CN101010423B

CN101010423B - 生产l-谷氨酸的微生物和生产l-谷氨酸的方法

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Publication number: CN101010423B
Application number: CN2005800298560A
Authority: CN
Inventors: 平野圣子; 山口美喜子; 中村纯; 伊藤久生
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2004-09-10
Filing date: 2005-09-09
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2025-09-09
Also published as: JP2006101875A; KR20070053321A; WO2006028298A3; BRPI0515035A; WO2006028298A2; EP1786899A2; EP1786899B1; CN101010423A; KR100930842B1

Abstract

本发明涉及具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，其至少以与非突变菌株或野生型菌株相同的生长速率生长，而且其具有的胞内α-酮戊二酸脱氢酶活性小于非突变或野生型菌株的一半，并通过将突变引入到染色体odhA基因的编码区或表达控制区而获得，所述染色体odhA基因编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的Elo亚基。

Description

生产L-谷氨酸的微生物和生产L-谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生产L-谷氨酸的微生物和利用所述微生物生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸广泛用于食品工业，例如，作为生产调味品的原料。

相关技术简述

已通过发酵方法利用生产L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌如属于短杆菌属(Brevibacterium)和棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌以工业规模常规生产L-谷氨酸。为了提高棒状杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力，将从自然界分离的菌株或这些菌株的人工突变体用作生产L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌。

已经报导了许多使用重组DNA技术，通过增强L-谷氨酸生物合成酶活性而提高L-谷氨酸生产能力的技术。例如，已报导了具有扩增的柠檬酸合酶基因的棒状杆菌型细菌(JP07-121228B)，和具有扩增的谷氨酸脱氢酶基因的棒状杆菌型细菌(EP 955368)。

在物质的发酵生产中，维持细菌细胞的充分生长以充分生产目标物质是有必要的。相应地，培育目标物质的生物合成增强的菌株而不引起细菌生长下降是有必要的。在L-谷氨酸的生产中，已报导降低α-酮戊二酸脱氢酶活性是有利的(JP06-237779A和WO95/34672)。然而，还没有降低α-酮戊二酸脱氢酶活性同时维持足够的L-谷氨酸生产水平的报导。

发明内容

本发明的目的是提供提高棒状杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力的技术，所述棒状杆菌型细菌用于L-谷氨酸的发酵生产。当α-酮戊二酸脱氢酶基因被破坏时，通过TCA循环产生的能量减少，导致细菌生长的阻滞。结果，可能无法获得足够的L-谷氨酸产率。

因此，降解L-谷氨酸的能力降低同时维持正常的生长速率的突变菌株可用于有效地生产L-谷氨酸。通过将突变引入到编码棒状杆菌型细菌α-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1o亚基的染色体odhA基因而获得了突变菌株，所述突变菌株具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性，并且保持了几乎与野生型菌株相同的生长速率。发现利用这样的突变菌株有效地生产L-谷氨酸。

本发明的目的是提供生产L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌，其包含

a)胞内α-酮戊二酸脱氢酶活性，该活性小于非突变或野生型菌株的一半，和

b)在染色体odhA基因的编码区或表达控制区中的突变，所述染色体odhA基因编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1o亚基，

其中所述细菌几乎以与非突变或野生型菌株相同的生长速率生长。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述odhA基因编码选自下组的蛋白质：

(A)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质，

(B)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质，其中在所述蛋白质中取代、缺失、插入、或添加了一个或几个氨基酸，并且其中所述蛋白质具有α-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1o亚基的活性，

(C)包含SEQ ID NO：10的氨基酸37至1257的蛋白质，和

(D)包含SEQ ID NO：10的氨基酸37至1257的蛋白质，其中在所述蛋白质中取代、缺失、插入、或添加了一个或几个氨基酸，并且其中所述蛋白质具有α-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1o亚基的活性。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述几个氨基酸是2至20个氨基酸。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述odhA基因选自下组：

(a)包含SEQ ID NO：9的核苷酸443至4213的基因，

(b)能够在严紧条件下与以下物质杂交的基因：包含SEQ ID NO：9的核苷酸443至4213的多核苷酸或由包含SEQ ID NO：9的核苷酸443至4213的多核苷酸制备的探针，并且其中所述基因编码蛋白质，该蛋白质具有α-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1o亚基的活性，

(c)包含SEQ ID NO：9的核苷酸551至4213的基因，和

(d)能够在严紧条件下与以下物质杂交的基因：包含SEQ ID NO：9的核苷酸551至4213的多核苷酸或由包含SEQ ID NO：9的核苷酸551至4213的多核苷酸制备的探针，并且其中所述基因编码蛋白质，该蛋白质具有α-酮戊二酸脱氢酶复合物的Elo亚基的活性。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变被引入到编码焦磷酸硫胺素结合区的区域。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变包括氨基酸的缺失，所述氨基酸从下组选择：SEQ ID NO：10所示氨基酸序列中686位的Gly、687位的Leu、688位的Gly、713位的Asn、714位的Asn及其组合。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变被引入到包含SEQ ID NO：9的核苷酸2534至2548的区域。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变包括在包含SEQ ID NO：10的氨基酸698至702的区域中缺失一个或多个氨基酸。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变包括氨基酸的替换，所述氨基酸从下组选择：SEQ ID NO：10所示氨基酸序列中698位的Lys、699位的Leu、700位的Arg、702位的Tyr、及其组合。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变被引入到包含SEQ ID NO：9的核苷酸1094至1114的区域。

本发明的又一目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变包括在包含SEQ ID NO：10的氨基酸218至224的区域中缺失一个或多个氨基酸。

本发明的又一目的是提供生产L-谷氨酸的方法，包括：

a)在培养基中培养根据权利要求1的棒状杆菌型细菌和

b)从培养基和/或所述细菌收集L-谷氨酸。

本发明的又一目的是提供编码突变的α-酮戊二酸脱氢酶的基因，所述基因选自下组：

(a)包含从SEQ ID NO：11、13和15组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸443至4213的基因，或者包含从SEQ ID NO：44、46和48组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸443至4210的基因，

(b)能够在严紧条件下与以下物质杂交的基因：包含从SEQ ID NO：11、13和15组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸443至4213的多核苷酸、包含从SEQ ID NO：44、46和48组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸443至4210的多核苷酸、由从SEQ ID NO：11、13和15组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸443至4213制备的探针、或由从SEQ ID NO：44、46和48组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸443至4210制备的探针，并且其中所述基因编码具有α-酮戊二酸脱氢酶活性的蛋白质，通过与E2o和E3亚基形成复合物，该蛋白质的α-酮戊二酸脱氢酶活性小于野生型或非突变菌株的α-酮戊二酸脱氢酶活性的一半，

(c)包含从SEQ ID NO：11、13和15组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸551至4213的基因，或者包含从SEQ ID NO：44、46和48组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸551至4210的基因，和

(d)能够在严紧条件下与以下物质杂交的基因：包含从SEQ ID NO：11、13和15组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸551至4213的多核苷酸、包含从SEQ ID NO：44、46和48组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸551至4210的多核苷酸、由从SEQ ID NO：11、13和15组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸551至4213制备的探针、或由从SEQ ID NO：44、46和48组成的组中选择的多核苷酸的核苷酸551至4210制备的探针，并且其中所述基因编码具有α-酮戊二酸脱氢酶活性的蛋白质，通过与E2o和E3亚基形成复合物，该蛋白质的α-酮戊二酸脱氢酶活性小于野生型或非突变菌株的α-酮戊二酸脱氢酶活性的一半。

本发明的又一目的是提供突变的α-酮戊二酸脱氢酶，其选自下组：

(a)从SEQ ID NO：12、14、16、45、47和49组成的组中选择的蛋白质，

(b)从SEQ ID NO：12、14、16、45、47和49组成的组中选择的蛋白质，其中在所述蛋白质中取代、缺失或添加了一个或几个氨基酸，并且其中通过与E2o和E3亚基形成复合物，所述蛋白质显示的α-酮戊二酸脱氢酶活性小于野生型或非突变菌株的α-酮戊二酸脱氢酶活性的一半，

(c)包含从SEQ ID NO：12、45、47和49组成的组中选择的氨基酸序列的氨基酸37至1256的蛋白质，包含氨基酸序列SEQ ID NO：14的氨基酸37至1255的蛋白质，或者包含氨基酸序列SEQ ID NO：16的氨基酸37至1254的蛋白质，和

(d)包含从SEQ ID NO：12、45、47和49组成的组中选择的氨基酸序列的氨基酸37至1256的蛋白质，包含氨基酸序列SEQ ID NO：14的氨基酸37至1255的蛋白质，或者包含氨基酸序列SEQ ID NO：16的氨基酸37至1254的蛋白质，其中在所述蛋白质中取代、缺失、或添加了一个或几个氨基酸，并且其中通过与E2o和E3亚基形成复合物，所述蛋白质显示的α-酮戊二酸脱氢酶活性小于野生型或非突变菌株的α-酮戊二酸脱氢酶活性的一半。

附图说明

图1显示质粒pBS3的构建。

图2显示质粒pBS4S的构建。

图3显示质粒pBSOAGN的构建。

图4显示质粒pBSOA2-2的构建。

图5显示培养各菌株时L-谷氨酸浓度的变化。

图6显示各菌株的生长速率。

图7显示培养各菌株时残糖(residual sugar)量的变化。

优选实施方案的说明

以下将详细描述本发明。

<1>本发明的棒状杆菌型细菌

本发明的棒状杆菌型细菌具有生产L-谷氨酸的能力，并且几乎以与非突变菌株或野生型菌株相同的生长速率生长。通过将突变引入到odhA基因的编码区或表达控制区，本发明的棒状杆菌型细菌所具有的胞内α-酮戊二酸脱氢酶(以下也称为″α-KGDH″)活性小于非突变菌株或野生型菌株的活性的一半，所述odhA基因编码α-KGDH复合物的E1o亚基。

α-KGDH也称为酮戊二酸脱氢酶或2-酮戊二酸脱氢酶。

在本发明中，棒状杆菌型细菌的例子包括常规的棒状杆菌型细菌，也包括曾经分类为短杆菌属但目前分类为棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，以及非常接近棒杆菌属细菌的短杆菌属细菌。这样的棒状杆菌型细菌的例子包括下述的细菌。

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)

白色短杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

棒状杆菌型细菌的具体实例如下：

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌ATCC15806

烷醇棒杆菌ATCC21511

美棒杆菌ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060，ATCC13869

百合花棒杆菌ATCC 15990

栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965

Corynebacterium efficiens AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒状杆菌ATCC13868

二歧短杆菌ATCC14020

黄色短杆菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13869

玫瑰色短杆菌ATCC13825

解糖短杆菌ATCC 14066

生硫短杆菌ATCC 19240

产氨棒杆菌ATCC6871，ATCC 6872

白色短杆菌ATCC15111

蜡状短杆菌ATCC15112

嗜氨微杆菌ATCC15354。

这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United States ofAmerica)获得。即，给予每个菌株唯一的登记号，该登记号列于ATCC的目录中。可以使用此登记号来定购菌株。根据布达佩斯条约的规定，将AJ12340菌株于1989年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(the National Institute of Bioscienceand Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministryof International Trade and Industry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)，地址为TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，日本)，并给予登记号FERM BP-1539。根据根据布达佩斯条约的规定，于1989年1月5日将AJ12418菌株保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，并给予登记号FERM BP-2205。

在本发明中，″L-谷氨酸生产能力″指当在培养基中培养本发明的棒状杆菌型细菌时，导致在培养基中累积足够量的L-谷氨酸的能力。L-谷氨酸生产能力可以是培育本发明的棒状杆菌型细菌的亲本株的特性，或者是通过突变、基因重组等等所赋予或增强的特性。另外，可以通过向编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1o亚基的odhA基因中引入突变而赋予L-谷氨酸生产能力。

赋予L-谷氨酸生产能力的方法的例子包括增强编码L-谷氨酸生物合成酶的基因的表达。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的例子包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、和磷酸葡糖异构酶。

这些基因表达的增强可以通过将包含这种基因的DNA片段整合到能够在棒状杆菌型细菌中自主复制的适当质粒中，并用所得质粒转化细菌细胞；通过同源重组、接合(conjugation)、移位(transposition)等等将这种基因整合到染色体中；或者将突变引入这种基因的启动子区来实现(WO/0018935)。

当上述基因通过质粒引入或者被整合在染色体上时，用于所述基因表达的启动子可以是任何启动子，只要它能够在棒状杆菌型细菌中起作用。这种启动子的例子包括lac启动子、trp启动子、trc启动子、PS2启动子、和pL启动子。也可以使用所述基因的天然启动子。

经修饰而使柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、和/或谷氨酸脱氢酶基因表达增强的微生物的例子包括JP2001-333769A(EP1078989A)、JP2000-106869A(EP955368A)、JP2000-189169A(EP952221A)、和JP2001-333769A (EP1078989A)中公开的那些微生物。

赋予L-谷氨酸生产能力的修饰包括减小或消除酶的活性，所述酶催化合成除L-谷氨酸之外的化合物并由L-谷氨酸生物合成途径分支的反应。这些酶的例子包括异柠檬酸裂解酶、乙酰磷酸转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、乙酰甲酸转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、和1-焦磷酸脱氢酶。

为了减小或消除上述酶的活性，可以将导致酶活性减小或丧失的突变或缺失引入到染色体上酶的基因中。这可以通过例如破坏染色体上编码酶的基因，或者通过修饰基因的表达控制序列如启动子和/或Shine Dargarno(SD)序列来实现。此外，可以通过引入导致氨基酸取代的错义突变、产生终止密码子的无义突变、或者在编码区中添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变、或者通过缺失基因的一部分来减小或消除这些酶的活性(Journal of biologicalChemistry 272：8611-8617(1997))。另外，可以通过构建其编码区被缺失的编码突变酶的基因，并通过同源重组用所得基因替换染色体基因来减小或消除这些酶的活性。

也可以通过筛选对有机酸类似物或呼吸作用抑制剂有抗性的菌株，或者通过筛选对细胞壁合成抑制剂敏感的菌株来赋予L-谷氨酸生产能力。这些方法的例子包括赋予对于苯并吡喃酮(benzopirone)或萘醌(Naphtoquinone)的抗性(JP56-1889A)、赋予对于HOQNO的抗性(JP56-140895A)、赋予对于α-酮丙二酸的抗性(JP57-2689A)、赋予对于胍的抗性(JP56-35981A)、和赋予对于青霉素的敏感性(JP04-88994A)。

这些细菌的具体例子包括下述菌株。

黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；JP56-1889A)

谷氨酸棒杆菌AJ11355(FERM P-5020；JP56-1889A)

黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；JP57-2689A)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；JP57-2689A)

黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；JP56-140895A)

黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；JP56-35981A)

谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；JP04-88994A)

本发明的棒状杆菌型细菌可以通过向编码α-KGDH复合物E1o亚基的染色体odhA基因引入突变，并挑选几乎以与非突变菌株或野生型菌株相同的生长速率生长，其显示的α-KGDH活性小于非突变菌株或野生型菌株的活性的一半的那些菌株，从如前所述具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌获得。或者，可以首先将这种突变引入到odhA基因，之后赋予L-氨基酸生产能力。

本发明中，α-KDGH活性指催化α-酮戊二酸(2-酮戊二酸)的氧化脱羧反应，产生丁二酰-CoA的活性。上述反应由α-KDGH复合物催化，所述α-KDGH复合物包括三种亚基，即α-酮戊二酸脱氢酶(E1o，ECl.2.4.2)、二氢硫辛酰胺-S-琥珀酰转移酶(E2o，EC：2.3.1.61)、和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3，EC：1.8.1.4)。也就是说，这三种亚基催化下述各个反应：

E1o亚基：

2-酮戊二酸+[二氢硫辛酰赖氨酸-残基琥珀酰转移酶]硫辛酰赖氨酸＝[二氢硫辛酰赖氨酸-残基琥珀酰转移酶]S-琥珀酰二氢硫辛酰赖氨酸+CO₂

E2o亚基：

CoA+酶N6-(S-琥珀酰二氢硫辛酰)赖氨酸＝丁二酰-CoA+酶N6-(二氢硫辛酰)赖氨酸

E3亚基：

蛋白质N6-(二氢硫辛酰)赖氨酸+NAD⁺＝蛋白质N6-(硫辛酰)赖氨酸+NADH+H⁺

″α-KDGH复合物″的活性指催化以上三种反应的总反应的活性。

在大肠杆菌(Escherichia coli)中，这三种亚基形成复合物。

在棒状杆菌型细菌的情况中，E1o亚基由odhA基因编码，E3亚基由lpd基因编码(GenBank登录号Y16642；SEQ ID NO：17)。E2o亚基是作为双功能蛋白与E1o亚基一起由odhA基因编码(Usuda et al.，Microbiology 1996 142，3347-3354)，还是由GenBank数据库中登记为登录号NC_003450的NCg12126(SEQ ID NO：27)的单独基因所编码存在争议。因此，除了E1o亚基之外，odhA基因可编码E2o亚基。

本发明的棒状杆菌型细菌在染色体odhA基因中具有突变。odhA基因包括，例如，具有编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的核苷酸序列的基因。odhA基因还包括例如具有编码SEQ ID NO：51所示氨基酸序列的核苷酸序列的基因。此外，尽管SEQ ID NO：9的核苷酸序列中551至553位的″gtg″是Val的密码子，但有可能翻译为Met，并可在该密码子启动翻译。因此，odhA基因还包括具有编码SEQ ID NO：10的氨基酸37至1257的氨基酸序列的核苷酸序列的基因。另外，odhA基因还可以是编码具有SEQ ID NO：10或51所示氨基酸序列，或SEQ ID NO：10的氨基酸37至1257的氨基酸序列的蛋白质的基因，其包括一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加，只要其显示α-KGDH复合物E1o亚基的活性。E1o亚基本身的活性可以用Massey etal.(Biochim.Biophys.Acta 38，447-460)的方法测定。此处所用″几个″优选为2至20个，更优选2至10个，特别优选2至5个。

更具体地，odhA基因优选具有SEQ ID NO：9的核苷酸443至4213的核苷酸序列，或SEQ ID NO：9的核苷酸551至4213的核苷酸序列。odhA基因可以具有SEQ ID NO：50所示的核苷酸序列。另外，由于odhA基因的核苷酸序列在棒状杆菌型细菌的菌种或菌株之间可以有所不同，因而odhA基因可以为在严紧条件下与具有SEQ ID NO：9核苷酸443至4213的核苷酸序列的多核苷酸、具有SEQ ID NO：50所示核苷酸序列、或SEQ ID NO：9的核苷酸551至4213的核苷酸序列的多核苷酸、或者由所述核苷酸序列制备的探针杂交的基因，只要所述基因编码的蛋白质显示α-KGDH复合物E1o亚基的活性。如此处所用的″严紧条件″为在此条件下形成所谓的特异性杂合体且不形成非特异性杂合体的条件。难以用任何的数值清楚地表示此条件。然而，严紧条件的例子包括在其条件下，DNA于Southern杂交通常洗涤的盐浓度下互相杂交的条件，即在1x SSC、0.1％SDS在60℃，优选0.1x SSC、0.1％SDS在60℃，更优选0.1x SSC、0.1％SDS在68℃洗涤一次或优选2-3次。

本发明中，″突变被引入到染色体odhA基因中″包括其中染色体上的odhA基因被突变的odhA基因替换而产生基本相同的条件的情况，在该条件中突变被直接引入到染色体odhA基因中。

上述突变不仅可以在编码区引入，还可以在odhA基因的表达控制区引入。表达控制区包括，例如启动子、SD序列、和操纵子。odhA基因的表达控制区包括SEQ ID NO：9的核苷酸1至442的核苷酸序列。odhA基因的表达控制序列也可以通过基因分析软件如GENETYX或者通过Goldstein et al.(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，l，105-128)中公开的方法鉴定。

″α-KGDH活性小于非突变或野生型菌株的α-KGDH活性的一半″优选指培养4小时的本发明棒状杆菌型细菌的每单位细胞(每单位蛋白质重量)的α-KGDH活性小于在相同条件下培养的棒状杆菌型细菌的非突变菌株或野生型菌株活性的一半。这种α-KGDH活性减小的棒状杆菌型细菌的例子包括其中每个细胞的α-KGDH分子数目减少的细菌，和其中每个α-KGDH分子的活性减小的细菌。用作对照的野生型棒状杆菌型细菌的例子包括乳发酵短杆菌ATCC 13869菌株。本发明的棒状杆菌型细菌的胞内α-KGDH活性优选小于非突变或野生型菌株所述活性的40％，更优选小于其30％。虽然α-KGDH活性可以降低到不可检测的水平，但优选没有完全消除该活性。可以用Shiio et al.的方法(Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda，Agric.Biol.Chem.，44(8)，1897-1904，1980)测定α-KGDH活性(α-KGDH复合物的活性)。

作为胞内α-KGDH活性减小的结果，棒状杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力提高。本发明中，″提高L-谷氨酸生产能力″优选指当在培养基中培养已在odhA基因中引入突变的棒状杆菌型细菌菌株时，由突变的棒状杆菌型细菌累积在培养基中的L-谷氨酸量大于由野生型或非突变菌株累积的量，或者突变的棒状杆菌型细菌生产L-谷氨酸的速率高于野生型或非突变菌株的生产速率。

短语“与野生型菌株或非突变菌株相比，细菌几乎以相同的生长速率生长”优选指本发明的细菌几乎以与野生型菌株如乳发酵短杆菌ATCC13869相同的生长速率生长。此处，″几乎以相同的生长速率″指野生型或非突变菌株生长速率的80％或更高，更优选90％、或更优选95％或更高。本发明的棒状杆菌型细菌在任何培养温度下都几乎以与野生型或非突变菌株相同的生长速率生长不是必需的。也就是说，在低温下显示足够的生长速率但在高温下显示降低的生长速率的棒状杆菌型细菌，如实施例中所示的GN-2-2菌株也包括于本发明的棒状杆菌型细菌中。

例如，可以通过在培养基中接种相同数目的各菌株的细胞，并在预定时间后比较活细胞数来比较本发明的菌株和野生型或非突变菌株的生长速率。当使用液体培养基时，可以根据例如预定时间后600nm波长的光密度(OD)或细菌细胞的重量计算活细胞数目。当使用固体培养基如平板培养基时，可以根据预定时间后出现的菌落数计算活细胞数目。

向染色体上的odhA基因引入突变的方法的例子包括用X-射线或紫外线照射棒状杆菌型细菌，以及用诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理棒状杆菌型细菌。也可以通过制备突变的odhA基因，并通过同源重组技术用此突变的odhA基因替换染色体odhA基因将突变引入到染色体上的odhA基因中。这种突变的odhA基因可以通过易错PCR、DNA改组、或StEP-PCR(FirthAE，Patrick WM；Bioinformatics.2005Jun 2；Statistics of protein libraryconstruction.)，或重叠-延伸PCR(overlap-extension PCR)(Urban，A.，Neukirchen，S.and Jaeger，K.E.，A rapid and eficient method for site-directedmutagenesis using one-step overlap extension PCR.Nucleic Acids Res，25，2227-8.(1997))制备。

同源重组可以通过使用线性DNA的称为″Red-驱动的整合(Red-drivenintegration)″的方法(Datsenko，K.A.，PNAS，97(12)，6640-6645，2000)，或者通过使用具有温度敏感性复制起点的质粒的方法(USP6303383，和JP05-007491A)来进行。向染色体odhA基因引入突变也可以通过使用不能在棒状杆菌型细菌细胞中复制的质粒或能够通过接合转移到棒状杆菌型细菌的质粒来进行。

用于棒状杆菌型细菌的这种温度敏感性质粒的例子包括p48K和pSFKT2(JP2000-262288A)、pHSC4(法国专利Laid-open公布号2667875，1992和JP5-7491A)、pBS5T等等。这些质粒在棒状杆菌型细菌中可以在至少25℃的温度自主复制，但不能在37℃的温度自主复制。含有pHSC4的AJ12571菌株依据布达佩斯条约的规定于1991年8月26日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and HumanTechnology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry ofInternational Trade and Industry)(目前为产业技术综合研究所特许微生物保藏中心International Patent Organism Depositary，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，其地址为Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，给予保藏号FERMBP-3524。

不能在棒状杆菌型细菌细胞中复制的质粒优选为可在埃希氏菌属的细菌细胞中复制的质粒，其例子包括pHSG299(Takara Bio)和pHSG399(TakaraBio)。能够通过接合转移到棒状杆菌型细菌的质粒的例子包括pK19mobsacB(J.Bacteriology 174：5462-65(1992))。

将突变的odhA基因插入到温度敏感性质粒或者不能在棒状杆菌型细菌中复制的质粒中，所获得的重组质粒用于转化棒状杆菌型细菌。转化可以通过常规方法进行。例如，可以使用用氯化钙处理感受体细胞以增加DNA通透性的方法，其已报导用于大肠杆菌(Mandel，M.and Higa，A.，J.MoI.Biol.，53，159(1970))，和使用从生长细胞制备的感受态细胞以引入DNA的方法，其已报导用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.andYoung，RE.，Gene，1，153(1977))。除了这些方法外，还可以使用将重组DNA引入到原生质体-样或原生质球-样(protoplast-or spheroplast-like)受体细胞中的方法，其已报导可用于枯草芽孢杆菌、放线菌类(actinomytetes)和酵母(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，.A.Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.USA，75，1929(1978))。此外，棒状杆菌型细菌的转化还可以通过电脉冲法进行(Sugimoto et al，JP2-207791A)。

在使用在棒状杆菌型细菌的细胞中无能的质粒的情况下，染色体上的野生型odhA基因由质粒上的突变odhA基因所替换。

在使用温度敏感性质粒的情况下，在热敏感性复制起点不起作用的温度(例如25℃)培养转化的菌株，以获得引入了所述质粒的菌株。然后，在高温下培养转化体以除去温度敏感性质粒，并涂布在含抗生素药物如卡那霉素的平板培养基上。虽然去除了所述质粒的菌株不能在含这种抗生素药物的平板上生长，但其中染色体odhA基因被突变的odhA基因替换的少数菌株能够生长并出现菌落。

在这种如上所述将含突变odhA基因的重组DNA整合到染色体DNA中的菌株中，重组DNA导致与原来存在于染色体上的odhA基因重组，并将染色体odhA基因与突变odhA基因的融合基因插入到染色体，以使重组DNA的其它部分(载体区段、温度敏感性复制起点和药物抗性标记)存在于融合基因之间。然后，为了在染色体DNA上只留下突变的odhA基因，将一个拷贝的odhA基因连同载体区段(包括温度敏感性复制起点和药物抗性标记)从染色体DNA去除。在这种情况下，将正常odhA基因留在染色体DNA上，并将突变的odhA基因从染色体DNA切除，或者相反，将突变的odhA基因留在染色体DNA上，将正常odhA基因从染色体DNA切除。然后，可以使用PCR、Southern杂交等选择在染色体上只留下突变odhA基因的菌株。

可以使用编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因作为重组标志物来进行同源重组。编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因用于有效选择菌株，在所述菌株中，染色体odhA基因被突变的odhA基因所替换，并从染色体消除(cure)载体部分(Schafer，A.et al.，Gene 145(1994)69-73)。也就是说，在棒状杆菌型细菌的情况中，当果聚糖蔗糖酶表达时，通过蔗糖同化产生的果聚糖对细菌来说变得致命，并由此细菌不能生长。因此，通过在含蔗糖平板上培养，可以选择其中在载体中的突变odhA基因和染色体odhA基因之间发生取代，并从中消除了载体的其它部分的菌株。

sacB基因的例子包括下述基因。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subillus)：sacB GenBank登录号X02730(SEQ IDNO：19)

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqufaciens)：sacB GenBank登录号X52988运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)：sacB GenBank登录号L33402嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)：surB GenBank登录号U34874

Lactobacillus sanfranciscensis：frfA GenBank登录号AJ508391

Acetobacter xylinus：lsxA GenBank登录号AB034152

Gluconacetobacter diazotrophicus：lsdA GenBank登录号L41732

<2>本发明的突变的odhA基因

将要引入到染色体odhA基因中的突变没有具体限制，只要其为将α-KGDH活性降至低于非突变菌株或野生型菌株α-KGDH活性的一半，但不引起细菌生长延缓的突变。所述突变的具体例子包括下述突变。

(1)焦磷酸硫胺素结合区中的突变

该突变被引入到辅酶焦磷酸硫胺素的结合区。焦磷酸硫胺素结合区指相应于由odhA基因(SEQ ID NO：9)的核苷酸2498至2584编码区的区域。该区域的氨基酸序列如SEQ ID NO：10中氨基酸686至714所示。该区域中突变的例子包括导致一个或多个氨基酸残基缺失的突变，所述氨基酸残基选自下组：686位的Gly、687位的Leu、688位的Gly、713位的Asn、和714位的Asn。

也可以在odhA基因(SEQ ID NO：9)的核苷酸2534至2548的区域引入焦磷酸硫胺素结合区中的突变。该突变命名为GN型突变。GN型突变优选为导致一个或多个氨基酸残基缺失和/或取代的突变，所述氨基酸残基选自下组：SEQ ID NO：10中698位的Lys、699位的Leu、700位的Arg、701位的Gly、和702位的Tyr。这种突变的例子为缺失SEQ ID NO：10中701位的Gly的突变。具有该突变的突变odhA基因的例子包括具有SEQ ID NO：13的核苷酸443至4213的核苷酸序列的基因，和具有SEQ ID NOS：44、46或48的核苷酸443至4210的核苷酸序列的基因，和由这些基因编码的突变α-KGDH蛋白如SEQ ID NOS：14、45、47、和49所示。具有该突变的突变odhA基因的例子还包括具有SEQ ID NO：13的核苷酸551至4213的核苷酸序列的基因和具有SEQ ID NOS：44、46或48的核苷酸551至4210的核苷酸序列的基因，由这些基因编码的突变α-KGDH蛋白如SEQ ID NOS：14的氨基酸37至1255、和SEQ ID NOS：45、47、和49的氨基酸37至1256所示。在SEQ ID NO：13的核苷酸序列中引入在SEQ ID NO：9的2538位缺失″t″和在SEQ ID NO：9的2543至2547位缺失″ggcta″的突变。

另外，具有突变的突变odhA基因也是优选的，所述突变导致从SEQ IDNO：10中698位的Lys、699位的Leu、700位的Arg、和702位的Tyr组成的组中选择的一个或多个氨基酸残基被另一种氨基酸所替换。所述″另一种氨基酸″没有具体限制，只要其不同于原来的氨基酸，并选自天然氨基酸如Lys、Glu、Thr、Val、Leu、Ile、Ser、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、Met、Phe、Trp、Tyr、Gly、Ala、Pro、和His。然而，优选698位的Lys被除碱性氨基酸如Arg和His之外的氨基酸所替换，699位的Leu被除疏水性脂肪族氨基酸如Ile和Val之外的氨基酸所替换，700位的Arg被除碱性氨基酸如Lys和His之外的氨基酸所替换，702位的Tyr被除羟基氨基酸如Ser和Thr之外的氨基酸所替换。特别优选698位的Lys被疏水性脂肪族氨基酸如Ile、Leu、或Val所替换，699位的Leu被羟基氨基酸如Ser、Thr或Tyr所替换，700位的Arg被含硫氨基酸如Cys或Met所替换，702位的tyr被疏水性脂肪族氨基酸如Ile、Leu、或Val所替换。

GN型突变可以同时导致701位的Gly的缺失和从SEQ ID NO：10中698位的Lys、699位的Leu、700位的Arg、和702位的Tyr组成的组中选择的一个或多个氨基酸残基的替换。这种突变odhA基因的例子包括具有SEQ IDNOS：44、46、和48的核苷酸443至4210的核苷酸序列的基因。由这些突变odhA基因编码的突变α-KGDH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NOS：45、47、和49所示。这种突变odhA基因的例子还包括具有SEQ ID NOS：44、46、和48的核苷酸551至4210的核苷酸序列的基因。由这些突变odhA基因编码的突变α-KGDH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NOS：45、47、和49的氨基酸37至1256所示。然而，在焦磷酸硫胺素结合区具有突变的突变odhA基因不限于这些例子。

(2)2-2型突变

这种类型的突变优选为引入到odhA基因(SEQ ID NO：9)的核苷酸1094至1114区域中的突变，其导致选自SEQ ID NO：10中选自218位的Asp、219位的Val、220位的Ile、221位的Asp、222位的Gly、223位的Lys、和224位的Pro的一个或多个氨基酸残基的缺失和/或取代。2-2型突变优选为在SEQID NO：10中218位缺失Asp的突变。具有此突变的odhA基因的例子包括具有SEQ ID NO：11的核苷酸443至4213的核苷酸序列的odhA基因，或者具有SEQ ID NO：11的核苷酸551至4213的核苷酸序列的odhA基因。由这些基因编码的突变α-KGDH的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：12的37至1256位氨基酸所示。SEQ ID NO：11的核苷酸序列具有在SEQ IDNO：9所示核苷酸序列中缺失1094至1098的″gacgt″并用″ggcc″替换1110至1111的″ag″的突变。

2-2型突变还优选为替换选自219位的Val、220位的Ile、221位的Asp、222位的Gly、和223位的Lys的一个或多个氨基酸的突变。虽然替换这些氨基酸的氨基酸没有具体限制，但优选用除脂肪族疏水性氨基酸如Ile和Leu之外的氨基酸替换219位的Val，用除脂肪族疏水性氨基酸如Leu之外的氨基酸替换220位的Ile，用除酸性氨基酸如Glu之外的氨基酸替换221位的Asp，以及用除简单氨基酸如Ala之外的氨基酸替换222位的Gly。更优选用碱性氨基酸如His、Arg和Lys替换219位的Val、220位的Ile、和221位的Asp，用氨基酸如Asp和Gln替换222位的Gly，以及用氨基酸如Gly和Ala替换223位的Lys。

然而，具有2-2型突变的突变odhA基因不限于这些例子。

(3)GN2-2型突变

该突变同时包括GN型突变和2-2型突变。具有此突变的odhA基因的例子包括具有SEQ ID NO：15的核苷酸443至4213的核苷酸序列的odhA基因，或者具有SEQ ID NO：15的核苷酸551至4213的核苷酸序列的odhA基因。由这些基因编码的突变α-KGDH的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16或SEQID NO：16的氨基酸37至1254所示。然而，具有GN2-2型突变的突变odhA基因不限于这些例子。

用于本发明的其他类型的突变odhA基因可以利用ygg突变株，如以下实施例5中所述的ATCC13869-L来筛选。也就是说，将随机突变引入到odhA基因中，并用于转化ygg突变菌株。从转化体选择几乎以与野生型菌株或非突变菌株相同的生长速率生长，并显示小于野生型菌株或非突变菌株的一半α-KGDH活性的菌株，之后测序。由此可以获得突变的odhA基因。

由上述突变odhA基因编码的α-KGDH复合物的突变E1o亚基是蛋白质，其通过与α-KGDH复合物的E2o和E3亚基形成复合物，具有小于野生型或非突变菌株α-KGDH活性一半的α-KGDH活性，并且在棒状杆菌型细菌中表达时不引起棒状杆菌型细菌严重的生长延缓。

认为即便是一个或几个氨基酸被其它氨基酸所替换，突变E1o亚基的这些特性也将保持，所述一个或几个氨基酸是除上述GN型或2-2型突变体中被替换的特定氨基酸之外的氨基酸，例如不影响酶活性的氨基酸。因此，在以上提到的突变E1o亚基蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NOS：12、14、16、45、47和49，SEQ ID NOS：12、45、47和49的氨基酸37至1256，SEQ ID

NO：14的氨基酸37至1255，或者SEQ ID NO：16的氨基酸37至1254)中，可以替换除GN型或2-2型突变体中被取代的特定氨基酸之外的其它一个或几个氨基酸，只要所编码的蛋白质通过与α-KGDH E2o亚基和E3亚基蛋白一起形成复合物，显示小于野生型α-KGDH复合物一半的α-KGDH活性。此处″几个″优选指2至20个，更优选2至10个，并特别优选2至5个。这种氨基酸取代可以是通过源于细菌个体差异和菌种差异的天然存在的突变所引起的取代，其中odhA基因由所述细菌衍生。例如，具有编码氨基酸序列SEQID NO：51的核苷酸序列的突变odhA基因也可用于本发明，其中对应于上述GN-型突变或2-2型突变的氨基酸被缺失和/或取代。氨基酸序列SEQ ID NO：51中对应于GN-型突变或2-2型突变的这些氨基酸可以很容易地通过比对SEQ ID NOS：10和51的氨基酸序列来鉴定。上述取代优选为保守性取代。在芳香族氨基酸的情况中，保守性取代指phe、trp、和tyr之间的相互取代。在疏水性氨基酸的情况中，保守性取代指leu、ile、和val之间的相互取代。在极性氨基酸的情况中，保守性取代指gln和asn之间的相互取代。在碱性氨基酸的情况中，保守性取代指arg、lys、和his之间的相互取代。在酸性氨基酸的情况中，保守性取代为asp和glu之间的相互取代。在含羟基氨基酸的情况中，保守性取代指ser和thr之间的取代。保守性取代还包括：ser或thr取代ala，gln、his或lys取代arg；glu、gln、lys、his或asp取代asn；asn、glu或gln取代asp；ser或ala取代cys；asn、glu、lys、his、asp或arg取代gln；asn、gln、lys或asp取代glu；val取代gly；asn、lys、gln、arg或tyr取代his；leu、met、val或phe取代ile；ile、met、val或phe取代leu；asn、glu、gln、his或arg取代lys；ile、leu、val或phe取代met；trp、tyr、met、ile或leu取代phe；thr或ala取代ser；ser或ala取代thr；phe或tyr取代trp；his、phe、或trp取代tyr；以及met、ile、或leu取代val。

当E1o亚基和E2o亚基由单个odhA基因编码时，α-KGDH复合物可以包括SEQ ID NO：10(或SEQ ID NO：10的氨基酸37至1257)的蛋白质和SEQID NO：18的蛋白质。当E1o亚基由odhA基因编码且E2o亚基由SEQ ID NO：27的基因编码时，α-KGDH复合物可以包括SEQ ID NO：10的蛋白质、SEQID NO：18的蛋白质、和SEQ ID NO：28的蛋白质。

本发明的突变odhA基因是编码上述突变α-KGDH E1o亚基的基因。本发明的突变odhA基因可以是在严紧条件下，与各自具有SEQ ID NO：11、13、或15的核苷酸443至4213的核苷酸序列的多核苷酸，与各自具有SEQ ID NO：44、46或48的核苷酸443至4210的核苷酸序列的多核苷酸，与SEQ ID NO：11、13、或15的核苷酸551至4213的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：44、46、或48的核苷酸443至4210的核苷酸序列，或与从所述序列制备的探针杂交的基因，只要该基因编码通过与E2o亚基和E3亚基蛋白形成复合物，显示小于野生型α-KGDH复合物一半的α-KGDH活性的蛋白质。严紧条件的例子包括在其条件下，DNAs于Southern杂交通常洗涤的盐浓度下互相杂交的条件，即在1x SSC、0.1％SDS在60℃，优选0.1x SSC、0.1％SDS在60℃，更优选0.1x SSC、0.1％SDS在68℃的条件下洗涤一次或优选2-3次。

<3>生产L-谷氨酸的方法

可以通过在培养基中培养本发明的棒状杆菌型细菌，导致L-谷氨酸在培养基中和/或在细菌细胞中累积，并从培养基和/或细菌细胞收集L-谷氨酸来生产L-谷氨酸。在本发明的生产方法中，优选通过例如在25至40℃培养本发明的棒状杆菌型细菌8至120小时来生产L-谷氨酸。如果在低温下显示足够的生长速率但在高温下显示减小的生长速率的菌株，如实施例中所示的GN-2-2菌株用于L-谷氨酸生产，则优选在低温下如25至30℃培养这种菌株8至30小时，以使所述菌株能够生长；然后在高温下如34至40℃将所得细菌细胞保温16至48小时，使所述菌株能够生产L-谷氨酸。

所述培养基可以是包含碳源、氮源、无机盐、和任选有机微量营养物如氨基酸和维生素的常规培养基。合成培养基或天然培养基均可使用。可以使用任何种类的碳源和氮源，只要它们能够被要培养的菌株所利用。

糖类如葡萄糖、丙三醇、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、和糖蜜可以用作碳源。此外，有机酸如醋酸和柠檬酸、以及醇如乙醇也可以单独或组合作为碳源使用。氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、和乙酸铵、硝酸盐等可以用作氮源。氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、包含蛋白胨的物质、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、和大豆蛋白分解产物可以以少量使用作为有机营养物。当使用其生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变株时，优选添加这种所需的营养物。磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等可以作为无机盐使用。

优选通过控制发酵温度并将培养基的pH调节至3到9来进行需氧培养。培养期间pH降低时，通过添加碱如碳酸钙或氨气来中和培养基。培养约10至约120小时使培养基中累积大量的L-谷氨酸。

此外，可以使用液体培养基进行培养，所述液体培养基被调节至生产的L-谷氨酸结晶并析出的条件。L-谷氨酸结晶的条件包括pH 5.0至4.0，优选pH 4.5至4.0，更优选pH 4.3至4.0，特别优选pH 4.0(EP1233069、EP1233070)。

培养完成后，可以通过常规方法从培养基收集L-谷氨酸。例如可以通过从培养基去除细菌细胞并浓缩L-谷氨酸或者通过使用离子交换层析来收集L- 谷氨酸。当在L-谷氨酸结晶并析出的条件下进行培养时，可以例如通过离心或过滤来收集结晶的L-谷氨酸。在这种情况下，也可以在溶解的L-谷氨酸结晶后收集溶解在培养基中的L-谷氨酸。

实施例

以下本发明将通过参考以下非限制性实施例更具体地解释本发明。

实施例1

<1>携带sacB基因的载体的构建

(A)pBS3的构建

使用枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为模板，SEQ ID NOS：21和22的寡核苷酸作为引物通过PCR，获得了sacB基因(SEQ ID NO：19)。按照以下程序用LAtaq(可由TaKaRa获得)进行PCR：94℃预变性5分钟的一个循环；94℃变性30秒、49℃退火30秒、72℃延伸2分钟的25个循环。用常规方法纯化所得PCR产物，然后用BglII和BamHI消化并平端化。将所述片段插入到已用AvaII消化且平端化的pHSG299中。所得DNA用于转化大肠杆菌JM109(可由Takara Bio获得)的感受态细胞。然后，将转化的细菌细胞涂布到含25μg/ml卡那霉素(以下缩写为″Km″)的LB琼脂平板上，保温一夜。此后，选择出现的菌落作为转化体。从所得转化体分离质粒，并将具有目的PCR产物插入物的质粒命名为pBS3。图1显示构建pBS3的方法。

(B)pBS4S的构建

使用不引起氨基酸取代的交换(cross-over)PCR来破坏pBS3上卡那霉素抗性基因中的SmaI识别位点。首先使用pBS3作为模板，SEQ ID NOS：23和24的合成DNAs作为引物进行PCR，以获得卡那霉素抗性基因的N末端片段。另一方面，为了获得卡那霉素抗性基因的C末端片段，使用pBS3作为模板，SEQ ID NOS：25和26的合成DNAs作为引物进行PCR。按照以下程序用Pyrobest DNA聚合酶(可由TaKaRa Bio获得)进行PCR：98℃预变性5分钟；及98℃变性10秒、57℃退火30秒、72℃延伸1分钟的25个循环。SEQ ID NOS：24和25相互之间部分互补，而且不包含SmaI识别位点。然后，为了获得不含SmaI识别位点的突变卡那霉素抗性基因的全长片段，将上述N末端和C末端基因产物以基本上等摩尔的量互相混合。使用所述基因产物作为模板，SEQ ID NOS：23和26的合成DNAs作为引物进行PCR，以获得引入了突变的Km抗性基因。按照以下程序用Pyrobest DNA聚合酶(可由TaKaRaBio获得)进行PCR：98℃预变性5分钟；及98℃变性10秒、57℃退火30秒、72℃延伸1.5分钟的25个循环。

用常规方法纯化PCR产物，接下来用BanII消化，然后插入到pBS3的上述BanII识别位点中。所得质粒用于转化大肠杆菌JM109(可由Takara Bio获得)的感受态细胞。即，将转化的细菌细胞涂布到包含25μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上，并保温一夜。此后，选择出现的菌落作为转化体。从所得转化体分离质粒，并将具有目的PCR产物插入物的质粒命名为pBS4S。图2显示构建pBS4S的方法。

<2>将odhA突变(GN-型)引入到谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中

编码棒状杆菌型细菌α-酮戊二酸脱氢酶的odhA的序列已有报导(Microbiology 142，3347-3354(1996)，GenBank登录号D84102)。

本发明的发明人成功培育的生产L-谷氨酸的细菌菌株GN的核苷酸序列分析显示，该菌株在odhA基因(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列中具有核苷酸2538和核苷酸2543至2547的缺失，如表1所示。表1还显示了由突变odhA基因编码的突变Elo亚基的氨基酸序列。

表1

菌株	odhA基因的核苷酸序列
		ATCC13869	GCT AAG CTG CGT GGC TAC GAC GTC GGA GGC ACC ATC
OAGN	GCT AAG C-G CGT-----C GAC GTC GGA GGC ACC ATC
		菌株	Elo亚基的氨基酸序列
ATCC13869	Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr Ile
		OAGN	Ala Lys Arg Val------Asp Val Gly Gly Thr Ile

然后，将该突变odhA基因引入到谷氨酸棒杆菌2256菌株(ATCC13869)中并评估。首先制备用于将这些突变引入到谷氨酸棒杆菌2256菌株(ATCC13869)中的质粒。使用Bacterial Genomic DNA Purif.试剂盒(由MSTechnosystems Co.，Ltd.生产)从上述GN菌株提取染色体DNA，使用所获得的染色体DNA作为模板，SEQ ID NOS：1和2的寡核苷酸作为引物进行PCR。按照以下程序使用Pyrobest聚合酶(可由TaKaRa Bio获得)进行PCR以扩增约2.75kb的片段：98℃变性10秒、50℃退火30秒、72℃延伸3分钟的30个循环。所述引物在5’端包含BamHI识别序列，并设计用于扩增GenBank登录号D84102序列的核苷酸1521至4270的区域。扩增的片段用BamHI消化，并连接到用BarnHI消化的pBS4S载体(Ligation kit Ver.2，使用可从Takara Bio获得的产品)，由此获得质粒pBSOAGN(图3显示构建方法)。

通过电脉冲法(JP02-207791A)将pBSOAGN导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中，将所获得的细菌细胞涂布到含25μg/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基(5g/l葡萄糖、10g/l多蛋白胨、10g/l酵母提取物、1g/lKH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/1MnSO₄·4-5H₂O、3g/l尿素、1.2g/l大豆蛋白水解物、和20g/l琼脂，pH调节到7.5)。25℃培养后，通过使用PCR确认出现的菌落为一次重组菌株(once recombinantstrain)，在此菌株中，pBSOAGN通过同源重组整合在染色体上。使用候选菌株的染色体DNA作为模板，具有特异于pBS4S的序列(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列的寡核苷酸和具有特异于染色体上的序列(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR。也就是说，由于pBS4S的序列在非重组菌株的染色体上不存在，因而如果所述候选菌株不是重组菌株，则没有片段通过PCR被扩增。将所获得的一次重组菌株在25℃在含25μg/ml卡那霉素的CM-Dex液体培养基中培养一天，适当稀释所得培养物并涂布到S10平板上，所述S10平板具有上述CM-Dex培养基的组成，其中只是用10g/l的蔗糖替换5g/l的葡萄糖。选择了几个生长在S10平板上并显示卡那霉素敏感性的菌株，然后通过Sanger的方法(J.MoI.Biol.，143，161(1980))确认odhA序列的核苷酸序列。使用BigDye终止物测序试剂盒(由Applied Biysystems生严)通过遗传Analyzer ABI310(由Applied Biosystems生产)分析核苷酸序列。将如此获得的携带GN-型突变odhA基因的菌株命名为ATCC13869OAGN。

<3>将2-2型突变odhA基因导入谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中

本发明的发明人成功培育的生产L-谷氨酸的″2-2″菌株的核苷酸序列分析显示，该菌株在odhA基因(SEQ ID NO：9)中包含核苷酸1094至1098的缺失和以″ggcc″替换处于1110至1111的″ag″，如表2所示。表2还显示了由突变odhA基因编码的突变E1o亚基的氨基酸序列。

表2

菌株	odhA基因的核苷酸序列
		ATCC13869	AAC TCC TAC GAC GTC ATC GAC GGC AAG CCA ACC CTG

OA2-2	AAC TCC TAC---CAT CGA CGG CAG GCC CCA ACC CTG
		菌株	E1o亚基的氨基酸序列
ATCC13869	Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu
		OA2-2	Asn Ser Tyr---His Arg Arg Gln Ala Pro Thr Leu

然后，将该突变的odhA基因导入到谷氨酸棒杆菌2256菌株(ATCC13869)中并评估。首先制备用于将这些突变引入到谷氨酸棒杆菌2256中的质粒。用Bacterial Genomic DNA Purif.试剂盒(由MS Technosystems Co.，Ltd.生产)从2-2菌株分离染色体DNA，使用此染色体DNA作为模板，SEQ ID NOS：5和6的寡核苷酸作为引物进行PCR。按照以下程序使用TaKaRa Ex Taq(可由TaKaRa Bio获得)进行PCR以扩增约2.0kb的片段：94℃变性30秒、55℃退火10秒、72℃延伸2分钟的25个循环。所述引物在5’端包含BamHI识别序列，该引物设计用于扩增GenBank登录号D84102核苷酸序列的核苷酸51至2150区域。扩增的片段用BamHI消化，并使用Takara Bio的Ligation kit Ver.2连接到经BamHI消化的pBS4S载体，由此获得质粒pBSOA2-2(图4显示构建图)。实施与实施例1<2>中所述相同的步骤以获得携带2-2型突变odhA基因的菌株(ATCC13869OA2-2菌株)。

<4>将2-2型突变引入到ATCC13869OAGN菌株的GN型odhA基因中

按照与实施例1<2>中所述相同的方法，将实施例1<3>中构建的质粒pBSOA2-2导入实施例1<2>中制备的ATCC13869OAGN菌株中，以获得odhA基因中同时携带GN型和2-2型突变的ATCC13869菌株。以下由2-2型突变和GN型突变组成的双突变也称为GN2-2突变。

虽然在实施例1<2>至<4>中，所述突变株使用通过PCR扩增的突变odhA基因制备，所述PCR利用来自GN菌株或2-2菌株的染色体DNA作为模板，但它们也可以通过使用突变的odhA基因制备，所述突变的odhA基因通过定点诱变技术如使用Mutan-Super Express Km试剂盒(Takara Bio)的技术获得。例如，可以如以下所述获得具有类似于实施例1<2>中制备的pBSOAGN的结构的质粒。即，使用SEQ ID NOS：2和5的合成DNAs作为引物，野生型odhA基因的染色体DNA作为模板，通过PCR制备odhA基因片段，并将所得PCR片段克隆到Mutan-Super Express Km试剂盒附带的质粒pKF 19k的BamHI识别位点。接下来，使用所得质粒模板和具有磷酸化的5’-末端的SEQ ID NO：7 的合成DNA引物和Mutan-Super Express Km试剂盒附带的选择引物进行另一PCR。用所得PCR产物转化sup⁰大肠杆菌，例如MV 1184菌株(可由Takara Bio获得)，结果构建了包含突变odhA基因片段的质粒。最后，用BamHI消化所述片段并插入到pBS4S载体中，由此可以构建与pBSOAGN类似的质粒。

类似地，为了获得包含2-2型突变的odhA基因，可以用具有磷酸化的5’-末端的SEQ ID NO：8的合成DNA代替上述方法中具有磷酸化的5’-末端的SEQ ID NO：7的合成DNA来构建类似于pBSOA2-2的质粒。

此外，为了获得包含GN2-2双突变的odhA基因，从上述类似于pBSOAGN的质粒切除或PCR扩增包含GN-型突变的片段，并用于替换上述类似于pBSOA2-2的质粒上的相应片段。

实施例2

菌株ATCC13869OAGN、OA2-2、和OAGN2-2降解谷氨酸的能力的对比

虽然携带野生型odhA基因的菌株能够同化培养基中的L-谷氨酸，但推测由于odhA突变而削弱或消除了α-KGDH活性的菌株也具有减小的降解谷氨酸的能力。然后，使用实施例1<2>至<4>中制备的各odhA突变株ATCC13869OAGN、OA2-2、和OAGN2-2测定降解谷氨酸的能力。各菌株均在CM-Dex平板上在25℃培养一天，然后接种到液体培养基中，所述液体培养基由20g/l谷氨酸钠、2.64g/l(NH₄)₂SO₄、0.5g/l KH₂PO₄、0.5g/l K₂HPO₄、0.25g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、0.01g/lCaCl₂、0.02mg/l CuSO₄、40g/l MOPS、0.03g/l原儿茶酸(protocatechinic acid)、200μg/l维生素B1、和300μg/l生物素(用NaOH调节至pH 6.7)组成，之后在25℃和34℃培养50小时。分别测定起点、和培养25小时和50小时后谷氨酸的量，并比较25℃和34℃培养的菌株之间降解的(degraded)谷氨酸的量。表3显示结果。特别地，GN2-2突变株显示降解的谷氨酸的量明显减小，尤其是当培养温度为34℃时。这些结果表明引入GN2-2突变能够有效地减小α-KGDH活性，具有此突变的菌株优选用于L-谷氨酸生产。

表3：降解的谷氨酸的量

(单位：g/l)

实施例3

ATCC13869OAGN、OA2-2、和OAGN2-2菌株α-KGDH活性的对比

菌株ATCC13869OAGN、OA2-2、和OAGN2-2的α-KGDH活性如下所述使用实施例4中自培养起始4小时后收集的培养液测定。所述活性按照Agric.Biol.Chem.，44(8)，p1897(1980)中所述方法测定。具体地，在用0.2％氯化钠洗涤细菌细胞后，将其悬浮在含30％甘油的100mM TES-NaOH(pH 7.5)缓冲溶液中。用Bioruptor(Olympus)超声处理细菌细胞，然后离心以去除未破裂的细菌细胞，之后使用Sephadex-G25(Amersham Pharmacia)用相同缓冲液凝胶过滤。将如此获得的制备物用作粗酶溶液。将所述粗制酶溶液添加到含100mM TES-NaOH(pH 7.7)、5mM MgCl2、0.2mM CoA、0.3mM辅羧酶(cocarboxylas e)、1mM α-酮戊二酸、3mM L-半胱氨酸、和1mM乙酰吡啶-腺嘌呤-二核苷酸的反应体系，用Hitachi分光光度计U-2001在31.5℃在365nm测定吸收。在粗制酶溶液中蛋白浓度的测量中，使用蛋白质测试(Bio-Rad)。牛血清白蛋白用作标准蛋白质。

表4显示测定α-KGDH活性的结果。与ATCC13869相比，引入GN型突变、2-2型突变、和GN2-2型突变导致α-KGDH活性减小。特别地，在引入GN2-2型突变的菌株的情况中，观测到相当大的活性减小。这表明GN型突变、2-2型突变、和GN2-2型突变是减小α-KGDH活性的突变。

表4：α-KGDH活性

(单位：ΔAbs/min/mg蛋白质)

实施例4

菌株ATCC13869OAGN、OA2-2、和OAGN2-2的L-谷氨酸生产能力的对比

在发酵釜培养中检验菌株ATCC13869OAGN、OA2-2、和OAGN2-2的L-谷氨酸生产能力。首先，将上述四种菌株在25℃在CM-Dex琼脂培养基上培养一天，并将所得的细菌细胞接种在300ml灭菌的种子培养基(seed medium)中，所述种子培养基含60g/l葡萄糖、1.54g/l H₃PO₄、1.45g/l KOH、0.9g/lMgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、670μg/l维生素B 1、3,200μg/l生物素、0.28g/l DL-Met、1.54g/l大豆蛋白水解物、和0.1ml/l消泡剂AZ-20R，一直培养到糖被完全耗尽。在培养期间，以1/l VVM通气来搅拌培养基，以使溶解氧的浓度保持在不小于5％。用氨气将培养期间的pH控制到pH 7.2。然后，将30ml所得种子培养物接种到270ml含80g/l葡萄糖、3.46g/l KH₂PO₄、1.0g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、230μg/l维生素B 1、525μg/l生物素、0.35g/l大豆蛋白水解物、和0.2ml/l消泡剂AZ-20R的主培养基中，在25℃或34℃培养。培养期间如上所述进行通气。用氨气将培养期间的pH控制在pH 7.3。

表5显示自培养起始约7.5小时后累积的L-谷氨酸的量。图5、6和7分别显示L-谷氨酸累积、细菌细胞量、和残余糖分的时间进程。ATCC13869菌株不累积L-谷氨酸，而OAGN和OAGN2-2突变菌株累积L-谷氨酸。特别地，当这些菌株在34℃培养时，所累积的L-谷氨酸的量显著增加。每种引入突变的菌株都显示几乎与野生型菌株相同的生长速率。

由这些结果证实GN型突变、2-2型突变、和GN2-2型突变对增加L-谷氨酸生产是有效的。发现在这些突变当中，GN2-2型突变对L-谷氨酸生产有最显著的影响。

表5：引入odhA突变的菌株所生产的L-谷氨酸(GIu)的量

实施例5

用yggB突变菌株筛选odhA突变菌株

<L30型yggB突变菌株的构建>

首先，由ATCC13869菌株构建在yggB基因中具有突变的突变菌株。L30型突变为在yggB基因(SEQ ID NO：29)中用″T″替换1768位的″C″的突变。具有L30型突变的突变yggB基因如SEQ ID NO：31所示，由该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示。所述突变yggB基因以与实施例1中相同的方法构建。即，使用SEQ ID NOS：33和34的引物和ATCC13869菌株的染色体DNA模板通过PCR制备编码ygg基因N-末端部分的片段。以类似的方式使用SEQ ID NOS：35和36的引物和ATCC13869菌株的染色体DNA模板通过PCR制备编码ygg基因C-末端部分的片段。随后，利用SEQ ID NOS：37和35的引物以及等量的N-末端片段和C-末端片段的混合物模板通过PCR获得包含L30型突变的yggB基因片段。用SacI消化所得PCR产物并连接到SacI消化的pBS4S，由此获得用于引入所述突变的质粒(pBS4 yggB-L)。将所得pBS4yggB-L整合到ATCC13869菌株的染色体中，然后按照与实施例1中类似的方法将其从所述菌株消除。测定所得卡那霉素抗性菌株yggB基因的核苷酸序列，并选择其中yggB基因被L30型替换的菌株。将具有SEQ ID NO：31的yggB基因的菌株命名为ATCC 13869-L菌株。该菌株可用于odhA突变基因的筛选。

<ygg、odhA双突变菌株的构建>

然后，将表6所示的各种突变引入到ATCC13869-L菌株的染色体odhA基因中。表6中显示了各菌株相应于SEQ ID NO：9的核苷酸2528至2562区域的核苷酸序列。表7中显示了各菌株相应于SEQ ID NO：10的氨基酸696至707区域的氨基酸序列。

引入具有核苷酸序列SEQ ID NO：42的odhA基因的L30sucA8菌株可以如下获得。使用SEQ ID NOS：2和5的引物通过PCR制备突变的odhA基因片段。所得片段用BamHI消化并连接到Mutan-Super Express Km(Takara Bio)附带的质粒pKF19m的BamHI位点。然后，使用具有磷酸化的5’-末端的引物SEQ ID NO：38和Mutan-Super Express Km的选择引物进行PCR，所得PCR产物用于转化sup0-大肠杆菌菌株如MV1184菌株，以得到包含突变odhA片段的质粒。将该片段插入到pBS4S质粒中，按照与实施例1中类似的方法用所得质粒转化ATCC13869-L菌株，由此获得所述质粒整合到其染色体中的菌株。然后，从这些菌株中选择对蔗糖有抗性且对卡那霉素敏感的菌株。测定所选择菌株的odhA基因的核苷酸序列，并选择其中由于odhA基因中的移码突变而使α-KGDH功能缺陷的菌株作为ATCC13869-L30sucA8(odhA8)菌株。其它的odhA突变菌株可以使用yggB突变菌株通过类似的方法获得。

引入了具有核苷酸序列SEQ ID NO：44的突变odhA基因的sucA801菌株可以通过与上述类似的方法获得，所述方法中，用具有磷酸化的5’-末端的引物SEQ ID NO：39代替引物SEQ ID NO：38。

引入了具有核苷酸序列SEQ ID NO：46的突变odhA基因的sucA805菌株可以通过与上述类似的方法获得，所述方法中，用具有磷酸化的5’-末端的引物SEQ ID NO：40代替引物SEQ ID NO：38。

引入了具有核苷酸序列SEQ ID NO：48的突变odhA基因的sucA77菌株可以通过与上述类似的方法获得，所述方法中，用具有磷酸化的5’-末端的引物SEQ ID NO：41代替引物SEQ ID NO：38。

L30sucA8菌株没有胞内α-KGDH，因为sucA8突变是引起α-KGDH蛋白不成熟截断的移码突变。另一方面，sucA801菌株、sucA805菌株和sucA77菌株具有减小的但有一些α-KGDH活性，因为这些突变不是移码突变，而且不引起α-KGDH蛋白的不成熟截断。

表6：odhA突变基因的部分核苷酸序列

菌株	odhA基因的核苷酸序列
		ATCC13869-L	CTG GCT AAG CTG CGT GGC TAC GAC GTCGGA GGC ACC
L30sucA8	CTG GCT AAG CTG CGT C GAC GTC GGAGGC ACC
		L30sucA801	CTG GCT AAG CTG CGT CTC GAC GTC GGA GGC ACC
L30sucA805	CTG GCT AAA AGC TGC GTC GAC GTC GGA GGC ACC
		L30sucA77	CTG GCT ATA AGC TGC GTC GAC GTC GGA GGC ACC

表7：odhA突变体的氨基酸序列

菌株	E1o亚基的氨基酸序列
		野生的	Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr
L30sucA8(ΔsucA)	Leu Ala Lys Leu Arg Arg Arg Arg Arg His

L30sucA801	Leu Ala Lys Leu Arg---Leu Asp Val Gly Gly Thr
		L30sucA805	Leu Ala Lys Ser Cys---Val Asp Val Gly Gly Thr
L30sucA77	Leu Ala Ile Ser Cys---Val Asp Val Gly Gly Thr

<使用携带各种突变odhA基因的菌株生产L-谷氨酸>

通过在坂口(Sakaguchi)烧瓶中培养所得odhA突变菌株来评估这些菌株的L-谷氨酸生产力。将表6列出的各种菌株在CM-Dex琼脂培养基上在31.5℃培养过夜，然后将1/6的培养物转移到20ml含60g/l葡萄糖、22.5g/l(NH₄)₂SO₄、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/lMnSO₄·4-5H₂O、200μg/l维生素B1、0.48g/l大豆蛋白水解物、和300μg/l生物素(用KOH调节至pH 8.0)的培养基中，添加CaCO₃并在31.5℃、115rpm搅动培养。培养19小时后累积的L-谷氨酸的量如表8所示。sucA801、sucA805、和sucA77菌株显示高于ATCC13869-L菌株和sucA8菌株的L-谷氨酸生产力，其中ATCC13869-L菌株携带野生型odhA基因，而sucA8菌株携带含有移码突变的odhA基因。这些结果显示，通过将突变引入到odhA基因的焦磷酸硫胺素结合区附近区域中以调节α-KGDH活性，从而有效地生产了L-谷氨酸。

表8：odhA突变菌株的L-谷氨酸生产

菌株	L-谷氨酸(g/L)
		ATCC13869-L	4.9
L30sucA8	19.8
		L30sucA801	22.1
L30sucA805	23.8
		L30sucA77	21.6