CN115927500A - 东莨菪内酯的酶法制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种东莨菪内酯的酶法制备方法，具体包括先制备含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌；再将重组基因工程菌活化、发酵后，以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。经基因序列优化后，本发明首次将阿魏酰辅酶A合成酶和F6’H1酶同时构建在大肠杆菌中且实现二者同时高效的功能性共表达。建立了以价格低廉、安全低毒可持续的阿魏酸为底物，通过“两个酶‑两步催化‑一锅合成”的方式快速高效便捷合成具有高附加值的产物东莨菪内酯。本发明以1mM阿魏酸为底物催化12h后，生产摩尔产率达到86.5％，获得以阿魏酸为底物生产东莨菪内酯最高产量166.28mg/L，催化过程简单、环保，具有广阔的工业化应用前景。

Description

东莨菪内酯的酶法制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及东莨菪内酯的酶法制备方法。

背景技术

东莨菪内酯，又称东莨菪素、莨菪酚、莨菪亭，化学名为7-羟基-6甲氧基香豆素，英文名为：scopoletin，属于香豆素类化合物中的一种，分子式为C₁₀H₈O₄，相对分子质量为192.17，是植物体内一种重要的酚类抗毒素。东莨菪内酯广泛存在于多种药用植物、杂草和作物中，目前发现含有东莨菪内酯的植物超过110000种。东莨菪内酯已证实具有多种生物活性，临床上具有抗癌、抗炎、保肝、解痉挛的作用，同时也有研究表明东莨菪内酯可以通过降血压、调节血脂抑制主动脉收缩从而抗心血管疾病，对老年痴呆症也具有很好的治疗作用，还具有抗血小板凝聚、抗HIV和抗氧化等活性。

随着东莨菪内酯的活性不断被挖掘，市场的需求日益增大，东莨菪内酯的生产问题成为了研究的热点。然而，目前东莨菪内酯的获取主要通过从中药植物黄花蒿的组织中进行分离提取。然而东莨菪内酯在植物中的含量非常低下，传统的获取方式在提倡环境友好型社会发展的当下有着诸多的弊端。其次，植物中的多种东莨菪内酯类似物难以通过低成本和无公害的方式进行去除。化学合成现今面临反应时间长，高耗能、毒副产品及环境污染等难题未能解决。合成生物学的发展为诸多植物次生代谢产物的合成提供了可能。它主要是利用重组微生物工程菌株的发酵来实现，微生物菌株能简便地从实验室到工业化的大规模生产，且具有生产周期短、培养成本低、产物提纯简便和环境污染少等优势，相比起来，具有更广阔的应用前景。

近年来，利用基因工程技术改造大肠杆菌，使其生物合成东莨菪内酯的研究报道很少。Lin等^[1]在大肠杆菌中共表达酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia-lyase，TAL)、大肠杆菌羟化酶(two-component flavin-dependent monoxygenase，HpaBC)、咖啡酰-CoA-O-甲基转移酶(Caffeoyl-CoA-3-O-methyltransferase，CcoOMT)、4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)和阿魏酰-CoA-6’-羟化酶(Feruloyl-CoA hydroxylase，F6’H)，实现了以葡萄糖和甘油为碳源生成31mg/L东莨菪内酯。Yang等^[2]将F6’H与GST标签蛋白融合后，增强了F6’H的稳定性和溶解性，以阿魏酸为底物生成了80mg/L东莨菪内酯。由此可以看出，微生物制备东莨菪内酯仍处于起步阶段，有许多问题有待解决，能完善和优化出一套东莨菪内酯合成制备体系，定将对东莨菪内酯的产业有重要的推动作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成效率高的东莨菪内酯的酶法制备方法。该方法可高产东莨菪内酯，催化过程简单、环保，具有广阔的工业化应用前景。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、东莨菪内酯的酶法制备方法，包括以下步骤：

A.制备含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌；

B.将重组基因工程菌活化、发酵后，以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。

进一步，在本发明提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，所述F6’H1基因的序列如SEQ ID NO.1所示,所述阿魏酰辅酶A合成酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，在本发明提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，步骤A中制备重组基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

进一步，在本发明提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，步骤A重组基因工程菌的具体制备方法为：

(1)将人工合成F6’H1基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57-F6’H1；设计包含Bam HI酶切位点的上游引物F6‘H1-BamHI-F和包含Eco RI酶切位点的下游引物F6‘H1-EcoRI-R，以pUC57-F6‘H1为模板，PCR扩增含有双酶切位点的F6‘H1基因：ggatcc+F6‘H1+gaattc；同样分别经BamHI和EcoRI双酶切载体pGEX-6p-1；将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接；连接完毕后，转化到宿主细胞感受态中；挑选含有F6’H1基因的阳性克隆；

(2)将人工合成阿魏酰辅酶A合成酶基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57-FCS；设计包含EcoRI酶切位点和核糖体结合位点rbs的上游引物FCS-EcoRI-rbs-F和包含XhoI酶切位点的下游引物FCS-XhoI-R，以pUC57-FCS为模板，PCR扩增含有双酶切位点和核糖体结合位点的FCS基因片段：ggatcc+aaggagatatacca+FCS+ctcgag；同样分别经EcoRI和XhoI双酶切载体pGEX-F6’H1；将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接；连接完毕后，转化到宿主细胞感受态中；最后得到含有F6’H1基因和FCS基因的重组基因工程菌。

进一步，在本发明提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，所述上游引物F6‘H1-BamHI-F的序列如SEQ ID NO.5所示；所述下游引物F6‘H1-EcoRI-R的序列如SEQ IDNO.6所示。

进一步，在本发明提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，所述上游引物FCS-EcoRI-rbs-F的序列如SEQ ID NO.9所示；所述下游引物FCS-XhoI-R的序列如SEQ IDNO.10所示。

进一步，在本发明提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，步骤B中发酵具体为：将活化后的重组基因工程菌以1:20-70的比例接种于LB培养基中，37℃，250rpm恒温培养直至OD600达到0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.8-1.2mM，37℃，250rpm恒温继续培养4-12h。

进一步，在本发明提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，转化后还包括取发酵液加入同等体积的乙酸乙酯进行萃取得到东莨菪内酯。

2、本发明还提供一种用于制备东莨菪内酯的F6‘H1基因，所述F6’H1基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

3、本发明还提供一种用于制备东莨菪内酯的阿魏酰辅酶A合成酶基因，所述阿魏酰辅酶A合成酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的有益效果在于：

1、为了解决来源于植物的东莨菪内酯合成关键酶F6’H1在大肠杆菌中功能性表达差的问题，我们经过重重技术筛选，最后经实验效果验证选定来源于拟南芥的F6’H1酶；并根据大肠杆菌密码子偏好性对其进行了密码子优化，使其在重组宿主中高表达且具有较好的酶活。

2、来源于链霉菌的阿魏酰辅酶A合成酶(FCS)来替换植物来源的4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)，并根据大肠杆菌密码子偏好性进行了密码子优化，同样使其在重组宿主中高表达且具有较好的酶活。本发明经序列优化后表达的阿魏酰辅酶A合成酶比4-香豆酰-CoA连接酶对底物阿魏酸具有更高度精确性和高效催化活性。它来源于细菌更有利于在大肠杆菌中实现高效的功能性表达，且本发明首次将阿魏酰辅酶A合成酶和F6’H1酶同时构建在大肠杆菌中且实现二者同时高效的功能性共表达。

3、我们选用来源广泛、价格低廉、安全低毒可持续的阿魏酸为底物，通过“两个酶-两步催化-一锅合成”的方式快速高效便捷合成东莨菪内酯。阿魏酸作为一种农业废弃物的主要来源物质，本发明的研究成功，对于农业废弃物的可持续以及增值利用具有重要意义和价值。

4、我们调整基因表达顺序，将F6’H1基因置于FCS基因前并通过多顺反子形式共表达，减少中间产物积累对细胞的毒害作用，加快底物的转化。

根据本发明实施例的生产东莨菪内酯的方法，其以1mM阿魏酸为底物催化12h后，生产摩尔产率达到86.5％，利用本发明的重组大肠杆菌生物转化生物基阿魏酸合成东莨菪内酯，获得已知报道的以阿魏酸为底物生产东莨菪内酯最高产量166.28mg/L，催化过程简单、环保，具有广阔的工业化应用前景。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为根据本发明实施例的FCS和F6’H1两种酶催化合成东莨菪内酯路径及东莨菪内酯合成策略；

图2为本发明pGEX-F6’H1-rbs-FCS的酶切鉴定电泳图。

图3为本发明pGEX-F6’H1-rbs-FCS菌液PCR鉴定电泳图。

图4为本发明东莨菪内酯标准曲线。

图5为色谱图和质谱图，其中A为本发明重组菌发酵产物色谱图，1代表阿魏酸标品，2代表发酵4h后产物，3代表发酵12h产物，4代表东莨菪内酯标品；B为发酵产物的质谱图。

图6为本发明利用重组菌转化阿魏酸生产东莨菪内酯中东莨菪内酯的浓度和重组菌生长随时间变化图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得；实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

所用材料来源：大肠杆菌菌株BL21(DE3)和DH5α为市售，大肠杆菌菌株BL21(DE3)用于本发明中所有基因的表达，DH5α用于载体构建。大肠杆菌表达载体pGEX-6p-1来源于Novagen，DNA聚合酶、限制性内切酶购买自Novagen。质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒购买自天根。

下述实施例中培养基配方：

LB液体培养基：10g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨和5g/L酵母提取物，余量为双蒸水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。加1.5g/100mL琼脂粉可制备固体培养基。用于东莨菪内酯生产时加入1×微量元素液。

1000×微量元素液：0.03g/L H₃BO₃,1g/L Thiamine,0.94g/L ZnCl₂,0.5g/LCoCl₂,0.38g/L CuCl₂,1.6g/L MnCl₂,3.6g/L FeCl₂。

下述实施例中所涉及的引物如表1所示：

表1引物序列

注：下划线为酶切位点，小写字母为rbs序列

实施例1

构建表达载体pGEX-F6’H1和重组菌株

1引物序列和基因序列

F6’H1基因扩增引物详见表1，最终优化后的阿魏酰-CoA-6’-羟化酶(F6’H1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

Arabidopsis thaliana的阿魏酰辅酶A羟化酶(F6’H1)，SEQ ID NO.1：

1 ATGGCGCCGA CCCTGTTGAC CACCCAGTTT AGCAATCCGG CGGAAGTGAC CGATTTTGTG

61 GTGTATAAAG GCAATGGCGT GAAAGGCCTG AGCGAAACCG GCATTAAAGC GCTGCCGGAA

121 CAGTATATTC AGCCGCTGGA AGAACGCCTG ATTAATAAAT TTGTGAACGA AACCGATGAG

181 GCGATTCCGG TGATTGATAT GAGCAATCCG GATGAAGATC GCGTGGCGGA AGCGGTGTGT

241 GATGCGGCGG AAAAATGGGG CTTTTTTCAG GTGATTAATC ACGGCGTGCC GCTGGAAGTG

301 CTGGATGATG TTAAAGCGGC GACCCATAAA TTTTTTAACC TGCCGGTGGA AGAAAAGCGC

361 AAATTTACCA AAGAAAATAG CCTGAGCACC ACCGTGCGCT TTGGCACCAG CTTTAGCCCG

421 TTAGCGGAAC AGGCGCTGGA ATGGAAAGAT TATCTGAGCC TGTTTTTTGT GAGCGAGGCG

481 GAAGCGGAAC AGTTTTGGCC GGATATTTGC CGCAATGAAA CCCTGGAATA TATTAACAAA

541 AGCAAAAAGA TGGTGCGCCG CCTGCTGGAA TATCTGGGCA AAAATCTGAA TGTGAAAGAG

601 CTGGATGAAA CCAAAGAAAG CCTGTTTATG GGCAGCATTC GCGTGAATCT GAATTATTAT

661 CCGATTTGCC CGAATCCGGA TCTGACCGTG GGCGTGGGTC GTCATAGCGA TGTTAGCAGC

721 TTGACCATTC TGCTGCAGGA TCAGATTGGC GGCCTGCATG TGCGCAGCTT AGCGAGCGGT

781 AATTGGGTTC ATGTGCCGCC GGTTGCGGGC AGCTTTGTTA TTAATATTGG CGATGCGATG

841 CAGATCATGA GCAATGGCCT GTATAAAAGC GTGGAACATC GCGTGCTGGC GAATGGCTAT

901 AATAATCGCA TTAGCGTGCC GATTTTTGTG AATCCGAAAC CGGAAAGCGT GATTGGCCCG

961 CTGCCAGAAG TTATTGCGAA TGGCGAAGAA CCGATTTATC GCGATGTGCT GTATAGCGAT

1021 TATGTGAAAT ATTTCTTCCG CAAGGCGCAC GATGGCAAGA AGACCGTGGATTATGCGAAA

1081 ATTTAA

氨基酸序列，SEQ ID NO.2：

1 MAPTLLTTQF SNPAEVTDFV VYKGNGVKGL SETGIKALPE QYIQPLEERL INKFVNETDE

61 AIPVIDMSNP DEDRVAEAVC DAAEKWGFFQ VINHGVPLEV LDDVKAATHK FFNLPVEEKR

121 KFTKENSLST TVRFGTSFSP LAEQALEWKD YLSLFFVSEA EAEQFWPDIC RNETLEYINK

181 SKKMVRRLLE YLGKNLNVKE LDETKESLFM GSIRVNLNYY PICPNPDLTV GVGRHSDVSS

241 LTILLQDQIG GLHVRSLASG NWVHVPPVAG SFVINIGDAM QIMSNGLYKS VEHRVLANGY

301 NNRISVPIFV NPKPESVIGP LPEVIANGEE PIYRDVLYSD YVKYFFRKAH DGKKTVDYAK

361 I*

2实验方法

2.1阿魏酰辅酶A羟化酶F6’H1编码的基因的获取

根据大肠杆菌密码子偏好性将来源于Arabidopsis thaliana的阿魏酰辅酶A羟化酶(F6’H1)(GenBank ID At3g13610)对应的基因进行密码子优化，交由北京华大生物科技有限公司进行合成，获得含有目的基因的质粒pUC57-F6’H1。

2.2含有双酶切位点的F6’H1基因的扩增

设计上游引物F6’H1-BamHI-F(包含Bam HI酶切位点)和下游引物F6’H1-EcoRI-R(包含Eco RI酶切位点)，以pUC57-F6’H1为模板，PCR扩增目的基因F6’H1：(BamHI)ggatcc+F6’H1+gaattc(EcoRI)，反应体系如表2。

表2含有双酶切位点的F6’H1基因的扩增体系

2.3 pGEX-F6’H1的构建及其转化

2.3.1双酶切反应

将上述扩增出的两端含有BamHI和EcoRI酶切位点的F6’H1基因片段与载体pGEX-6p-1分别经BamHI和EcoRI双酶切，在37℃条件下酶切反应1h，反应体系如表3。

表3双酶切反应体系

2.3.2连接并转化

(1)将2.3.1用同种酶分别进行双酶切的目的片段与载体按3:1的比例在T4连接酶的作用下进行连接，16℃过夜连接。反应体系如下表4：

表4目的片段与载体连接体系

(2)连接反应结束以后，将连接液全部转化到100μL的E.coli BL21(DE3)感受态中，缓慢地将其摇匀后在冰浴中放置30min；

(3)上述转化混合反应液在42℃水浴中加热90s后迅速在冰浴中冷却2min；

(4)无菌条件下，将900μL的LB培养基加到上述离心管中，然后恒温振荡37℃，200rpm，1h；

(5)将上述培养的菌液4000rpm，2min，去除800μL的上清液，余下混匀后吸取100μL加到含有Amp抗生素的LB平板上，用涂布棒均匀涂开；

(6)将涂布后的平板密封后(用封口膜)，37℃条件下静置15min(将菌液完全吸干)，最后将其倒置培养12h。

2.3.3菌液PCR鉴定

(1)挑取单菌落接种至1mL含有50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养4-6h，以引物F6’H1-F和F6’H1-R进行扩增，反应体系如下表5：

表5菌检PCR反应体系

(2)PCR扩增终止后，取少量的PCR产物经1％凝胶电泳进行检测，并对结果进行分析，初步筛选出阳性重组菌。

2.3.4重组质粒的提取

将上步测序正确的重组菌按照1:50的比例接种至新鲜的LB液体培养基(Amp⁺，50mg/L)中，恒温培养过夜12h(37℃，200rpm)。然后按照天根公司的质粒小提试剂盒操作步骤进行重组质粒的提取，具体步骤如下：

(1)取2mL菌液，12000rpm离心30s后尽量将上清除尽；

(2)向上述离心管中缓慢加入250μL的溶液P1，用移将液器反复抽打混匀菌体；

(3)将250μL的溶液P2缓慢加入到上述溶解液中，缓慢上下颠倒6-8次，直至菌体彻底破碎裂解成透明溶液；

(4)取350μL的溶液P3加入到上述离心管中，迅速上下颠倒6-8次，12000rpm离心10min；

(5)缓慢地将离心所得的上清液吸入到吸附柱AC，然后12000rpm离心1min，弃滤液；

(6)将500μL的溶液WB吸取至吸附柱中，然后12000rpm离心1min，弃滤液；

(7)吸附柱重新12000rpm离心1min，最大程度去除残留的溶液；

(8)将吸附柱转移至无酶离心管中，吸取50μL的ddH₂O从柱中央缓慢地加入，室温静置2min，12000rpm离心2min，所得产物放于-20℃保存。

2.3.5、酶切鉴定

将上步提取的pGEX-F6’H1质粒，分别经过BamHI与EcoRI双酶切鉴定。双酶切反应体系如表3。

2.3.6测序鉴定

将上述初步鉴定为阳性的菌液送至测序公司进行测序。测序结果表明，表达载体已成功构建。

3结果

菌液PCR鉴定结果经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出的片段大小为1086bp左右；提取经经菌液PCR鉴定为阳性的菌株质粒，经BamHI与EcoRI双酶切反应，酶切结果经琼脂糖凝胶电泳检测：双酶切片段大小分别为5400bp和1086bp左右，前者与pGEX-6p-1空载体得到的片段相符，后者与目的片段F6’H1大小相符，进一步验证了构建成功的原核表达载体；最后将上步初步鉴定为阳性的菌液送到测序公司进行测序，结果表明F6’H1已成功通过BamHI与EcoRI酶切位点连接到pGEX-6p-1原核表达载体上。

实施例2

构建表达载体pGEX-F6’H1-rbs-FCS和重组菌株

1引物

FCS基因扩增引物详见表1，最终优化后的阿魏酰辅酶A合成酶FCS核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

Streptomyces sp.strain V-1的阿魏酰辅酶A合成酶(FCS)，SEQ ID NO.3：

1 ATGCGCAATC AGGGCTTGGG TAGCTGGCCA GTTCGTCGCG CGCGTATGAG CCCACATGCG

61 ACCGCGGTTC GTCATGGTGG TACCGCGTTG ACCTATGCGG AATTAAGCCG TCGCGTGGCG

121 CGTCTGGCGC ATGGTTTGCG CGAAGCGGGT GTTCGTCCAG GTGATCGTGT TGCGTATTTG

181 GGCCCGAATC ATCCGGCGTA TCTGGAAACC CTGTTTGCGT GCGGCCAGGC GGGTGCGGTT

241 TTTGTTCCAT TAAATTTTCG CCTGGGCGTG CCGGAACTGG ATCATGCGCT GGCGGATAGC

301 GGTGCGAGCG TTTTAATTCA TACCCCGGAA CATGCGGAAA CCGTGGCGGC GTTAGCGGGT

361 GATCGTTTAT TGCGCGTTCC AGCGGGTGAA TTGGAAGCGG CGGATGATGA ACCACTGGAT

421 CTGCCGGTTG GCTTGGATGA TGTTTGCCTG CTGATGTATA CCAGCGGCAG CACCGGCCGT

481 CCAAAAGGCG CGATGTTAAC CCATGGTAAT CTGACCTGGA ATTGCGTGAA TGTGCTGGTG

541 GAAACCGATC TGGCGAGCGA TGAACGCGCG TTAGTTGCGG CGCCATTATT TCATGCGGCG

601 GCGTTAGGCA TGGTGTGTCT GCCGACTTTA TTGAAAGGCG GCACCGTTAT TTTGCATAGC

661 GCGTTTGATC CGGGCGCGGT GTTAAGCGCG GTTGAACAAG AACGCGTTAC CCTGGTGTTT

721 GGCGTGCCGA CTATGTATCA GGCGATTGCG GCGCATCCGC GCTGGCGTAG CACTGATTTG

781 AGCAGCTTAC GTACCCTGCT GTGCGGTGGC GCGCCAGTTC CAGCGGATTT AGCGGGTCGT

841 TATCTGGATC GTGGCCTGGC GTTTGTGCAA GGCTATGGCA TGACCGAAGC GGCGCCAGGT

901 GTTCTGGTTT TAGATCGCGC GCATGTTGCG GAAAAAATTG GCAGCGCGGG CGTGCCGAGC

961 TTTTTTACCG ATGTGCGCGT GGCGGGCCCG AGTGGCGAAC CAGTTCCACC AGGTGAAAAA

1021 GGCGAAATTG TGGTGAGCGG CCCGAATGTG ATGAAAGGCT ATTGGGGCCGCCCGGAAGCG

1081 ACTGCGGAAG TTTTAAGAGA TGGTTGGTTT CGCAGCGGCG ATGTGGCGACTGTTGATGGT

1141 GATGGTTATT TTCATGTGGT GGATCGCCTG AAAGATATGA TTATTAGCGGCGGCGAAAAT

1201 ATCTATCCGG CGGAAGTGGA AAATGAGCTG TATGGCTATC CGGGCGTGGAAGCGTGTGCG

1261 GTTATTGGCG TTCCAGATCC GCGCTGGGGT GAAGTTGGTA AAGCGGTGGTTGTTCCAGCG

1321 GCGGGTAGTC GAATTGATGG TGCGGAATTA TTGGCGTGGT TGCGCACCCGTCTGGCGGGT

1381 TATAAAGTGC CAAAAAGCGT GGAATTTACC GACCGCCTGC CGACCACCGGCAGCGGCAAA

1441 ATTTTAAAAG GCGAAGTGCG CCGCCGCTTT GGCTAA

氨基酸序列，SEQ ID NO.4：

1 MRNQGLGSWP VRRARMSPHA TAVRHGGTAL TYAELSRRVA RLAHGLREAG VRPGDRVAYL

61 GPNHPAYLET LFACGQAGAV FVPLNFRLGV PELDHALADS GASVLIHTPE HAETVAALAG

121 DRLLRVPAGE LEAADDEPLD LPVGLDDVCL LMYTSGSTGR PKGAMLTHGN LTWNCVNVLV

181 ETDLASDERA LVAAPLFHAA ALGMVCLPTL LKGGTVILHS AFDPGAVLSA VEQERVTLVF

241 GVPTMYQAIA AHPRWRSTDL SSLRTLLCGG APVPADLAGR YLDRGLAFVQ GYGMTEAAPG

301 VLVLDRAHVA EKIGSAGVPS FFTDVRVAGP SGEPVPPGEK GEIVVSGPNV MKGYWGRPEA

361 TAEVLRDGWF RSGDVATVDG DGYFHVVDRL KDMIISGGEN IYPAEVENEL YGYPGVEACA

421 VIGVPDPRWG EVGKAVVVPA AGSRIDGAEL LAWLRTRLAG YKVPKSVEFT DRLPTTGSGK

481 ILKGEVRRRF G*

2实验方法

2.1阿魏酰辅酶A合成酶FCS编码的基因的获取

根据大肠杆菌密码子偏好性将来源于Streptomyces sp.strain V-1的阿魏酰辅酶A合成酶(FCS)对应的基因进行密码子优化，交由北京华大生物科技有限公司进行合成，获得含有目的基因的质粒pUC57-FCS。

2.2含有双酶切位点和核糖体结合位点的FCS基因的扩增

设计上游引物FCS-EcoRI-rbs-F(包含EcoRI酶切位点和核糖体结合位点rbs)和下游引物FCS-XhoI-R(包含XhoI酶切位点)，以pUC57-FCS为模板，PCR扩增含有双酶切位点和核糖体结合位点的FCS基因片段：(BamHI)ggatcc+(rbs)aaggagatatacca+FCS+ctcgag(XhoI)。反应体系如表2。

2.3 pGEX-F6’H1-rbs-FCS的构建及其转化

2.3.1双酶切反应

将上述扩增出的两端含有EcoRI和XhoI酶切位点的FCS基因片段与载体pGEX-F6’H1分别经EcoRI和XhoI双酶切。反应体系如表3。

2.3.2连接并转化

按实施例1方法操作，得到重组菌株BL21(DE3)，并携带重组质粒pGEX-F6’H1-rbs-FCS，命名为ySL88。

2.3.3菌液PCR鉴定

按实施例1方法操作

2.3.4重组质粒的提取

按实施例1方法操作，得到pGEX-F6’H1-rbs-FCS质粒。

2.3.5酶切鉴定

将上步提取的pGEX-F6’H1-rbs-FCS质粒，分别经过BamHI和EcoRI双酶切和EcoRI和XhoI进行双酶切鉴定。图2为本发明pGEX-F6’H1-rbs-FCS的酶切鉴定电泳图。

2.3.6测序鉴定

将上述初步鉴定为阳性的菌液送至测序公司进行测序。测序结果表明，表达载体已成功构建。

3结果

图3为本发明pGEX-F6’H1-rbs-FCS菌液PCR鉴定电泳图，菌液PCR鉴定结果经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出的片段大小为1476bp左右；提取经菌液PCR鉴定为阳性的菌株质粒，经BamHI与EcoRI双酶切反应，酶切结果经琼脂糖凝胶电泳检测：双酶切片段大小为1086bp左右，酶切出来的目的片段与F6’H1大小相符；经EcoRI与XhoI双酶切反应，酶切结果经琼脂糖凝胶电泳检测：双酶切片段大小分别为1476bp左右，酶切出来的目的片段与FCS加上rbs片段大小相符；最后将上步初步鉴定为阳性的菌液送到测序公司进行测序，结果表明pGEX-F6’H1-rbs-FCS原核表达载体已构建成功。

实施例3

利用重组菌株生物转化阿魏酸制备东莨菪内酯的方法

使用的菌株是实施例2中所构建的重组菌株ySL88。

1东莨菪内酯标准曲线的建立

精确称量东莨菪内酯标准品10mg溶解于色谱甲醇中，并用色谱甲醇定容至1mL，即为1000mg/L的标准品溶液，并按照比例与色谱甲醇混合配成浓度分别为1、5、10、50、100和200mg/L的标准品溶液。经过高效液相色谱测定，测定方法。最后，根据实验结果建立了东莨菪内酯标品的色谱峰面积与其浓度的线性回归方程，如图4所示，这为后续发酵试验定量分析东莨菪内酯的浓度提供了理论依据。

2重组菌发酵合成东莨菪内酯

2.1重组菌种的活化

重组菌的活化就是将低温保存的甘油重组菌重新接种于新鲜且预热的培养基(含相应抗生素)中扩大培养，通过多次扩培筛选后得到生长良好、菌种单一与状态稳定的目的重组菌。活化后的重组菌可以通过菌液PCR、酶切反应以及测序来鉴定所得到的重组菌是否发生变异。具体活化操作如下：

(1)将-80℃保存的甘油菌立即放置在38-40℃水浴中，不断摇动直至全部融化成液体；

(2)无菌条件下，用接种环将少量融化的菌种划线在含有氨苄青霉素的平板上；

(3)将划线后的平板密封后，37℃条件下静置15min(吸收菌液)，最后将其在37℃的恒温培养箱中倒置12h后观察菌落；

(4)无菌条件下，挑取平板上的单菌落至1mL的LB液体培养基(Amp⁺，50mg/L)，在37℃，200rpm条件下过夜培养。

活化后的重组菌液应该放置在4℃冰箱中保存，为后续的发酵实验做准备。若重组菌液保存时间超过一周，需要新扩培活化与鉴定。

2.2发酵转化及其产物的提取

(1)将上述活化的重组菌以1:50的比例接种于50mL新鲜的LB培养基(Amp⁺，50mg/L)中，37℃，250rpm恒温培养直至OD₆₀₀达到0.6-0.8，然后添加外源诱导剂IPTG至终浓度为1mM，37℃，250rpm恒温继续培养4h；

(2)然后向(1)中添加1mM阿魏酸；

(3)37℃，250rpm的恒温培养箱中发酵培养12h；

(4)充分摇匀发酵液，无菌条件下取1mL发酵液放置于2mL的离心管中，再加入同等体积的乙酸乙酯，重复萃取3次；

(5)萃取结束后，将乙酸乙酯相合并放于通风橱内自然吹干；

(6)将所得残留成分溶解于色谱甲醇中，进样前置于4℃保存。

3结果与分析

3.1高效液相色谱检测

图5为色谱图和质谱图，其中图5中A为不同物质色谱图，曲线4为东莨菪内酯标品的色谱图，在保留时间为7.9min左右有一明显的色谱峰，曲线1为阿魏酸标准品的色谱图，在保留时间为9.6min左右有一明显的色谱峰。曲线2和曲线3为重组菌发酵产物色谱图，保留时间为9.6min时有一色谱峰与阿魏酸标准品的色谱图一致，表明此峰代表的是阿魏酸，即未转化的底物。而且曲线2和曲线3中，洗脱时间约为7.9min时还有一个明显的色谱峰，该色谱峰的洗脱时间与东莨菪内酯标准品相一致。图5B为将曲线3中洗脱时间约为7.9min的物质通过质谱分析，确定该物质为东莨菪内酯。实验结果表明，本研究构建的重组菌株ySL88具有很好的催化活性，能够催化底物阿魏酸高效转化为东莨菪内酯。

3.2东莨菪内酯的产量及其转化率

3.2.1东莨菪内酯的产量

通过对发酵产物的色谱和质谱图进行分析，我们证实了重组菌的发酵液中含有东莨菪内酯。至于发酵产物中东莨菪内酯的含量可以根据色谱峰的峰面积并结合建立的东莨菪内酯标准曲线求得。如图4所示，以色谱峰面积对质量浓度作图，得工作标准曲线，东莨菪内酯标准品的线性回归方程为Y＝24.863X+1.591，相关系数R²＝0.998。其中Y为东莨菪内酯标准品浓度，单位为mg/L；X为峰面积，单位为mAU*s。经计算，东莨菪内酯的产量随时间变化如图6所示，而且最高产量为166.28mg/L，即摩尔浓度为0.865mM。

3.2.2东莨菪内酯的摩尔转化率

利用重组微生物将底物生物转化为目标产物时，为了衡量重组菌的生物转化能力需要对底物的利用率做出计算。东莨菪内酯的摩尔转化率是指在东莨菪内酯的生物合成过程中，单位摩尔的阿魏酸经过重组菌发酵转化以后生产东莨菪内酯的摩尔数。本研究中，所使用的底物浓度为1mM，而发酵液中东莨菪内酯的摩尔浓度为0.865mM。根据此定义，可以计算出本研究的东莨菪内酯的摩尔转化率为86.5％。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.制备含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌；

B.将重组基因工程菌活化、发酵后，以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。

2.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，所述F6’H1基因的序列如SEQ ID NO.1所示,所述阿魏酰辅酶A合成酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，步骤A中制备重组基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

4.根据权利要求1-3任一项所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，步骤A重组基因工程菌的具体制备方法为：

1)将人工合成F6’H1基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57-F6’H1；设计包含Bam HI酶切位点的上游引物F6‘H1-BamHI-F和包含Eco RI酶切位点的下游引物F6‘H1-EcoRI-R，以pUC57-F6‘H1为模板，PCR扩增含有双酶切位点的F6‘H1基因：ggatcc+F6‘H1+gaattc；同样分别经BamHI和EcoRI双酶切载体pGEX-6p-1；将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接；连接完毕后，转化到宿主细胞感受态中；挑选含有F6’H1基因的阳性克隆；

2)将人工合成阿魏酰辅酶A合成酶基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57-FCS；设计包含EcoRI酶切位点和核糖体结合位点rbs的上游引物FCS-EcoRI-rbs-F和包含XhoI酶切位点的下游引物FCS-XhoI-R，以pUC57-FCS为模板，PCR扩增含有双酶切位点和核糖体结合位点的FCS基因片段：ggatcc+aaggagatatacca+FCS+ctcgag；同样分别经BamHI和EcoRI双酶切载体pGEX-F6‘H1；将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接；连接完毕后，转化到宿主细胞感受态中；最后得到含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，所述上游引物F6‘H1-BamHI-F的序列如SEQ ID NO.5所示；所述下游引物F6‘H1-EcoRI-R的序列如SEQ IDNO.6所示。

6.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，所述上游引物FCS-EcoRI-rbs-F的序列如SEQ ID NO.9所示；所述下游引物FCS-XhoI-R的序列如SEQ ID NO.10所示。

7.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，步骤B中发酵具体为：将活化后的重组基因工程菌以1:20-70的比例接种于LB培养基中，37℃，250rpm恒温培养直至OD600达到0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.8-1.2mM，37℃，250rpm恒温继续培养4-12h。

8.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，转化后还包括取发酵液加入同等体积的乙酸乙酯进行萃取得到东莨菪内酯。

9.一种用于制备东莨菪内酯的F6‘H1基因，其特征在于，所述F6’H1基因的序列如SEQID NO.1所示。

10.一种用于制备东莨菪内酯的阿魏酰辅酶A合成酶基因，其特征在于，所述阿魏酰辅酶A合成酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

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