JPH07163383A

JPH07163383A - Ｌ−アラニンの製造法

Info

Publication number: JPH07163383A
Application number: JP26015893A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Yamagata; 恒山縣; Yasurou Kurusu; 泰朗久留主; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1993-10-18
Filing date: 1993-10-18
Publication date: 1995-06-27

Abstract

(57)【要約】【目的】新規形質転換細菌を用いたＬ−アラニンの製
造法の提供。【構成】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコードする
構造遺伝子および該遺伝子の発現を調節し得るプロモー
ター領域を含むＤＮＡ断片とコリネ型細菌内で複製可能
なプラスミドＤＮＡからなる組換え体ＤＮＡにより形質
転換されたコリネ型細菌を用いた、Ｌ−アスパラギン酸
を原料としたＬ−アラニンの製造法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−アラニンの製造方
法に関し、さらに詳しくは、アスパラギン酸β−脱炭酸
酵素活性を付与した組換え体ＤＮＡで形質転換したコリ
ネ型細菌を用い、Ｌ−アスパラギン酸を原料とする、Ｌ
−アラニンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アラニンは、食品および医農薬中間
体等の原料として近年その需要が増しているアミノ酸で
ある。従って、Ｌ−アラニンを製造する際に用いられる
アスパラギン酸β−脱炭酸酵素（E.C. 4.1.1.12）も、
産業上重要な酵素である。この酵素は、Ｌ−アスパラギ
ン酸の４位のカルボキシル基を脱炭酸してＬ−アラニン
を生成する。

【０００３】従来、Ｌ−アスパラギン酸を酵素的にＬ−
アラニンに変換する方法としては、アスパラギン酸β−
脱炭酸酵素活性の強いキサントモナス（Xanthomonas）
属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ブレビバクテ
リウム（Brevibacterium）属、アースロバクター（Arth
robactor）属、アクロモバクター（Achromobacter）
属、エルビニヤ（Erwinia）属、クロストリジウム（Clo
stridium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）
属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、コリネバクテ
リウム（Corynebacterium）属、セラチア（Serratia）
属、サルチナ（Sarcina）属、アグロバクテリウム（Agr
obacterium）属、フラボバクテリウム（Flavobacteriu
m）属菌株を用いる方法（特公昭42-11995号公報、特公
昭42-28951号公報参照)、シュードモナス・ダクネー（P
seudomonas dacunhae)、アクロモバクター・ペステイフ
アー（Acromobacter pestifer）を用いる方法（特公昭4
6-7560号公報参照）等が知られている。また、組換えＤ
ＮＡ技術により開発された方法としては、シュードモナ
ス属細菌由来のアスパラギン酸β−脱炭酸酵素遺伝子で
形質転換した大腸菌を用いた方法（米国特許第5,019,50
9号明細書）が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
方法においては、反応中に菌体が溶解して酵素が反応液
中に漏出するために酵素活性の安定性が著しく低下し、
従って、これらの方法を工業的に利用するためには、反
応槽中において菌体または酵素を合成高分子または天然
物多糖等の基材に固定化してこれを保持し、酵素活性の
安定性を高めるという煩雑な操作を必要とするという欠
点があった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはこのような
状況を考慮し、組換えＤＮＡ技術を活用し鋭意検討を重
ねた結果、ある種の組換え体ＤＮＡでコリネ型細菌を形
質転換し、該形質転換細菌を用いてＬ−アラニンを製造
することにより、効率的なＬ−アラニン製造法が確立さ
れ、それにより上記課題が全て解決されることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。前述の如く、シュード
モナス属細菌由来のアスパラギン酸β−脱炭酸酵素遺伝
子で形質転換した細菌としては、該遺伝子を導入した大
腸菌の例が知られているが（米国特許第5,019,509号明
細書）、該遺伝子がコリネ型細菌内で安定かつ強力に発
現し、ために該遺伝子を導入したコリネ型細菌をＬ−ア
スパラギン酸を原料としたＬ−アラニン製造に使用する
ことができることは本発明により初めて得られた知見で
ある。

【０００６】本発明は、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とコリネ型細菌内
で複製可能なプラスミドＤＮＡとからなる組換え体ＤＮ
Ａで形質転換されたコリネ型細菌の存在下、Ｌ−アスパ
ラギン酸をＬ−アラニンに変換することを特徴とするＬ
−アラニンの製造法を提供する。本発明の組換え体ＤＮ
Ａに使用することができるアスパラギン酸β−脱炭酸酵
素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とは、「アスパ
ラギン酸β−脱炭酸酵素をコードする構造遺伝子および
該遺伝子の発現を調節しうるプロモーター領域を含むＤ
ＮＡ断片」を意味するものである。

【０００７】上記アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコー
ドする構造遺伝子としては、アスパラギン酸β−脱炭酸
酵素産生能を有するシュードモナス属細菌の染色体に由
来する遺伝子を例示することができる。該構造遺伝子の
供給源となるシュードモナス属細菌としては、例えば、
シュードモナス・ダクネー（Pseudomonas dacunhae）IA
M1152、同 ATCC21192、シュードモナス・プチダ（Pseud
omonas putida）IAM1506、同 ATCC21812、シュードモナ
ス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）IFO3
081、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas ae
ruginosa）IAM1054 等が例示できるが、これらの中でも
シュードモナス・ダクネー（Pseudomonas dacunhae）AT
CC21192 が特に好適に用いられる。

【０００８】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコードす
る構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の取得方法としては、例
えば、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素産生能を有するシ
ュードモナス属細菌から該酵素を精製して得られる精製
物または高速液体クロマトグラフィーにより精製した該
酵素の蛋白質部分分解物に、エドマン分解法を適用して
得られるＮ末端アミノ酸配列を基に作製されるオリゴヌ
クレオチドＤＮＡプローブにより大腸菌内に作成され
る、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素産生能を有するシュ
ードモナス属細菌のジーンライブラリーからサザンハイ
ブリダイゼーションにより目的の遺伝子を吊り上げる方
法；前記と同様にして作製した複数のオリゴヌクレオチ
ドＤＮＡプローブを用い、ポリメラーゼ・チェーン・リ
アクション(Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）法
［サイキ・アール・ケイ（Saiki,R.K.）ら、サイエンス
（Science)、239巻、491頁、1988年］により目的遺伝子
を増幅する方法；ならびに、前記と同様にして精製した
前記酵素の蛋白質でマウス、兎またはヤギ等の動物を免
役して抗アスパラギン酸β−脱炭酸酵素蛋白質血清また
は坑体を調製し、ジーンライブラリーを発現させた細菌
に目的蛋白質が存在するかどうかを判断する方法等；そ
れ自体公知の方法（例えば、ジェイ・サムブルック、イ
ー・エフ・フリッチ、テイー・マニアチス、モルキュラ
ー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス社刊（1989年）［J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.M
aniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd
ed, Cold Spring HarborLaboratory Press（1989）］
等参照）が挙げられる。

【０００９】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素産生能を有
するシュードモナス属細菌から該酵素を収得および精製
する方法としては、硫安沈殿、イオン交換・疎水・ゲル
濾過等の各種クロマトグラフィーの組合わせ等、それ自
体公知の方法（例えば、蛋白質・酵素の基礎実験法、堀
尾武一、山下仁平編集、南江堂 1981年刊参照）があ
り、シュードモナス・ダクネーに由来するアスパラギン
酸β−脱炭酸酵素の精製法については、カキモト(Kakim
oto）らが、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Journal of Biological Chemistry）第244巻
2号、353〜358頁（1969年）に詳細に記述している。

【００１０】さらに、米国特許第5,019,509号明細書に
は、シュードモナス・ダクネーに由来し、アスパラギン
酸β−脱炭酸酵素をコードする構造遺伝子の塩基配列
（約2,000塩基の配列により533アミノ酸残基をコードし
ている)、およびその取得方法が記載されていると共
に、該遺伝子を有するプラスミドｐＰＤ６０１が、ブタ
ペスト条約に基づく寄託機関であり、アメリカ合衆国メ
リーランド州ロックビルに在るアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（American Type CultureColle
ction：ATCC）に ATCC40448 の番号にて寄託されている
ことが述べられている。従って、その記載に基づき、該
プラスミドもしくは前記シュードモナス属細菌の染色体
ＤＮＡから前記構造遺伝子をクローニングすること、も
しくは化学合成により前記塩基配列を有するＤＮＡを調
製することにより、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコ
ードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することが
できる。

【００１１】本発明の組換え体ＤＮＡに使用できる前記
アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコードする構造遺伝子
の発現を調節し得るプロモーター領域を含むＤＮＡ断片
としては、コリネ型細菌内で機能するものであれば特に
制限はなく、上記構造遺伝子の供給源であるシュードモ
ナス属由来のものであっても、他の細菌由来のものであ
ってもよい。例えば、モリナガ・ワイ（Morinaga,Y.）
ら、ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Journal
of Biotechnology）第5巻、305〜312頁（1987年)、ツチ
ヤ・エムとモリナガ・ワイ（Tsuchiya,M and Morinaga,
Y.)、バイオ/テクノロジー（Bio/Technology）第6巻、2
59〜268頁（1986年)、アイクマンス・ビー・ジェー（Ei
kmanns,B.J.）ら、ジーン（Gene)、第102巻、93〜98頁
（1991年）に記載の大腸菌由来のプロモーター等があ
る。アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコードする構造遺
伝子および該遺伝子の発現を調節し得るプロモーター領
域を含むＤＮＡ断片を組込むために使用される、コリネ
型細菌内で複製可能なプラスミドＤＮＡとしては、宿主
コリネ型細菌内で複製可能なものであれば特に制限はな
いが、例えば、プラスミドｐＢＹ５０１（特開昭60-248
182号公報）；ｐＢＹ５０２（特開昭63-36787号公
報）；プラスミドｐＢＹ５０３（特開平1-95785号公
報）；プラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３（特開平
1-191686号公報）；プラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ
２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３Ｋ
ＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ（特開平2-276579号公報)；プ
ラスミドｐＣＲＹ２０およびｐＣＲＹ３０(特開平3-210
184号公報）等のプラスミドを例示することができる。
これらの中でも、コリネ型細菌内でプラスミドの安定化
機能を司るＤＮＡ領域およびコリネ型細菌内で複製増殖
機能を司るＤＮＡ領域を有するプラスミドが好ましく、
例えば、プラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐ
ＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣＲ
Ｙ３ＫＸ、ｐＣＲＹ２０、ｐＣＲＹ３０等が好適に用い
られる。

【００１２】上記例示中のプラスミドベクター、ｐＣＲ
Ｙ３０を調製する方法の１例を以下に示す。ブレビバク
テリウム・スタチオニス（Brevibacterium stationis）
IFO12144（FERM BP-2515）からプラスミドｐＢＹ５０３
（特開平1-95785号公報）ＤＮＡを常法により抽出し、
これを制限酵素ＸｈｏＩで処理して、プラスミド複製増
殖機能を司る遺伝子を有する大きさ約４.０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を切り出す。同様にして該プラスミドＤＮＡを制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで処理して、プラスミ
ド安定化機能を司る遺伝子を有する大きさ約２.１ｋｂ
のＤＮＡ断片を切り出す。得られた２つのＤＮＡ断片を
プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＳａｌＩ部位
およびＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ部位にそれぞれ組込むこと
により、プラスミドｐＣＲＹ３０を調製することができ
る。

【００１３】なお、本明細書において、制限酵素の「認
識部位数」は、ＤＮＡ断片またはプラスミドを制限酵素
の存在下で完全分解し、その分解物をそれ自体公知の方
法で１％アガロース電気泳動に供した際に分離識別可能
な断片の数から決定した。また、「切断断片の大きさ」
および「プラスミドの大きさ」については、エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）のλファージＤＮＡを制
限酵素ＨｉｎｄIIIで切断して得られる分子量既知のＤ
ＮＡ断片、およびｐＨＹマーカー（宝酒造製）を試料と
同一のアガロースゲル上で電気泳動に供し、その泳動距
離で描かれる標準線に基づいて、切断断片の大きさおよ
びプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出した。

【００１４】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコードす
る構造遺伝子および該遺伝子の発現を調節し得るプロモ
ーター領域を含むＤＮＡ断片とコリネ型細菌内で複製可
能なプラスミドＤＮＡとからなる組換え体ＤＮＡは、試
験管内において、該組換え体を構成するＤＮＡ断片をそ
れぞれ制限酵素で切り出して混合した後、直接ＤＮＡリ
ガーゼで処理するか、あるいはその切断末端をターミナ
ルトランスフェラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼで処理
した後にＤＮＡリガーゼで処理して各ＤＮＡ断片を連結
する常法（例えばジェイ・サムブルック、イー・エフ・
フリッチ、テイー・マニアチス、モルキュラー・クロー
ニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社刊
（1989年)[J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Maniatis, Mol
ecular Cloning： A LaboratoryManual 2nd ed, Cold S
pring Harbor Laboratory Press（ 1989)］等参照）に
より作製することができる。

【００１５】本発明において上記組換え体ＤＮＡで形質
転換することができる宿主コリネ型細菌としては、アミ
ノ酸、核酸等の生産菌、例えば、コリネバクテリウム・
アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidoph
ilum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Cor
ynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム
・アルカノリチクム（Corynebacterium alkanolyticu
m)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacteri
um glutamicum)、コリネバクテリウム・リリウム（Cory
nebacterium lilium）、コリネバクテリウム・メラッセ
コラ（Corynebacterium melassecola）等のコリネバク
テリウム（Corynebacterium）属細菌；ブレビバクテリ
ウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagene
s)、ブレビバクテリウム・ヂバリカツム（Brevibacteri
um divaricatum)、ブレビバクテリウム・フラバム（Bre
vibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・ヘルボラ
ム（Brevibacterium helvolum)、ブレビバクテリウム・
ケトグルタミクム（Brevibacterium ketoglutamicum)、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・リネン
ス（Brevi-bacterium linens)、ブレビバクテリウム・
ロゼウス（Brevibacterium roseus)、ブレビバクテリウ
ム・スタチオニス（Brevibacterium stationis）等のブ
レビバクテリウム（Brevi-bacterium）属細菌；アルス
ロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus)、ア
ルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter glob
iformis)、アルスロバクター・シンプレックス（Arthro
bacter simplex)、アルスロバクター・スルフレウス（A
rthrobacter sulfureus）等のアルスロバクター（Arthr
obacter）属細菌；ロドコッカス・エクイ（Rhodococcus
equi)、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis)、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodoco
ccus rhodochrous）等のロドコッカス（Rhodococcus）
属細菌；ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Mi
crobacterium ammoniaphilum）等のミクロバクテリウム
（Microbacterium）属細菌等を挙げることができる。

【００１６】上記宿主コリネ型細菌の例示の中でもブレ
ビバクテリウム属細菌が好ましく、α−アミノ−n−酪
酸耐性を有するブレビバクテリウム属細菌がより好まし
い。そのような細菌として、例えば、ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Brevi-bacterium flavum）ＭＪ−２３３
(FERM BP-1497)、同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１(FERM BP
-1498）等が例示できる。前者は天然界よりα−アミノ
−n−酪酸耐性を指標に選抜取得した菌株であり、後者
は前者を人為的突然変異処理してα−アミノ−n−酪酸
耐性の向上した株として選抜取得した菌株である（特公
昭59-28398号公報）。

【００１７】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株の
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭63-36787号公
報）のために形質転換が困難な場合があるので、そのよ
うな場合には、本菌株よりプラスミドｐＢＹ５０２を除
去することが望ましい。プラスミドｐＢＹ５０２を除去
する方法としては、例えば、継代培養を繰り返すことに
より自然に欠落させることも可能であるし、人為的に除
去することも可能である［バクテリオロジカル・レビュ
ー（Bacteriological Review)、第36巻、361頁、1972
年]。

【００１８】既述の連結ＤＮＡ、即ち組換え体ＤＮＡを
用いてコリネ型細菌を形質転換し、得られた転換株の中
から、目的のプラスミドを保有し、かつアスパラギン酸
β−脱炭酸酵素活性の向上した菌株を選択することによ
り、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコードする構造遺
伝子および該遺伝子の発現を調節し得るプロモーター・
オペレーター領域を有するＤＮＡ断片と、コリネ型細菌
内で複製可能なプラスミドＤＮＡとからなる組換え体Ｄ
ＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を得ることができ
る。

【００１９】コリネ型細菌の形質転換の方法としては、
ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電する方法［ワイ・サトウ
（Y.Satoh)ら、ジャーナル・オブ・インダストリアル・
マイクロバイオロジー（Journal of Industrial Microb
iology)、5巻、159頁、1990年］等を利用することがで
きる。

【００２０】得られた形質転換コリネ型細菌は、炭素
源、窒素源、無機非金属または金属塩、ビタミン類等、
該細菌の増殖に必要かつ十分な栄養成分を含有する培地
を用いて、適当な好気、温度、ｐＨ条件の下に培養する
ことができる。培地に含有される栄養成分は、培養の開
始時に全て添加することもできるし、また培養の進展に
伴い逐次または連続的に添加することもできる。

【００２１】培地中の炭素源としては、例えば、グルコ
ース、グリセロール、フルクトース、シュクロース、マ
ルトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の炭水化物；コハク
酸、フマル酸、酢酸、乳酸等の有機酸；エタノール等の
アルコール類の中から培養対象細菌が資化可能な炭素源
を選択して、単独でまたは組合わせて用いることができ
る。窒素源としては、例えば、アンモニアまたは塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無機あるい
は有機アンモニウム塩類；尿素等の他の無機含窒素化合
物；グルタミン酸等のアミノ酸類；ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、コーンスチープ
リカー等の含窒素天然栄養源等を用いることができる。

【００２２】無機非金属または金属塩としては、リン酸
一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸アンモニウム、硫
酸第一鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化
マンガン、硫酸マンガン等を用いることができる。ビタ
ミン類としてはビオチン、チアミンなどを必要に応じて
用いるが、含窒素天然栄養源の中にはこれらのビタミン
類を含有するものがあるので、これをもってビタミン類
の代替とすることも可能である。培養は振盪培養、通気
攪拌培養等の好気条件下で行なう。培養温度は一般に２
０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃に、培地のｐＨは
６〜８の中性付近に、それぞれ維持することが好まし
い。培養期間は通常１〜５日間である。培養菌体は、培
養終了後に遠心分離、膜分離等の適当な手段で培養液か
ら分離回収することができる。

【００２３】本発明の方法においては、上記手法で調製
された菌体の存在下、水性溶媒中でＬ−アスパラギン酸
又はその塩をＬ−アラニンに変換する。本発明に使用さ
れるＬ−アスパラギン酸またはその塩としては、Ｌ−ア
ラニンの酵素法による製造に一般的に用いられるもので
あれば特に制限はないが、例えば、Ｌ−アスパラギン酸
の塩としては、ナトリウム塩、アンモニウム塩またはカ
リウム塩等が好適に用いられる。

【００２４】反応液に添加するＬ−アスパラギン酸又は
その塩の濃度は、通常０.５〜５０％（ｗ/ｖ)、好まし
くは３〜３０％である。Ｌ−アスパラギン酸またはその
塩は、その溶解度の関係から水性溶媒に完全には溶解せ
ず、いわゆるスラリーの状態で反応液中に存在すること
もありうるが、その状態で溶媒中に存在していても反応
に差し支えない。反応液のｐＨは通常ｐＨ３〜１０、好
ましくは６〜９であり、ｐＨの調整にはアルカリ溶液、
例えば、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム等の溶液が好適に用いられる。反応温度は２０〜５０
℃、好ましくは３０〜４５℃である。反応時間は、通常
５〜７２時間である。

【００２５】この反応液には、この他にピリドキサル
５'−リン酸を０.０００５〜０.０５％（ｗ/ｖ)、好ま
しくは０.００１〜０.０１％添加してもよい。さらに、
必要な場合にはエチレンオキサイド単位の数が５〜５０
であるポリオキシエチレンパラ−タ−シャリオクチル
フェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤を０.０１〜
０.５％（ｗ/ｖ)、好ましくは０.０３〜０.３％の範囲
で添加してもよい。また、さらに必要な場合には、ピル
ビン酸、α−ケト酪酸等のα−ケト酸を０.０００１〜
０.５％（ｗ/ｖ)、好ましくは０.００１〜０.２％添加
してもよい。さらに、塩化カルシウムを０.０５〜１％
添加することもできる。反応液中の菌体濃度は、通常
０.１〜５０％（ｗ/ｖ)、好ましくは０.５〜３０％であ
る。生成したＬ−アラニンは、菌体を除去した後に活性
炭処理またはイオン交換樹脂処理等の公知の方法によ
り、反応液から分離精製することができる。

【００２６】

【実施例】以下の実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。なお、特に記載のない限り、使用した制限酵
素は宝酒造製である。

【００２７】参考例１コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドＤＮＡであるｐ
ＣＲＹ３０の調製（Ａ）プラスミドｐＣＲＹ３０の基となるプラスミド
ｐＢＹ５０３の調製プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニス（Brevi-bacterium stationis）IFO12144（FER
M BP-2515）から分離された、分子量約１０メガダルト
ンのプラスミドであり、該プラスミドを特開平1-95785
号公報に記載の方法にて調製した。培地［組成：尿素
２ｇ、硫酸アンモニウム７ｇ、リン酸一カリウム０.
５ｇ、リン酸二カリウム０.５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０.５ｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ＦｅＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１
ｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン塩酸１００μｇを
脱イオン水に溶解して１ｌとする（ｐＨ７.４)］１ｌを
５ｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間加圧
滅菌した。これにブレビバクテリウム・スタチオニス I
FO12144（FERMBP-2515）を一白金耳植菌し、あらかじめ
滅菌済みの５０％（ｗ/ｖ）グルコース溶液を４ｍｌ添
加した後、３３℃にて対数増殖期後期まで振とう培養し
た。この培養液を遠心分離して菌体を集菌し、得られた
菌体をリゾチームを１０ mg/mｌ濃度で含有する緩衝液
［組成：２５ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭＥＤＴＡ・２
Ｎａ(ｐＨ８.０)、５０ｍＭグルコース］２０ｍｌに懸
濁し、３７℃で１時間処理した。次に、アルカリ−ＳＤ
Ｓ液［組成：０.２ＭＮａＯＨ、１％ＳＤＳ］を４０
ｍｌ添加し、緩やかに混和して室温にて１５分間放置し
た。続いて、この溶液に酢酸カリウム水溶液［組成：５
Ｍ酢酸カリウム６０ｍｌ、酢酸１１.５ｍｌ、蒸留水２
８.５ｍｌの混合液］３０ｍｌを添加し、十分混和して
から、氷水中に１５分間放置した。

【００２８】この溶菌液全体を遠心管に移し、４℃で１
０分間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、その上清
画分を回収した。これに等量のフェノール/クロロホル
ム（１：１、ｖ/ｖ）混和液を添加して混合した後、全
量を滅菌済み遠心管に移し、１０〜１２℃で２０分間、
５,０００×ｇの遠心分離にかけ、その上清画分を分取
した。これに２倍量のエタノールを穏やかに添加し、−
２０℃で１時間放置した後、再度、４℃で１０分間、１
５,０００×ｇの遠心分離にかけ、その沈殿を回収し
た。得られた沈殿を減圧乾燥した後、１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８.０)−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶
液２ｍｌに溶解した。この溶解液に塩化セシウム溶液
［組成：５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０)−５
ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液に塩化セシウム１７０ｇを
溶解させる］１０ｍｌと１０ mg/mｌエチジウム・ブロ
ミド溶液１ｍｌを添加して該液の密度を１.３９２ｇ/
mｌに調節した後、ベックマン社製ＸＬ−９型超遠心分
離器を用いて、１２℃で４２時間、１１６,０００×ｇ
の遠心分離を行なった。遠心後、プラスミドｐＢＹ５０
３は、紫外線照射により遠心管内の下方に存在するバン
ドとして見いだされる。このバンドを、滅菌済みプラス
チック製注射器で遠心管の側面から抜き出すことによ
り、プラスミドＤＮＡを含む分画液を得た。

【００２９】この分画液を、等量のイソアミルアルコー
ルで４回処理してエチジウム・ブロミドを抽出除去し、
１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０)−１ｍＭＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ溶液２ｍｌに対して透析した。このプラス
ミドｐＢＹ５０３を含有する透析液に、最終濃度０.３
Ｍとなるように３Ｍ酢酸ナトリウムを添加した後、２
倍量のエタノールを添加して−２０℃で１時間放置し
た。次に、４℃で１０分間、１５,０００×ｇの遠心分
離にかけ、プラスミドｐＢＹ５０３のＤＮＡ約５０μｇ
を回収した。

【００３０】（Ｂ）プラスミドｐＣＲＹ３０の調製プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０.５μｇを、
制限酵素ＳａｌＩ５units と３７℃で１時間処理して
該プラスミドＤＮＡを完全分解した。前記（Ａ）で調製
したプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡ２μｇを制限酵素
ＸｈｏＩ１ unit により３７℃で３０分間処理して該
プラスミドＤＮＡを部分分解した。両者のＤＮＡ分解物
を混合し、６５℃で１０分間処理して制限酵素を不活性
化させた後、該混合液にそれぞれの最終濃度が５０ｍ
Ｍトリス塩酸、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造製）１ unit となるように各成分を添加し、１
６℃で約１５時間インキュベートした。この溶液を用い
て、エシエリヒア・コリＪＭ１０９コンピテント細胞
（宝酒造製）を製造者のマニュアルに従い形質転換し
た。

【００３１】得られた形質転換株は、５０ μg/mｌカ
ナマイシン、１００ μg/mｌイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシド、１００ μg/mｌ５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドを含むＬ培地［組成：トリプトン１０ｇ，酵母
エキス５ｇ，塩化ナトリウム５ｇを蒸留水に溶解して
１ｌとする］を最終濃度２％（ｗ/ｖ）の寒天で固化さ
せた培地にて、３７℃で２４時間培養し、培地上に白い
コロニーとして生育した株をそれぞれ独立に選抜し、各
々のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法により独立に抽出
した。上記手順により、プラスミドｐＢＹ５０３に由来
する大きさ約４ｋｂの断片、即ちプラスミド複製増殖機
能を司る遺伝子を有するＤＮＡ断片がプラスミドｐＨＳ
Ｇ２９８の制限酵素ＳａｌI認識部位に挿入されたプラ
スミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉを得た。次に、同様の方
法を用いて前記（Ａ）で得られたプラスミドｐＢＹ５０
３のＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで処理
して得られる大きさ約２.１ｋｂの断片、即ち、プラス
ミド安定化機能を司る遺伝子を有するＤＮＡ断片を上記
プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉのＫｐｎＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ認識部位にクローニングし、プラスミドｐＣＲＹ３
０を調製した。

【００３２】実施例１アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片とコリネ型細菌内で複製可能なプラスミド
ＤＮＡとからなる組換え体ＤＮＡの作成

【００３３】（Ａ）シュードモナス・ダクネー菌株の
全ＤＮＡの抽出ＬＢ培地［組成：バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキ
ス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする
（ｐＨ７.２)］１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ
に分注し、１２０℃で１５分間加圧滅菌した後、シュー
ドモナス・ダクネー ATCC21192 を一白金耳植菌し、３
０℃で２４時間振盪攪拌培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を収集した。得られた菌体を、リゾ
チームを１０ mg/ml の濃度で含有する緩衝液［組成：
１０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥ
ＤＴＡ・２Ｎａ（ｐＨ８.０)］２０ｍｌに懸濁した。続
いて最終濃度１００ μg/ml 量のプロティナーゼＫを添
加し、３７℃で１時間インキュベートした。さらに最終
濃度０.５％（Ｗ/Ｖ）量のドデシル硫酸ナトリウムを添
加し、５０℃で６時間インキュベートして溶菌させた。
この溶菌液に等量のフェノール/クロロホルム（1：1、
ｖ/ｖ）混和液を添加し、室温で１０分間緩やかに振盪
した後、全量を滅菌済み遠心管に移し、１０〜１２℃で
２０分間、５,０００×ｇの遠心分離にかけた。得られ
た上清画分を分取し、３Ｍ酢酸ナトリウムを最終濃度
が０.３Ｍとなるように添加した後、これに２倍量のエ
タノールを穏やかに添加した。溶液の水層とエタノール
層の間に存在するＤＮＡをガラス棒で巻取り、得られた
ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。こ
のＤＮＡに１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５)−
１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液を５ｍｌ添加して４℃で
一晩静置した後、研究に供した。

【００３４】（Ｂ）アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を
コードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅米国特許第5,019,509号明細書に記載のアスパラギン酸
β−脱炭酸酵素をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡの
塩基配列に基づき、上記（Ａ）にて調製したシュードモ
ナス・ダクネー菌株由来の染色体ＤＮＡのプライマーを
合成し、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Poly
merase Chain Reaction：ＰＣＲ）法により該酵素をコ
ードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行なっ
た。米国特許第5,019,509号明細書に記載のアスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素をコードする構造遺伝子ＤＮＡの塩
基配列の５'末端および３'末端配列に基づき、両端に制
限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列タッグを付与した下記配列
を有する２種類のオリゴ・ヌクレオチド・プライマー
を、ＤＮＡ/ＲＮＡシンセサイザー［394型、アプライ
ド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems)、米
国］を用いて合成した。 5'-CCGGAATTCATGAGCAAGGATTATCAGAGTCTGGCGAAC-3' 5'-CCGGAATTCCTCGCCGTCAGCGCTTGTTCCCTTGCTGGG-3'

【００３５】５００μｌ容エッペンドルフ・チューブ
に、染色体ＤＮＡ１０ｎｇ、オリゴ・ヌクレオチド・
プライマー各１μｇ、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.
３)、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、２５ｍＭＫＣｌ、０.０５
％ツイーン２０、１００μg/ml 牛胎児血清アルブミ
ン、各々５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよ
びｄＣＴＰ、２.５ units ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
［パーキン・エルマー（Perkin−Elmer）社］を総量で
１００μｌ量添加し、サーマル・サイクラー［パーキン
・エルマー（Perkin−Elmer）社］を用いて、ＤＮＡ変
性条件：９６℃で１５秒間、プライマーのアニーリン
グ：５５℃で３０秒間、プライマーの伸長７２℃で９０
秒間を１サイクルとして、２５サイクルの増幅を行っ
た。

【００３６】得られた増幅ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ
２ units で処理して切断し、大きさ約１.６ｋｂのＤ
ＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ、ＳｐｈＩ、ＢｇｌII、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIIIお
よびＳａｌＩで処理して切断したところ、それぞれ下記
表１に示す大きさを有する切断断片が得られた。これら
の切断断片の大きさは、米国特許第5,019,509号明細書
に記載の塩基配列から予想される切断断片の大きさと完
全に一致した。さらに制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、
ＳｍａＩおよびＸｈｏＩは増幅ＤＮＡ断片を切断しなか
った。これらの結果から、増幅して取得されたＤＮＡ断
片が、目的酵素遺伝子ＤＮＡをコードする、米国特許第
5,019,509号明細書に記載の遺伝子に相当することが確
認された。

【００３７】

【表１】表１制限酵素切断断片の大きさ（ｋｂ）ＢａｍＨＩ０.３７１.２ＳｐｈＩ０.６１.０ＢｇｌII ０.７５０.８５ＰｓｔＩ１.４＊ＨｉｎｄIII １.４＊ＳａｌＩ０.４１.２＊０.３ｋｂ以下のバンドが不明瞭ながら観察される

【００３８】（Ｃ）アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を
コードする構造遺伝子のプラスミドｐＫＫ２２３−３へ
のサブクローニングプラスミドｐＫＫ２２３−３のＤＮＡ（ファルマシアＬ
ＫＢバイオテクノロジー社）１μｇを、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ５ units と、３７℃で１時間反応させて該プラス
ミドＤＮＡを完全分解した。これに前記（Ｂ）にて調製
したアスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコードする構造遺
伝子を含むＤＮＡ断片４μｇを混合し、６５℃で１０
分間処理して制限酵素を不活性化した後、該液にそれぞ
れの最終濃度が５０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴ
Ｐ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ unit となるように各成分
を添加し、１６℃で約１５時間インキュベートした。こ
の溶液を用いて、エシエリヒア・コリＪＭ１０９コンピ
テント細胞（宝酒造製）を製造者のマニュアルに従い形
質転換した。

【００３９】得られた形質転換株は、５０ μg/ml アン
ピシリンを含むＬ培地［組成：トリプトン１０g、酵母
エキス５g、塩化ナトリウム５ｇを蒸留水に溶解して
１ｌとする］を最終濃度２％（ｗ/ｖ）の寒天で固化さ
せた培地にて、３７℃で２４時間培養した。この培地上
に生育した形質転換株を合計２０コロニー選抜し、その
各々のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法［ジェイ・サム
ブルック、イー・エフ・フリッチ、テイー・マニアチ
ス、モルキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・
マニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス社、1989年刊（J.Sambrook, E.F.
Fritsch, T.Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss（1989）参照］により抽出した。これら抽出したプラ
スミドＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩ２ units またはＰｓ
ｔＩ２ units で処理して切断したところ、ＳｐｈＩ消
化で大きさ約１.０ｋｂと５.１ｋｂの断片に切断され、
かつＰｓｔＩ消化で大きさ約０.３ｋｂと５.９ｋｂの断
片に切断されるプラスミドと、ＳｐｈＩ消化で大きさ約
１.４ｋｂと４.７ｋｂの断片とに切断され、かつＰｓｔ
Ｉ消化で大きさ約１.３ｋｂと４.９ｋｂの断片とに切断
されるプラスミドの、２種類のプラスミドが得られた。
即ち、挿入ＤＮＡ断片の挿入方向が順方向であるプラス
ミドと、逆方向であるプラスミドの２種類である。

【００４０】上記手順によりプラスミドｐＫＫ２２３−
３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ認
識部位にアスパラギン酸β−脱炭酸酵素の構造遺伝子を
有する大きさ約１.６ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したプラ
スミドの中で、制限酵素ＳｐｈＩにより大きさ約１.０
ｋｂと５.１ｋｂの切断断片に切断され、かつＰｓｔＩ
により大きさ約０.３ｋｂと５.９ｋｂの切断断片に切断
されるプラスミドを選び、これをプラスミドｐＫＫ２２
３−３−ＡＤＢと命名し、以後の研究に供した。

【００４１】（Ｄ）アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を
コードする構造遺伝子および該遺伝子の発現を調節し得
るプロモーター領域を含むＤＮＡ断片の調製プラスミドｐＫＫ２２３−３の公知の塩基配列を基に、
両端に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列タッグを付与した下
記配列を有する２種類のオリゴ・ヌクレオチド・プライ
マーを、ＤＮＡ/ＲＮＡシンセサイザー［394型、アプラ
イド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems)、米
国］を用いて合成した。 5'-GCGCTCGAGACGGTGCACCAATGCTTCTG-3' 5'-GCGCTCGAGGCTTCTGCGTTCTGATTTAA-3'

【００４２】５００μｌ容エッペンドルフ・チューブ
に、プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＡＤＢのＤＮＡ１
０ｎｇ、２種類のオリゴ・ヌクレオチド・プライマーを
各１μｇ、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.３)、１.５ｍ
ＭＭｇＣｌ₂、２５ｍＭＫＣｌ、０.０５％ツイーン２
０、１００ μg/ml 牛胎児血清アルブミン、各々５０μ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ２.５ units［パーキン・エ
ルマー（Perkin−Elmer）社製］を総量で１００μｌ添
加し、サーマル・サイクラー［パーキン・エルマー(Per
kin−Elmer）社］を用いて、ＤＮＡ変性条件：９６℃で
１５秒間、プライマーのアニーリング：５５℃で３０秒
間、プライマーの伸長７２℃で９０秒間を１サイクルと
して、２５サイクルの増幅をおこなった。得られた増幅
ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ２ units で処理して切断
し、大きさ約１.７ｋｂの切断断片を取得した。

【００４３】（Ｅ）アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を
コードする構造遺伝子および該遺伝子の発現を調節し得
るプロモーター領域を含むＤＮＡ断片のｐＣＲＹ３０へ
のクローニング前記参考例１で調製したプラスミドｐＣＲＹ３０ＤＮ
Ａ１μｇを、制限酵素ＸｈｏＩ２ units で完全分解
した。得られたＤＮＡ分解物に前記（Ｄ）で調製した大
きさ約１.７ｋｂのＤＮＡ断片４μｇを混合し、６５℃
で１０分間処理して制限酵素を不活性化した後、この混
合液に、それぞれの最終濃度が５０ｍＭトリス塩酸、
１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオスレイトール、
１ｍＭＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ unit となるよ
うに各成分を添加し、１６℃で約１５時間インキュベー
トした。この溶液を用いて、エシエリヒア・コリＪＭ１
０９コンピテント細胞（宝酒造製）を製造者のマニュア
ルに従い形質転換した。

【００４４】得られた形質転換株は、５０ μg/ml カナ
マイシンを含有するＬ培地［組成：トリプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを蒸留水に
溶解して１ｌとする］を最終濃度２％（ｗ/ｖ）の寒天
で固化させた培地にて、３７℃で２４時間培養し、培地
上に生育した株を合計２０コロニー選抜した。得られた
プラスミドをそれぞれ独立にアルカリ−ＳＤＳ法（ジェ
イ・サムブルック、イー・エフ・フリッチ、テイー・マ
ニアチス、モルキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル第２版、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー・プレス社刊（1989年)［J.Sambroo
k, E.F.Fritsch, T.Maniatis, MolecularCloning: A La
boratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Labora
toryPress（1989)］参照）により抽出した。そして、得
られたプラスミドの中から、ｐＣＲＹ３０の制限酵素Ｘ
ｈｏＩ認識部位に約１.７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入され
たプラスミドを選び、これをプラスミドｐＣＲＹ３０−
ＡＢＤと命名した。上記手順により作成されたプラスミ
ドｐＣＲＹ３０−ＡＢＤは、シュードモナス・ダクネー
（Pseudomonas dacunhae）ATCC21192 菌株由来のアスパ
ラギン酸β−脱炭酸酵素をコードする構造遺伝子および
該遺伝子の発現を調節し得るプロモーター領域を含む大
きさ約１.７ｋｂのＤＮＡ断片とコリネ型細菌内で複製
可能なプラスミドｐＣＲＹ３０とからなる組換え体ＤＮ
Ａである。

【００４５】実施例２アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片とコリネ型細菌内で複製可能なプラスミド
ＤＮＡとからなる組換え体ＤＮＡで形質転換したコリネ
型細菌の作成、ならびに同菌株のアスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性の測定

【００４６】（Ａ）プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＢＤ
のブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM B
P-1497）への導入ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の生育を不
完全に阻害する濃度、例えば０.２〜５０ μg/ml の濃
度でアクリジンオレンジを含有する培養培地［組成：尿
素２ｇ、硫酸アンモニウム７ｇ、リン酸一カリウム
０.５ｇ、リン酸二カリウム０.５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ０.５ｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ＦｅＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸
１ｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン塩酸１００μｇ
を脱イオン水に溶解して１ｌとする（ｐＨ７.４)］に、
培地１ｍｌ当たり約１０菌体の密度で該菌株を植菌し、
その生育を不完全に阻害しながら約３５℃で約２４時間
培養した。次に培養液を希釈した後、寒天培地［組成：
前記培養培地を最終濃度２％の寒天で固化する］に塗布
し、約３５℃で約２日間培養した。培地上に生育したコ
ロニーからそれぞれ独立にプラスミド抽出操作を行な
い、プラスミドの除去されている株を選抜した。

【００４７】得られたプラスミド除去株を前記培養培地
１００ｍｌにて対数増殖期初期まで培養した後、ペニ
シリンＧを１ unit/ml 濃度となるように添加し、さら
に２時間振盪培養した。培養液を遠心して菌体を収集
し、得られた菌体を電気パルス用溶液［組成：２７２ｍ
Ｍシュークロース、７ｍＭリン酸一カリウム、１ｍＭ
塩化マグネシウム（ｐＨ７.４)］２０ｍｌにて洗浄し
た。洗浄後、再び遠心分離して菌体を収集し、この菌体
を電気パルス用溶液５ｍｌに懸濁した。該懸濁液０.７
５ｍｌを、実施例１（Ｅ）で調製したプラスミドｐＣＲ
Ｙ３０−ＡＢＤのＤＮＡ溶液０.０５ｍｌと混合し、氷
水中にて２０分間静置した。続いて、ジーンパルサー
（米国バイオ・ラッド社製）のパルス条件を印加電圧
２,５００ボルト、キャパシタンス２５μＦＤに設定
し、該装置により前記混合液に電気パルスを印加した。
パルス印加後、混合液を氷水中にて２０分間静置した。
次いで、該液の全量を前記培養培地３ｍｌに移し、３
０℃で１時間培養した後、カナマイシンを１５ μg/ml
の濃度で含有する上記寒天培地に塗布し、これを３０℃
で２〜３日間培養した。培地上に生育したカナマイシン
耐性株のプラスミドを既述の手順にて調べ、プラスミド
ｐＣＲＹ３０−ＡＢＤを保有する形質転換株を選抜し、
該菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−
ＡＢＤと命名した。この菌株は茨城県つくば市東１丁目
１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に平成５
年９月２８日付で受託番号：FERM P-13875 として寄託
されている。

【００４８】（Ｂ）形質転換株ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３−ＡＢＤのアスパラギン酸β−脱炭
酸酵素活性の測定前記（Ａ）にて調製したプラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＤ
Ｂ保有菌株プレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ＡＢＤ（FERM P-13875)、アスパラギン酸β−脱炭酸酵
素の遺伝子源であるシュードモナス・ダクネー（Pseudo
monas dacunhae）ATCC21192 、および組換え菌株の親株
であるブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium
flavum）ＭＪ−２３３（FERM BP-1497）について、ア
スパラギン酸β−脱炭酸酵素活性およびアスパルターゼ
活性を測定した。その手順を以下に示す。

【００４９】（Ｂ)−１シュードモナス・ダクネー菌
体の調製培地［組成：フマル酸ナトリウム５ｇ、フマル酸アン
モニウム１０ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸一カリウム
０.５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.５ｇを脱イオン水に
溶解して１ｌとする（ｐＨ７.０)］１００ｍｌを５００
ｍｌ容三角フラスコに分注し、これを１２０℃で２０分
間加圧滅菌した。これにシュードモナス・ダクネー ATC
C21192 を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間振盪培養
した。培養終了後、菌体を遠心分離により収集した。得
られた菌体を−２０℃で凍結保存し、必要に応じて解凍
して研究に供した。

【００５０】（Ｂ）−２コリネ型細菌菌体の調製培地［組成：尿素４ｇ、硫酸アンモニウム１４ｇ、リ
ン酸一カリウム０.５ｇ、リン酸二カリウム０.５ｇ、
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.５ｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ
６ｍｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵母エキス１
ｇ、カザミノ酸１ｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン
塩酸１００μｇを脱イオン水に溶解して１ｌする（ｐ
Ｈ７.４)］１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分
注し、１２０℃で２０分間加圧滅菌した。この培地にカ
ナマイシンを５０ μg/ml 濃度となるように添加した
後、培養菌体であるプレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ＡＢＤ（FERM P-13875）を一白金耳植菌した。
さらに、あらかじめ滅菌済みの５０％（ｗ/ｖ）グルコ
ース溶液４ｍｌを培地に添加した後、３３℃で２４時
間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により収
集した。得られた菌体を−２０℃で凍結保存し、必要に
応じて解凍して研究に供した。同様にして、本菌株の親
株であり、組換えプラスミドを保持しないブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３株も、培地にカナマイシ
ンを添加しない以外は、全く同一の方法にて培養および
保存し、供試菌体を得た。

【００５１】（Ｂ)−３アスパラギン酸β−脱炭酸酵
素活性の測定上記（Ｂ)−１および２にて調製した菌体１ｇを、それ
ぞれ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）５ｍ
ｌに懸濁し、氷冷下に超音波破砕装置（ソニファイア−
２５０、ブランソン・ソニック・パワー社製、米国）を
用いて菌体を破砕した。得られた破砕液を４℃で２０分
間、１０,０００ｒｐｍの遠心にかけ、その上清を粗酵
素液として測定に用いた。この粗酵素液中の蛋白質濃度
は、牛血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ社製、
米国）を標準として、ブラッドフォードの方法［ブラッ
ドフォード、エム、エム（Bradford,M.,M.)、アナリテ
イカル・バイオケミストリー（AnalyticalBiochemistr
y)、第72巻、248頁］により、市販のキット（バイオラ
ッド社製、米国、プロテイン・アッセイ・キット）を用
いて測定した。

【００５２】酵素反応および生成アラニン量の測定は、
以下の手順により行った。反応液［組成：５００ｍＭ
Ｌ−アスパラギン酸、５ｍＭピルビン酸、０.１ｍＭ
ピリドキサル５'−リン酸、０.０３ mg/ml ヒドロキシ
プロピルセルロース、２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５.３)］２７ｍｌに上記酵素液の希釈液を３ｍ
ｌ添加し、３７℃で３０分間反応させた。この反応液を
沸騰水中で加熱して反応を停止させ、これにより生成し
た変性蛋白質を遠心分離により除去した。得られた上清
中の生成アラニンを、島津製作所製アミノ酸分離カラム
SC-07/S-1504Na 型により分離し、オルソフタルアルデ
ヒド法により誘導体化した後、蛍光検出器でピークを検
出してピーク面積を積算する高速液体クロマトグラフィ
ー（内部標準；バリン）により定量した。得られた測定
結果を下記表２に示す。表中、酵素の活性は、３７℃に
おいて１時間当たり１ μmol のアラニンを生成する酵
素の量を１ unit とし、かつシュードモナス・ダクネー
の酵素活性を１００として、粗酵素液中の蛋白質１ｍｇ
当たりの酵素活性（比活性）の相対値で表した。

【００５３】

【表２】表２供試菌体比活性シュードモナス・ダクネー ATCC21192 １００ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＡＢＤ６５ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３＞４

【００５４】上記表２に示した如く、親株として用いた
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-
1497）においては実質的にアスパラギン酸β−脱炭酸酵
素活性が認められなかったのに対し、形質転換株である
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＡＢＤ（FE
RM P-17385）においてはアスパラギン酸β−脱炭酸酵素
遺伝子が機能的に発現しており、しかもその酵素活性が
遺伝子源であるシュードモナス菌とほぼ同一レベルであ
ることが確認された。

【００５５】実施例３形質転換された菌株であるブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３−ＡＢＤによるＬ−アラニンの製造プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＢＤ保有菌株ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ２３３−ＡＢＤ（FERM P-17385）
を、実施例２（Ｂ)−２に記載の方法で培養して供試菌
体を得た。同様にして、実施例２（Ｂ)−１に記載の方
法により、シュードモナス・ダクネー ATCC21192 の供
試菌体を得た。これらの菌体を用いてＬ−アラニンを製
造した。反応液［組成：１ＭＬ−アスパラギン酸、０.
１ｍＭピリドキサル５'−リン酸、５ｍＭピルビン
酸、０.１％（ｗ/ｖ）ツイーン２０、アンモニア水にて
ｐＨを４.７に調整］１００ｍｌに、培養液１００ｍ
ｌから得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢＤおよびシュードモナス・ダクネーを懸濁し、４
５℃で１５時間、振盪しつつ反応させた。反応終了後、
反応液を遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体
を、再度、新鮮な反応液１００ｍｌに懸濁して同様の
反応を行わせた。同様の手順を繰り返して計３回反応を
行わせ、反応毎に製造されたアラニンを、島津製作所製
アミノ酸分離カラム SC-07/S-1504Na型により分離し、
オルソフタルアルデヒド法により誘導体化した後、蛍光
検出器でピークを検出してピーク面積を積算する高速液
体クロマトグラフィー（内部標準；バリン）により定量
した。得られた測定結果を下記表３に示す。表中、生成
アラニン量は、各菌が一回目の反応で生成したアラニン
の量を１００とした相対値として示した。

【００５６】

【表３】表３生成アラニン量反応回数Ｂ.flavum MJ233-ABD Ｐ.dacunhae ATCC21192 １回目１００１００２回目９５２５３回目９３６

【００５７】従来用いられてきたシュードモナス・ダク
ネー ATCC21192 を用いた製造例においては、反応液を
遠心分離にかけても菌体はほとんど回収されず、菌体の
溶菌が生じていることが判明した。そこで、菌体の回収
手段として、遠心分離のかわりにポリスルフォンを基材
とする排除限界分子量２０,０００の中空糸型限外膜
（日東電工製）を採用して、上記と同様の条件にて再度
Ｌ−アラニンを製造したところ、３回目の反応により製
造されたＬ−アラニンの量は、１回目の反応により製造
された量の約６５％であった。これは、該菌の溶菌によ
り漏出した酵素の安定性の低下、もしくは濾過による回
収率の低さを示すものであり、いずれにしても、該菌体
を固定化せずにＬ−アラニンを繰り返し製造することは
困難であることが確認された。これに対し、上記表３に
示した如く、本発明のブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＡＢＤ（FERM P-17385）を用いたアラニン製
造においては、菌体を回収するための遠心分離による活
性の低下および菌体回収率の低下がほとんど認められ
ず、高価な限外濾過膜を用いずとも精密濾過膜または遠
心分離等の簡便な手段で菌体を回収することで、該菌体
を用いてアラニンを製造する反応を繰り返し実施するこ
とが可能であることが判明した。

【００５８】

【発明の効果】本発明によれば、アスパラギン酸β−脱
炭酸酵素をコードする構造遺伝子および該遺伝子の発現
を調節し得るプロモーター領域を含むＤＮＡ断片とコリ
ネ型細菌内で複製可能なプラスミドＤＮＡとからなる組
換え体ＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を用いるこ
とで、Ｌ−アスパラギン酸からＬ−アラニンへの効率的
な変換プロセスが確立された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:38）Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素をコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片とコリネ型細菌内で複製可
能なプラスミドＤＮＡとからなる組換え体ＤＮＡで形質
転換されたコリネ型細菌の存在下、Ｌ−アスパラギン酸
およびその塩をＬ−アラニンに変換することを特徴とす
るＬ−アラニンの製造法。