CN102498216B - L-氨基酸的产生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养能够产生L-氨基酸并已经如此修饰而具有增强的碳酸酐酶活性的棒状杆菌型细菌以在所述培养基或所述细菌的细胞中产生并蓄积L-氨基酸，和从所述培养基或细胞收集L-氨基酸。

Description

L-氨基酸的产生方法
技术领域
本发明涉及通过发酵高效地产生L-氨基酸如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸的方法。
背景技术
L-氨基酸主要通过使用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)或微杆菌属(Microbacterium)的称作棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)的L-氨基酸生产菌或者它们的突变菌株的发酵来工业生产(参照例如非专利文献1)。作为通过使用其它细菌菌株的发酵来生产L-氨基酸的方法，已知有下述方法：使用属于芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Sreptomyces)或青霉属(Penicillium)等的微生物的方法(参照例如专利文献1)，使用属于假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)或假丝酵母属(Candida)等的微生物的方法(参照例如专利文献2)，使用属于芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属或产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)(现在名为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))等的微生物的方法(参照例如专利文献3)，使用大肠杆菌的突变菌株的方法(参照例如专利文献4)，等等。此外，还公开了使用属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantotea)、或肠杆菌属(Enterobacter)的微生物的产生L-氨基酸的方法(参照例如专利文献5至7)。
此外，已经公开了通过利用重组DNA技术增强用于生物合成L-氨基酸的酶的活性来增加L-氨基酸生产能力的多种技术。例如，据报道，在棒杆菌属或短杆菌属细菌中导入编码源自大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的柠檬酸合酶的基因，对于增强棒状杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力是有效的(参照例如专利文献8)。此外，还据报道，将源自棒状杆菌型细菌的柠檬酸合酶基因导入属于肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、或埃希氏菌属的肠杆菌科细菌，对于增强L-谷氨酸生产能力是有效的(参照例如专利文献9)。
碳酸酐酶是涉及二氧化碳和碳酸氢根相互转化的酶。据报道，大肠杆菌具有两种碳酸酐酶，即Can(碳酸酐酶2)和CynT(碳酸酐酶1)(非专利文献2和非专利文献3)。已阐明Can是β型的碳酸酐酶，是大肠杆菌在通常大气的二氧化碳分压下生长所必需的。Can和CynT分别由yadF和cynT基因编码。还已知在谷氨酸棒杆菌中，已发现β型和γ型碳酸酐酶，且β型主要发挥功能(参见非专利文献4)。
作为使用碳酸酐酶生产有用物质，已知其在从含有木素纤维素的植物原料生产乙醇中用于原料的预处理步骤的用途(参见专利文献10)。此外，据报道，在增强棒杆菌属细菌的β碳酸酐酶的研究中，未增加赖氨酸的产生量(参见非专利文献4)，而且仍然不知道β碳酸酐酶的增强是否对物质生产有效，以及β碳酸酐酶活性与L-氨基酸生产力之间的关系。
现有技术文献
专利文献
【专利文献1】美国专利第3,220,929号说明书
【专利文献2】美国专利第3,563,857号说明书
【专利文献3】特公昭32-9393号公报
【专利文献4】特开平5-244970号公报
【专利文献5】特开2000-106869号公报
【专利文献6】特开2000-189169号公报
【专利文献7】特开2000-189175号公报
【专利文献8】特公平7-121228号公报
【专利文献9】特开2000-189175号公报
【专利文献10】美国专利申请公开2008/0171370号说明书
非专利文献
【非专利文献1】明石邦彦等，氨基酸发酵，学会出版中心，195～215，1986
【非专利文献2】J.Biol.Chem，267，3731-3734，1992
【非专利文献3】Smith K.S.，Ferry J.G.，″Prokaryotic carbonic anhydrases″，FEMS Microbiol.Rev.，24(4)：335-66，2000.
【非专利文献4】Appl.Microbiol.Biotechnol.，63，592-601，2004
发明内容
本发明的目的为提供通过发酵法产生L-氨基酸，特别是L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸的新方法。
本发明人为了实现上述目的，进行了勤勉的研究，其结果，发现了通过培养赋予了L-氨基酸生产能力，并经修饰而增强了碳酸酐酶(下文中，除非另行指明，指β-碳酸酐酶)活性的棒状杆菌型细菌，可高效地产生L-氨基酸如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸，从而完成了本发明。
即，本发明涉及如下：
(1)一种产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌以在该培养基或细菌细胞中产生并蓄积L-氨基酸，并从该培养基或细胞收集L-氨基酸，其中所述棒状杆菌型细菌经修饰而增强了碳酸酐酶活性。
(2)根据(1)的方法，其中所述碳酸酐酶活性是通过增加编码碳酸酐酶的基因的拷贝数，或通过修饰基因的表达调控序列来增强的。
(3)根据(2)的方法，其中所述编码碳酸酐酶的基因是如下(a)或(b)中定义的DNA：
(a)DNA，包含SEQ ID NO：11的核苷酸编号562至1182的核苷酸序列，或SEQ ID NO：13的核苷酸序列；或
(b)DNA，能够与SEQ ID NO：11的核苷酸编号562至1182的核苷酸序列或SEQ ID NO：13的核苷酸序列的互补链在严格条件下杂交，并编码具有碳酸酐酶活性的蛋白。
(4)根据(1)至(3)任一项的方法，其中所述细菌进一步经修饰而赋予了D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶活性和/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性。
(5)根据(1)至(4)任一项的方法，其中所述细菌进一步经修饰而增强了磷酸转乙酰酶活性。
(6)根据(1)至(5)任一项的方法，其中所述细菌进一步经修饰而增强了丙酮酸羧化酶活性。
(7)根据(1)至(6)任一项的方法，其中所述细菌进一步经修饰而增强了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。
(8)根据(1)至(7)任一项的方法，其中所述L-氨基酸选自下组：L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸。
通过本发明的产生方法，可高效地产生L-氨基酸如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸。
附图说明
图1显示了以碳酸酐酶(BCA)增强株观察到的L-氨基酸蓄积量。
实施本发明的方式
以下，具体说明本发明
<1>用于本发明的棒状杆菌型细菌
用于本发明方法中的棒状杆菌型细菌是具有L-氨基酸生产能力、并经修饰而增强了碳酸酐酶活性的棒状杆菌型细菌。用于本发明的棒状杆菌型细菌可通过如下获得：使用具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌为亲本株，并对其进行修饰使得其碳酸酐酶活性增强。用于本发明方法中的棒状杆菌型细菌可为固有地具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌，或可为通过利用突变法、重组DNA技术等的育种而赋予了L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌。在本发明中，“棒状杆菌型细菌”还包括先前归类于短杆菌属、但现在归类于棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41：255-260，1991)，以及与棒杆菌属紧密相关的属于短杆菌属的细菌。这样的棒状杆菌型细菌的实例包括如下：
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
美棒杆菌(Corynebacterium callunae)
谷氨酸棒杆菌
百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacterium efficiens)
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨棒杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)
白色短杆菌(Brevibacterium album)
Brevibacterium cerinum
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
这些细菌的具体实例包括如下菌株：
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870
醋谷棒杆菌ATCC15806
烷醇棒杆菌ATCC21511
美棒杆菌ATCC15991
谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060
百合花棒杆菌ATCC15990
栖糖蜜棒杆菌ATCC17965
嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒杆菌ATCC13868
二歧短杆菌ATCC14020
黄色短杆菌ATCC13826、ATCC14067
Brevibacterium immariophilum ATCC14068
乳发酵短杆菌ATCC13869
玫瑰色短杆菌ATCC13825
解糖短杆菌ATCC14066
生硫短杆菌ATCC19240
产氨棒杆菌ATCC6871、ATCC6872
白色短杆菌ATCC15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
嗜氨微杆菌ATCC15354
这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，地址：12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852 P.O.Box1549，Manassas，VA 20108，United States of America)。即，对每种菌株都给予了登记号，可以使用这些登记号通过分售获得菌株(参见http://www.atcc.org/)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了每种菌株的对应登录号。根据布达佩斯条约的规定，将AJ12340菌株于1987年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienceand Technology)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，International Patent Organism Depositary))(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编305-5466)，登录号为FERM BP-1539。
在本发明中，“L-氨基酸生产能力”意指在培养基中培养本发明方法中使用的棒状杆菌型细菌时，所述细菌在培养基中蓄积L-氨基酸的能力。此种L-氨基酸生产能力可为棒状杆菌型细菌野生型菌株具有的性质，或通过育种而赋予或增强的性质。
L-氨基酸的实例包括L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-半胱氨酸(胱氨酸)、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-高丝氨酸。然而，优选来自草酰乙酸和乙酰CoA的L-氨基酸，特别优选L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸。
<1-1>L-氨基酸生产能力的赋予
以下，对赋予L-氨基酸生产能力的方法和赋予了L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌参考实例进行说明。
通过育种来赋予或者增强L-谷氨酸生产能力的方法包括例如修饰细菌使得编码L-谷氨酸生物合成相关酶的基因的表达增强的方法。L-谷氨酸生物合成相关酶的实例包括例如谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡糖磷酸异构酶等。
如上所述用于增强这些基因的表达的方法的实例包括：导入扩增质粒，所述扩增质粒是通过如下获得的：将包含这些基因的DNA片段导入适当的质粒，例如至少包含负责质粒在棒状杆菌型细菌中的复制和增殖功能的基因的质粒；通过接合、基因转移等使这些基因在染色体上的拷贝数增加；和在这些基因的任一种的启动子区导入突变(参照国际专利公开WO95/34672号)。
当使用上述扩增质粒或在染色体上增加拷贝数时，用于表达这些基因的启动子可为任何类型的启动子，只要选择了在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子，且可为要使用的基因本身的启动子。也可以通过适宜地选择启动子来进行基因表达量的调控。通过如上所述的方法进行修饰从而增强了柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的棒状杆菌型细菌的实例包括WO00/18935号等中记载的棒状杆菌型细菌。
用于赋予L-谷氨酸生产能力的修饰可以通过降低或消除下述酶的活性来获得，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径分支出来且生成除L-谷氨酸外的化合物的反应。催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支出来且生成除L-谷氨酸以外的化合物的反应的酶的实例包括：异柠檬酸裂合酶、α-酮戊二酸脱氢酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶，乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。
为了降低或者消除上述酶活性，可以通过常规的突变方法向染色体上的上述酶的基因中导入突变使得细胞中该酶的活性降低或消除。这样的突变的导入可通过如下实现：例如，使用基因重组消除基因组上的编码酶的基因，或者对表达调控序列如启动子或Shine-Dalgarno(SD)序列进行修饰。此外，还可以通过如下实现：向染色体上编码酶的区域导入氨基酸取代的突变(错义突变)、终止密码子(无义突变)、或者用于添加或缺失一或二个核苷酸的移码突变，或者部分地缺失所述基因(J.Biol.Chem.272：8611-8617，1997)。此外，还可以通过如下降低或消除酶活性：构建编码其编码区缺失的突变酶的基因，并通过同源重组等用该基因取代基因组上的正常基因。
例如，为了降低α-酮戊二酸脱氢酶活性，可通过使用编码该酶的E1o亚基的sucA(odhA)基因进行修饰。
sucA基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：9和10所示。例如，sucA基因的破坏可使用SEQ ID NO：1～6的引物通过后述实施例中所述的方法进行。
此外，α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的菌株的实例包括例如如下菌株：
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ΔS菌株(国际公开95/34672号)
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ12821(FERM BP-4172；法国专利公报9401748号说明书)
黄色短杆菌AJ12822(FERM BP-4173；法国专利公报9401748号说明书)
谷氨酸棒杆菌AJ12823(FERMBP-4174；法国专利公报9401748号说明书)
其它赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法还包括赋予对有机酸类似物、呼吸链抑制剂等的抗性的方法，和赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。这类方法的实例包括赋予对苯并吡喃酮或萘醌类的抗性的方法(特开昭56-1889)、赋予对HOQNO的抗性的方法(特开昭56-140895)、赋予对α-酮丙二酸的抗性的方法(特开昭57-2689)、赋予对胍的抗性的方法(特开昭56-35981)、赋予对青霉素的敏感性的方法(特开平4-88994)，等等。
这样的抗性菌株的具体实例包括如下菌株：
黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；参照特开昭56-1889号公报)
谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020；参照特开昭56-1889号公报)
黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；参照特开昭57-2689号公报)
谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；参照特开昭57-2689号公报)
黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；参照特开昭56-140895公报)
黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；参照特开昭56-35981号公报)
谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；参照特开平04-88994号公报)
用于赋予L-谷氨酰胺生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得编码L-谷氨酰胺生物合成相关酶的基因的表达增强。L-谷氨酰胺生物合成相关酶的实例包括例如谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶(特开2002-300887号公报)。
此外，用于赋予L-谷氨酰胺生产能力的修饰还可通过如下获得：降低或缺失催化从L-谷氨酰胺生物合成途径分支出来且生成其他化合物的反应的酶的活性。例如，可举出降低胞内谷氨酰胺酶活性(特开2004-187684号公报)。
此外，用于赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法的实例还包括赋予对氨基酸类似物等的抗性。具体实例包括赋予6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性(特开平3-232497)，赋予嘌呤类似物抗性和/或甲硫氨酸亚砜抗性(特开昭61-202694)，赋予α-酮丙二酸抗性(特开昭56-151495)、赋予对含有谷氨酸的肽的抗性(特开平2-186994号公报)等。
具有L-谷氨酰胺生产能力的棒状杆菌型细菌的具体实例包括如下菌株：
黄色短杆菌AJ11573(FERM P-5492；特开昭56-151495)
黄色短杆菌AJ12210(FERM P-8123；特开昭61-202694)
黄色短杆菌AJ12212(FERM P-8125；特开昭61-202694)
黄色短杆菌AJ12418(FERM BP2205；特开平2-186994号公报)
黄色短杆菌DH18(FERM P-11116；特开平3-232497号公报)
栖糖蜜棒杆菌DH344(FERM P-11117；特开平3-232497号公报)
谷氨酸棒杆菌AJ11574(FERM P-5493：特开昭56-151495号公报)
用于赋予L-脯氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得编码L-脯氨酸生物合成相关酶的基因的表达增强。L-脯氨酸生物合成相关酶的实例包括例如谷氨酸-5-激酶、γ-谷氨酰磷酸还原酶和吡咯啉-5-羧酸还原酶。
用于赋予L-脯氨酸生产能力的修饰可通过如下进行：降低或缺失催化从L-脯氨酸生物合成途径分支出来且生成其他化合物的反应的酶的活性。实例包括例如降低胞内鸟氨酸氨基转移酶活性。
用于赋予L-精氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得编码L-精氨酸生物合成相关酶的基因的表达增强。L-精氨酸生物合成酶的实例包括选自N-乙酰谷氨酰-磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合酶的一种或两种以上。
其他赋予L-精氨酸生产能力的方法是赋予对氨基酸类似物等的抗性的方法。通过这样的方法获得的细菌的实例包括除对2-噻唑丙氨酸的抗性外，还显示L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸营养缺陷性的棒状杆菌型细菌(特开昭54-44096号公报)；对酮丙二酸、氟丙二酸(fluoromalonic acid)或单氟乙酸有抗性的棒状杆菌型细菌(特开昭57-18989号公报)；对精氨醇(argininol)有抗性的棒状杆菌型细菌(特开昭62-24075号公报)；对X-胍(X是脂肪酸或脂族链的衍生物)有抗性的棒状杆菌型细菌(特开平2-186995号公报)；对精氨酸氧肟酸和6-氮尿嘧啶有抗性的棒状杆菌型细菌(特开昭57-150381号公报)等。
此外，因为L-赖氨酸、L-谷氨酰胺和L-脯氨酸包含L-谷氨酸作为基本结构，可在上述L-谷氨酸生产菌中，可通过扩增编码催化从L-谷氨酸生成各L-氨基酸的反应的酶的基因来育种具有产生任何这些氨基酸的能力的细菌。
此外，L-瓜氨酸和L-鸟氨酸与L-精氨酸的生物合成途径是共同的，因而可通过增加N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酰-磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)和乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的酶活性来赋予生成这些氨基酸的能力。
作为具有L-半胱氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，已知有例如通过携带对L-半胱氨酸的反馈抑制脱敏的丝氨酸乙酰转移酶而增加胞内丝氨酸乙酰转移酶活性的棒状杆菌型细菌(特开2002-233384号公报)。
用于赋予L-缬氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得编码L-缬氨酸生物合成相关酶的基因的表达增强。L-脯氨酸生物合成相关酶的实例包括由存在于ilvBNC操纵子上的基因编码的酶，即，由ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶和由ilvC编码的异构还原酶(isomero-reductase)(国际公开WO00/50624号)。此外，由于ilvBNC操纵子受到L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的操纵子的表达调节，期望的是消除弱化作用，以避免由所生成的L-缬氨酸导致的表达抑制。
具有L-缬氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌还可通过如下获得：降低或消除至少一种与减少L-缬氨酸生产的物质代谢途径相关的酶的活性。例如，可以考虑降低涉及L-亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶的活性，或降低涉及D-泛酸合成的酶的活性(国际公开WO00/50624号)。
赋予L-缬氨酸生产能力的方法的实例还包括赋予对氨基酸类似物等的抗性。通过这样的方法获得的细菌的实例包括，例如，L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸营养缺陷性的、并对D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的、并且具有L-缬氨酸生产能力的突变株(FERMP-1841，FERMP-29，特公昭53-025034)，对聚酮类有抗性的突变株(FERM P-1763，FERM P-1764；特公平06-065314)，在包含醋酸作为唯一碳源的培养基中对L-缬氨酸有抗性、且在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基中对丙酮酸类似物(β-氟丙酮酸(fluoropyruvic acid)等)敏感的突变株(FERM BP-3006，BP-3007，日本专利3006929号)。
赋予L-丙氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的实例包括，例如，H+-ATP酶活性缺陷的棒状杆菌型细菌(Appl Microbiol Biotechnol.2001Nov；57(4)：534-40)；其中天冬氨酸β-脱羧酶基因经过扩增的棒状杆菌型细菌(特开平07-163383)等。
赋予L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的实例包括，具有L-赖氨酸生产能力的L-赖氨酸类似物抗性株或代谢调节突变株，具体实例包括S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸(以下简称为“AEC”)抗性突变株(乳发酵短杆菌AJ11082(NRRL B-11470)株等：参照特公昭56-1914号公报、特公昭56-1915号公报、特公昭57-14157号公报、特公昭57-14158号公报、特公昭57-30474号公报、特公昭58-10075号公报、特公昭59-4993号公报、特公昭61-35840号公报、特公昭62-24074号公报、特公昭62-36673号公报、特公平5-11958号公报、特公平7-112437号公报、特公平7-112438号公报)；生长需要氨基酸如L-高丝氨酸的突变株(参照特公昭48-28078号公报、特公昭56-6499号公报)；显示对AEC的抗性且还需要氨基酸如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸的突变株(参照美国专利第3,708,395号以及第3,825,472号说明书)；显示对DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂内酰胺、天冬氨酸-类似物、磺胺类药、醌类、N-月桂酰亮氨酸的抗性的L-赖氨酸生产突变株；显示对草酰乙酸脱羧酶或呼吸道酶抑制剂的抗性的L-赖氨酸生产突变株(特开昭50-53588号公报、特开昭50-31093号公报、特开昭52-102498号公报、特开昭53-9394号公报、特开昭53-86089号公报、特开昭55-9783号公报、特开昭55-9759号公报、特开昭56-32995号公报、特开昭56-39778号公报、特公昭53-43591号公报、特公昭53-1833号公报)；需要肌醇或乙酸的L-赖氨酸生产突变株(特开昭55-9784号公报、特开昭56-8692号公报)；对氟代丙酮酸或34℃以上的温度显示易感性的L-赖氨酸生产突变株(特开昭55-9783号公报、特开昭53-86090号公报)；对乙二醇显示抗性的短杆菌属或棒杆菌属的L-赖氨酸生产突变株(美国专利第4,411,997号说明书)等。
此外，赋予L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌还可以通过增加L-赖氨酸生物合成系统的酶活性来获得。所述酶活性的增加可以通过增加编码酶的基因在细胞内的拷贝数或对其表达调控序列进行修饰来获得。
编码L-赖氨酸生物合成系统酶的基因的实例包括编码二氨基庚二酸途径的酶的基因，如二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(所有以上基因参见国际公开第96/40934号)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(特开昭60-87788号公报)、天冬氨酸氨基转移酶基因(aspC)(特公平6-102028号公报)、二氨基庚二酸差向异构酶基因(dapF)(特开2003-135066号公报)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)(国际公开第00/61723号)等，或者编码氨基己二酸途径的酶的基因如高乌头酸水合酶基因(特开2000-157276号公报)等。通过使用这些基因修饰的棒状杆菌型细菌公开于特开平10-215883、特开平10-165180、WO96/40934等。
作为编码天冬氨酸激酶III的基因(lysC)，优选使用经过修饰而使酶对于L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的基因。这样的经过修饰而对于反馈抑制脱敏的lysC基因可通过美国专利5,932,453中描述的方法来获得。
此外，赋予L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌可具有降低的催化生成除L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的活性或可为在所述活性方面缺陷的，或它们可具有降低的对L-赖氨酸产生起负面作用的酶的活性或或可为在所述活性方面缺陷的。这样的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA，ldcC)和苹果酸酶(malic enzyme)等，而且这些酶的活性降低或缺失的菌株记载于国际公开第WO95/23864号等。
赋予了L-色氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的优选实例为其中增强了邻氨基苯甲酸合酶活性、磷酸甘油酸脱氢酶活性和色氨酸合酶活性中的一种或两种以上酶的活性的细菌。因为邻氨基苯甲酸合成酶和磷酸甘油酸脱氢酶分别受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，可以通过构建具有反馈抑制脱敏型突变酶的细菌来增强其酶活性。
此外，还可通过导入含有色氨酸操纵子的重组DNA来赋予L-色氨酸生产能力。此外，可通过在色氨酸操纵子内增强编码色氨酸合酶的基因(trpBA)的表达来改进或赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由α和β亚基组成，其分别由trpA和trpB基因编码。色氨酸操纵子的核苷酸序列和trpA和trpB的核苷酸序列登记于GenBank登录号J01714(国际公开第2005/103275号)。
赋予了L-色氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的实例包括黄色短杆菌AJ11667(参照特开昭57-174096)。
赋予了L-酪氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的实例包括谷氨酸棒杆菌AJ11655(FERM P-5836)(参照特公平2-6517)和乳发酵短杆菌AJ12081(FERM P-7249)(参照特开昭60-70093)。
具有苯丙氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的实例包括显示酪氨酸营养缺陷性和L-苯丙氨酰-L-酪氨酸抗性的株(特开平5-49489号公报)和乳发酵短杆菌AJ12637(FERM BP-4160)(参照法国专利公开第2,686,898号)。
L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸都是芳族氨基酸，分享共同的生物合成系统。编码这些芳族氨基酸的生物合成系统酶的基因包括脱氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酸合酶(deoxyarabino-heptulosonate phosphate synthase)(aroG)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase)(aroA)和分支酸合酶(aroC)。(欧洲专利申请公开763127号说明书)。因此，可以通过增加编码这些酶的基因在质粒或染色体上的拷贝数来改进芳族氨基酸产生能力。此外，已知这些基因受酪氨酸阻抑物(tyrR)的调控，因此也可以通过缺失tyrR基因来增加芳族氨基酸生物合成系统酶的活性(参见欧洲专利763127号说明书)。
此外，具有L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的实例包括嗜乙酰乙酸棒杆菌AJ12318(FERM BP-1172；参照美国专利第5,188,949号)等。
赋予了L-亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的实例包括乳发酵短杆菌AJ3718(FERM P-2516；具有2-噻唑丙氨酸和β-羟亮氨酸抗性以及异亮氨酸和甲硫氨酸缺陷型)。
具有L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌的实例包括黄色棒杆菌AJ12149(FERM BP-759；参照美国专利第4,656,135号)等。
<1-2>碳酸酐酶活性的增强
通过修饰如上所述赋予了L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌而增强了其碳酸酐酶活性的棒状杆菌型细菌，可获得用于本发明的生产方法的棒状杆菌型细菌。然而，用于增强碳酸酐酶活性的修饰或L-氨基酸生产能力的赋予可以在先进行。
表述“经修饰而增强了碳酸酐酶活性”，包括与亲本株或野生株等相比增加了每个细胞的碳酸酐酶分子数目的情况，以及增加了每个碳酸酐酶分子的活性的情况。此外，用作比较对象的野生型可为，例如，谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC13869株或ATCC13032株。
碳酸酐酶活性的增强可通过将碳酸酐酶活性或编码碳酸酐酶的基因的mRNA量与野生型或非修饰株相比较来确认。用于确认表达量的方法的实例包括Northern杂交和RT-PCR(Molecular Cloning，Cold spring HarborLaboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001)。可将活性或表达量增加到任何水平，只要其与野生型或未修饰株相比增加，期望与例如野生株或非修饰株相比，增加1.5倍以上，更优选2倍以上，还更优选3倍以上。
碳酸酐酶是与二氧化碳与碳酸氢根的相互转化相关的酶(EC 4.2.1.1)。碳酸酐酶活性可通过Wilbur等的方法(Wilbur K.M.，Anderson N.G.，Electrometricand Colorimetric Determination of Carbonic Anhydrase，J.Biol.Chem.，176：147-154，1948)来测量。
作为编码棒状杆菌型细菌的碳酸酐酶的基因(ca基因)，已报道了两种基因，编码β类型的碳酸酐酶的基因(bca)和编码γ类型的碳酸酐酶的基因(gca)，更优选地，可使用登记于GenBank的谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的NCgl2579(对应于bca，是登录号BA_000036.3的2837954..2838577的互补链)。该基因核苷酸序列示于SEQ ID NO：13(编码区为核苷酸编号1～621)，编码的蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：14。此外，谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的bca基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：11中的核苷酸编号562至1182，而编码的蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12。
此外，作为可用于本发明的基因，可使用源自其他微生物的ca基因的同源物，只要它可表达在棒状杆菌型细菌中具有碳酸酐酶活性的蛋白。这样的ca基因的同源物可通过使用BLAST等以SEQ ID NO：11的核苷酸编号562至1182或SEQ ID NO：13的核苷酸序列为参照进行检索(http://blast.genome.jp/)。
因为可用于本发明的bca基因的序列已经阐明，可使用基于上述核苷酸序列制备的引物，例如SEQ ID NO：7和8所示的引物，和棒状杆菌型细菌的染色体DNA为模板通过PCR来获得含有bca和bca调控区的区。亦可以同样方法获得其他微生物的bca的同源物。
此外，由于依赖于棒状杆菌型细菌的种或株，bca基因的核苷酸序列存在差异，用于本发明的bca基因并不限于SEQ ID NO：11的核苷酸编号562～1182或SEQ ID NO：13的核苷酸序列，且其可为编码具有SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：14的序列、但在一个或多个位置包含一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等的蛋白的突变体或人工修饰的基因，只要其编码的Bca蛋白具有碳酸酐酶活性。在此，术语“一个或几个”可随着氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置或种类不同而不同，具体而言，为1至20个，优选1至10个，更优选1至5个。在此，上述氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位等，亦可包括基于携带bca基因的微生物的个体差异或物种差异等而天然存在的突变(突变体或变体)所产生的那些。
上述取代优选为保守取代，其为中性取代，即，不产生功能编号的取代。作为保守突变，当取代部位为芳族氨基酸时，是指在Phe、Trp、Tyr之间相互取代的突变；当取代部位为疏水性氨基酸时，是指在Leu、Ile、Val之间相互取代的突变；当取代部位为极性氨基酸时，是指在Gln、Asn之间相互取代的突变；当取代部位为碱性氨基酸时，是指在Lys、Arg、His之间相互取代的突变；当取代部位为酸性氨基酸时，是指在Asp、Glu之间相互取代的突变；当取代部位为带有羟基的氨基酸时，是指在Ser、Thr之间进行相互取代的突变。保守取代的具体实例包括：用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，以及用Met、Ile或Leu取代Val。
此外，bca基因还可包括编码与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的氨基酸序列整体上具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，特别优选97％以上同一性并具有碳酸酐酶活性的蛋白的核苷酸序列。此外，取决于导入所述bca基因的宿主，基因的简并程度可有所差异，因此可将密码子替换为在各种bca导入的宿主中便于使用的密码子。
而且，bca基因可编码具有延伸或缺失的N端或C端序列的蛋白，只要所述蛋白具有碳酸酐酶活性。例如，延伸或缺失的氨基酸序列的长度可为50个氨基酸以下，优选20个以下，更优选10个以下，特别优选5个以下。更具体而言，bca基因可编码具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的氨基酸序列、但其中所述序列在N端或C端侧延伸或缺失50至5个氨基酸残基的蛋白。
此种与bca基因具有同一性的基因可通过如下获得：例如，藉由位点特异性突变来修饰SEQ ID NO：11的核苷酸编号562～1182或SEQ ID NO：13的核苷酸序列使得由所述基因编码的蛋白质包含在特定位点的氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。此外，同源基因还可通过常规已知的突变处理来获得，如下所述。例如，可将上述核苷酸序列用羟胺等在体外处理，或可将携带该基因的微生物，例如棒状杆菌型细菌，使用紫外线照射或通常的用于突变处理的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)来进行处理，或基于易错PCR、DNA改组(shuffling)、StEP-PCR的遗传重组来人工地将突变导入bca从而可获得高活性的bca基因(Firth A.E.，Patrick W.M.，Bioinformatics，2005 Jun 2，Statistics of Protein Library Cconstruction)。
此外，bca基因的实例包括DNA，所述DNA在严格条件下与SEQ ID NO：11的核苷酸编号562～1182或SEQ ID NO：13的核苷酸序列的互补序列，或可从这些序列制备的探针杂交，并编码具有碳酸酐酶活性的蛋白质。在此，所谓“严格条件”可为形成特异性杂合物，但不形成非特异性杂合物的条件。实例包括，例如，彼此具有高同源性的DNA，例如，彼此具有80％以上、90％以上、95％以上或97％以上的同源性的DNA彼此杂交，而具有低于上述水平的同源性的DNA彼此不杂交的条件。“严格条件”还可包括或通常的Southern杂交中通常的洗涤条件，例如在60℃、1xSSC、0.1％SDS，优选在60℃、0.1xSSC，0.1％SDS，更优选在68℃、0.1xSSC，0.1％SDS的盐浓度和温度，洗涤一次，更优选洗涤2～3次。
还可将SEQ ID NO：11的核苷酸编号562～1182或SEQ ID NO：13的核苷酸序列的部分序列用作探针。此种探针可使用基于该核苷酸序列而制备的寡核苷酸作为引物，包含SEQ ID NO：11的核苷酸编号562～1182的核苷酸序列，或SEQ ID NO：13的核苷酸序列的DNA片段作为模板通过PCR制备。将长度为约300bp的DNA片段用作探针，例如，在上述条件下杂交后的洗涤条件可例示为在50℃，2xSSC，0.1％SDS。
bca基因表达量的增强，可通过提高bca基因的拷贝数来达成。例如，可通过将含有bca的基因的片段与在棒状杆菌型细菌起作用的载体，优选多拷贝型载体相连接而制备重组DNA，并用所述DNA转化如上所述的具有L-氨基酸生产能力的微生物来增加所述基因的拷贝数。或者，在通过导入如上所述的重组DNA来转化棒状杆菌型细菌的野生型株之后，可将L-氨基酸生产能力赋予该转化株。此外，基因拷贝数的提高亦可通过将bca基因的单拷贝或多拷贝转移至细菌的染色体来达成。bca基因转移至染色体可通过使用bca基因一部分作为探针通过Southern杂交来加以确认。
此外，bca基因表达的增强，亦可通过修饰bca基因的表达调控序列来达成。例如，可通过用更强的启动子替换bca启动子序列，或使启动子序列更接近共有序列来达成(国际公开WO00/18935号)。
以下，阐明用于修饰棒状杆菌型细菌而增强碳酸酐酶活性的方法。这些方法可依照如Molecular Cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Coldspring Harbor(USA)，2001)的手册所述来进行。
bca基因表达量的增加，可通过提高bca基因拷贝数来达成，而提高拷贝数可通过如下所述通过使用质粒扩增bca基因来达成。首先，从棒状杆菌型细菌染色体克隆bca基因。染色体DNA可从DNA供体细菌例如通过斋藤和三浦的方法(参照H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619，1963；生物工学实验书、日本生物工学会编、97-98页，培风馆，1992年)等来制备。用于PCR的寡核苷酸可基于上述已知信息来合成，例如，可使用SEQ ID NO：7和8所示的合成寡核苷酸来扩增bca基因。
可将含有通过PCR扩增的bca基因的基因片段与在大肠杆菌和/或棒状杆菌型细菌的细胞内可自主复制的载体DNA连接而制备重组DNA，并将此重组DNA导入大肠杆菌，这使得后续操作更容易。作为在大肠杆菌细胞内可自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pBR322、pACYC184、pMW219等。
将上述DNA导入在棒状杆菌型细菌中起作用的载体。在棒状杆菌型细菌中起作用的载体，为例如在棒状杆菌型细菌中可自主复制的质粒。在棒状杆菌型细菌中可以自主复制的质粒的具体实例包括特开平3-210184号公报中记载的质粒pCRY30；特开平2-72876号公报和美国专利5,185,262号公报中记载的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX；特开平1-191686号公报中记载的质粒pCRY2和pCRY3；特开昭58-67679号公报中记载的pAM330；特开昭58-77895号公报中记载的pHM1519；特开昭58-192900号公报中记载的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；特开昭57-134500号公报中记载的pCG1；特开昭58-35197号公报中记载的pCG2；特开昭57-183799号公报中记载的pCG4和pCG11等；和特开平10-215883号公报中记载的pVK7。
此外，如果从任何这些载体中切出在棒状杆菌型细菌中能使质粒自主复制的DNA片段，并将所述片段插入用于大肠杆菌的任何前述载体，则可将所得的用作在大肠杆菌和棒状杆菌型细菌二者中均可自主复制的所谓穿梭载体。
为了通过将bca基因与在棒状杆菌型细菌中起作用的载体连接来制备重组DNA，将载体用适于bca末端的限制性酶消化。可将该限制性酶位点预先导入用于扩增bca基因的合成寡核苷酸中。连接通常使用连接酶如T4DNA连接酶进行。
为了将上述制备的重组质粒导入棒状杆菌型细菌，可遵循迄今为止报道的任何转化法进行。例如，对于大肠杆菌K-12报道的，可用氯化钙处理受体细菌而增加DNA通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159，1970)。还有对于枯草芽孢杆菌报道的从生长中的细胞制备感受态细胞并可将DNA导入这些细胞的方法(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，Gene，1，153，1977)。其他方法为对于枯草芽孢杆菌、放线菌类和酵母已知的，将DNA受体细胞制成容易摄入重组DNA的原生质体或原生质球，并可将重组DNA导入这些DNA受体菌的方法(Chang，S.和Choen，S.N.，Mol.Gen.Genet.，168，111，1979；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398，1978；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929，1978)。此外，亦可通过电脉冲法(特开平2-207791号公报)或接合转移法(Biotechnology(NY).1991 Jan，9(1)：84-7)进行棒状杆菌型细菌的转化。
提高bca基因的拷贝数亦可通过使bca基因在棒状杆菌型细菌的染色体DNA上以多拷贝存在来达成。为了将bca以多拷贝导入棒状杆菌型细菌的染色体DNA上，可通过利用在染色体DNA上以多拷贝存在的序列作为靶进行同源重组来进行。作为在染色体DNA上以多拷贝存在的序列，可使用重复DNA或在可转座元件端部存在的反向重复序列。或者，亦可如特开平2-109985号公报中公开的，可通过将多拷贝的bca基因并入转座子并转移转座子从而将多拷贝的bca基因导入染色体DNA(特开平2-109985号；特开平7-107976号；Mol.Gen.Genet.，245，397-405，1994；Plasmid 2000Nov，44(3)：285-91)。
亦可适用下述方法，即，将bca基因导入具有在宿主中无法复制的复制起点的质粒，或具有在宿主中无法复制的复制起点以及导致结合转移至宿主的能力的质粒，并将获得的质粒导入宿主以使该基因在染色体上扩增。例如，所述质粒的实例包括pSUP301(Simo等，Bio/Technology 1，784～791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schaefer等，Gene145，69～73(1994))、pGEM-T(Promega corporation，Madison，WI，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman(1994).Journal of Biological Chemisty269：32678～84；US-A 5487993)、pCR Blunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bernard等，Journal of Molecular Biology，234：534～541(1993))、pEM1(Schrumpf等，1991，Journal of Bacteriology 173：4510～4516)或pBGS8(spratt等，1986，Gene，41：337～342)等。通过结合或转化，将含有bca基因的质粒载体转移至棒状杆菌型细菌中。结合方法，记载于例如Schaefer等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，756～759(1994))。转化方法，例如记载于Theirbach等(APpliedMicrobiology and Biotechnology 29，356～362(1988))、Dunican和Shivinan(Bio/Technology 7，1067～1070(1989))以及Tauch等(FEMS Microbiological Letters123，343～347(1994))。
此外，作为提高Bca活性的手段，可通过在染色体DNA或质粒上的bca基因的表达调控序列如启动子用更强的替代，修饰涉及bca基因的表达调控的因子如操纵子或阻抑子，或与强的终止子相连接的来达成(Hamilton等；Journalof Bacterology171：4617-4622)。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、PS2启动子等为强的启动子。启动子强度的评价方法以及强的启动子的实例，记载于Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等。此外，如国际公开WO00/18935记载的，可通过在目标基因的启动子区中进行几个核苷酸取代使该序列更接近共有序列来增加使启动子的强度。例如，可考虑将-35区替换为TTGACA或TTGCCA序列，将-10区替换为TATAAT或TATAAC序列。此外，已知通过在核糖体结合位点(RBS)与翻译起始密码子之间的间隔区，特别是紧邻开始启动子的上游序列中取代几个核苷酸来显著地影响mRNA的翻译效率，并且也可对它们进行修饰。
bca基因的上游区的实例包括，例如，SEQ ID NO：11的核苷酸编号1～561的区。bca基因上游的表达调控序列如启动子可通过使用启动子检索载体或基因分析软件如GENETYX来确定。通过这些启动子的取代或修饰，可增强bca基因的表达。表达调控序列的取代，例如，可通过使用温度敏感性质粒来进行。而且，表达调控序列的修饰，亦可与增加bca基因的拷贝数相组合。
此外，表达量的提高还可通过延长mRNA的存活时间，或防止酶蛋白在细胞内降解来达成。
而且，作为编码大肠杆菌的碳酸酐酶的基因，已报道了分别编码两种碳酸酐酶Can(碳酸酐酶2)和CynT(碳酸酐酶1)的yadF和cynT基因，并可使用这些基因来代替上述bca基因。作为yadF，可例示在GenBank登录的大肠杆菌的yadF(登录号EG_12319)。该基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：27(编码区201-860)，编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：28。此外，作为cynT基因，可例示大肠杆菌的cynT(登录号EG_10176)。cynT基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：29(编码区201-857)，编码的核苷酸序列示于SEQ ID NO：30。还可使用编码下述蛋白质的基因：所述蛋白质与这些氨基酸序列全长具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，特别优选97％以上的同一性，并具有碳酸酐酶活性。
用于本发明制备方法的微生物，亦可为除了增强碳酸酐酶活性之外，经修饰赋予D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性的微生物。
对于D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性，可赋予任一种活性，亦可二者活性均赋予。而且，在本说明书中，D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶可统称为磷酸酮醇酶。
所谓D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶活性，意指消耗磷酸，将木糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸并释放出一分子的水的活性。该活性可通过在Goldberg，M.等记载的方法(Methods Enzymol.，9，515-520，1966)或L.Meile记载的方法(J.Bacteriol.，183：2929-2936，2001)来测定。
此外，所谓果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性，意指消耗磷酸，将果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸并释放出一分子的水的活性。该活性可通过在Racker，E.记载的方法(Methods Enzymol.，5，276-280，1962)或L.Meile记载的方法(J.Bacteriol.，183：2929-2936，2001)来测定。
磷酸酮醇酶的活性赋予，可通过使用质粒将编码磷酸酮醇酶的基因导入棒状杆菌型细菌的细胞内，或将该基因并入棒状杆菌型细菌的染色体等来进行。
由于棒状杆菌型细菌不具有固有的磷酸酮醇酶活性，可通过下述方法赋予磷酸酮醇酶活性：将含有源自其他生物的编码磷酸酮醇酶的基因的质粒导入棒状杆菌型细菌的细胞内，或将源自其他生物的编码磷酸酮醇酶的基因并入棒状杆菌型细菌的染色体等。
编码D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶的基因，可通过使用具有该酶活性的微生物的染色体DNA作为模板进行PCR等手段获得。此种微生物的实例包括细菌如乳酸细菌、甲醇同化细菌，甲烷同化细菌，属于链球菌属(Streptococcus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲基球菌属(Methylococus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、丝状杆菌属(Fibrobacter)等的细菌，或属于假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、毕赤酵母属(Pichia)、西洋蓍霉属(Yarrowia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、温酵母属(Wingea)等的酵母等。
编码果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶的基因，可通过使用具有该酶活性的微生物的染色体DNA作为模板进行PCR等手段获得。此种微生物的实例包括细菌如属于醋酸杆菌属、双歧杆菌属、绿菌属(Chlorobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、甲基球菌属、加德纳氏菌属(Gardnerella)等的细菌；或属于假丝酵母属、红酵母属、酵母属等的酵母等。
编码D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶的基因的具体实例包括编码戊酸乳杆菌(Lactobacillus pentosus)MD363的D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶的xpkA基因。其核苷酸序列以登录号AJ309011(Posthuma，C.C.等，Appl.Environ.Microbiol.，68(2)，831-7(2002))登录于EMBL/GenBank数据库(SEQ ID NO：15)。
此外，亦可使用源自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的xpk1基因。其核苷酸序列以登录号NC_004567Region：互补体(2362936..2365302)(Kleerebezem，M.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(4)，1990-1995(2003))登录于EMBL/GenBank数据库(SEQ ID NO：17)。
此外，这些基因的同源物的实例包括GenBank登录号NC_004567互补体(3169067-3171478)的植物乳杆菌的基因，编码GenBank登录号NP_736274的氨基酸序列的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的基因，编码GenBank登录号NP_267658的氨基酸序列的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)的基因，GenBank登录号NC_005362(696462..698867)的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)基因，编码GenBank登录号YP_193510的氨基酸序列的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的基因等。
亦可使用编码具有D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶二者的活性的蛋白质的基因。此种基因的实例包括乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)的xfp基因，其核苷酸序列以登录号AJ293946(Meile，L.等，J.Bacteriol.，183(9)，2929-36，2001)登录于EMBL/GenBank数据库(SEQ ID NO：19)。
作为xfp基因的同源基因，亦可使用编码GenBank登录号NP_696135的氨基酸序列的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的基因，编码GenBank登录号NP_662409的氨基酸序列的Chlorobium tepidum的基因，编码GenBank登录号NP_699578的氨基酸序列的猪布鲁氏菌(Brucella suis)的基因，编码GenBank登录号YP_223570的氨基酸序列的流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的基因等。
而且，磷酸酮醇酶基因亦可为下述DNA，所述DNA与上述任一核苷酸序列的互补体或可从该互补体制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有磷酸酮醇酶活性的蛋白质。此外，亦可使用下述DNA，所述DNA编码与SEQ ID NO：16、18或20的氨基酸序列的全长具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，特别优选97％以上的同一性，并具有磷酸酮醇酶活性的蛋白质。
在本发明的生产方法中使用的微生物，除了增强碳酸酐酶活性外，还可经修饰使得与野生型株相比较增强磷酸转乙酰酶活性。磷酸转乙酰酶是与醋酸代谢相关的酶。在大肠杆菌中，其负责醋酸生成的主要途径的一部分，即从乙酰CoA与磷酸生成乙酰磷酸的反应。另外，已知在谷氨酸棒杆菌中，同化醋酸和生成乙酰CoA时磷酸转乙酰酶活性增加，此外，转录因子RamB涉及对磷酸转乙酰酶活性的负调控(Microbiology，145，503-513，1999；Journal of Bacteriology，186，9，2798-2809，2004)。磷酸转乙酰酶的活性增强，与上述磷酸转乙酰酶的活性增强相同，可通过增加编码磷酸转乙酰酶的基因的拷贝数或修饰编码磷酸转乙酰酶的基因的启动子等来进行。此外，亦可通过缺失上述ramB基因，或通过修饰位于编码磷酸转乙酰酶的基因上游的RamB蛋白质结合部位来达成所述增强。
作为编码棒状杆菌型细菌的磷酸转乙酰酶的基因(pta基因)，可使用登录于GenBank的ATCC13032的核苷酸序列NCgl2657(登录号NC_003450.3的2936506..2937891的互补链)。该基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：21，编码的蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：22。此外，谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的pta基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：23的核苷酸编号1214～2641，编码的蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：24。
此外，作为本发明的基因，只要它在棒状杆菌型细菌中编码显示磷酸转乙酰酶活性的蛋白，就可使用源自其他微生物的pta基因的同源基因。这样的pta基因的同源物可通过使用BLAST等参照SEQ ID NO：23的核苷酸编号1214～2641的核苷酸序列进行检索(http://blast.genome.jp/)。
已阐明可用于本发明的pta基因的核苷酸序列。因此，可使用基于已知核苷酸序列制备的引物，例如示于SEQ ID NO：25和26的引物，和棒状杆菌型细菌的染色体DNA为模板通过PCR(聚合酶链式反应；参照White，T.J.等，Trends Genet.5，185，1989)获得含pta基因及其表达调控序列的区。亦可以同样方法获得源自其他微生物的pta基因的同源物。
此外，随着棒状杆菌型细菌的种或菌株的不同，pta基因的核苷酸序列可以不同，用于本发明的pta基因并不限于SEQ ID NO：23的核苷酸编号1214～2641或SEQ ID NO：21的核苷酸序列，只要编码的Pta蛋白质的功能具有磷酸转乙酰酶活性，可为编码具有SEQ ID NO：24或22的氨基酸序列，但在一个或多个位置包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加等的蛋白质的突变体或人工变体。在此，所谓“一个或几个”可随着氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置或种类不同而不同，具体而言，其可为1至20个，优选1至10个，更优选1至5个。此外，上述氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位等亦可包括基于包含pta基因的微生物的个体差异或物种差异等由天然存在的变异(mutant或variant)所产生的那些。此外，可使用编码下述蛋白质的DNA，所述蛋白质与SEQ ID NO：24或22的氨基酸序列全长具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，特别优选97％以上的同一性，并具有磷酸转乙酰酶活性。
在本发明的生产方法中使用的棒状杆菌型细菌，除了上述修饰以外，还可为经修饰而与野生型株相比较增强丙酮酸羧化酶活性的微生物。作为编码丙酮酸羧化酶的基因，例如，可使用源自棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌的基因，谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的pyc基因(GenBank登录号NCgl0659)或枯草芽孢杆菌的pyc基因(欧州专利1092776号)。
在本发明的生产方法中使用的棒状杆菌型细菌，除了上述修饰以外，还可为经修饰而与野生型株相比较增强磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的微生物。作为编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，例如，可使用源自棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌的基因，谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的ppc基因(GenBank登录号NCgl1523)或源自大肠杆菌MG1655的ppc基因(GenBank登录号NP_418391)。
而且，因为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可受天冬氨酸的反馈抑制，优选经修饰使其对于天冬氨酸的反馈抑制脱敏(欧洲专利0723011号)。
<2>产生L-氨基酸的方法
可通过如下产生L-氨基酸：将如上所述获得的棒状杆菌型细菌在培养基中培养以在培养基中生成并蓄积L-氨基酸，并从该培养基收集L-氨基酸。
用于培养的培养基可使用含有碳源、氮源、无机盐，以及根据需要的有机微量营养物如氨基酸和维生素普通培养基。合成培养基或天然培养基二者均可使用。可将任何种类的碳源和氮源用于培养基中，只要它们能够被待培养的所选菌株利用。
作为碳源，可使用糖类如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜。此外，有机酸如醋酸和柠檬酸和醇类如乙醇，可单独使用或与其他碳源组合使用。作为氮源，可使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵或硝酸盐等。作为有机微量营养物，可使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、以及含有这些物质的那些如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解物等。在使用其生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变株时，优选补充所需的营养物。作为无机盐，可使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。
培养优选为发酵温度控制为20～45℃，pH控制在3～9的通气培养。在培养过程中，当pH下降时，例如，可添加碳酸钙，或用碱性物质如氨气中和培养物。在此种条件下，优选通过10小时～120小时程度的培养，在培养液中蓄积显著量的目标L-氨基酸如L-谷氨酸。
此外，在生产L-谷氨酸时，可使用经调整以满足L-谷氨酸析出的条件的液体培养基作为培养基，在L-谷氨酸在培养基中析出的同时进行培养。L-谷氨酸析出的条件的实例包括，例如，pH5.0～4.0，优选pH4.5～4.0，更优选pH4.3～4.0，特别优选pH4.0(欧洲专利申请公开第1078989号说明书)
培养终止之后从培养基收集L-氨基酸的方法，可遵循公知的回收方法进行。例如，可在从培养液除去细胞之后通过将培养基浓缩以使L-氨基酸结晶的方法或离子交换色谱法等进行收集L-氨基酸。当在L-谷氨酸析出的条件下进行培养时，培养液中析出的L-谷氨酸可通过离心分离或过滤等进行收集。在此情况下，可使在培养基中溶解的L-谷氨酸结晶，然后与已经析出的L-谷氨酸一起进行分离。
实施例
以下，参考实施例具体地说明本发明。但本发明并不限于下述实施例。
1.谷氨酸棒杆菌ATCC13869bca扩增株的构建
使用sucA缺陷株作为bca基因扩增的亲本株。sucA缺陷株可通过以下方法构建。
(1-1)sucA缺陷株的构建
如下所述构建了ATCC13869的sucA缺陷株(ATCC13869ΔsucA)
编码α-酮戊二酸脱氢酶的E1o亚基的sucA基因的破坏，是使用携带编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因的质粒pBS3进行的。携带sacB的用于基因破坏的载体的构建，使用国际公开2005/113745号和2005/113744号中记载的pBS3。
由源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的sucA组成的缺少ORF的基因片段，是使用以已经公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032(GenBank数据库登录号NC_003450)的该基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)为参考设计的合成DNA作为引物通过重叠PCR方法获得的。具体而言，以谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的染色体DNA作为模板，SEQ ID NO：1和2的合成DNA作为引物通过常规方法进行PCR，获得了sucA基因N末端侧的扩增产物。另外，为了获得sucA基因C末端侧的扩增产物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13869株基因组DNA为模板，SEQ ID NO：3和4的合成DNA作为引物通过常规方法进行PCR。SEQ ID NO：2和3的核苷酸序列彼此互补，并具有由sucA组成缺少ORF全序列的结构。
接着，为了获得内部序列缺失的sucA基因片段，将上述sucA的N末端和C末端的基因产物以等摩尔混合并用作模板，以SEQ ID NO：5和6的合成DNA作为引物通过常规方法进行PCR，获得导入突变的sucA基因扩增产物。将生成的PCR产物通过常规方法纯化之后用BamHI消化，并将所得物插入上述pBS3的BamHI位点。使用获得的DNA转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(Takara Bio社制造)，涂布于含100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km的LB平板培养基上，过夜培养，挑取出现的白色菌落，分离成单菌落以获得转化体。从获得的转化体提取质粒，将插入目标PCR产物的质粒命名为pBS3ΔsucA。
(1-2)sucA缺陷株的构建
由于上述(1-1)中获得的pBS3ΔsucA不含有在棒状杆菌型细菌的细胞内能使质粒自主复制的任何区，因此使用该质粒转化棒状杆菌型细菌时，虽然以低频率出现，但该质粒通过同源重组而并入染色体的株会作为转化体出现。将谷氨酸棒杆菌ATCC13869株通过电脉冲法用高浓度的质粒pBS3ΔsucA转化，涂布于含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex平板培养基(葡萄糖5g/L、聚胨10g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·7H2O0.01g/L、尿素3g/L、大豆水解物1.2g/L、生物素10μg/L、琼脂15g/L、用NaOH调整至pH7.5)，在31.5℃培养约30小时。作为该质粒的sucA基因片段与ATCC13869株基因组上的同一基因之间发生的同源重组的结果，在此培养基上生长的株为该基因组中插入了来自该质粒的卡那霉素抗性基因和sacB基因的株。
接着，将这些第一次重组体在不含卡那霉素的CM-Dex液体培养基(从CM-Dex平板培养基成分中去除琼脂而制备成)在31.5℃培养过夜，在适当稀释之后，涂布于不含卡那霉素的含10％蔗糖Dex-S10平板培养基(蔗糖100g/L、聚胨10g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、FeSO4·7H2O0.01g/L、MnSO4·4H2O 0.01g/L、尿素3g/L、大豆水解物1.2g/L、生物素10μg/L、琼脂15g/L、用KOH调整至pH7.5)，在31.5℃培养约30小时。其结果，可通过第二次同源重组获得推定为由于消除sacB基因而成为蔗糖非敏感性的株。
如上所述获得的株包括该sucA基因被源自pBS3ΔsucA的突变型替代的株和sucA基因回复为野生型的株。sucA基因是突变型还是野生型的确认，可通过使用在Dex-S10平板培养基上培养所得的细胞直接进行PCR反应以检测sucA基因而容易地确定。使用PCR扩增sucA基因用的引物(SEQ ID NO：5和6)进行分析时，将提供比用ATCC13869株的染色体DNA作为模板所得的PCR产物更小的PCR产物的株作为sucA缺陷株在接下来的实验中使用。
sucA缺陷株的L-谷氨酸生产能力的评价用下述方法进行。将这些菌株在CM-Dex平板培养基上进行培养，将生长出来的各菌株在分装于坂口烧瓶的20ml在1L纯水中含有葡萄糖30g、KH2PO41g、MgSO40.4g、(NH4)2SO415g、FeSO4·7H2O 0.01g、MnSO4·7H2O 0.01g、大豆水解物13.7ml、硫胺素盐酸盐200μg、生物素300μg和CaCO350g的培养基(用KOH将pH调整至8.0)中，在31.5℃振荡培养。在培养基中的葡萄糖全部消耗时结束培养。L-谷氨酸浓度是在将培养上清以适当倍数用水稀释之后，通过BiotechAnalyzer(AS-210，Sakura SI)测定的。选择显示高L-谷氨酸发酵产率的株，命名为ATCC13869ΔsucA。
(1-3)bca扩增用质粒的构建
为了构建碳酸酐酶(bca)基因表达增强的株，将pVK9穿梭载体用BamHI处理，将其与编码该酶的DNA片段(以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13869株的染色体DNA作为模板通过PCR进行扩增，并用BamHI处理而获得)连接，使用连接产物转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(Takara Bio制造)，并将细胞涂布于含有IPTG 100μM、X-Gal 40μg/ml和Cm25μg/ml的LB平板培养基，过夜培养。此后，挑取出现的白色菌落，并分离成单菌落以获得转化体。从获得的转化体提取质粒，将bca基因沿相对于lacZ基因的正向连接的质粒命名为pVK9-bca。
而且，pVK9为将pHSG299(Takara Bio)的AvaII位点平端化，并将通过用BamHI和KpnI切割在棒状杆菌型细菌内可自主复制的pHK4(特开平05-007491)的区并将该区域平端化而获得的片段插入pHSG299的平端化位点而得到的穿梭载体。
此外，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的合成DNA，可参考已经公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032(GenBank数据库登录号NC_003450，SEQ ID NO：13)的碳酸酐酶基因的核苷酸序列进行设计。
(1-4)向ATCC13869ΔsucA株导入BCA扩增用质粒
通过用pVK9(对照用质粒)和pVK9-bca(BCA扩增用质粒)转化ATCC13869ΔsucA获得株。转化通过电脉冲法进行，并将细胞涂布于含有卡那霉素25μg/ml的CM-Dex平板培养基，在31.5℃培养约30小时以获得转化株。导入上述各质粒的株分别命名为ATCC13869ΔsucA(pVK9)和ATCC13869ΔsucA(pVK9-bca)。
2.在BCA增强的ATCC13869ΔsucA株中L-谷氨酸蓄积改善效果的确认
bca扩增效果通过使用示于1-2的烧瓶培养评价系统进行评价。
(2-1)用BCA增强株观察到的谷氨酸蓄积
使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869ΔsucA(pVK9)株和ATCC13869ΔsucA(pVK9-bca)株，通过以与上述(1-2)中所述用于sucA缺陷株评价的相同方法培养来评价BCA增强对于L-谷氨酸蓄积改善的效果。培养12小时之后的结果示于下表。对于L-谷氨酸蓄积量，与对照株相比较，BCA增强株明显较高(n＝4)。
表1
Figure BDA0000138505820000271
(2-2)用BCA增强株观察到的L-氨基酸蓄积
使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869ΔsucA(pVK9)株和ATCC13869ΔsucA(pVK9-bca)株，通过以与上述(1-2)中所述用于sucA缺陷株评价的相同方法培养来评价BCA增强对于的L-氨基酸蓄积改善的效果。对于两株的培养物，将24小时后的培养上清各一个样品用0.02N盐酸稀释51倍，用氨基酸分析器(L-8500，Hitachi Co.，Ltd)进行稀释物中多种L-氨基酸的定量。其结果示于图1。显而易见，通过BCA的增强，L-天冬氨酸和L-丙氨酸的蓄积量与对照株相比得到改善(n＝2)。
序列表说明
SEQ ID NO：1：谷氨酸棒杆菌ATCC13869sucA基因破坏用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：2：谷氨酸棒杆菌ATCC13869sucA基因破坏用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：3：谷氨酸棒杆菌ATCC13869sucA基因破坏用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：4：谷氨酸棒杆菌ATCC13869sucA基因破坏用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：5：谷氨酸棒杆菌ATCC13869sucA基因扩增用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：6：谷氨酸棒杆菌ATCC13869sucA基因扩增用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：7：谷氨酸棒杆菌bca基因扩增用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：8：谷氨酸棒杆菌bca基因扩增用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：9：谷氨酸棒杆菌ATCC13869sucA基因核苷酸序列
SEQ ID NO：10：谷氨酸棒杆菌ATCC13869α-KGDH氨基酸序列
SEQ ID NO：11：谷氨酸棒杆菌ATCC13869bca基因核苷酸序列
SEQ ID NO：12：谷氨酸棒杆菌ATCC13869Bca氨基酸序列
SEQ ID NO：13：谷氨酸棒杆菌ATCC13032bca基因核苷酸序列
SEQ ID NO：14：谷氨酸棒杆菌ATCC13032Bca氨基酸序列
SEQ ID NO：15：戊酸乳杆菌MD363xpkA基因核苷酸序列
SEQ ID NO：16：戊酸乳杆菌MD363XpkA氨基酸序列
SEQ ID NO：17：植物乳杆菌xpk1基因核苷酸序列
SEQ ID NO：18：植物乳杆菌Xpk1氨基酸序列
SEQ ID NO：19：乳双歧杆菌的xfp基因核苷酸序列
SEQ IDNO：20：乳双歧杆菌的Xfp氨基酸序列
SEQ ID NO：21：谷氨酸棒杆菌ATCC13869pta基因核苷酸序列
SEQ ID NO：22：谷氨酸棒杆菌ATCC13869Pta氨基酸序列
SEQ ID NO：23：谷氨酸棒杆菌ATCC13032pta基因核苷酸序列
SEQ ID NO：24：谷氨酸棒杆菌ATCC13032Pta氨基酸序列
SEQ ID NO：25：谷氨酸棒杆菌pta基因扩增用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：26：谷氨酸棒杆菌pta基因扩增用引物核苷酸序列
SEQ ID NO：27：大肠杆菌MG1655yadF基因核苷酸序列
SEQ ID NO：28：大肠杆菌MG1655YadF氨基酸序列
SEQ ID NO：29：大肠杆菌MG1655cynT基因核苷酸序列
SEQ ID NO：30：大肠杆菌MG1655CynT氨基酸序列
Figure IDA0000138505880000011
Figure IDA0000138505880000021
Figure IDA0000138505880000031
Figure IDA0000138505880000041
Figure IDA0000138505880000051
Figure IDA0000138505880000061
Figure IDA0000138505880000091
Figure IDA0000138505880000111
Figure IDA0000138505880000121
Figure IDA0000138505880000131
Figure IDA0000138505880000141
Figure IDA0000138505880000151
Figure IDA0000138505880000161
Figure IDA0000138505880000171
Figure IDA0000138505880000181
Figure IDA0000138505880000191
Figure IDA0000138505880000201
Figure IDA0000138505880000211
Figure IDA0000138505880000221
Figure IDA0000138505880000231
Figure IDA0000138505880000251
Figure IDA0000138505880000261
Figure IDA0000138505880000281
Figure IDA0000138505880000301

Claims (8)

1.一种产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌以在该培养基或细菌细胞中产生并蓄积L-氨基酸，并从该培养基或细菌细胞收集L-氨基酸，其中所述棒状杆菌型细菌经修饰而增强了碳酸酐酶活性，其中所述L-氨基酸选自下组：L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸。
2.权利要求1的方法，其中所述碳酸酐酶活性是通过增加编码碳酸酐酶的基因的拷贝数或通过修饰基因的表达调控序列来增强的。
3.权利要求2的方法，其中所述编码碳酸酐酶的基因是由SEQ ID NO:11的核苷酸编号562至1182的核苷酸序列或SEQ ID NO:13的核苷酸序列组成的DNA。
4.权利要求1的方法，其中所述细菌进一步经修饰而赋予了D-木糖-5-磷酸磷酸酮醇酶活性和/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性。
5.权利要求1的方法，其中所述细菌进一步经修饰而增强了磷酸转乙酰酶活性。
6.权利要求1的方法，其中所述细菌进一步经修饰而增强了丙酮酸羧化酶活性。
7.权利要求1的方法，其中所述细菌进一步经修饰而增强了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。
8.权利要求1的方法，其中所述棒状杆菌型细菌是谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌。
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