CN113061563A - 一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成l-苹果酸的方法 - Google Patents

一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成l-苹果酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明生物酶合成技术领域，特别是涉及一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L‑苹果酸的方法。本发明要解决的技术问题是富马酸酶提取的产率低、成本高。本发明的技术方案是一种利用重组大肠杆菌合成L‑苹果酸的方法，具体如下：构建表达富马酸酶基因的大肠杆菌工程菌，液体培养工程菌，加入反应底物富马酸钠，全细胞催化直至反应完全，收集反应液。本申请利用分子生物学技术，通过重组大肠杆菌全细胞，以富马酸钠为转化底物生产L‑苹果酸。本发明方法中L‑苹果酸的产率可达到95％。本发明为提高苹果酸产量的研究提供方向，同时也为其他有机酸的研究奠定基础。

Description

一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法
技术领域
本发明生物酶合成技术领域，特别是涉及一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法。
背景技术
苹果酸别名2-羟基丁二酸，是一种十分常见却又十分重要的天然有机酸，其电离常数K1为4.0×10-4、K2为9×10-6，是生物体内三羧酸循环成员之一。分子内含有一个不对称碳原子，有两个对映体，即L-苹果酸和D-苹果酸，分别呈左旋和右旋。在许多领域都有着广泛的用途，生产苹果酸的方法有许多，诸如化学合成法、生物合成法、直接发酵法(又称一步发酵法)、两步发酵法、酶转化法、直接抽提法等。其中的化学合成法因为合成的是消旋苹果酸，其产物很难实现良好的分离效果，在日后的研究中已经被淘汰不用。生物合成法主要采用联L-苹果酸和乳酸及固定化细胞联产L-苹果酸生产工艺。再有一步发酵法生产L-苹果酸由于需要消耗比较大的能源物质，也很少有人继续采用此方法。之后又有部分国内外人士提出使用固定化细胞和固定化酶法生产L-苹果酸，并在之后形成了一定规模的工业化生产，但是人们仍然发现这种方法的产量过低，并且成本偏高。现如今，随着科学技术的日渐发展，越来越多的人发现了生物酶这一物质的奇特之处，众所周知，酶具有专一性强，高效的催化效率，以及酶促反应的催化环境相对较为温和等特点，有着很好的工业化应用前景，酶转化法省去一系列为保证对映选择性或区域选择性而使用的繁杂操作步骤，而且由于酶促反应环境的温和性，解决了以往各种生产方法的条件苛刻性这一问题，国内孟津等改进传统酶转化法工艺与国外Efrem等对传统装置进行改进，使回收率大大提高。且有利于保护环境，节能减排。
目前工业上生物酶法制备L-苹果酸的关键酶是富马酸酶。富马酸酶，又名延胡索酸酶，作用是催化延胡索酸和苹果酸之间的相互转化。由于富马酸酶在生产苹果酸上起着关键的作用。富马酸酶在自然界中广泛存在于产氨短杆菌、脱氮副球菌、黄色短杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及短乳杆菌等微生物中。虽然富马酸酶存在广泛，但是在生物合成富马酸酶的过程中，仍然遇到存在产率低，成本高的问题，这仍然将成为日后研究苹果酸转化的重点方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题是富马酸酶提取的产率低、成本高。
本发明的技术方案是一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，具体如下：构建表达富马酸酶基因的大肠杆菌工程菌，液体培养工程菌，离心收集湿菌体细胞，，加入反应底物富马酸钠，全细胞催化至反应完全，收集反应液。
具体的，所述反应温度为30～40℃。
优选的，所述反应温度为35℃。
具体的，所述反应pH为7～8。
优选的，所述反应pH为7。
进一步的，所述反应时间为8～12h。
优选的，所述反应时间为10h。
具体的，所述反应体系中，每10mL转化合成体系中添加0.5～2g富马酸钠和0.05～2g湿菌体细胞。
具体的，所述反应体系中，每10mL转化合成体系中添加1g富马酸钠和0.1g湿菌体细胞。
进一步的，所述的反应体系中还添加有终浓度为50mmoL.L-1的Ca2+或/和终体积分数为0.03％～0.06％的烷基酚聚氧乙烯醚OP。
其中，所述富马酸酶基因来自耐辐射球菌。
具体的，构建表达富马酸酶基因的大肠杆菌工程菌的过程如下：设计引物DR2627up和DR2627dn，以耐辐射球菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增；将PCR产物与T载体连接后转化感受态细胞DH5α并进行筛选培养获得阳性重组细胞；从阳性重组细胞中抽提质粒并进行酶切，并将酶切片段插入pET22b载体构建重组质粒pET22b-fumC，将重组质粒pET22b-fumC转入感受态细胞BL21并进行筛选培养获得重组富马酸酶基因工程菌。
进一步的，所述的引物DR2627up和DR2627dn的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示。
本发明还提供了所述方法得到的富马酸酶。
苹果酸转化反应进程：在10mL含1g富马酸钠的最佳转化体系中，加入诱导后、0.1g菌体细胞，置于水浴中反应，每间隔2h取样检测。结果表明：催化上述转化过程均在10h时L-苹果酸生产量达到最高，产率为95％(产率是指产物苹果酸的量与加入的底物富马酸钠的比值)，随着转化反应的继续进行，L-苹果酸含量在减少，并在12h时反应达到平衡，这可能与富马酸和苹果酸之间是可逆转化过程有关。
本发明的有益效果：本申请利用分子生物学技术，通过重组大肠杆菌全细胞，以富马酸钠为转化底物生产L-苹果酸。本发明方法中L-苹果酸的产率可达到95％。本发明为提高苹果酸产量的研究提供方向，同时也为其他有机酸的研究奠定基础。
附图说明
图1为PCR扩增产物和重组质粒双酶切电泳验证；其中，(a)为PCR扩增产物电泳验证结果；1为PCR扩增条带，2为DNA Marker(b)为重组质粒双酶切电泳验证结果，1为双酶切产物，2为DNA Marker。
图2为重组菌种SDS-PAGE电泳验证结果。其中，①为对照组；②、③、④分别为诱导2h、4h、6h的重组菌株。
图3为转化温度对重组富马酸酶酶活的影响。
图4为pH对重组富马酸酶酶活的影响。
图5为金属离子对重组富马酸酶活的影响。
图6为表面活性剂对酶转化反应影响。
具体实施方式
下述实施例中用到的主要试剂、仪器、遗传材料和培养基：
Taq DNA聚合酶，限制性内切酶和T4 DNA连接酶，质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均为北京鼎国昌盛有限公司提供；乙腈，色谱纯；富马酸钠，L-苹果酸等其他试剂均为分析纯。
高压蒸汽灭菌锅(TOMY SX-500)；；全温摇床(金坛市盛蓝仪器制造公司)；高效液相色谱仪(日本岛津)；PCR仪(Bio-Rad)；电热恒温干燥箱(金坛市盛蓝仪器制造公司)。
耐辐射球菌Deinococcus radiodurans保藏号ATCC13939。
TGY液体培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.3％，葡萄糖0.1％。
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％。
实施例1重组大肠杆菌的获得
以耐辐射球菌(D.radiodurans)富马酸酶基因fumC序列(GenBank:CP015081.1)设计引物，分别在引物5＇端添加酶切位点以及保护碱基：DR2627up，gacacCATATGaccaaaacccgccaagaaacc(SEQ ID No.1)，下划线所示为NdeI酶切位点以及保护碱基；DR2627dn，gacac CTCGAGgttgtgagtcatgcccagcgg(SEQ ID No.2)，下划线所示为XhoI酶切位点以及保护碱基。
提取耐辐射球菌(D.radiodurans)基因组DNA，然后以DR2627up和DR2627dn为引物，以耐辐射球菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应程序为：95℃预变性3min；(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸120s)，括号内35个循环；72℃再延伸6min；4℃保温)，电泳鉴定。如图1(a)所示，由PCR扩增获得大小约为1400bp的核酸条带，与理论大小相符。
PCR产物与T载体的连接及转化：PCR产物电泳回收，与T载体连接，在PCR仪中16℃的连接体系里连接10h。取连接产物加入感受态细胞DH5α中，处理后于LB培养基中37℃200rpm培养30min；将培养液均匀涂布在氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养过夜。
构建fumC重组质粒及转化：用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒并用限制性内切酶NdeI/XhoI进行酶切，用相同的限制性内切酶对pET22b载体进行酶切，用T4 DNA连接酶将二者连接，获得重组质粒pET22b-fumC。重组质粒转入感受态细胞BL21，在LB液体培养基中，37℃，200rpm培养30min；涂板于含氨苄青霉素LB平板上，37℃培养过夜，抽质粒酶切并测序验证。重组质粒采用限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，获得大小1400bp和5500bp两条带(图1(b))。重组质粒中的基因再以pET载体通用引物测序、对比，与耐辐射球菌(D.radiodurans)来源的基因均一致。上述结果表明基因已成功连接到质粒载体上。
挑取含有目的基因且测序正确的单菌落于10mL含50μg·mL-1氨苄青霉素的LB培养基中，37℃250r·min-1过夜培养；将上述培养物按体积分数1％接种量接入含50μg·mL-1氨苄青霉素的50mL LB培养基，37℃200r·min-1摇床培养至菌体OD600为0.6左右，加入终浓度为0.5mmol·L-1IPTG，25℃250r·min-1分别诱导2、4、6、8h。诱导结束后于7000r·min-1离心5min收集菌体细胞，通过SDS-PAGE分析重组蛋白表达。重组菌株通过IPTG诱导、SDS-PAGE电泳验证显示在约50kDa处有特异性表达条带。结果如图2所示，与未诱导的对照相比，工程菌在诱导之后50KDa有明显的诱导条带，随着诱导时间的增加，条带变粗，表达量上升，说明富马酸酶成功在大肠杆菌中表达。
实施例2合成L-苹果酸方法的筛选
产物检测方法：10mL质量浓度10％富马酸钠溶液(氢氧化钠调pH)中含湿菌体细胞0.1g，于水浴反应10h，利用高效液相色谱法(HPLC)检测反应液中生成的L-苹果酸。HPLC检测L-苹果酸色谱条件：色谱柱：WATERS C18亲水柱；流动相：0.1％质量浓度的甲酸加5％的乙腈缓冲溶液，流速0.8mL·min-1，柱温23℃，紫外检测波长为210nm，进样量10μL。
1、转化温度对重组富马酸酶酶活的影响
在反应液的pH 7.0，底物浓度0.1g/mL，0.1g湿菌体细胞，酶促反应在适宜的温度中反应可使酶的转化率(转化率就是底物转化的比例)达到最大。重组菌株在分别在不同的温度(30℃、35℃、40℃、45℃)下水浴，进行酶促转化反应10h后终止反应，以最高酶活定为100％，在30～40℃转化温度较佳，最佳转化温度为35℃(图3)。
2、pH对重组富马酸酶酶活的影响
在转化温度35℃，底物浓度0.1g/mL和0.1g湿菌体细胞时，酶促反应在适宜的酸碱度环境中反应可使酶的转化率达到最佳。重组菌株在分别在不同的pH(7.0、8.0)环境下35℃水浴10h，进行酶促转化反应10h后终止反应，取样，实验重复3次，以最高酶活定为100％，得出结论如图4所示：由HPLC检测可得富马酸酶fumC在pH 7.0时，酶活最好。
3、金属离子对重组富马酸酶活的影响
不同的金属离子对重组富马酸酶的酶活产生不同的影响，本实验检测了几种常见金属离子(Ca2+、Mg2+、Zn2+、K+、Cu2+)对于重组菌株的富马酸酶酶活性的影响。在转化温度35℃，pH 7.0，底物浓度150g/L和0.1g湿菌体细胞时，在反应体系中加入Ca2+、Mg2+、Zn2+、K+、Cu2 +等金属离子，终浓度为50mmoL·L-1，10h后终止反应。以对照组的酶活定为100％，HPLC检测结果如图5所示：Ca2+对fumC酶活有促进作用，而k+有轻微抑制；其他对fumC酶活性的影响不大。
4、表面活性剂对酶转化反应影响
在转化温度35℃，pH 7.0，底物浓度0.1g/mL和0.1g湿菌体细胞时，向反应体系中加入不同体积分数(0.03％、0.06％)的表面活性剂(烷基酚聚氧乙烯醚(OP)、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100))，检测不同浓度不同表面活性剂对富马酸酶活力影响，将最大酶活定为100％，结果如图6所示：0.03％OP对酶活有最大的促进作用，另外两种表面活性剂对fumC活性也有微弱的提高。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 台州学院
<120> 一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacaccatat gaccaaaacc cgccaagaaa cc 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacacctcga ggttgtgagt catgcccagc gg 32

Claims (10)

1.一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，其特征在于，具体如下：构建表达富马酸酶基因的大肠杆菌工程菌，液体培养工程菌，离心收集湿菌体细胞，加入反应底物富马酸钠，待反应完全，收集反应液。
2.如权利要求1所述利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，其特征在于，所述反应温度为30～40℃；优选的，所述反应温度为35℃。
3.如权利要求1或2所述利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，其特征在于，所述反应pH为7～8；优选的，所述反应pH为7。
4.如权利要求1或2所述利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，其特征在于，所述反应时间为8～12h；优选的，所述反应时间为10h。
5.如权利要求1或2所述利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，其特征在于，所述反应体系中，每10mL转化合成体系中添加0.5～2g富马酸钠和0.05～2g湿菌体细胞；优选的，所述反应体系中，每10mL转化合成体系中添加1g富马酸钠和0.1g湿菌体细胞。
6.如权利要求1或2所述利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，其特征在于，所述的反应体系中还添加有终浓度为50mmoL.L-1的Ca2+或/和终体积分数为0.03％～0.06％的烷基酚聚氧乙烯醚OP。
7.如权利要求1所述利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，其特征在于，所述富马酸酶基因来自耐辐射球菌。
8.如权利要求7所述利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，其特征在于，构建表达富马酸酶基因的大肠杆菌工程菌的过程如下：设计引物DR2627up和DR2627dn，以耐辐射球菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增；将PCR产物与T载体连接后转化感受态细胞DH5α并进行筛选培养获得阳性重组细胞；从阳性重组细胞中抽提质粒并进行酶切，并将酶切片段插入pET22b载体构建重组质粒pET22b-fumC，将重组质粒pET22b-fumC转入感受态细胞BL21并进行筛选培养获得重组富马酸酶基因工程菌。
9.如权利要求8所述利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，其特征在于，所述的引物DR2627up和DR2627dn的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
10.权利要求1～9任一项所述方法得到的富马酸酶。
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