CN103923955A - 一种生产l-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生产L-丙氨酸的方法,涉及基因工程和发酵工程领域,是利用天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶生产L-丙氨酸。本发明方法使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因,诱导天冬氨酸-β-脱羧酶的表达,再对其进行化学交联得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶,以其为酶,以L-天冬氨酸作为底物,生产L-丙氨酸。每升反应液中,L-天冬氨酸底物浓度达1800g/L,酶促反应20小时后摩尔转化率达99.9%。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和发酵工程技术领域,具体涉及一种利用天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶生产L-丙氨酸的方法。
背景技术
L-丙氨酸是一种应用十分广泛的氨基酸,其外观为白色结晶性粉末,无臭有甜味,溶于水和乙醇,难容于乙醚。在食品上广泛添加于化学调味品、饮料、有机酸、酒类及腌制品中,作为一种重要的添加剂,同时具有增鲜保鲜的作用。L-丙氨酸在医药上主要是合成维生素B6和氨基丙醇的重要原料,是组成复合氨基酸注射液和口服液的原料。随着对L-丙氨酸不断研究和开发,在医药和食品等行业的应用不断扩大,并有日益增长的趋势。L-丙氨酸产品全球年需要量将超过30000吨。
目前利用固定化细胞酶转化法是最为有效的工业化生产L-丙氨酸之一。即利用菌体中的天冬氨酸-β-脱羧酶以L-天冬氨酸为原料,酶法脱梭生成L-丙氨酸。由于天冬氨酸-β-脱羧酶位于菌体内,作为底物的L-天冬氨酸必须通过菌体的细胞壁和细胞膜,导致反应速度慢,在工业化生产过程中,生产周期长达4-5天。菌体内含有杂酶,特别是氨基酸消旋酶作用于L-丙氨酸产出D-丙氨酸,影响产品质量。因此迫切需要一种生产周期短,产物浓度高,杂质少的生产L-丙氨酸的方法。
发明内容
本发明克服上述固相化细胞生产L-丙氨酸技术不足,利用基因工程技术表达天冬氨酸-β-脱羧酶,制备天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶,再利用此固相酶。
本发明的第一个目的是提供天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶的制备方法,包括:
(1)使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因;
(2)PCR产物连接载体、转化大肠杆菌,超声波破碎菌体,收集上清液,再进行分离纯化;
(3)用化学交联方法得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶。
本发明的第二个目的是提供一种生产周期短,产物浓度高,杂质少的生产L-丙氨酸的方法。
本发明的生产L-丙氨酸的方法含有以下步骤:
(1)使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因;
(2)PCR产物连接载体、转化大肠杆菌,超声波破碎菌体,收集上清液,再进行分离纯化;
(3)用化学交联方法得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶;
(4)以磷酸盐缓冲液对步骤(3)获得的酶进行定容,再加入L-天冬氨酸生产L-丙氨酸。
其中,步骤(1)中PCR方法所用的引物为:
正向引物:5′-AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3′;
反向引物:5′-AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3′。
其中斜体字母部分分别为酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ。PCR反应在50μL总体积中进行,反应条件为在94℃变性5min后开始循环,然后94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸3min,共30个循环后,再于72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证,结果见图1,回收目的片段,测序验证为正确扩增,序列如SEQ ID NO.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中,步骤(2)中PCR产物连接载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,在20-30℃使用乳糖作为诱导剂,诱导天冬氨酸-β-脱羧酶表达。
具体为将PCR产物连接载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,挑取1个阳性克隆,接种于含50mg/ml卡那霉素抗性的10ml LB液体培养基中,37℃,220rpm振荡培养至OD600为0.6-0.8时,取2ml转接于2000mL的含2.5g/L甘油的LB液体培养基中,36-38℃,200-220rpm振荡培养,待OD600值约达2.0时,加入终浓度为2-6g/L的乳糖,24-26℃诱导6-24h。
在本发明的一个实施例中,将PCR产物连接入载体pET-28b,构建表达载体pET-Asd,将该表达载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞。
本发明方法中,还包括对诱导的培养液在4-6℃,8000rpm离心,收集菌体,菌体以0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮,即湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体:5-6mL缓冲液,在冰浴中以超声波破碎菌体,破碎后,4-6℃,8000rpm离心收集上清。
本发明方法的步骤(2)中分离纯化的方法为硫酸铵分段沉淀法,具体为向上清液中加入5%饱和度的硫酸铵溶液,边加边搅拌,然后在4-6℃,8000-10000rpm离心10min,取上清,再向上清液中缓慢加入25%饱和度硫酸铵溶液,边加边搅拌,静置1-5h,4-6℃,8000-10000rpm离心10min,收集沉淀物。
其中,步骤(3)所述的化学交联方法是以戊二醛作为交联剂,对纯化的天冬氨酸-β-脱羧酶进行固定化处理,得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶。
进一步地,是将分离纯化收集到的沉淀按照1g:10-12mL的比例滴加50%的戊二醛交联剂,混合均匀于4-6℃下交联22-24h后离心,取沉淀物,用蒸馏水洗涤3-5次,再用0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤2-3次,分离得到沉淀即制得天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶。
其中步骤(4)中对7-9g的天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶使用0.1M,pH7.0的磷酸盐缓冲液定容至1L。
具体地,步骤(4)向天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶定容液中加入L-天冬氨酸的方法为,初始L-天冬氨酸的加入量为400-500g;反应4小时后,按每小时100g加入天冬氨酸,每升反应液中可转化L-天冬氨酸量高达1800g。
步骤(4)的反应温度为36-38℃。
步骤(4)反应期间每4h取样,16h后每1h取样,通过HPLC检测反应溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量,当L-丙氨酸含量不再增加时,即为反应终点。
对于步骤(4),本发明的一个实施例的HPLC检测使用的高效液相色谱仪Agilent1100series(安捷伦公司),高效液相色谱柱ZorbaxSBC18柱(5μm,4.6mm×250mm)(安捷伦公司)。
流动相:流动相A:0.02mol/L NaAc,pH6.2;流动相B:乙腈。采用线性梯度洗脱:时间(min)0-20,B(%)5-33。流速:1.0ml/min;柱温:30℃;二极管阵列检测器(DVD)工作条件:检测波长:360nm;参比波长:600nm。
本发明提供的生产L-丙氨酸的方法中,首先通过基因工程的方法制备得到天冬氨酸-β-脱羧酶,然后以戊二醛作为交联剂,对纯化的天冬氨酸-β-脱羧酶进行固定化处理,得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶,通过酶活测定及计算,本发明制得的天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶酶活为28000U/g。再利用制得的天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶,以L-天冬氨酸固体为底物制得L-丙氨酸,酶促反应20小时后摩尔转化率达99.9%,整个过程仅需4天,且杂质少。本发明方法简单有效,具有生产周期短,产物浓度高,杂质少的技术优点。
附图说明
图1为PCR方法扩增天冬氨酸-β-脱羧酶基因的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为天冬氨酸-β-脱羧酶SDS-PAGE图。
图3为天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体(×100)。
图4为L-天冬氨酸的HPLC图谱。
图5为天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶转化L-天冬氨酸(L-Asp),反应产物L-丙氨酸(L-Ala)HPLC图谱。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,实施例中,加入各原料除特别说明外,均为市售。实施例1天冬氨酸-β-脱羧酶(Asd)基因的获得
以1μg德阿昆哈假单孢菌(Pseudomonas dacunhae)基因组DNA为PCR反应模板,按SEQ ID NO.3的序列设计正向引物Asd-F为5′-AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3′;反向引物Asd-R为5′-AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3′。其中斜体字母部分分别为酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ。PCR反应在50μL总体积中进行,反应条件为在94℃变性5min后开始循环,然后94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸3min,共30个循环后,再于72℃延伸10min。取3μL PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证,结果如图1所示。取100μL PCR产物做琼脂糖凝胶电泳,按照胶回收试剂盒(购自上海生工生物公司)的步骤回收目的片段,即Asd基因。测序验证为正确扩增,目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2天冬氨酸-β-脱羧酶基因表达载体的构建
实施例1中PCR产物经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切消化后,与用相同限制性内切酶消化的载体pET-28b(购自Novagen公司)进行连接反应,然后将连接的混合物转化大肠杆菌DH5α(购自promega公司),并进行序列测定提取转化菌体库的质粒,构建的表达载体被称为pET-Asd。
实施例3天冬氨酸β-脱羧酶基因在大肠杆菌中的表达及表达产物分离
将pET-Asd质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自promega公司)感受态细胞;挑取1个阳性克隆,接种于含卡那霉素抗性(50mg/ml)的10ml LB液体培养基中,37℃,220rpm振荡培养至OD600约为0.6-0.8时,取2ml转接于2000mL的LB液体培养基中(加入2.5g/L甘油),37℃,220rpm振荡培养,待OD600值约达2.0时,加入终浓度为2-6g/L的乳糖,25℃诱导6-24h。然后对诱导的培养液在4℃,8000rpm离心,收集菌体,菌体以0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮(湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体:5mL缓冲液),在冰浴中以超声波破碎菌体,破碎后,4℃,8000rpm离心收集上清,取100μl上清加入5×SDS-PAGE上样缓冲液,混匀,100℃沸水浴15min后,进行SDS-PAGE分析。结果见图2。
向100ml上清液中缓慢加入5%饱和度的硫酸铵溶液,边加边搅拌,然后4℃,8000rpm离心10min,取上清,再向上清液中缓慢加入25%饱和度硫酸铵溶液,边加边搅拌,静置3h,4℃,8000rpm离心10min,收集沉淀物,即为含有天冬氨酸-β-脱羧酶组分。
实施例4天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体的交联
将实施例3中收集的8g沉淀物滴加90ml50%的戊二醛交联剂,再次缓慢搅拌令其混合均匀。于4℃下交联22h后,在4℃,8000-10000rpm离心10min,取沉淀物,先用蒸馏水洗涤三次,再用0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次,最终分离得到沉淀。待冰冻干燥后即为制得的天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶。光学显微镜下观察到,天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶是单体的多聚形式,形状不规则,颗粒较小(图3)。
实施例5天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶的酶活测定
在pH7.0,温度为37℃的条件下,每克天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶每分钟转化生成1μmol L-丙氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
取1g天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶,加入0.1M,pH7.0的磷酸盐缓冲液,定容至100ml,再加入10g L-天冬氨酸作为底物,37℃水浴30min后,高效液相色谱检测溶液中L-丙氨酸含量。
高效液相色谱仪Agilent1100series(安捷伦公司),高效液相色谱柱Zorbax SBC18柱(5μm,4.6mm×250mm)(安捷伦公司)。
流动相:流动相A:0.02mol/L NaAc,pH6.2;流动相B:乙腈。采用线性梯度洗脱:时间(min)0-20,B(%)5-33。
流速:1.0ml/min
柱温:30℃
二极管阵列检测器(DVD)工作条件:检测波长:360nm;参比波长:600nm。
通过HPLC检测酶促反应中底物(L-天冬氨酸)转化为产物(L-丙氨酸)的量来计算酶活,即从反应起始5分钟内每克天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶每分钟产生1μmol L-丙氨酸定义为1U,经HPLC检测酶促反应5分钟内L-丙氨酸摩尔量计算得天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶酶活为28000U/g。
实施例6天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶生产L-丙氨酸
用实施例4制得的8g天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶为酶源,加入0.1M,pH7.0的磷酸缓冲液,定容至1L,直接加入L-天冬氨酸固体,控制整个反应过程pH7.0,温度37℃。初始L-天冬氨酸加入量400-500g,反应4小时后,按每小时100g加入天冬氨酸,每升反应液中可转化L-天冬氨酸量高达1800g,0h取样检测,见图4,此时无L-丙氨酸生成。反应期间每4h取样,16h后每1小时取样,通过HPLC检测溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量,当L-丙氨酸含量不再增加时即为反应终点,第20h和第21h取样检测,测定溶液中L-丙氨酸都为1204g。根据计算摩尔转化率达99.9%,且第20小时HPLC检测(图4)杂峰的峰面积占总峰面积小于0.1%。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种生产L-丙氨酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因;
(2)PCR产物连接载体、转化大肠杆菌,超声波破碎菌体,收集上清液,再进行分离纯化;
(3)用化学交联方法得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶;
(4)以磷酸盐缓冲液对步骤(3)获得的酶进行定容,再加入L-天冬氨酸生产L-丙氨酸。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中PCR方法所用的引物为:
正向引物:5′-AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3′;
反向引物:5′-AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3′。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中PCR产物连接载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,在20-30℃使用乳糖作为诱导剂,诱导天冬氨酸-β-脱羧酶表达。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,还包括对诱导的培养液在4-6℃,8000rpm离心,收集菌体,菌体以0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮,即湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体:5-6mL缓冲液,在冰浴中以超声波破碎菌体,破碎后,4-6℃,8000rpm离心收集上清。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中分离纯化的方法为硫酸铵分段沉淀法,具体为向上清液中加入5%饱和度的硫酸铵溶液,边加边搅拌,然后在4-6℃,8000-10000rpm离心10min,取上清,再向上清液中缓慢加入25%饱和度硫酸铵溶液,边加边搅拌,静置1-5h,4-6℃,8000-10000rpm离心10min,收集沉淀物。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述的化学交联方法是以戊二醛为交联剂,将分离纯化收集到的沉淀按照1g:10-12mL的比例滴加50%的戊二醛交联剂,混合均匀于4-6℃下交联22-24h后离心,取沉淀物,用蒸馏水洗涤3-5次,再用0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤2-3次,分离得到沉淀即制得天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶。
7.如权利要求1-6任一所述的方法,其特征在于,步骤(4)中对7-9g的天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶使用0.1M,pH7.0的磷酸盐缓冲液定容至1L。
8.如权利要求1-6任一所述的方法,其特征在于,步骤(4)向天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶定容液中加入L-天冬氨酸的方法为:初始L-天冬氨酸的加入量为400-500g;反应4小时后,按每小时100g逐步加入天冬氨酸,每升反应液中可转化L-天冬氨酸量达1800g。
9.如权利要求1-6任一所述的方法,其特征在于,步骤(4)的反应温度为36-38℃。
10.如权利要求1-6任一所述的方法,其特征在于,在步骤(4)反应期间每4h取样,16h后每1h取样,通过HPLC检测反应溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量,当L-丙氨酸含量不再增加时,即为反应终点。
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