CN101248170B

CN101248170B - 产生l-谷氨酸的细菌和用于产生l-谷氨酸的方法

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Publication number: CN101248170B
Application number: CN2006800311678A
Authority: CN
Inventors: 平野圣子; 中村纯; 伊藤久生
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2005-08-26
Filing date: 2006-08-23
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2026-08-23
Also published as: EP1930409A4; KR101078611B1; JPWO2007024010A1; US7867735B2; EP1930409A1; KR20080038438A; CN101248170A; US20090258402A1; EP1930409B1; WO2007024010A1

Abstract

本发明涉及用于产生L-谷氨酸的方法，包括如下步骤：在培养基中培养具有产生L-谷氨酸的能力并且经修饰而使fasR基因的表达增强的棒状杆菌型细菌，以在培养基或细胞中产生和积累L-谷氨酸，和从所述培养基或细胞中收集L-谷氨酸。

Description

产生L-谷氨酸的细菌和用于产生L-谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及发酵工业，更精确地，本发明涉及用于产生L-谷氨酸的方法和用于所述方法的棒状杆菌型细菌(coryneform bacterium)。L-谷氨酸作为调味品(seasoning)的原料广泛使用。

背景技术

通常使用具有产生L-谷氨酸的能力的属于短杆菌属(Brevibacterium)或棒杆菌属(Corynebacterium)等的棒状杆菌型细菌通过发酵来产生L-谷氨酸。为了改进这些棒状杆菌型细菌的生产力，使用从自然界分离的细菌菌株，或它们的人工突变菌株或通过基因重组修饰的菌株。

棒状杆菌型细菌的野生型菌株在生物素过量存在的条件下不产生L-谷氨酸。因此，在常规的L-谷氨酸产生方法中，采用在限制生物素浓度的培养基中的培养，或者，当使用含有足量生物素的培养基时，采用在培养起始或培养期间添加表面活性剂或内酰胺抗生素作为生物素活性抑制剂的培养基中的培养。然而，特别在使用价廉但是含有过量生物素的原料如糖蜜黑废液(blackstrap molasses)作为培养基的碳源时，必需向培养基添加的生物素活性抑制剂导致高生产成本(非专利文献1)。

同时，已经鉴定了源自棒杆菌属细菌并且赋予所述细菌对于表面活性剂的抗性的蛋白质(DTSR蛋白)编码基因(dtsR基因)的存在；并且已经阐明将该基因破坏的产生L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌即使在生物素以野生型菌株几乎不产生L-谷氨酸的量存在的条件下，也产生可观量的L-谷氨酸；还已阐明如果在产生L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌中扩增dtsR基因，则所述菌株产生L-谷氨酸的能力得到增强。

此外，本发明的发明人发现如果将对于生物素活性抑制剂的温度敏感性赋予产生L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌，则所述细菌能够稳定地通过发酵产生L-谷氨酸，即使在生物素存在下；还发现如果将产生L-赖氨酸的能力赋予对生物素活性抑制剂表现出温度敏感性的菌株，则所述菌株能够稳定地通过发酵同时产生L-赖氨酸和L-谷氨酸，即使在生物素存在下。他们进一步披露使用编码温度敏感型变体DTSR蛋白的变体dtsR基因的基因取代作为一种将对于生物素活性抑制剂的温度敏感性赋予棒状杆菌型细菌的方法(专利文献2)。

然而，在棒状杆菌型细菌中，至今未知任何通过增加其表达量来改进对于表面活性剂的敏感性的基因。

非专利文献1：Biosci.Biotech.Biochem.，61(7)，1109-1112，1997

非专利文献2：Biochem.Biophys.Res.Commun.，1997 May 8，234(1)：157-61

专利文献1：International Patent Publication WO95/23224

专利文献2：International Patent Publication WO96/06180

发明内容

本发明的目的是提供在使用棒状杆菌型细菌的L-谷氨酸产生中用于改进产生L-谷氨酸的能力的新技术。

本发明的发明人们为了达到上述目的进行了多方面研究。结果，它们发现通过扩增细胞中棒状杆菌型细菌的fasR基因，能够改进所述细胞产生L-谷氨酸的能力，并且使L-谷氨酸产生能够在富含生物素并且不添加生物素活性抑制剂如表面活性剂的培养基中进行，由此完成了本发明。

(1)具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，对所述棒状杆菌型细菌进行修饰以使fasR基因的表达增强，并且所述棒状杆菌型细菌与未将fasR基因增强的菌株相比显示改进的对于表面活性剂的敏感性。

(2)根据(1)的棒状杆菌型细菌，其中所述fasR基因是(a)或(b)中限定的DNA：

(a)含有SEQ ID NO：3中核苷酸序列号506至976的核苷酸序列的DNA，

(b)在严紧条件下可与SEQ ID NO：3中核苷酸序列号506至976的核苷酸序列杂交的DNA，并且当所述DNA的表达在棒状杆菌型细菌中增强时，该DNA编码的蛋白质显示使棒状杆菌型细菌对于表面活性剂的敏感性改进的活性。

(3)根据(1)或(2)的棒状杆菌型细菌，通过增加基因的拷贝数或修饰基因的表达调控序列对所述棒状杆菌型细菌进行修饰以使fasR基因的表达增强。

(4)用于产生L-谷氨酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养根据(1)-(3)任一项的棒状杆菌型细菌以在培养基或细胞中产生和积累L-谷氨酸；和从所述培养基或细胞中收集L-谷氨酸。

附图简述

图1显示用于fasR基因扩增的质粒pVKFASR的构建方法

图2：显示在表面活性剂存在下fasR基因扩增型菌株的生长曲线。

优选实施方式描述

<1-1>具有产生L-谷氨酸能力的本发明的棒状杆菌型细菌

本发明的棒状杆菌型细菌是具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，并且所述细菌经修饰而将fasR基因的表达增强，并且所述细菌与未将fasR基因增强的菌株相比显示改进的对于表面活性剂的敏感性。

用于本发明的棒状杆菌型细菌包括棒杆菌属细菌，和曾经归类于短杆菌属，但是已经重新归类于棒杆菌属的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，并且进一步包括属于极其接近棒杆菌属的短杆菌属的细菌。具体实例包括以下：

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumeffieiens)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)

白色短杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

具体而言，可包括以下菌株：

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870

醋谷棒杆菌ATCC 15806

烷醇棒杆菌ATCC 21511

美棒杆菌ATCC 15991

谷氨酸棒杆菌ATCC 13020、ATCC 13032、ATCC 13060

百合花棒杆菌ATCC 15990

栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965

嗜热产氨棒杆菌AJ 12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌ATCC 13868

二歧短杆菌ATCC 14020

黄色短杆菌ATCC 13826、ATCC 14067

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

乳发酵短杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒杆菌ATCC 13869)

玫瑰色短杆菌ATCC 13825

解糖短杆菌ATCC 14066

生硫短杆菌ATCC 19240

产氨短杆菌ATCC 6871、ATCC 6872

白色短杆菌ATCC 15111

蜡状短杆菌ATCC 15112

嗜氨微杆菌ATCC 15354

这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得。即，给予每个菌株登记号。使用该登记号(http://www.atcc.org/)能够订购菌株。对应于各菌株的登记号列于ATCC的目录。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定，将AJ12340菌株于1987年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscienceand Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry ofinternational Trade and Industry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)，位于Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，并给予登录号FERM BP-1539。

在本发明中，“产生L-谷氨酸的能力”的意思是当在培养基中培养本发明的棒状杆菌型细菌时，在培养基或细胞中积累L-谷氨酸的能力。本发明的细菌可能具有这种产生L-谷氨酸的能力作为棒状杆菌型细菌野生菌株的特性，或所述能力可为通过培育赋予或增强的性质。此外，可通过用下文描述的方式增强fasR基因的表达来赋予产生L-谷氨酸的能力。

用于通过培育来赋予或增强产生L-谷氨酸的能力的方法的实例包括增强基因的表达，所述基因编码L-谷氨酸生物合成中涉及的酶。L-谷氨酸生物合成中涉及的酶的实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡糖磷酸异构酶等。

就用于增强这些基因的表达的方法而言，能够通过以下方法实现增强：引入扩增质粒，所述质粒通过将含有任何这些基因的DNA片段引入适合的质粒而获得，所述质粒例如含有至少负责该质粒在棒状杆菌型细菌中复制和增殖功能的基因的质粒载体；通过接合、基因转移等增加这些基因在染色体中的拷贝数；或通过在这些基因的启动子区引入突变(参考International PatentPublication WO95/34672)。在棒状杆菌型细菌中可自主复制的质粒的实例包括但不限于，Japanese Patent Laid-open No.3-210184中描述的质粒pCRY30；Japanese Patent Laid-open No.2-72876和US.Patent No.5,185,262中描述的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX；JapanesePatent Laid-open No.1-191686中描述的质粒pCRY2和pCRY3；Japanese PatentLaid-open No.58-67679中描述的pAM330；Japanese Patent Laid-open No.58-77895中描述的pHM1519；Japanese Patent Laid-open No.58-192900中描述的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；Japanese Patent Laid-open No.57-134500中描述的pCG1；Japanese Patent Laid-open No.58-35197中描述的pCG2；JapanesePatent Laid-open No.57-183799中描述的pCG4和pCG11等。

在将目标基因引入前述扩增质粒或染色体时，可以使用任何启动子作为用于所述基因表达的启动子，只要选择在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子。启动子可以是所用基因的固有启动子，或修饰的启动子。基因的表达还能够如下调节：通过适当地选择在棒状杆菌型细菌中发挥强效功能的启动子，或通过使启动子的-35和-10区接近共有序列。经修饰而使柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和/或谷氨酸脱氢酶的基因表达增强的棒状杆菌型细菌的实例包括International Patent Publication WO00/18935和EuropeanPatent Publication No.1010755等中描述的微生物。

还可以通过降低或缺失酶的活性来获得赋予产生L-谷氨酸的能力的修饰，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径分支、产生另外的化合物的反应。催化从L-谷氨酸生物合成途径分支以合成L-谷氨酸之外化合物的反应的酶的实例包括异柠檬酸裂合酶、α-酮戊二酸脱氢酶、乙酰磷酸转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、乙酰甲酸转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶(1-pyrroline dehydrogenase)等。α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的棒状杆菌型细菌的实例包括以下菌株。

乳发酵短杆菌ΔS菌株(WO95/34672)

乳发酵短杆菌AJ12821菌株(FERM BP-4172；参见FR9401748)

黄色短杆菌AJ12822菌株(FERM BP-4173；参见FR9401748)

谷氨酸棒杆菌AJ12823菌株(FERM BP-4174；参见FR9401748)

为了降低或缺失上述酶中任一种的活性，可以通过常规诱变方法将突变引入染色体上前述酶的基因中，所述突变使所述酶的胞内活性降低或缺失。例如，这能够通过缺失染色体上编码所述酶的基因，或通过基因重组修饰表达调控序列如启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列来实现。此外，也能够通过将氨基酸取代的突变(错义突变)、终止密码子(无义突变)或添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变引入染色体上的酶编码区中来实现，或通过将基因部分或整体地缺失来实现(Journal of Biological Chemistry，272：8611-8617(1997))。此外，还能够通过构建编码其编码区缺失的突变酶的基因，并且通过同源重组等用构建的基因取代染色体上的正常基因；或通过在基因中引入转座子或IS因子，来降低或缺失酶活性。

为了将这种如上所述降低或缺失酶活性的突变引入基因，例如，可以使用以下方法。通过修饰目标基因的部分序列来制备突变基因，将所述突变基因设计为不产生正常发挥功能的酶，并且用含有所述基因的DNA转化棒状杆菌型细菌以引起突变基因和染色体上基因的重组，可用突变基因取代染色体上的目标基因。已经建立这种以利用同源重组的基因取代为基础的位点特异性诱变，关于该方法的实例包括使用线性DNA或含有温度敏感复制起点的质粒的方法(U.S.Patent No.6,303,383、Japanese Patent Laid-open No.05-007491)等。此外，如上所述的这种以利用同源重组的基因取代为基础的位点特异性诱变还能够通过使用在宿主中不显示复制能力的质粒进行。

用于棒状杆菌型细菌的温度敏感质粒的实例包括p48K和pSFKT2(关于这些质粒参见U.S.Patent No.6,303,383)、pHSC4(参见French Patent Laid-openNo.2667875，1992和Japanese Patent Laid-open No.5-7491)等。在棒状杆菌型细菌中，这些质粒至少能够在25℃自主复制，但是不能在37℃自主复制。将含有pHSC4大肠杆菌AJ12571于1990年10月11日保藏在国立生命科学和人体技术研究所(the National Institute of Bioscience and Human-Technology，the Agency of Industrial Science and Technology，the Ministry of InternationalTrade and Industry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，postal code：305-5466))，并给予登录号FERM P-11763。然后根据布达佩斯条约的规定，在1991年8月26日将所述保藏转为国际保藏，并给予登录号FERM BP-3524。

赋予或增强产生L-谷氨酸的能力的其它方法包括赋予对有机酸类似物或呼吸抑制剂的抗性，或赋予对细胞壁合成的抑制剂的敏感性。这些方法的实例包括，例如赋予对苯并吡喃酮(benzopirone)或萘醌(naphtoquinones)的抗性(JP56-1889A)，赋予对HOQNO的抗性(JP56-140895A)，赋予对α-酮丙二酸的抗性(JP57-2689A)，赋予对胍的抗性(JP56-35981A)，赋予对青霉素的敏感性(JP04-88994A)，赋予道诺霉素(daunomycin)抗性(JP58-158192A)等。

这种抗性细菌的具体实例包括以下菌株：

黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；JP56-1889A)

谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020；JP56-1889A)

黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；JP57-2689A)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；JP57-2689A)

黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；JP56-140895A)

黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；JP56-35981A)

谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；JP04-88994A)

优选作为本发明的棒状杆菌型细菌的亲本菌株使用的棒状杆菌型细菌是在以下条件下积累L-谷氨酸的菌株：限制培养基中生物素浓度的条件；或培养基含有高浓度的生物素，并且含有表面活性剂或内酰胺抗生素作为生物素活性抑制剂的条件。在本文中，表面活性剂的实例包括饱和脂肪酸例如月桂酸、豆蔻酸、硬脂酸和棕榈酸，脂肪酸酯型非离子表面活性剂例如脂肪酸甘油酯、脂肪酸脱水山梨糖醇酯、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇/聚丙二醇脂肪酸酯和聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，和N-酰基氨基酸例如N-棕榈酰甘氨酸、N-棕榈酰丙氨酸、N-棕榈酰缬氨酸、N-棕榈酰亮氨酸、N-棕榈酰苏氨酸、N-棕榈酰甲硫氨酸、N-棕榈酰天冬氨酸、N-棕榈酰谷氨酸、N-豆蔻酰谷氨酸、N-硬脂酰谷氨酸、N，N’-二棕榈酰鸟氨酸和N，N’-二棕榈酰赖氨酸。抗生素的实例包括内酰胺抗生素类例如青霉素和头孢噻啶(cephaloridine)(Yamada K.，Takahashi J.& Nakamura J.，Hakkokogaku Kaishi，20，348-350(1962)；Udagawa K.，Abe S.& Kinoshita S.，Hakkokogaku Kaishi，40，614-619(1962))。

在本文中，限制生物素浓度的条件相应于在产生L-谷氨酸的条件下，培养基中的生物素浓度为30μg/L或更低，优选20μg/L或更低，更优选10μg/L或更低，或所述培养基可以完全不含生物素。在培养基含有高浓度的生物素，并且含有表面活性剂或内酰胺型抗生素作为生物素活性抑制剂的条件下，培养基含有浓度为50μg/L或更高，优选100μg/L或更高，更优选200μg/L或更高的生物素；所述培养基中作为生物素活性抑制剂的表面活性剂的浓度是0.1U/ml或更高，优选0.2U/ml或更高，更优选0.4U/ml或更高；并且培养基中作为生物素活性抑制剂的表面活性剂的浓度是0.4g/L或更高，优选1g/L或更高，更优选2g/L或更高。然而，只要诱导L-谷氨酸的产生，这些物质的浓度可以是任何浓度。

适合作为在上述产生L-谷氨酸的条件下积累L-谷氨酸的菌株的实例包括，例如上述棒状杆菌型细菌的野生型菌株和以下菌株。

黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；JP57-2689A)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；JP57-2689A)

乳发酵短杆菌AJ11426(FERM P-5123 JP56-048890A)

谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERM P-5137 JP56-048890A)

乳发酵短杆菌AJ11796(FERM P-6402 JP58-158192A)

<1-2>fasR基因表达的增强

“修饰以使fasR基因的表达增强”的情形相应于以下情形：与亲本菌株或野生型菌株相比，每细胞FasR产物的分子数增加；每细胞FasR产物的活性增加等。作为参照用于比较的野生型棒状杆菌型细菌是例如谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC 13869或ATCC 13032。如果对棒状杆菌型细菌进行修饰而使fasR基因的表达量增加，则所述棒状杆菌型细菌对于表面活性剂的敏感性增加。

在本发明中，“增加对于表面活性剂的敏感性的活性”意指本发明的fasR基因产物的活性。具体而言，其意指通过增加fasR基因的表达量使L-谷氨酸能够在含有高浓度生物素的培养基中产生的活性。“含有高浓度生物素的培养基”在本文中指具有50μg/L或更高，优选100μg/L或更高，更优选200μg/L或更高的生物素浓度的培养基，并且所述培养基不含生物素活性抑制剂例如青霉素或表面活性剂，或含有降低浓度的生物素活性抑制剂。就生物素活性抑制剂而言，期望地以0.1g/L或更低，优选0.05g/L或更低，更优选0.01g/L或更低的浓度添加表面活性剂，或可以完全不添加表面活性剂。

此外，当亲本菌株具有在含有高浓度生物素、缺乏生物素活性抑制剂的培养基中积累L-谷氨酸的能力时，通过扩增fasR基因来改进L-谷氨酸生产力。在本文中，如果fasR基因扩增型菌株显示培养基中的L-谷氨酸积累量或L-谷氨酸产生速率高于未扩增菌株的情况，则能够说明fasR基因扩增型菌株产生L-谷氨酸的能力得到改进。如果通过改进fasR基因的表达使每糖产率(yieldper saccharide)与亲本菌株或未修饰菌株相比改进例如2％或更多，期望地4％或更多，更期望地6％或更多，则能够说明产生L-谷氨酸的能力得到改进。

能够通过与野生型或未修饰的菌株比较fasR的mRNA量来确认fasR基因表达量的增加。用于确认表达量的方法的实例包括Northern杂交和RT-PCR(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)2001)。只要与野生菌株或未修饰菌株相比有所增加，不具体限制表达量的增加程度。然而，与野生菌株或未修饰菌株相比期望表达量增加到例如1.5倍或更多，优选2倍或更多，更优选3倍或更多。

本发明的fasR基因编码的蛋白质是一种转录调节蛋白(transcriptionalregulator)或其同源物，并且当该蛋白(Fatty Acid Synthase Regulator，fasR)表达增强时，所述蛋白质显示使棒状杆菌型细菌对于表面活性剂的敏感性改进的活性。编码棒状杆菌型细菌的fasR的基因(fasR基因)的实例包括例如，含有源自谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC 13869的SEQ ID NO：3中核苷酸号506至976的核苷酸序列的DNA，和具有源自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因。谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的fasR基因由登记为Genbank Accession No.NC_003450的基因组序列的核苷酸3189878至3190351编码，并且登记为NCgl 2886。此外，作为本发明的基因，也可使用源自其它微生物的fasR的同源基因，只要在棒状杆菌型细菌中能够通过扩增该基因来增强对于表面活性剂的敏感性。可参照NCgl 2886的基因序列使用BLAST等(http://blast.genome.jp)搜索fasR基因的同源物。

因为能够用于本发明的fasR基因的序列已经阐明，fasR及其包括fasR的调控区的侧翼区能够通过PCR(聚合酶链式反应，参见White，T.J.et al.，TrendsGenet.，5，185(1989))获得，所述PCR使用基于阐明的核苷酸序列制备的引物，例如，SEQ ID NOS：1和2中所示的引物，和棒状杆菌型细菌的染色体DNA作为模板。也能够以相似方式获得其它微生物中fasR的同源物。

此外，由于fasR基因的核苷酸序列可能依赖于棒状杆菌型细菌的菌种或菌株而有差异，用于本发明的fasR基因不限于那些具有SEQ ID NO：3中核苷酸号506至967的核苷酸序列或SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因，并且只要将编码的FasR蛋白的功能保留，即，能够通过其扩增改进对于表面活性剂的敏感性，用于本发明的fasR基因可以是任何突变体和人工修饰的基因，其编码具有在一个或多个位置包括取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸残基的SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列的蛋白质。尽管本文中提及的“几个”氨基酸残基的数目可以依赖于蛋白质的氨基酸残基在三维结构中的位置和其种类而不同，其可以优选是2至20，更优选2至10，尤其优选2至5。此外，这些如上所述的氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和倒位包括由天然存在的突变引起的那些或基于含有fasR基因的微生物的个体或菌种差异的变异。

上述取代优选是保守取代，其是不引起功能性改变的中性突变。保守取代包括：在芳族氨基酸的情况下Phe、Trp和Tyr的相互取代；在疏水氨基酸的情况下Leu、Ile和Val的相互取代；在极性氨基酸的情况下Gln和Asn的相互取代；在碱性氨基酸的情况下Lys、Arg和His的相互取代；在酸性氨基酸的情况下Asp和Glu的相互取代；和在含羟基氨基酸的情况下Ser和Thr的相互取代。更具体地，保守突变的实例包括：以Ser或Thr取代Ala，以Gln、His或Lys取代Arg，以Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，以Asn、Glu或Gln取代Asp，以Ser或Ala取代Cys，以Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，以Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，以Pro取代Gly，以Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，以Leu、Met、Val或Phe取代Ile，以Ile、Met、Val、Phe取代Leu，以Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，以Ile、Leu、Val或Phe取代Met，以Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，以Thr或Ala取代Ser，以Ser或Ala取代Thr，以Phe或Tyr取代Trp，以His、Phe或Trp取代Tyr和以Met、Ile或Leu取代Val。

此外，作为fasR基因，还可以使用编码与SEQ ID NO：4或6的完整氨基酸序列具有80％或更高、优选90％或更高、更优选95％或更高、尤其优选97％或更高同源性的蛋白质的基因，并且所述基因能够通过其表达的增强来改进棒状杆菌型细菌对于表面活性剂的敏感性。此外，由于基因的简并性依赖于引入所述基因的宿主而变化，fasR基因可为其中将密码子用在引入fasR的宿主中更易于使用的密码子取代的基因。也可以将fasR基因延伸或缺失，从而使蛋白质在N末端侧或C末端侧延伸或缺失，只要所述基因具有通过其扩增使棒状杆菌型细菌对于表面活性剂的敏感性改进的功能。就氨基酸残基数目而言，所述延伸或缺失的长度是例如50个或更少，优选20个或更少，更优选10个或更少，尤其优选5个或更少。更具体地，蛋白质可以具有将N末端侧的50至5个氨基酸残基或C末端侧的50-5个氨基酸残基缺失的SEQ IDNO：4的氨基酸序列，或在N末端侧或C末端侧延伸50至5个氨基酸残基的SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

这种与fasR基因同源的基因能够通过如下获得，例如，通过位点特异性诱变修饰SEQ ID NO：3中核苷酸号506-976的核苷酸序列或SEQ ID NO：5的核苷酸序列，从而使编码的蛋白质中特定位点的氨基酸残基包括氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。此外，还能够通过下文所述的常规已知诱变处理来获得。所述诱变处理包括：用羟胺等体外处理SEQ ID NO：3中核苷酸号506-976的核苷酸序列或SEQ ID NO：5的核苷酸序列；用紫外照射或常规诱变处理使用的诱变剂处理含有所述基因的微生物如棒状杆菌型细菌，所述诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)。可通过基因重组将突变人工引入fasR以获得高活性的fasR，所述基因重组通过易错PCR、DNA改组或StEP-PCR(Firth AE，Patrick WM，Bioinformatics.，2005 Jun.2，Statistics of protein library construction)进行。这种fasR同源基因是否编码在其表达量增加时使对于表面活性剂的敏感性改进的蛋白质可如下确定，例如，将所述基因引入棒状杆菌型的野生型菌株，并且检查在未添加表面活性剂的培养基中产生L-谷氨酸的能力是否得到改进。

fasR基因还包括在严紧条件下，能够与SEQ ID NO：3中核苷酸号506至976的核苷酸序列、SEQ ID NO：5的核苷酸序列或能够从前述序列制备的探针杂交的DNA，并且当所述DNA的表达增强时，编码使棒状杆菌型细菌对于表面活性剂的敏感性改进的蛋白质。在本文中，“严紧条件”是形成所谓的特异性杂合体(hybrid)，并且不形成非特异性杂合体的条件。严紧条件的实例包括那些条件，在该条件下高度同源的DNA互相杂交，例如，不少于80、90、95或97％同源的DNA相互杂交，并且比以上所述同源性低的DNA不相互杂交；或在相应于常规Southern杂交中洗涤条件的盐浓度和温度下，即1xSSC、0.1％SDS在60℃，优选0.1xSSC、0.1％SDS在60℃，更优选0.1xSSC、0.1％SDS在68℃洗涤一次或优选2或3次。

作为探针，还可使用具有SEQ ID NO：3中核苷酸号506至976的核苷酸序列或SEQ ID NO：5的核苷酸序列的部分序列的探针。这种探针能够通过PCR产生，所述PCR使用基于SEQ ID NO：3中核苷酸号506至976的核苷酸序列或SEQ ID NO：5的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物，和含有SEQID NO：3中核苷酸号506至976的核苷酸序列或SEQ ID NO：5的核苷酸序列的DNA片段作为模板。在使用长度为大约300bp的DNA片段作为探针时，杂交洗涤条件是例如2xSSC、0.1％SDS在50℃。

fasR基因表达的增强能够通过增加fasR基因的拷贝数实现。例如，能够通过将含有fasR基因的基因片段与在棒状杆菌型细菌中发挥功能的载体(优选多拷贝型载体)连接来制备重组DNA，并将所述重组DNA引入具有上述产生L-谷氨酸的能力的宿主以将其转化。或者，可将上述重组DNA引入野生型棒状杆菌型细菌以获得转化体，然后可将产生L-谷氨酸的能力赋予所述转化体。也可通过将编码fasR的基因的一个或多个拷贝转移至染色体中来实现拷贝数的增加。能够通过使用fasR基因的一部分作为探针进行Southern杂交来确认fasR基因转移至染色体。

还可通过修饰fasR基因的表达调控序列来实现fasR基因表达的增强。例如，这可通过将fasR基因的启动子序列用更强的启动子取代，或使启动子序列接近共有序列来实现(International Patent Publication WO00/18935)。

用于构建经修饰而使fasR基因表达量增加的棒杆菌型细菌的方法如下所示。可考手册例如Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001)实施这些方法。

还可通过增加基因的拷贝数实现fasR基因表达的增强，可通过如下所述使用质粒扩增fasR基因实现拷贝数的增加。首先，从棒状杆菌型细菌的染色体克隆fasR基因。通过例如Saito and Miura(参考H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)；Text for Bioengineering Experiments，Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)的方法等，可从细菌制备染色体DNA作为DNA供体。可基于已知信息例如上述信息来合成用于PCR的寡核苷酸，可通过使用例如SEQID NOS：1和2的合成寡核苷酸扩增fasR基因。

如果将含有PCR扩增的fasR基因的基因片段连接至在大肠杆菌和/或棒状杆菌型细菌的细胞中可自主复制的载体DNA而形成重组DNA，并且将这种重组DNA引入大肠杆菌细胞，则后续步骤将变得简单。在大肠杆菌细胞中可自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pBR322、pACYC184、pMW219等。

将上述DNA引入在棒状杆菌型细菌中发挥功能的载体。所述在棒状杆菌型细菌中发挥功能的载体是例如在棒状杆菌型细菌中能够自主复制的质粒。在棒状杆菌型细菌中能够自主复制的质粒的具体实例包括，例如，JapanesePatent Laid-open No.3-210184中描述的质粒pCRY30；Japanese PatentLaid-open No.2-72876和U.S.Patent No.5,185,262中描述的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX；Japanese PatentLaid-open No.1-191686中描述的质粒pCRY2和pCRY3；Japanese PatentLaid-open No.58-67679中描述的pAM330；Japanese Patent Laid-open No.58-77895中描述的pHM1519；Japanese Patent Laid-open No.58-192900中描述的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；Japanese Patent Laid-open No.57-134500中描述的pCG1；Japanese Patent Laid-open No.58-35197中描述的pCG2；JapanesePatent Laid-open No.57-183799中描述的pCG4和pCG11；和Japanese PatentLaid-open No.10-215883中描述的pVK7。

此外，如果将具有使质粒在棒状杆菌中可自主复制的能力的DNA片段从这些载体中取出，并且插入上述用于大肠杆菌的载体中，则可将它们用作所谓的穿梭载体，其在大肠杆菌和棒状杆菌型细菌二者中均可自主复制。

这些载体能够从保藏的细菌如下获得。即，使用溶菌酶和SDS溶解在它们的指数生长期收集的细胞，并且在30000xg离心。向获得自溶解产物的上清添加聚乙二醇，通过氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心进行分级和纯化。

为了将fasR基因和在棒状杆菌型细菌中发挥功能的载体连接以制备重组DNA，将载体用限制酶消化，所述限制酶提供与fasR基因的末端匹配的末端。可以事先将这种限制位点引入用于fasR基因扩增的合成寡核苷酸中。通常使用连接酶例如T4 DNA连接酶进行连接。

为了将如上所述制备的重组DNA引入棒状杆菌型细菌，可使用至今已经报导的任何已知的转化方法。例如，可使用以氯化钙处理受体细胞以使其对于DNA的通透性增加的方法，该方法已被报导用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))；和从生长期细胞制备感受态细胞，其后将DNA引入其中的方法，该方法已被报导用于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(Duncan，C.H.，Wilson，GA.and Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。除这些之外，还可使用的方法是将DNA受体细胞制成能够轻易摄取重组DNA的原生质体或原生质球，接着将重组DNA引入所述细胞，已知所述方法可应用于枯草芽孢杆菌、放线菌类和酵母(Chang，S.and Choen，S.N.，Mol.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，GR.，Proc.Natl.Sci.USA，75，1929(1978))。此外，还可通过电脉冲方法(Japanese Patent Laid-open No.2-207791)或接合转移(Biotechnology(NY)，1991 Jan，9(1)：84-7)进行棒状杆菌型细菌的转化。

还可通过将fasR基因的多拷贝引入棒状杆菌型细菌的染色体DNA来实现fasR基因拷贝数的增加。为了将fasR基因的多拷贝引入棒状杆菌型细菌的染色体DNA，使用以多拷贝存在于所述染色体DNA上的序列作为靶进行同源重组。作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列，可以使用重复DNA和存在于可转座元件末端的反向重复。或者，如Japanese Patent Laid-open No.2-109985中公开，也可将fasR基因并入转座子，并且允许所述转座子转移以将基因的多拷贝引入染色体DNA(Japanese Patent Laid-open Nos.2-109985和7-107976；Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)；Plasmid，2000 Nov，44(3)：285-91)。

此外，还预期将fasR基因引入含有在宿主中无法复制的复制起点的质粒，或引入含有在宿主中无法复制的复制起点并且能够接合转移至宿主的质粒，由此扩增染色体上的基因。可用载体的实例包括，例如pSUP301(Simo et al.，Bio/Technology，1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schaefer et al.，Gene，145，69-73(1994))、pGEM-T(Promega，Madison，WI，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman，Journal of Biological Chemistry，269：32678-84(1994)；US-A5,487,993)、pCR

Blunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bernard et al.，Journal of Molecular Biology，234：534-541(1993))、pEM1(Schrumpf et al.，Journal of Bacteriology，173：1991，4510-4516)、pBGS8(Spratt et al，1986，Gene，41：337-342)等。将含有fasR基因的质粒载体通过接合或转化转移至棒状杆菌型细菌。用于接合的方法在例如Schaefer et al.(Applied and EnvironmentalMicrobiology，60，756-759(1994))中描述。用于转化的方法在例如Theirbach etal.，Applied Microbiology and Biotechnology，29，356-362(1988)；Dunican andShivinan，Bio/Technology 7，1067-1070，(1989)；和Tauch et al.，FEMSMicrobiological Letters，123，343-347(1994)中描述。

此外，也可如下实现fasR活性的增加：将表达调控序列例如染色体DNA或质粒上的启动子用较强启动子取代；修饰参与fasR表达调控的因子，例如，操纵基因或阻抑物；或通过连接强终止子(Hamilton et al， Journal of Bacterology，171：4617-4622)。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、PS2启动子等是已知的强启动子。用于评估启动子效力的方法和强启动子的实例在Goldsteinet al.的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology，Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等中描述。此外，如International Patent PublicationWO00/18935中公开，也可在目标基因的启动子区引入几个核苷酸的核苷酸取代，从而使启动子序列接近共有序列，由此将其修饰成更强的启动子。例如，预期用TTGACA或TTGCCA序列取代-35区，或用TATAAT或TATAAC序列取代-10区。此外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中，特别在起始密码子的直接上游区中取代几个核苷酸，显著影响mRNA的翻译效率，也可对这些进行修饰。

此外，也可通过延长m-RNA的存在时间(lifetime)，或通过防止细胞中酶蛋白的分解来实现表达量的增加。也可使用启动子搜索载体、基因分析软件如GENETYX等测定fasR基因的表达调控区例如上游区中的启动子。通过这种启动子取代或修饰，将fasR基因的表达增强。能够使用例如温度敏感质粒进行表达调控序列的取代。用于棒状杆菌型细菌的温度敏感质粒的实例包括p48K和pSFKT2(Japanese Patent Laid-open No.2000-262288)、pHSC4(FrenchPatent Laid-open No.2667875，1992和Japanese Patent Laid-open No.5-7491)等。在棒状杆菌型细菌中，这些质粒能够至少在25℃自主复制，但是不能在37℃自主复制。修饰表达调控序列可以与增加fasR基因的拷贝数组合进行。

<2>L-谷氨酸的产生

L-谷氨酸能够如下有效地产生：在培养基中培养如上所述获得的棒状杆菌型细菌，以在培养基中产生和积累L-谷氨酸；和从所述培养基中收集L-谷氨酸。

作为用于培养的培养基，可以使用含有碳源、氮源、无机盐和任选地有机微量营养物如氨基酸和维生素的普通培养基。可以使用合成培养基或天然培养基。可以使用任何种类的碳源和氮源，只要它们能够被所培养的菌株利用。

糖类例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、糖蜜等可以用作碳源。另外，有机酸例如乙酸和柠檬酸，和醇例如乙醇也可以单独或与其它碳源组合使用。氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵、硝酸盐等可以用作氮源。氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，和含有这些物质的胨、酪蛋白氨基酸(casamino acid)、酵母提取物和大豆蛋白分解物可以作为有机微量营养物使用。当使用生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变菌株时，优选加入这样的必需营养物。磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等可以用作无机盐。

在本发明的情况下，因为诱导L-谷氨酸产生所需的表面活性剂的量能够通过扩增fasR基因而降低，培养基可以含有高浓度的生物素。培养基期望地含有浓度为50μg/L或更高，优选100μg/L或更高，更优选200μg/L或更高的生物素。

需氧培养通过将发酵温度控制在20至45℃并且将培养基的pH调节至3-9来进行。在培养期间当pH降低时，通过添加碱例如碳酸钙或氨气来中和培养基。培养大约10至大约120小时导致可观量的L-谷氨酸在培养基中积累。

此外，培养还能够如下进行：将液体培养基调节至L-谷氨酸在所述培养基中析出的条件，通过使用所述液体培养基使L-谷氨酸在培养基中析出。L-谷氨酸析出的条件的实例包括pH5.0-4.0，优选pH4.5至4.0，更优选pH4.3至4.0，尤其优选pH4.0。

对于在培养之后从培养基中收集L-谷氨酸的方法，可以通过已知收集方法进行所述收集。例如，通过从培养基中去除细胞后，再由浓缩引起结晶的方法，离子交换层析等来完成收集。当在L-谷氨酸析出的条件下进行培养时，可通过离心或过滤来收集培养基中析出的L-谷氨酸。在这种情况下，可以将溶解在培养基中的L-谷氨酸析出，其后一起分离。

实施例

在下文中，将参考以下实施例对本发明进行具体说明。然而，本发明不限于以下实施例。

实施例1：谷氨酸棒杆菌ATCC13869的fasR扩增型菌株的制备

制备用于扩增fasR基因的质粒。因为谷氨酸棒杆菌的全基因组序列已经测定，所以使用Bacterial Genomic DNA Purif.Kit(MS Techno Systems)从谷氨酸棒杆菌ATCC13869提取染色体，并且使用这种染色体作为模板和SEQ IDNOS：1和2的引物组合进行PCR以扩增大约900bp的片段。PCR使用Pyrobest聚合酶(Takara Bio Inc.)进行，将98℃变性10秒、55℃退火30秒和72℃延伸2分钟的循环重复25次。在SEQ ID NOS：1和2的引物的5’端添加KpnI序列，并对其设计以扩增SEQ ID NO：3中核苷酸号111至1010的区。

将扩增的片段用KpnI完全消化，并且连接至用KpnI类似地完全消化的pVK7载体(在Japanese Patent Laid-open No.10-215883中描述)(使用LigationKit Ver.2(Takara Bio Inc.))，以构建pVKFASR(构建方案示于图1)。

通过电脉冲方法(Japanese Patent Laid-open No.2-207791)将pVKFASR引入谷氨酸棒杆菌ATCC13869，并且将细胞涂布于含有25μg/ml卡那霉素的CM-2B琼脂培养基(10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl、10μg/l生物素、20g/l琼脂，用KOH调节至pH7.0)。将出现的菌株作为fasR扩增型菌株命名为ATCC13869/pVKFASR。

实施例2：ATCC13869/pVKFASR菌株产生谷氨酸的能力的确认

通过使用Sakaguchi摇瓶进行培养来检验ATCC13869/pVKFASR菌株产生谷氨酸的能力。通过将载体引入野生菌株获得对照菌株ATCC13869/pVK7，将所述对照菌株和作为fasR扩增型菌株的ATCC13869/pVKFASR菌株在含有25μg/ml卡那霉素的CM-2B琼脂培养基(10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/lNaCl、10μg/l生物素、20g/l琼脂，用KOH调节至pH7.0)中在31.5℃培养一整天，并且接种至20ml种子培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l维生素B1、0.48g/l大豆蛋白水解物、300μg/l生物素，用KOH调节至pH8.0)。将1g事先经过干热灭菌的碳酸钙添加至培养基，然后在31.5℃以115rpm的速度摇动进行培养。在确认了全部糖被完全消耗之后，将1ml种子培养液接种至20ml主培养基中(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/lMgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l维生素B1、0.48g/l大豆蛋白水解物、300μg/l生物素，用KOH调节至pH8.0)。将1g事先经过干热灭菌的碳酸钙添加至培养基，然后在31.5℃以115rpm的速度摇动进行培养。在培养开始2.5小时之后，添加0.01、0.1或1g/l Tween 40(Sigma)，或不添加Tween 40。41小时后的细胞量(在620nm测量吸光度)、积累的谷氨酸量和残余的糖量示于表1。

结果，在不添加或添加少量表面活性剂的条件下，ATCC13869/pVKFASR菌株积累了大约10g/l谷氨酸，在该条件下ATCC13869/pVK7菌株没有积累谷氨酸。从上述结果，确认了fasR基因的扩增对于完全消除对表面活性剂的需求或对于降低表面活性剂的量是有效的，所述表面活性剂对于诱导谷氨酸产生通常是必需的。

表1：fasR扩增型菌株的谷氨酸产量

表面活性剂的浓度	菌株	OD620nm	谷氨酸(g/l)	残余的糖(g/l)
					0g/l	ATCC13869/pVK7ATCC13869/pVKFASR	80.6864.41	0.011.0	0.00.0
0.01g/l	ATCC13869/pVK7ATCC13869/pVKFASR	79.1566.05	0.06.8	0.00.0
					0.1g/l	ATCC13869/pVK7ATCC13869/pVKFASR	78.4960.59	0.011.8	0.00.0

实施例3：ATCC13869/pVKFASR菌株对于表面活性剂的敏感性的改变

因为在fasR扩增型菌株中仅仅通过添加低浓度的表面活性剂来诱导谷氨酸的产生，估计所述菌株与对照菌株(引入载体的菌株ATCC13869/pVK7)相比对于表面活性剂的敏感性增加。因此，检测fasR扩增型菌株对于表面活性剂的敏感性。将在31.5℃在CM-2B琼脂培养基上培养了一整天的细胞接种至CM-2B液体培养基，并且向培养基中添加浓度为0.01、0.1、0.25或0.5g/l的Tween 40或不添加。通过进行试管培养，随时间测定620nm的吸光度(OD 620nm)。计算比生长速率，并将结果示于图2。在添加0.01g/L表面活性剂时对于fasR扩增型菌株观察到比生长速率的显著减少，因此确认了fasR基因是改变了对于表面活性剂的敏感性的基因。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>产生L-谷氨酸的细菌和用于产生L-谷氨酸的方法

<130>2005-151

<150>JP2005-245214

<151>2005-08-26

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于扩增fasR的引物

<400>1

gccgggtacc gctgccacaa atcgggcaag gataatctgc 40

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于扩增fasR的引物

<400>2

gccgggtacc tcaaattccg gagttgagat ggagaaaact 40

<210>3

<211>1020

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221>CDS

<222>(506)..(976)

<223>fasR

<400>3

gcctgccgtc cattctttac caactgttcg atttcttctt cacttcgagc agaacctgcc 60

gcccgaccga tttcatcgcc ataaacccac aaaaccacac gtagatcctc gctgccacaa 120

atcgggcaag gataatctgc gaggtgtccg tgatatttgc tcgcagtcac caagatgaac 180

tcggcgtcac aaattgtgtc tttttgcacc aaccccgccc gaaactgacg gagagtctgc 240

ctacgagcta gttggtgact gatctcattt tgatattgca ccacgattaa aaagtgtagc 300

cgtaagccga ccaatgaaac gaccctctag aagcatcgtt tagaattgct tttaagtgaa 360

taaggaacag cacagaatta aggcgtcgga gttatcgctc acgctacttc tcaagtggcg 420

ccaaggtaag ttgtactttt tctgtccaaa ttattgtttt ttccgtagat aggttatcga 480

acggaaatta cttggcaata ccgct atg ctg gca ggc atg cct aat tta aac 532

Met Leu Ala Gly Met Pro Asn Leu Asn

1 5

gct gag gag cta gca gtc cgc gtg cga ccc gcg ctg aca aaa ctc tac 580

Ala Glu Glu Leu Ala Val Arg Val Arg Pro Ala Leu Thr Lys Leu Tyr

10 15 20 25

gtt ctc tat ttc cgc cgc tct gtg aat tct gac ctc tcg ggt cca cag 628

Val Leu Tyr Phe Arg Arg Ser Val Asn Ser Asp Leu Ser Gly Pro Gln

30 35 40

ctc act att ttg agt cgc ctg gaa gaa aac ggc cca tcc cga att agt 676

Leu Thr Ile Leu Ser Arg Leu Glu Glu Asn Gly Pro Ser Arg Ile Ser

45 50 55

cgc atc gcg gaa ctt gaa gat att cgt atg cca acc gct tcg aat gct 724

Arg Ile Ala Glu Leu Glu Asp Ile Arg Met Pro Thr Ala Ser Asn Ala

60 65 70

ctg cat cag ctg gag caa ctc aac ctg gtt gag cgt atc cgc gac acc 772

Leu His Gln Leu Glu Gln Leu Asn Leu Val Glu Arg Ile Arg Asp Thr

75 80 85

aaa gac cgc cga ggc gtg cag gtt cag ctc act gat cat gga cgc gaa 820

Lys Asp Arg Arg Gly Val Gln Val Gln Leu Thr Asp His Gly Arg Glu

90 95 100 105

gag ctt gag cgc gtg aac aat gaa cga aac gca gag atg gct cga ctc 868

Glu Leu Glu Arg Val Asn Asn Glu Arg Asn Ala Glu Met Ala Arg Leu

110 115 120

ctt gaa atg ctc acc cca gag cag ctg gag cgt acc gaa gac ctg gtg 916

Leu Glu Met Leu Thr Pro Glu Gln Leu Glu Arg Thr Glu Asp Leu Val

125 130 135

gat atc att act gag ctt gca gag gtg tac ggt agc tgg aaa gag acc 964

Asp Ile Ile Thr Glu Leu Ala Glu Val Tyr Gly Ser Trp Lys Glu Thr

140 145 150

gac agc ggt tct taacagtttt ctccatctca actccggaat ttgatgaaac aacc 1020

Asp Ser Gly Ser

155

<210>4

<211>157

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400>4

Met Leu Ala Gly Met Pro Asn Leu Asn Ala Glu Glu Leu Ala Val Arg

1 5 10 15

Val Arg Pro Ala Leu Thr Lys Leu Tyr Val Leu Tyr Phe Arg Arg Ser

20 25 30

Val Asn Ser Asp Leu Ser Gly Pro Gln Leu Thr Ile Leu Ser Arg Leu

35 40 45

Glu Glu Asn Gly Pro Ser Arg Ile Ser Arg Ile Ala Glu Leu Glu Asp

50 55 60

Ile Arg Met Pro Thr Ala Ser Asn Ala Leu His Gln Leu Glu Gln Leu

65 70 75 80

Asn Leu Val Glu Arg Ile Arg Asp Thr Lys Asp Arg Arg Gly Val Gln

85 90 95

Val Gln Leu Thr Asp His Gly Arg Glu Glu Leu Glu Arg Val Asn Asn

100 105 110

Glu Arg Asn Ala Glu Met Ala Arg Leu Leu Glu Met Leu Thr Pro Glu

115 120 125

Gln Leu Glu Arg Thr Glu Asp Leu Val Asp Ile Ile Thr Glu Leu Ala

130 135 140

Glu Val Tyr Gly Ser Trp Lys Glu Thr Asp Ser Gly Ser

145 150 155

<210>5

<211>474

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(474)

<223>fasR

<400>5

atg ctg gca ggc atg cct aat tta aac gct gag gag cta gca gtc cgc 48

Met Leu Ala Gly Met Pro Asn Leu Asn Ala Glu Glu Leu Ala Val Arg

1 5 10 15

gtg cga ccc gcg ctg aca aaa ctc tac gtt ctc tat ttc cgc cgc tct 96

Val Arg Pro Ala Leu Thr Lys Leu Tyr Val Leu Tyr Phe Arg Arg Ser

20 25 30

gtg aat tct gac ctc tcg ggt cca cag ctc act att ttg agt cgc ctg 144

Val Asn Ser Asp Leu Ser Gly Pro Gln Leu Thr Ile Leu Ser Arg Leu

35 40 45

gaa gaa aac ggc cca tcc cga att agt cgc atc gcg gaa ctt gaa gat 192

Glu Glu Asn Gly Pro Ser Arg Ile Ser Arg Ile Ala Glu Leu Glu Asp

50 55 60

att cgt atg cca acc gct tcg aat gct ctg cat cag ctg gag caa ctc 240

Ile Arg Met Pro Thr Ala Ser Asn Ala Leu His Gln Leu Glu Gln Leu

65 70 75 80

aac ctg gtt gag cgt atc cgc gac acc aaa gac cgc cga ggc gtg cag 288

Asn Leu Val Glu Arg Ile Arg Asp Thr Lys Asp Arg Arg Gly Val Gln

85 90 95

gtt cag ctc act gat cat gga cgc gaa gag ctt gag cgc gtg aac aat 336

Val Gln Leu Thr Asp His Gly Arg Glu Glu Leu Glu Arg Val Asn Asn

100 105 110

gaa cga aac gca gag atg gct cga ctc ctt gaa atg ctc acc cca gag 384

Glu Arg Asn Ala Glu Met Ala Arg Leu Leu Glu Met Leu Thr Pro Glu

115 120 125

cag ctg gaa cgt acc gaa gac ctg gtg gat atc att act gag ctt gca 432

Gln Leu Glu Arg Thr Glu Asp Leu Val Asp Ile Ile Thr Glu Leu Ala

130 135 140

gag gtg tac ggt agc tgg aaa gag acc gac agc ggt tct taa 474

Glu Val Tyr Gly Ser Trp Lys Glu Thr Asp Ser Gly Ser

145 150 155

<210>6

<211>157

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400>6

Met Leu Ala Gly Met Pro Asn Leu Asn Ala Glu Glu Leu Ala Val Arg

1 5 10 15

Val Arg Pro Ala Leu Thr Lys Leu Tyr Val Leu Tyr Phe Arg Arg Ser

20 25 30

Val Asn Ser Asp Leu Ser Gly Pro Gln Leu Thr Ile Leu Ser Arg Leu

35 40 45

Glu Glu Asn Gly Pro Ser Arg Ile Ser Arg Ile Ala Glu Leu Glu Asp

50 55 60

Ile Arg Met Pro Thr Ala Ser Asn Ala Leu His Gln Leu Glu Gln Leu

65 70 75 80

Asn Leu Val Glu Arg Ile Arg Asp Thr Lys Asp Arg Arg Gly Val Gln

85 90 95

Val Gln Leu Thr Asp His Gly Arg Glu Glu Leu Glu Arg Val Asn Asn

100 105 110

Glu Arg Asn Ala Glu Met Ala Arg Leu Leu Glu Met Leu Thr Pro Glu

115 120 125

Gln Leu Glu Arg Thr Glu Asp Leu Val Asp Ile Ile Thr Glu Leu Ala

130 135 140

Glu Val Tyr Gly Ser Trp Lys Glu Thr Asp Ser Gly Ser

145 150 155

Claims

1.一种棒状杆菌型细菌，对所述细菌进行修饰以使fasR基因的表达增强，使得所述细菌能够在以50μg/L或更高的浓度包含生物素且不包含选自由表面活性剂和青霉素组成的组的生物素活性抑制剂的培养基中产生L-谷氨酸，

其中所述fasR基因是由SEQ ID NO：3中核苷酸号506至976的核苷酸序列或SEQ ID NO：5中核苷酸号1至474的核苷酸序列组成的DNA。

2.根据权利要求1的棒状杆菌型细菌，通过增加基因的拷贝数或修饰基因的表达调控序列对所述棒状杆菌型细菌进行修饰以使fasR基因的表达增强。

3.用于产生L-谷氨酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养根据权利要求1或2的棒状杆菌型细菌，以在培养基或细胞中产生和积累L-谷氨酸；和从所述培养基或细胞中收集L-谷氨酸。