CN117904215A - 一种生产酪醇的方法及其工程菌株和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产酪醇的方法及其工程菌株和应用，属于生物工程技术领域。本发明的生产酪醇的方法通过L‑阿拉伯糖对工程菌株进行诱导表达并进行全细胞催化获得酪醇。本发明提供的工程菌株具有利用双质粒表达载体系统，其中基因组上引入带有强启动子的GDH以用于后续实现还原力自循环无需辅酶及外源添加还原力；另一方面，该质粒系统通过控制大肠杆菌L‑阿拉伯糖的代谢，驱动目的基因的高效表达。相比传统IPTG诱导时易造成细胞代谢负担且规模化应用时造成发酵成本的增加等缺点，L‑阿拉伯糖作为菌体可代谢的糖类，诱导时不会造成菌体生长负担且其价格低廉，更有利于生产放大。具有成本低，工艺简单的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种生产酪醇的方法及其工程菌株和应用。
背景技术
酪醇是一种天然酚类化合物，具有抗氧化及抗炎活性，其主要用作医药、香料合成的中间体。在医药领域，酪醇的衍生物如羟基酪醇和红景天苷等具有显著的抗氧化和抗炎作用，被广泛应用于制药和医药行业。这些衍生物能够有效地清除自由基，保护细胞免受氧化损伤，从而对心血管疾病、糖尿病等疾病具有一定的预防和治疗作用。另一方面，酪醇在食品工业中也有着广泛的应用。它可以作为食品添加剂，例如添加进清酒或葡萄酒中，能够改善风味，提高食品的口感和品质。此外，酪醇还具有抗菌、防腐等作用，可以延长食品的保质期，保障消费者的健康安全。
由于酪醇的广泛应用前景，其生产方法一直受到人们的关注。目前，酪醇的生产方法主要包括植物提取法、化学合成法和微生物合成法。植物提取法虽然能够获得天然的酪醇，但由于植物中的含量较低，提取工艺复杂，限制了其大规模生产。化学合成法虽然成熟，但存在原料成本高、工艺条件苛刻、纯化复杂等弊端，同时易产生环境污染，在实际生产过程中存在较大问题。
而微生物合成法作为一种具有成本低、条件温和、环境污染少等优点的生产方法，成为了研究热点。当前生产酪醇的微生物合成法主要包括代谢法和生物酶催化法。代谢法工艺是利用大肠杆菌或酵母等重组菌株，以葡萄糖为底物经发酵代谢产生。然而，该工艺存在转化率低、发酵周期长、发酵产物复杂难分离等问题。而目前已报道的产酪醇的生物催化法大部分存在诱导需要昂贵诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，催化需要辅酶焦磷酸硫胺素，且受酪醇生物毒性影响，生长受限菌种密度低，总体转化率低等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供转化率高，工艺条件简单的高效生产酪醇的方法及其工程菌株和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种生产酪醇的方法，包括以下步骤：
(1)工程菌株的活化：接种工程菌株至培养基，向培养基中加入L-阿拉伯糖进行诱导表达，结束后得到发酵液，收集发酵液中的活化工程菌株；
(2)全细胞催化：取步骤(1)的活化工程菌株加入全细胞反应液进行全细胞催化，结束后收集反应液，离心反应液后取上清，分离得到酪醇；
所述全细胞催化的底物为酪氨酸；所述工程菌株为双质粒表达系统和大肠杆菌突变体的重组大肠杆菌；所述双质粒表达系统包括表达苯丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的pYs-Aro10-yahk质粒和表达L-氨基脱氨酶和葡萄糖脱氢酶的pA-AAD-GDH质粒。
本发明的高效生产酪醇的方法，以L-酪氨酸为底物，经大肠杆菌突变体经廉价诱导剂L-阿拉伯糖诱导蛋白表达后进行全细胞催化生成酪醇；一方面，由于工程菌株中是具有利用双质粒表达载体系统，其中基因组上引入带有强启动子的GDH以用于后续实现还原力自循环无需辅酶及外源添加还原力；另一方面，该质粒系统通过控制大肠杆菌L-阿拉伯糖的代谢，驱动目的基因的高效表达。相比传统IPTG诱导时易造成细胞代谢负担且规模化应用时造成发酵成本的增加等缺点，L-阿拉伯糖作为菌体可代谢的糖类，诱导时不会造成菌体生长负担且其价格低廉，更有利于生产放大。本发明的高效产酪醇的方法反应路径短，可短时间内快速积累产物，在一定程度上降低产物的生物毒性的影响，明显提高菌种密度和生产强度，具有成本低，工艺简单，绿色环保且产品纯度高等优点。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述L-阿拉伯糖在诱导表达体系中的终浓度为0.5-2.0g/L。
优选地，所述L-阿拉伯糖在诱导表达体系中的终浓度为0.5g/L。L-阿拉伯糖诱导剂浓度降低至0.5g/L依旧能在摇瓶发酵中达到与2g/L浓度诱导剂量相同的诱导效果。L-阿拉伯糖诱导剂浓度降低至0.5g/L时，以20g/L为底物，经全细胞催化，20h可产酪醇最高产14.254/L，酪氨酸转化率可达71.3％。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述诱导表达的时间为12-24h；所述诱导表达温度为27-32℃。优选地，所述诱导表达的时间为16h，所述诱导表达温度为30℃。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述工程菌株的接种量为0.5-1.5％；优选地，接种量为1％。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述培养基为ZYM自诱导培养基。ZYM自诱导培养基能够通过诱导细胞自主分化和增殖，提高细胞培养的效率和产量。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述全细胞反应液包括150-200mmol/L PB buffer，4-6mmol/L MgSO4，15-25g/L酪氨酸，5-15g/L葡萄糖。
优选地，所述全细胞反应液包括200mmol/L PB buffer、5mmol/L MgSO4、20g/L酪氨酸，10g/L葡萄糖。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述加入全细胞反应液的活化工程菌株的OD600值为20。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述全细胞催化温度为25-37℃；全细胞催化时间为18-25h，优选地，所述全细胞催化时间为20h。
优选地，所述全细胞催化温度为37℃。在该条件下，以20g/L为底物，经全细胞催化，20h可产酪醇最高产17.682g/L，酪氨酸转化率可达88.4％。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1)中所述诱导表达和步骤(2)中所述全细胞催化均在摇床中进行，所述摇床转速为200-220rpm。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述工程菌株的制备方法包括：将双质粒表达系统中的pYs-Aro10-yahk质粒和pA-AAD-GDH质粒通过化学转化法导入大肠杆菌突变体，得到基因工程菌株。
本发明的工程菌株以大肠杆菌BL21为起始菌株进行基因改造，通过双质粒表达系统，对功能基因酿酒酵母来源的苯丙酮酸脱羧酶Aro10、奇异变形杆菌来源的L-氨基脱氨酶AAD、巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶GDH进行基于大肠杆菌的密码子优化，结合大肠杆菌来源的乙醇脱氢酶yahk，即得到生产酪醇的基因工程菌株。通过根据酪醇生物合成代谢路径关键基因的筛选，能够削弱大肠杆菌消耗酪醇前体4-羟基苯乙醛的能力，提高L-酪氨酸的利用率，同时搭建L-酪氨酸-酪醇反应路径还原力自循环，适用于以更低成本的L-阿拉伯糖作为诱导剂的全细胞催化方法。选用同工酶苯丙酮酸脱羧酶Aro10实现脱羧可以规避选用常规丙酮酸脱羧酶需要依赖焦磷酸硫胺素等辅酶而增加成本的缺点，有利于生产放大。
第二方面，本发明提供一种大肠杆菌突变体，所述大肠杆菌突变体中不含feaB基因和lpxM基因；所述大肠杆菌突变体中包括GDH基因；所述大肠杆菌突变体的品种为大肠杆菌BL21；所述大肠杆菌突变体的基因型为E.coli BL21ΔfeaB,ΔlpxM::GDH。
作为本发明的大肠杆菌突变体的优选实施方式，所述大肠杆菌突变体的制备方法为：在大肠杆菌BL21中，用CRISPR技术敲除feaB基因，同时替换lpxM基因为表达GDH基因的119-GDH-rrnB基因片段，完成大肠杆菌突变体的制备。通过上述方法制备的大肠杆菌突变体，敲除了feaB基因，削弱大肠杆菌消耗酪醇前体4-羟基苯乙醛的能力；更换lpxM基因并在其基因组上引入带有强启动子的GDH，能够在全细胞催化中配合双质粒表达系统实现还原力的自循环。
第三方面，本发明提供一种双质粒表达系统，所述双质粒系统包括表达苯丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的pYs-Aro10-yahk质粒和表达L-氨基脱氨酶和葡萄糖脱氢酶的pA-AAD-GDH质粒。
作为本发明所述双质粒表达系统的优选实施方式，所述苯丙酮酸脱羧酶为功能基因酿酒酵母来源，其核酸序列如SEQ ID No:3所示；所述L-氨基脱氨酶为奇异变形杆菌来源，其核酸序列如SEQ ID No:5所示；所述葡萄糖脱氢酶为巨大芽孢杆菌来源，其核酸序列如SEQ ID No:6所示；所述乙醇脱氢酶为大肠杆菌来源，其核酸序列如SEQ ID No:4所示。
作为本发明所述工程菌株的优选实施方式，所述第一表达质粒的载体为pYs载体，其核酸序列如SEQ ID No:2所示，所述第二表达质粒的载体为pA载体，其核酸序列如SEQ IDNo:1所示。
本发明的质粒系统通过分别选用不同的载体，连接不同的酶进行表达改造，其中载体pYs和pA均为pBAD载体系统，是用于在细菌中表达重组蛋白的可靠且可控的系统，该系统通过araBAD操纵子控制大肠杆菌L-阿拉伯糖的代谢。将目的基因置于pBAD载体中araBAD启动子的下游，当L-阿拉伯糖存在时，araBAD启动子驱动目的基因的高效表达，降低了后续全细胞催化应用的成本；另一方面，双质粒系统和大肠杆菌协同作用，最终构建的大肠杆菌工程菌株在生产酪醇的同时可以实现还原力自足，其还原力循环通过NADP+在yahK作用下被还原成NADPH，NADPH在GDH作用下被氧化成NADP+实现，在yahK和GDH的协同作用下可以实现NADP+与NADPH自给自足。
第四方面，本发明提供了一种生产酪醇的方法在制药、食品和化工领域的应用。
在制药领域，酪醇及其衍生物在抗氧化和抗炎药物中发挥着重要作用。通过本发明的生产方法，可以大规模、高效地生产酪醇，为制药行业提供充足的原料，推动相关药物的研究和开发。在食品领域，酪醇可以作为食品添加剂，改善食品的风味和品质。通过本发明的生产方法，可以获得高纯度的酪醇，确保食品的安全性和口感。在化工领域，酪醇作为一种重要的化学品，可以用于合成其他具有特殊功能的化合物。本发明的生产方法能够为化工行业提供稳定、高效的酪醇来源，促进相关产品的研发和应用。以20g/L的L-酪氨酸作为底物，经过全细胞催化，仅仅20小时就能达到最高产量17.682g/L的酪醇，酪氨酸的转化率更是高达88.41％。这一显著的生产成果充分证明了本发明所提供的方法在高效、环保、经济地生产酪醇方面的巨大潜力和实用价值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明提供的生产酪醇的方法，利用L-酪氨酸作为底物，通过大肠杆菌突变体在廉价诱导剂L-阿拉伯糖的作用下进行蛋白表达，进而实现全细胞催化生成酪醇。此方法的突出优势在于它无需辅酶及外源添加还原力，从而简化了生产步骤并降低了成本。同时，该反应路径短，能够在短时间内快速积累产物，这不仅提高了生产效率，还在一定程度上降低了产物的生物毒性对微生物生长的影响，从而明显提高了菌种密度和生产强度。
2.本发明提供的方法在制药、食品和化工领域的应用，不仅成本低廉、工艺简单，而且符合绿色环保的原则，能够生产出高纯度的酪醇。在最优化的生产条件下，以20g/L的L-酪氨酸作为底物，经过全细胞催化，仅仅20小时就能达到最高产量17.682g/L的酪醇，酪氨酸的转化率更是高达88.41％，充分证明了本发明所提供的方法在高效、环保、经济地生产酪醇方面的巨大潜力和实用价值。
3.本发明根据酪醇生物合成代谢路径筛选关键基因进而选择载体设计的工程菌株，能够削弱大肠杆菌消耗酪醇前体4-羟基苯乙醛的能力，提高L-酪氨酸的利用率，同时搭建L-酪氨酸-酪醇反应路径还原力自循环，该菌株无需在体系中加入辅酶焦磷酸硫胺素及外源添加还原力，不容易造成菌体代谢负担。
附图说明
图1为大肠杆菌工程菌株合成酪醇的途径；
图2为实施例1中LC01工程菌株的菌检凝胶电泳图；
图3为实施例2中LC02工程菌株的菌检凝胶电泳图；
图4为实施例2中pYs-Aro10-yahk的质粒图谱；
图5为实施例2中pA-PmLAAD-GDH的质粒图谱；
图6为高效液相色谱测酪醇标准样品所得到的色谱图；
图7为实施例4中LC03催化过程中酪醇的产量变化图；
图8为实施例5中LC03不同浓度诱导剂下酪醇的产量对比图；
图9为实施例6中LC03不同催化温度酪醇的产量对比图；
图10为实施例7中对比L-阿拉伯糖和IPTG诱导效果对比图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1大肠杆菌突变体LC02的构建
在大肠杆菌BL21中敲除苯乙醛脱氢酶基因(feaB)，同时将脂类A生物合成豆蔻酰基转移酶基因(lpxM)替换为巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶(GDH)从而获得的大肠杆菌BL21的突变体，在本发明中简称为LC02，其基因型为E.coli BL21ΔfeaB,ΔlpxM::GDH。所述对所述大肠杆菌基因组中的基因进行敲除和编辑主要是基于Lambda-Red重组、FLP-FRT重组和CRISPR/Cas9技术。参考文献：Lambda Red RecombinationOne-step inactivationof chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl AcadSci U S A.2000Jun 6；97(12):6640-5.和Development of a fast and easy method forEscherichia coli genome editing with CRISPR/Cas9.Microb Cell Fact.2016Dec 1；15(1):205。
下述pCas质粒参考文献：Jiang Y,Chen B,Duan C,Sun B,Yang J,Yang S:Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Appl Environ Microbiol 2015,81:2506-2514；
下述pTargetF质粒参考文献：Jiang Y,Chen B,Duan C,Sun B,Yang J,Yang S:Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR Cas9system.Appl Environ Microbiol 2015,81:2506 2514
大肠杆菌突变体LC02的具体构建步骤如下：
S1、制备电转感受态细胞：将pCas质粒利用化学转化法转化大肠杆菌BL21，在含卡那霉素的LB平板(卡那霉素浓度为50ug/ml)上30℃培养筛选阳性克隆，阳性克隆接种在含2g/L L-阿拉伯糖的LB液体培养基中30℃培养至OD600约为0.6后，制备电转感受态细胞；
S2、构建pTarget质粒：利用网站http://chopchop.cbu.uib.no/选取敲除位点的N20，设计引物构建pTarget质粒。以pTargetF质粒作为模版，分别用引物对pTarget feaB F和pTarget feaB R，pTarget lpxM F和pTarget lpxM R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约2100bp的片段。PCR扩增体系为：5X SF Buffer 10ul、dNTP Mix(10mM each)1ul、模板pTargetF 20ng、引物(10uM)各2ul、Phanta Super Fidelity DNA Polymerase(南京诺维赞生物科技股份有限公司，产品目录为P501)1ul、蒸馏水34ul，总体积为50ul。扩增条件为：95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、55℃退火20秒、72℃延伸1.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。用DpnI甲基化酶反应约3h后，直接利用化学转化法转化大肠杆菌Fast T1感受态，在含链霉素的LB平板(链霉素浓度为50ug/ml)上筛选阳性克隆，并用引物pTarget cexu F测序验证。测序正确后分别命名为pTarget feaB，pTarget lpxM，所用引物序列如表1所示。
表1pTarget质粒构建引物序列
S3、扩增打靶片段：
(1)以BL21为模板，分别用引物对feaB up500 F和feaB up500 R，feaB down500 F和feaB down500 R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp和500bp的片段；以两个片段的混合物为模板，用引物对feaB up500 F和feaB down500 R进行PCR扩增，得到大小约为1000bp的ΔfeaB打靶片段；
(2)以BL21为模板，分别用引物对lpxM up500 F和lpxM up500 R，GDH F和GDH R，lpxM down500 F和lpxM down500 R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp和500bp的片段；将巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶GDH先进行序列密码子优化，优化过的该葡萄糖脱氢酶GDH的核苷酸如序列SEQ ID No：6所示，以为此优化过的片段为模板，分别用引物GDH F和GDH进行PCR扩增，分别得到大小约为1300bp的片段；以三个片段的混合物为模板，用引物对lpxM up500 F和lpxM down500 R进行PCR扩增，得到大小约为2300bp的lpxM::GDH打靶片段。
上述PCR扩增体系为：5X SF Buffer 10ul、dNTP Mix(10mM each)1ul、模板520ng、引物(10uM)各2ul、Phanta Super Fidelity DNA Polymerase(南京诺维赞生物科技股份有限公司，产品目录为P501)1ul、蒸馏水34ul，总体积为50ul。扩增条件为：95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性10秒、55℃退火20秒、72℃延伸0.5 2分钟(30秒/kb)(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)将打靶片段ΔfeaB，lpxM::GDH分别回收。打靶片段从上游到下游依次包含500bp上游同源臂，替换基因表达盒和500bp下游同源臂，步骤S3打靶片段所用引物序列如表2所示。
表2扩增打靶片段所用引物序列
| 引物名称 | 序列信息 | SEQ ID No： |
| feaB-up500F | gtaacgtaatatcgcctgc | 26 |
| feaB-up500R | cacacaccgacatcacttttccttattatttaccc | 27 |
| feaB-down500F | gaaaagtgatgtcggtgtgtgtacggtatta | 28 |
| feaB-down500R | gattcgtctgttgagtaac | 29 |
| lpxM-up500-F | tgcaccacacagaggtgttg | 34 |
| lpxM::BmGDH-up500-R | acgacgtggtgttagctgtgcatgcttttccagtttcgga | 35 |
| lpxM::BmGDH-down500-F | cgatatcgcaggtgagtactgatctttatcccatcaaata | 36 |
| lpxM-down500-R | ttctaaacaccgtctggacg | 37 |
| GDH-F | cacagctaacaccacgtcgt | 40 |
| GDH-R | agtactcacctgcgatatcg | 41 |
S4、电转化：将200ng pTarget feaB质粒，400ng打靶片段feaB与100μl步骤(S1)制备的电转化感受态细胞混合，置于2mm的电转杯中，2.5kV电击，加入1ml LB液体培养基30℃复苏后涂布在含卡那霉素和链霉素的LB平板上(卡那霉素浓度为50ug/ml，链霉素浓度为50ug/ml)，30℃培养，筛选阳性克隆。用引物对feaB up800 F和feaB down800 R进行PCR扩增，将扩增片段测序验证。
上述PCR扩增体系为：Green Taq Mix 10ul(南京诺维赞生物科技股份有限公司，产品目录为P131)、引物(10uM)各0.8ul、蒸馏水8.4ul、模板菌液0.2ul，总体积为20ul；所述PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟(1个循环)；95℃变性15秒、55℃退火15秒、72℃延伸1 5分钟(60秒/kb)(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
S5、消除pTarget质粒：将测序验证正确的阳性克隆接种在含有0.1mM IPTG和卡那霉素的LB液体培养基中30℃培养过夜以消除pTarget质粒。过夜培养后的菌株在含有卡那霉素的LB固体平板上划线，30℃培养过夜，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BL21ΔfeaB，命名为LC01。
S6、从步骤(S5)的平板上挑取单克隆，制备电转感受态细胞，与pTarget lpxM质粒和lpxM::GDH打靶片段混合,重复步骤(S4)(S5)的步骤，并用引物对lpxM up800 F和lpxMdown800 R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BL21ΔfeaBΔlpxM::GDH，命名为LC02。
S7、消除pCas质粒：将测序验证正确的含有pCas质粒的大肠杆菌突变BL21ΔfeaBΔlpxM::GDH(LC02)接种在LB液体培养基中，37℃培养过夜以消除pCas质粒。将过夜培养后的菌株在LB固体平板上划线，37℃培养过夜培养，得到不含质粒的大肠杆菌突变体BL21ΔfeaBΔlpxM::GDH，简称LC02。所述用于验证和测序的引物序列如下表3所示。
表3用于验证和测序的引物序列
| 引物名称 | 序列信息 | SEQ ID No： |
| feaB-up800F | gaaagtgccgggttattcat | 25 |
| feaB-down800R | cgcttatcgatcacaatatcg | 30 |
| lpxM-up800-F | agccatgcagtggcaaatgg | 33 |
| lpxM-down800-R | gtcatggacgtagcaaacgc | 38 |
实施例2双质粒表达系统的构建
1、第一表达质粒pYs-Aro10-yahk的构建
S1、将酿酒酵母来源的苯丙酮酸脱羧酶Aro10先进行序列密码子优化，优化过的该苯丙酮酸脱羧酶Aro10的核苷酸如序列SEQ ID No：3所示，用引物Aro10-NcoI-F和Aro10-xhoI-R进行PCR扩增获得，获得基因片段苯丙酮酸脱羧酶Aro10；以大肠杆菌BL21的基因组DNA为模板，用yahk-xhoI-F和yahk-EcoRI-R进行PCR扩增获得基因片段乙醇脱氢酶yahK，核苷酸如序列SEQ ID No：4所示。质粒pYs先进行基因合成，质粒pYs的核苷酸序列SEQ ID No:2所示，以pYs载体质粒为模板，用引物如vector-NcoI-R和vector-EcoRI-F经反义PCR扩增，获得载体基因大片段pYs。将回收的Aro10和yahK基因片段与载体大片段用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,SmithHO:Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Methods 2009,6:343 345.)进行连接，连接产物转化Fast T1感受态细胞(南京诺维赞生物科技股份有限公司，产品目录为C505)，涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，设计一对引物(pBAD F和pBAD R)进行PCR验证，正确的克隆送测序。将pYs载体的NcoI和EcoRI位点间的片段替换为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的苯丙酮酸脱羧酶Aro10和乙醇脱氢酶yahk，得到的重组载体命名为pYs-Aro10-yahk。
2.第二表达质粒pA-AAD-GDH的构建
将奇异变形杆菌来源的L-氨基脱氨酶AAD先进行序列密码子优化，优化过的该苯丙酮酸脱羧酶AAD的核苷酸如序列SEQ ID No：5所示，用引物pA-AAD-F和pA-AAD-R进行PCR扩增获得，获得基因片段苯丙酮酸脱羧酶AAD；将巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶GDH先进行序列密码子优化，优化过的该葡萄糖脱氢酶GDH的核苷酸如序列SEQ ID No：6所示，用引物pA-GDH-F和pA-GDH-R进行PCR扩增获得，获得基因片段葡萄糖脱氢酶GDH。质粒pA先进行基因合成，质粒pA的核苷酸序列SEQ ID No:1所示，以pA载体质粒为模板，用引物如pA-vector-F和pA-vector-R经反义PCR扩增，获得载体基因大片段pA。将回收的AAD和GDH基因片段与载体大片段用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,HutchisonCA,3rd,Smith HO:Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat Methods 2009,6:343 345.)进行连接，连接产物转化Fast T1感受态细胞(南京诺维赞生物科技股份有限公司，产品目录为C505)，涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，设计一对引物(pA-CEXU-F和pA-CEXU-R)进行PCR验证，正确的克隆送测序。将pA载体的NcoI和EcoRI位点间的片段替换为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的L-氨基脱氨酶AAD和葡萄糖脱氢酶GDH，得到的重组载体命名为pA-AAD-GDH。
上述表达载体构建过程所使用的引物序列如下表4所示。
表4构建双质粒系统所使用的引物序列
将上述表达载体pYs-Aro10-yahk和pA-AAD-GDH通过化学转化法导入大肠杆菌突变体LC02，得到基因工程菌株，命名为工程菌株LC03。
实施例3酪氨酸为底物全细胞转化合成酪醇的工艺
以得到的工程菌株LC03，通过全细胞催化，以酪氨酸为底物，合成酪醇。将重组突变菌LC03接种到5mL LB液体培养基中，37℃过夜培养，1％的接种量转接25mL新鲜液体ZYM培养基，所述ZYM培养基的组分如下表5所示：
表5ZYM自诱导培养基的组分
同时加入终浓度为50ug/mg的链霉素和100ug/mg氨苄青霉素及2g/L-阿拉伯糖诱导剂，在30℃，220rpm诱导培养16h，收集菌体，将其置于全细胞反应液，全细胞反应液包括：200mM PB buffer(pH 7.5)，5mM MgSO4(MgSO4体系终浓度0.6g/L)，20g/L酪氨酸，10g/L葡萄糖，菌体OD600约为20，30℃，220rpm催化20h，适当时间收集发酵液，离心取上清，将其用作高效液相色谱分析。其中高效液相所用色谱柱为Shim-pack GIS 5μm C18 4.6×250mm(HSS)，所用流动相为：A(0.1％乙酸)：B(甲醇)＝80：20，检测器波长：276nm，运行方式：等度洗脱，运行时间：18min；高效液相色谱检测酪醇所用检测器为紫外检测器，所用条件洗脱流速为1ml/min，检测波长为276nm，柱温：35℃。
在该工艺条件下，以20g/L为底物，经全细胞催化，20h可产酪醇最高产14.324g/L，酪氨酸转化率可达71.5％。
对比例1
调整反应体系中阿拉伯糖诱导剂的终浓度为0.5g/L，其余诱导及全细胞催化方法及条件同实施例3。L-阿拉伯糖诱导剂浓度降低至0.5g/L时，以20g/L为底物，经全细胞催化，20h可产酪醇最高产14.551/L，酪氨酸转化率可达71.3％。
对比例2
调整反应体系中阿拉伯糖诱导剂的终浓度为1.0g/L，其余诱导及全细胞催化方法及条件同实施例3。L-阿拉伯糖诱导剂浓度降低至1.0g/L时，以20g/L为底物，经全细胞催化，20h可产酪醇最高产14.254/L，酪氨酸转化率可达71.2％。
对比例3
调整全细胞催化时反应温度为25℃，其余诱导及全细胞催化方法及条件同实施例3。在该条件下，以20g/L为底物，经全细胞催化，20h可产酪醇最高产12.596g/L，酪氨酸转化率可达62.9％。
对比例4
调整全细胞催化时反应温度为37℃，其余诱导及全细胞催化方法及条件同实施例3。在该条件下，以20g/L为底物，经全细胞催化，20h可产酪醇最高产17.682g/L，酪氨酸转化率可达88.4％。
对比例5IPTG作为诱导剂
获取IPTG诱导的质粒组：pRSFduet-Aro10-yahk，pETduet-AAD-GDH，通过化学转化法导入大肠杆菌突变体LC02，得到基因工程菌株，命名为工程菌株LC03-I。以得到的工程菌株LC03-I，通过全细胞催化，以酪氨酸为底物，合成酪醇。将重组突变菌LC03-I接种到5mLLB液体培养基中，37℃过夜培养，以1％的接种量转接25mL新鲜液体ZYM培养基，LC03-I加入终浓度为50ug/mg的卡那霉素和100ug/mg氨苄青霉素，加入终浓度为0.2mM/的IPTG诱导剂。在30℃，220rpm诱导培养16h，收集菌体，将其置于全细胞反应液(200mM PB buffer(pH7.5)，5mM MgSO4，20g/L酪氨酸，10g/L葡萄糖)中，使其OD600约为20，37℃，220rpm催化20h，适当时间收集发酵液，离心取上清，将其用作高效液相色谱分析。高效液相色谱分析方法同实施例3。以IPTG为诱导剂，终浓度为0.2mM/L时，以20g/L为底物，经全细胞催化，20h可产酪醇最高产12.024/L，酪氨酸转化率可达60.1％。
综上所述，本发明提供的高效生产酪醇方法及其工程菌株，以L-酪氨酸为底物，经大肠杆菌突变体经廉价诱导剂L-阿拉伯糖诱导蛋白表达后进行全细胞催化生成酪醇，一方面无需辅酶及外源添加还原力，另一方面反应具备反应路径短，可短时间内快速积累产物，在一定程度上降低产物的生物毒性的影响，明显提高菌种密度和生产强度，具有成本低，工艺简单，绿色环保且产品纯度高等优点。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种生产酪醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)工程菌株的活化：接种工程菌株至培养基，向培养基中加入L-阿拉伯糖进行诱导表达，结束后得到发酵液，收集发酵液中的活化工程菌株；
(2)全细胞催化：取步骤(1)的活化工程菌株加入全细胞反应液进行全细胞催化，结束后收集反应液，离心反应液后取上清，分离得到酪醇；
所述全细胞催化的底物为酪氨酸；所述工程菌株为双质粒表达系统和大肠杆菌突变体的重组大肠杆菌；所述双质粒表达系统包括表达苯丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的pYs-Aro10-yahk质粒和表达L-氨基脱氨酶和葡萄糖脱氢酶的pA-AAD-GDH质粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述L-阿拉伯糖在诱导表达体系中的终浓度为0.5-2.0g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养基为ZYM自诱导培养基。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述全细胞反应液包括150-200mmol/L PB buffer，4-6mmol/L MgSO4，15-25g/L酪氨酸，5-15g/L葡萄糖。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌株的制备方法包括：将双质粒表达系统中的pYs-Aro10-yahk质粒和pA-AAD-GDH质粒通过化学转化法导入大肠杆菌突变体，得到工程菌株。
6.权利要求1-5任一项所述的生产酪醇的方法中的大肠杆菌突变体，其特征在于，所述大肠杆菌突变体中不含feaB基因和lpxM基因；所述大肠杆菌突变体中包括GDH基因；所述大肠杆菌突变体的品种为大肠杆菌BL21；所述大肠杆菌突变体的基因型为E.coli BL21ΔfeaB,ΔlpxM::GDH。
7.如权利要求6所述的大肠杆菌突变体，其特征在于，所述大肠杆菌突变体的制备方法为：在大肠杆菌BL21中，用CRISPR技术敲除feaB基因，同时替换lpxM基因为表达GDH基因的119-GDH-rrnB基因片段，完成大肠杆菌突变体的制备。
8.权利要求1-5任一项所述的生产酪醇的方法中的双质粒表达系统，其特征在于，所述双质粒系统包括表达苯丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的pYs-Aro10-yahk质粒和表达L-氨基脱氨酶和葡萄糖脱氢酶的pA-AAD-GDH质粒。
9.如权利要求8所述的双质粒表达系统，其特征在于，所述pYs-Aro10-yahk质粒的载体为pYs载体，pYs载体的核酸序列如SEQ ID No:2所示，所述pA-AAD-GDH质粒的载体为pA载体，pA载体的核酸序列如SEQ ID No:1所示。
10.权利要求1-7任一项所述的生产酪醇的方法在制药、食品和化工领域的应用。
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