CN1271018A - 生产l－谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了更有效地生产L－谷氨酸的新方法,与常规方法比较费用更低,该方法包括在培养基中培养具有L－谷氨酸生成能力的棒状细菌以便在培养基中产生和积累L－谷氨酸,然后由培养基中收集L－谷氨酸,其中所述棒状细菌中的L－谷氨酸吸收系统缺失或活性降低。

Description

生产L-谷氨酸的方法
本发明涉及L-谷氨酸产生菌和使用该细菌通过发酵方法生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种重要的食用、医用氨基酸。
迄今，L-谷氨酸一直通过发酵方法生产，主要使用产L-谷氨酸的所谓棒状细菌，它们属于短杆菌属或棒杆菌属(氨基酸发酵，GakkaiShuppan Center，pp.195-215，1986)。作为这种棒状细菌，从自然界中分离的野生型菌株和其突变体被用于提高产率。
另外，现在已经公开了多种提高L-谷氨酸生成能力的技术，它们通过重组DNA技术改进参与L-谷氨酸生物合成系统的酶的基因。例如，日本专利公开63-214189公开了通过改进谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸水合酶和柠檬酸合酶基因提高L-谷氨酸生成能力的技术。
另一方面，对L-苏氨酸来说，已知可以使用破坏该氨基酸吸收系统的技术来增加该氨基酸的生成(Okamoto，K.et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，61(11)，1877-1882(1997))。
对于L-谷氨酸，已经揭示了谷氨酸棒杆菌中L-谷氨酸吸收系统的基因簇(gluABCD操纵子)的结构(Kronemeyer，W.et al.，J.Bacteriol.，177(5)，1152-1158(1995))。并且，Kronemeyer等构建了一种菌株，其中缺失了由gluABCD操纵子编码的L-谷氨酸吸收系统，并使用该菌株研究了L-谷氨酸的分泌。在该研究中，他们认为谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸分泌不依赖于gluABCD，而依赖于其他吸收和分泌机制。此外，已经报导了不是由gluABCD编码的一种L-谷氨酸吸收系统(Burkovski，A.etal.，FEMS Microbiology Letters，136，169-173(1996))。这些报导表明，即使在gluABCD操纵子编码的L-谷氨酸吸收系统缺失时，培养基中L-谷氨酸的积累量也不受影响。因此，从未尝试通过破坏gluABCD编码的L-谷氨酸吸收系统来提高L-谷氨酸的生成能力。
本发明的目的是培育具有高的L-谷氨酸生成能力的细菌菌株，从而提供更有效的廉价生产L-谷氨酸的方法，以便满足对L-谷氨酸日益增长的需要量。
为了实现上述目的，发明人进行了大量研究。结果发现，与上述现有技术的结论相反，一种gluABCD操纵子缺失的产L-谷氨酸棒状细菌具有较高的L-谷氨酸生成能力，从而完成了本发明。
即，本发明提供：(1)一种生产L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌，在培养基中生成和积累L-谷氨酸，从培养基中收集L-谷氨酸，其中棒状细菌中的L-谷氨酸吸收系统缺失或活性降低。(2)上述(1)的方法，L-谷氨酸吸收系统由gluABCD操纵子编码。(3)上述(2)的方法，其中棒状细菌中缺失了gluABCD操纵子的至少一种表达产物。(4)上述(3)的方法，其中棒状细菌中至少缺失了gluA。(5)上述(4)的方法，其中棒状细菌中gluA，gluB，gluC，gluD均缺失。
与传统技术相比，本发明可以以较高的产率生产L-谷氨酸。
本发明中，“L-谷氨酸生成能力”是指本发明所用的棒状细菌在培养基中培养时在培养基中积累L-谷氨酸的能力。
以下详述本发明。
本发明的棒状细菌是具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌，其中L-谷氨酸吸收系统缺失或活性降低。
在本发明中属于棒杆菌属的细菌是伯杰氏鉴定细菌学手册第8版599页(1974)中限定的一组微生物。这些细菌是好气，革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽胞的杆菌，包括曾被分类为短杆菌属但现在已归入棒杆菌属的细菌(国际系统细菌学杂志，41，255(1981))，并包括与棒杆菌属密切相关、属于短杆菌属和微杆菌属的细菌。用于生产L-谷氨酸的优选棒状细菌的实例包括如下。
嗜乙酰乙酸棒杆菌
醋谷棒杆菌
Corynebacterium alkanolyticum
美棒杆菌
谷氨酸棒杆菌
百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)
Corynebacterium melassecola
Corynebacyerium thermoaminogenes
力士棒杆菌
Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒杆菌)
黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)
玫瑰色短杆菌
解糖短杆菌
生硫短杆菌
产氨短杆菌(产氨棒杆菌)
Brevibacterium album
Brevibacterium cerinum
嗜氨微杆菌
具体而言，可举出这些细菌的下列菌株：
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870
醋谷棒杆菌ATCC15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511
美棒杆菌ATCC15991
谷氨酸棒杆菌ATCC13020，13032，13060
百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC15990
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacyerium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒杆菌ATCC13868
Brevibacterinm divaricatum(谷氨酸棒杆菌)ATCC14020
黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13826，ATCC14067
Brevibacterium immariophilum ATCC14068
乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13655，ATCC13869
玫瑰色短杆菌ATCC13825
解糖短杆菌ATCC14066
生硫短杆菌ATCC19240
产氨棒杆菌(产氨短杆菌)ATCC6871
Brevibacterium album ATCC15111
Brevibacterium cerinum ATCC15112
嗜氨微杆菌ATCC15354
棒状细菌L-谷氨酸吸收系统的上述缺失或活性降低可以通过使用诱变处理或遗传重组技术突变或破坏编码吸收系统的基因来实现。“L-谷氨酸吸收系统缺失或活性降低”表示使吸收系统功能不正常，包括至少一种组成吸收系统的蛋白缺失或该蛋白的活性降低，两种或多种蛋白缺失或活性降低。此外，“蛋白缺失”在本文中包括蛋白完全不表达和表达的蛋白功能不正常两种情况。
编码L-谷氨酸吸收系统的基因可以通过利用同源重组进行基因置换来破坏。棒状细菌染色体上的基因通过以下方法来破坏：用含有缺失了其内部序列的修饰基因(缺失型基因)的DNA转化棒状细菌，使缺失型基因和染色体上的正常基因之间发生重组，因而吸收系统功能不正常。这种利用同源重组的基因破坏技术是成熟的技术，在上述技术中已有利用线性DNA、含有温度敏感型复制起点的质粒等的方法。优选利用含有温度敏感型复制起点的质粒的方法。
作为编码L-谷氨酸吸收系统的基因，gluABCD操纵子是已知的(Kronemeyer，W.et al.，J.Bateriol.，177(5)，1152-1158(1995))。并且，不是由gluABCD操纵子编码的L-谷氨酸吸收系统也是已知的(Burkovski，A.et al.，FEMS Microbiol.Lett.136，169-173(1996))。尽管这些基因中的任一个都可以被破坏，优选由gluABCD操纵子编码的吸收系统被破坏。
由于该操纵子的核苷酸序列是已知的(GenBank/EMBL/DDBJ登录号X81191)，该操纵子或gluABCD操纵子中的每一个结构基因都可以使用基于核苷酸序列制备的引物通过PCR从棒状细菌染色体中分离出来。可以利用一种或多种限制酶从获得的基因片段中切除一定的区域，或者缺失编码区或启动子等表达调控序列的至少一部分，以制备缺失型基因。
此外，缺失型基因也可以通过PCR获得，将引物设计成缺失基因的一部分。例如，使用具有序列表序列1和序列2所所示核苷酸序列的引物，可以获得缺失了一部分5′序列的gluD基因。此外，使用具有序列3和序列4所示核苷酸序列的引物，可以获得缺失了一部分3′序列的gluA基因。利用通过上述引物获得的缺失型gluA或gluD基因进行基因置换，可以破坏gluA基因或gluD基因。并且，如果将这些缺失型gluA基因和缺失型gluD基因连接，将所获得的融合基因用于基因置换，可以破坏gluA，gluB，gluC和gluD。此外，当使用含有gluA基因(使用具有序列3和序列5所示核苷酸序列的引物获得)的质粒作为模板，具有序列6和序列7所示核苷酸序列的引物进行PCR，并且扩增产物环化时，可以获得含有包括内部序列缺失和5′区和3′区框内连接的gluA基因的质粒。使用该质粒进行基因置换时，只有gluA基因被破坏。
并且，也可以通过本领域技术人员熟知的方法设计除上述实例以外的引物，使用这些引物破坏gluABCD操纵子中任何结构基因。或者，也可以通过缺失gluABCD操纵子的表达控制序列如启动子使得基因无法表达，使吸收系统缺失。
尽管以下详述的是gluABCD基因簇(以下称为gluABCD基因)的基因置换，但任何结构或表达控制序列均可以类似方式缺失。
宿主染色体上的gluABCD基因可以用缺失型gluABCD基因取代，如下所述。即通过插入温度敏感型复制起点、缺失型gluABCD基因和表达对药物如氯霉素、四环素和链霉素抗性的标记基因构建重组DNA，用该重组DNA转化棒状细菌。然后在温度敏感型复制起点没有功能的温度下培养转化菌株，再在含有相应药物的培养基中培养，获得其中重组DNA已经整合到染色体DNA中的转化菌株。
在这种菌株中，重组DNA如上所述整合到染色体中，引起本来位于染色体上的gluABCD基因序列的重组，染色体gluABCD基因和缺失型gluABCD基因的融合基因被插入到染色体中，在它们中间是重组DNA的其他部分(载体部分，温度敏感型复制起点和药物抗性标记)。因此，由于在这种状态下，正常gluABCD基因占优势，转化子菌株表达L-谷氨酸吸收系统。
然后，为了在染色体上只留下缺失型gluABCD基因，通过两个gluABCD基因的重组，从染色体DNA上消除一个拷贝的gluABCD基因和载体部分(包括所得敏感型复制起点和药物抗性标记)。发生重组时，染色体DNA上可以留下正常gluABCD基因，缺失型gluABCD基因被切除，或染色体DNA上可以留下缺失型gluABCD基因，正常gluABCD基因被切除。在两种情况下，如细胞在温度敏感型复制起点有功能的温度下培养，切除的DNA被保留在细胞内的质粒上。当细胞在温度敏感型复制起点没有功能的温度下培养时，质粒上的这种DNA从细胞内消除。通过PCR、杂交等检查染色体上的gluABCD基因结构，可以证实留在染色体DNA上的基因。
当这种gluABCD基因破坏的菌株在温度敏感型复制起点有功能的温度(如低温)下培养时，gluABCD基因将会保留在细胞内。当它在温度敏感型复制起点没有功能的温度(如高温)下培养时，gluABCD基因将会从细胞中消除。
具有在棒状细菌中有功能的温度敏感型复制起点的质粒的实例包括pHS4，pHSC4，pHS22，pHSC22，pHS23，pHSC23(参见日本专利公开(Kokoku)7-108228)等。在棒状细菌中的这些温度敏感型质粒在约10到32℃的温度下可以自主复制，但在约34℃或更高的温度下不能自主复制。
如上所述破坏了染色体上的gluABCD基因后，优选基因破坏菌株中引入recA-，因为引入recA-可以防止低温下培养时质粒上的gluABCD基因再次整合到染色体中。
本发明的棒状细菌中，除了L-谷氨酸吸收系统缺失或活性降低外，催化L-谷氨酸生物合成的酶可以具有提高的活性。催化L-谷氨酸生物合成的酶的说明性实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶等。
并且，在本发明的棒状细菌中，通过从L-谷氨酸生物合成途径分支催化产生非L-谷氨酸化合物的反应的酶可以减少或缺失。通过从L-谷氨酸生物合成途径分支催化产生非L-谷氨酸化合物的反应的酶的说明性实例包括α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟肟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。
此外，通过向具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌中引入生物素活性抑制物如表面活性剂的热敏突变，该细菌在生物素活性抑制物存在时在含有过量生物素的培养基中可以产生L-谷氨酸(参见WO 96/06180)。作为这种棒状细菌，可以提到WO 96/06180中公开的乳发酵短杆菌AJ13029菌株。AJ13029菌株于1994年9月2日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM P-14501。其后在1995年8月1日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-5189。
当具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌中L-谷氨酸吸收系统缺失或活性降低时，将其在合适的培养基中培养，培养基中可以积累L-谷氨酸。由于本发明的棒状细菌中L-谷氨酸吸收系统缺失或活性降低，阻止了从细胞中分泌的L-谷氨酸再次被吸收进细胞中。因此，培养基中的L-谷氨酸积累量增加了。根据本发明的方法，当培养基中L-谷氨酸浓度高时，预期阶段产率(interval yield)(一定的培养期间L-谷氨酸的积累量与糖的消耗量之比)会提高。具体来说，当使用发酵期间在培养基中积累高浓度L-谷氨酸的高产菌株时，可以获得显著的效果。
用来通过本发明的微生物生产L-谷氨酸的培养基是普通培养基，含有所需的碳源、氮源、无机盐以及其他痕量有机营养等等。碳源可以是糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物、糖蜜等；醇，如乙醇、肌醇；或有机酸，如乙酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸等。
氮源可以是无机铵盐，如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵，氨，有机氮，如胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆和大豆水解物，氨气，氨水等。
加入的无机离子(或其来源)是少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。至于微量有机营养，需要以合适的量加入所需的物质如维生素B1、酵母提取物等。
优选通过振荡、搅拌通气在好气条件下培养16到72小时。培养温度控制在30℃到45℃，pH控制在5到9。可以加入无机或有机酸性或碱性物质、氨气等调节pH。
从培养液中收集L-谷氨酸可以通过例如使用离子交换树脂的方法、结晶等实现。具体来说，L-谷氨酸可以通过阴离子交换树脂吸附或分离，或通过中和结晶。
图1为破坏gluABCD基因的质粒pTΔAD的构建示意图。
图2为破坏gluA的质粒pTΔA的构建示意图。
以下将参照具体实施例更具体地阐明本发明。
1.破坏gluABCD基因的质粒的构建
为了使用温度敏感型质粒通过同源重组创建gluABCD基因被破坏的棒状细菌菌株，构建破坏gluABCD基因的质粒。
首先，通过克隆具有5′序列缺失的gluD基因并将其与具有3′序列缺失的gluA基因连接构建缺失型gluABCD基因。具体而言，由乳发酵短杆菌ATCC13869(棒状细菌的野生型菌株)的染色体DNA，通过PCR扩增从gluD的BamHI位点到gluD下游约270bp的约300bp片段，使用具有序列1和2的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物。该扩增片段用BamHI和XbaI消化，所得片段与BamHI和XbaI消化的pHSG299(TakaraShuzo)用T4连接酶(Takara Shuzo)连接，获得质粒pHSGΔgluD。
然后，由乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA，通过PCR扩增从gluA上游约180bp的位点到gluA中的BamHI位点的约300bp片段，使用具有序列3和4的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物。该扩增片段用BamHI和EcoRI消化，所得片段与BamHI和EcoRI消化的pHSGΔgluD用T4连接酶连接，获得质粒pHSGΔgluAD。该质粒中缺失了gluB和gluC，部分gluA和gluD被连接在一起。
然后，为了使pHSGΔgluAD在棒状细菌中自主复制，来源于在棒状细菌中自主复制的质粒的温度敏感型复制起点被引入到pHSGΔgluAD中的单一HincII酶切位点。具体而言，使用以下步骤。
含有温度敏感型复制起点的质粒pHSC4(见日本专利公开(kokai)5-7491)用BamHI和KpnI消化。所得DNA片段的两个末端用平端化试剂盒(Takara Shuzo)平端化，与KpnI接头(Takara Shuzo)连接，然后使其自身连接获得pKCT4。PHSC4是按以下方法获得。即，含有复制起点的DNA片段被从质粒pAJ1844(见日本专利公开(kokai)58-216199)切除，该质粒具有来自pHM1519(K.Miwa et al.，Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)，日本专利公开(Kokai)58-77895)的复制起点，然后将片段与大肠杆菌质粒pHSG298连接，获得穿梭载体pHK4。该pHK4质粒用羟胺处理，获得修饰成温度敏感型的质粒pHS4。该温度敏感型复制起点被从pHS4中切除，连接到pHSG398获得pHSC4。携带pHSC4的大肠杆菌AJ12571于1990年10月11日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM P-11763。1991年8月26日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-3524。
如上所述制备的pKCT4中，来自pHM1519、被修饰成温度敏感型的复制起点被插入pHSG399的KpnI位点。通过用KpnI消化pKCT4获得含有温度敏感型复制起点的片段，用平端化试剂盒(Takara Shuzo)平端化，然后与HincII消化的pHSGΔgluAD连接，获得pTΔAD(图1)。
2.破坏gluA基因的质粒的构建
为了创建仅gluA基因被破坏的棒状细菌菌株，构建破坏gluA基因的质粒。
由乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA，通过PCR扩增含有gluA基因的约1500bp DNA片段，使用具有序列3和5的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物。该扩增片段用EcoRI消化，然后与EcoRI消化的pHSG299(Takara Shuzo)用T4连接酶(Takara Shuzo)连接，获得质粒pHSGgluA。
然后，通过PCR扩增除gluA基因内部区域以外的gluA基因的5′和3′区以及载体区段，使用具有序列6和7的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，pHSGgluA作为模板。上述引物被设计成含有BglII识别序列。该扩增片段用BglII消化，在T4连接酶存在时使其自身连接，获得质粒pHSGΔgluA。该质粒含有gluA约730bp开放读框中约250bp内部序列的缺失，并且其5′和3′区域框内连接在一起。
然后，为了使pHSGΔgluA在棒状细菌中自主复制，来源于在棒状细菌中自主复制的质粒的温度敏感型复制起点被引入到pHSGΔgluA中的单一KpnI酶切位点。具体而言，用KpnI消化pKCT4，获得含有复制起点的DNA片段，所获得的片段被插入到pHSGΔgluA的KpnI位点，获得pTΔA(图2)。
3.创建gluABCD基因被破坏的菌株和gluA基因被破坏的菌株
上述破坏基因的质粒pTΔAD和pTΔA被引入野生型菌株乳发酵短杆菌ATCC13869菌株，使用电脉冲法获得ATCC13869/pTΔAD和ATCC13869/pTΔA。使用这些转化菌株进行基因破坏。
具体而言，ATCC 13869/pTΔAD和ATCC 13869/pTΔA在CM2B肉汤中25℃下振荡培养24小时，接种到含有25μg/ml卡那霉素的CM2B培养基中。34℃下形成菌落的菌株是导入了质粒的菌株，在该温度下温度敏感型复制起点没有功能。然后，通过影印法获得34°下对卡那霉素敏感的菌株。这些敏感菌株的染色体DNA以常规方式获得。染色体上的gluABCD和gluA基因的结构通过PCR和测序检查，证实这些基因已用缺失型基因取代，含有缺失型基因的菌株分别被称为ΔAD菌株和ΔA菌株。
ΔAD菌株和ΔA菌株分别命名为AJ13587和AJ13588，于1999年3月23日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码：305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Tbaraki-ken，Japan)，保藏号分别为FERM P-17327和FERM P-17328，于2000年2月14日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号分别为FERM BP-7028和FERM BP-7029。
4.ΔAD菌株和ΔA菌株L-谷氨酸生成能力的评价
生产L-谷氨酸的ΔAD菌株和ΔA菌株的培养如下进行。在CM2B平板培养基中复苏的菌株在两种培养基中于31.5℃下培养，一种培养基在1升去离子水(在pH8.0时用氢氧化钾制备)中含有80克葡萄糖、1克磷酸二氢钾、0.4克7水硫酸镁、30克硫酸铵、0.01克7水硫酸铁、0.01克7水硫酸锰、15毫升大豆水解物溶液、200微克盐酸硫胺素、3微克生物素和50克碳酸钙，一种培养基另外还含有50克/升L-谷氨酸。培养后，测定培养基中积累的L-谷氨酸量和培养基稀释51倍后在620纳米的稀释值。未添加L-谷氨酸的培养基的结果见表1。添加了L-谷氨酸的培养基的结果见表2。
                           表1
    菌株     OD620  L-谷氨酸(g/L)     产率(％)
  ATCC13869     0.937     40.8     50.4
    ΔAD     1.127     36.3     44.9
    ΔA     0.766     44.3     54.8
                         表2
    菌株     OD620  L-谷氨酸(g/L)*     产率(％)
  ATCC13869     0.845     29.5     43.9
    ΔAD     0.927     30.0     44.6
    ΔA     0.749     32.0     47.6
*产量中未包括加入培养基中的L-谷氨酸。
这些结果表明，培养基中含有高浓度的L-谷氨酸时，ΔAD菌株和ΔA菌株的L-谷氨酸的积累量和产率都提高了。并且，即使在不含L-谷氨酸的培养基中，ΔA菌株的L-谷氨酸产率也提高了。
                          序列表(110)Ajinomoto Co.，Inc.(120)生产L-谷氨酸的方法(130)OP948(141)2000-03-(150)JP11-81693(151)1999-03-25(160)7(170)PatentIn Ver.2.0(210)1(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述：PCR引物(400)1gactggcagg atcctgatta taagg                             25(210)2(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述：PCR引物(400)2cgcgtctaga ggcgcttgag caaatcgacc                        30(210)3(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述：PCR引物(400)3aggtgaattc cggacaggat cggagactac                      30(210)4(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述：PCR引物(400)4ttgacttgcc ggatccggat ggtcc                           25(210)5(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述：PCR引物(400)5tcatgaattc ctcaccgttt tgaatgaggg                      30(210)6(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述：PCR引物(400)6gatgagatct cgttccaaca ggctcatcgc                      30(210)7(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述：PCR引物(400)7aagcagatct tcgtgtgttg ttcatggcgg                       30

Claims (5)

1.生产L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌以便在培养基中产生和积累L-谷氨酸，由培养基中收集L-谷氨酸，其中棒状细菌中的L-谷氨酸吸收系统缺失或活性降低。
2.权利要求1的方法，其中L-谷氨酸吸收系统由gluABCD操纵子编码。
3.权利要求2的方法，其中棒状细菌中缺失了gluABCD操纵子的至少一种表达产物。
4.权利要求3的方法，其中棒状细菌中至少缺失了gluA。
5.权利要求4的方法，其中棒状细菌中gluA、gluB、gluC和gluD均缺失。
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