaltene Fragment wurde mit pHSGΔgluD, verdaut mit EcoRI und BamHI, unter Verwendung von T4-Ligase verbunden, um ein Plasmid pHSGΔgluAD zu erhalten. Dieses Plasmid besaß eine Struktur, in der gluB und gluC deletiert waren und Teile von gluA und gluD verbunden waren.
Dann wurde, um pHSGΔgluAD autonom replizierbar in coryneform Bakterien zu machen, ein Temperatur-empfindlicher Replikationsursprung, entstammend einem Plasmid, das in coryneformen Bakterien autonom replizierbar war, in dem nur einmal vorhandenen HincII-Spaltungsort in pHSGΔgluAD eingeführt. Spezifisch wurde das folgende Verfahren verwendet.
Ein Plasmid pHSC4, das einen Temperatur-empfindlichen Replikationsursprung enthielt (siehe japanische offengelegte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 5-7491), wurde mit BamHI und KpnI verdaut. Die beiden Enden des erhaltenen DNA-Fragments wurden an den Enden unter Verwendung eines Blunting-Kits (hergestellt durch Takara Shuzo) abgestumpft, mit einem KpnI-Linker (hergestellt durch Takara Shuzo) ligiert und man ließ sie dann Selbstligation hervorrufen, um pKCT4 zu erhalten. pHSC4 war ein Plasmid, das wie folgt erhalten wurde. D.h., ein DNA-Fragment, das einen Replikationsursprung enthielt, wurde von einem Plasmid pAJ1844 (siehe japanische offengelegte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 58-216199) ausgeschnitten, das einen Replikationsursprung aufwies, der von pHM1519 (K. Miwa et al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901–2903 (1984), japanische offengelegte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 58-77895) stammte, und mit einem Plasmid für Escherichia coli, pHSG298, verbunden, um einen Shuttle-Vektor pHK4 zu erhalten. Dieser pHK4 wurde mit Hydroxylamin behandelt, um ein Plasmid pHS4 zu erhalten, das modifiziert war, um Temperatur-empfindlich zu sein. Der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung wurde aus pHS4 ausgeschnitten und an pHSG398 gebunden, um pHSC4 zu erhalten. Escherichia coli AJ12571, das pHSC4 beherbergte, wurde bei den National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology am 11. Oktober 1990 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-11763. Dann wurde es in die internationale Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag am 26. August 1991, überführt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-3524.
Wie oben beschrieben hergestelltes pKCT4 wies eine Struktur auf, bei der der Replikationsursprung, der von pHM1519 stammte, modifiziert, um Temperatur-empfindlich zu sein, in den KpnI-Ort von pHSG399 inseriert wurde. Man erhielt ein Fragment, das einen Temperatur-empfindlichen Replikationsursprung enthielt, durch den Verdau von pKCT4 mit KpnI, Enden abgestumpft durch Verwendung eines Blunting-Kits (hergestellt durch Takara Shuzo) und ligierte es an pHSGΔgluAD, verdaut mit HincII, um pTΔAD zu erhalten (1).
<2> Konstruktion eines Plasmids für die Unterbrechung eines gluA-Gens
Um ein coryneformes Bakterium zu schaffen, in dem nur das gluA-Gen unterbrochen war, wurde ein Plasmid für die Unterbrechung des gluA-Gens konstruiert.
Ein DNA-Fragment von ungefähr 1.500 bp, das das gluA-Gen enthielt, wurde aus chromosomaler DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden mit Nucleotidsequenzen, die als SEQ ID Nrn. 3 und 5 gezeigt werden, als Primer amplifiziert und das amplifizierte Fragment wurde mit EcoRI verdaut und an pHSG299 (hergestellt durch Takara Shuzo), verdaut mit EcoRI unter Verwendung von T4-Ligase (hergestellt durch Takara Shuzo) gebunden, um ein Plasmid pHSGgluA zu erhalten.
Dann wurde die 5'-Region und die 3'-Region des gluA-Gens und das Vektorsegment, ausgenommen der inneren Region des gluA-Gens, durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden mit den Nucleotidsequenzen, die als SEQ ID Nrn. 6 und 7 gezeigt werden, als Primer und pHSGgluA als eine Matrize amplifiziert. Die zuvor genannten Primer wurden so entworfen, dass sie eine BglII-Erkennungssequenz enthielten. Das amplifizierte Fragment wurde mit BglII verdaut und man ließ es Selbst-Ligation in Gegenwart von T4-Ligase hervorrufen, um ein Plasmid pHSGΔgluA zu erhalten. Dieses Plasmid enthielt eine Deletion von ungefähr 250 bp innerer Sequenz unter dem ungefähr 730 bp offenen Leserahmen von gluA und wies eine Struktur auf, bei der die 5'-Region und die 3'-Region in-frame verbunden waren.
Dann wurde, um pHSGΔgluA autonom replizierbar in coryneforme Bakterien zu machen, ein Temperatur-empfindlicher Replikationsursprung, der aus einem Plasmid stammte, das in coryneforme Bakterien autonom replizierbar war, in dem nur einmal vorhandenen KpnI-Spaltungsort in pHSGΔgluA eingefügt. Spezifisch wurde pKCT4 mit KpnI verdaut, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das einen Replikationsursprung enthielt, und das erhaltene Fragment wurde in den KpnI-Ort von pHSGΔgluA inseriert, um pTΔA zu erhalten (2).
<3> Schaffung eines gluABCD-Gen-unterbrochenen Stammes und gluA-Gen-unterbrochenen Stammes.
Die wie oben beschrieben erhaltenen Plasmide für die Unterbrechung von Genen, pTΔAD und pTΔA, wurden in einen Wildtypstamm, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869-Stamm, unter Verwendung des elektrischen Impulsverfahrens eingeführt, um ATCC13869/pTΔAD und ATCC13869/pTΔA zu erhalten. Die Genunterbrechung wurde unter Verwendung dieser Transformantenstämme durchgeführt.
Spezifisch wurden ATCC13869/pTΔAD und ATCC13869/pTΔA bei 25°C in CM2B-Brühe für 24 Stunden unter Schütteln kultiviert und auf CM2B-Medium, das 25 μg/ml Kanamycin enthielt, geimpft. Die Stämme, in die die Plasmide eingeführt wurden, wurden als Stämme erhalten, die Kolonien bei 34°C bildeten, bei welcher Temperatur der Temperatur- empfindliche Replikationsursprung nicht funktionierte. Dann wurden die Stämme, die sensibel auf Kanamycin bei 34°C wurden, durch das Replika-Verfahren erhalten. Chromosomale DNA dieser sensibilisierten Stämme wurde auf eine konventionelle Weise erhalten. Die Strukturen des gluABCD-Gens und des gluA-Gens auf dem Chromosom wurde durch PCR und Sequenzierung untersucht, um zu bestätigen, dass diese Gene durch diejenigen des Deletionstyps ersetzt sein sollten und die Stämme, die die Deletionstypgene enthielten, wurden als ΔAD-Stamm bzw. ΔA-Stamm bezeichnet.
Dem ΔAD-Stamm und dem ΔA-Stamm wurden die persönlichen Nummern AJ13587 bzw. AJ13588 verliehen und sie wurden bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Postleitzahl: 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) am 23. März 1999 hinterlegt und sie erhielten die Hinterlegungsnummern FERM P-17327 bzw. FERM P-17328, und dann wurden sie von der ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung, basierend auf dem Budapester Vertrag, am 14. Februar 2000 transferiert und wurden als die Hinterlegungsnummern FERM BP-7028 bzw. FERM BP-7029 hinterlegt.
<4> Beurteilung der L-Glutaminsäure-erzeugenden Fähigkeit der Stämme ΔAD und ΔA
Die Kultivierung der Stämme ATCC13869, ΔAD und ΔA für die Erzeugung von L-Glutaminsäure wurde wie folgt durchgeführt. Diese Stämme, die durch Kultivierung in einem CM2B-Plattenmedium aufgefrischt worden waren, wurden in zwei Arten von Medien kultiviert, einem Medium, das 80 g Glucose, 1 g KH₂PO₄, 0,4 g MgSO₄·7H₂O, 30 g (NH₄)₂SO₄, 0,01 g FeSO₄·7H₂O, 0,01 g MnSO₄·7H₂O, 15 ml Sojabohnenhydrolysatlösung, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 3 μg Biotin und 50 g CaCO₃ in 1 l entionisiertem Wasser (hergestellt bei pH 8,0 unter Verwendung von KOH) enthielt und einem Medium, das weiter 50 g/l L-Glutaminsäure in dem vorherigen Medium enthielt, bei 31,5°C. Nach der Kultivierung wurden die Mengen der akkumulierten L-Glutaminsäure in den Medien und die Absorption bei 620 nm des Mediums, 51-mal verdünnt, gemessen. Die Ergebnisse, die man für das Medium ohne Zugabe von L-Glutaminsäure erhielt, werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Ergebnisse, die man für das Medium erhielt, dem L-Glutaminsäure zugegeben wurde, werden in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 1
TABELLE 2

* Die Mengen beinhalten nicht die L-Glutaminsäure, die dem Medium zugegeben wurde.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Akkumulierungsmenge und der Ertrag von L-Glutaminsäure sowohl für den ΔA-Stamm wie auch für den ΔAD-Stamm verbessert wurden, wenn das Medium L-Glutaminsäure in einer höheren Konzentration enthielt. Weiter wurde der Ertrag von L-Glutaminsäure durch den ΔA- Stamm sogar in dem Medium, das nicht L-Glutaminsäure enthält, verbessert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, umfassend die Schritte der Kultivierung eines coryneformen Bakteriums, das eine L-Glutaminsäure-erzeugende Fähigkeit hat, in einem Medium, um L-Glutaminsäure in dem Medium zu erzeugen und anzuhäufen, und Sammeln der L-Glutaminsäure aus dem Medium, wobei ein L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem in dem coryneformen Bakterium deletiert oder vermindert ist, wobei das L-Glutaminsäure-Aufnahmesystem durch das gluABCD-Operon codiert wird und wobei mindestens eines der Expressionsprodukte des gluABCD-Operons in dem coryneformen Bakterium deletiert ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei mindestens gluA in dem coryneformen Bakterium deletiert ist.
Verfahren gemäss Anspruch 2, worin alle von gluA, gluB, gluC und gluD in dem coryneformen Bakterium deletiert sind.