CN106701844B - 克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法。以木糖为原料，克雷伯氏肺炎杆菌可以在好氧条件下将木糖转化成木糖酸。进一步，利用葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌转化木糖生产木糖酸，可以提高木糖到木糖酸的转化率。进一步，利用两段发酵法，在发酵的第一个阶段维持发酵液处于中性pH条件，第二阶段发酵液处于酸性发酵条件，发酵生产木糖酸，具有较高的底物转化率，较高的生产强度和较高的产物终浓度。利用葡萄糖和木糖混合物为原料，可以同时生产葡萄糖酸和木糖酸。

Description

克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法。

背景技术

木糖是半纤维素的主要组成单体，木糖的利用是最近几十年大家关注的一个热点。木糖酸是木糖的一个衍生物，木糖酸与葡萄糖酸结构相似，性质也相似，在很多应用方面可以替代葡萄糖酸。木糖酸是生产1,2,4-丁三醇以及共聚多酰胺的原料。另外，木糖酸还可应用于混凝土添加剂，其减水效果比葡萄糖酸更好。

木糖酸生产多数以木糖为原料通过化学或生物合成方法生产。化学法生成木糖酸主要通过催化剂氧化合成，如在强碱环境下，以甲醇作为溶剂用碘氧化木糖，得到木糖酸盐。也有研究人员用含钯的催化剂，催化木糖氧化为木糖酸。在贵金属催化剂催化下，木糖通过电氧化也可以生成木糖酸。

木糖酸也可以通过生物合成法进行生产。利用乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslacti)表达外源木糖脱氢酶，可以利用40g/L的木糖生产19g/L的木糖酸(MetabolicEngineering13(2011)383–391)。利用酿酒酵母，表达外源木糖脱氢酶，23g/L木糖可以生成17g/L木糖酸。利用莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)和氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)可以利用含有10％木糖的培养基转化成木糖酸，转化率到理论值的95％(Applied Microbiology and Biotechnolgy(1988)28:367--372)。利用大肠杆菌表达外源木糖脱氢酶，可以利用40g/L的木糖生产39.2g/L的木糖酸(BioresourceTechnology 115(2012)244–248)。利用Gluconobacter oxydans细胞进行催化反应，可以合成586g/L的木糖酸(Biochemical Engineering Journal 93(2015)196–199)。

克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，可用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、葡萄糖酸、乙偶姻等生产。克雷伯氏肺炎杆菌在细胞周质空间存在一条葡萄糖氧化途径，可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，进而氧化成2-酮基葡萄糖酸，葡萄糖酸和2-酮基葡萄糖酸转运进胞内形成其他代谢产物。目前，还未见利用克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产木糖的相关报道。

发明内容

本发明的目的是，提供一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明提供一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法，该方法将克雷伯氏肺炎杆菌接种到含有木糖的培养基中，在好氧条件下培养，克雷伯氏肺炎杆菌可以将培养基中的木糖转化成木糖酸。

优选地，将葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌接种到含有木糖的培养基中，在好氧条件下培养，转化木糖生产木糖酸。

优选地，所述克雷伯氏肺炎杆菌或葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌在好氧条件下培养生产木糖酸时，第一个阶段控制发酵培养基的pH处于中性条件，使得菌体大量生长，待菌体生长到一定浓度后；再将发酵培养的pH调整到酸性条件，酸性条件下菌体生长受到抑制，使得大量木糖转化成木糖酸。

进一步优选地，所述好氧条件培养生产木糖酸的条件为：溶解氧大于1％，发酵温度25-45℃，第一个阶段控制发酵培养基的pH值为6-8，使得菌体大量生长，待菌体生长到一定浓度，将发酵培养的pH值调整到4-6，菌体生长受到抑制，使大量木糖转化成木糖酸。

优选地，发酵生产木糖酸的培养基组成包括：葡萄糖0-100g/L，木糖5-200g/L，氮源0.5-50g/L，无机盐0-10g/L。所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐；所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

所述葡萄糖脱氢酶是指位于细胞周质空间的葡萄糖酸脱氢酶，催化周质空间的葡萄糖酸氧化生成2-酮基葡萄糖酸。该酶蛋白由三个亚基组成，三个亚基的编码基因相邻，其在克雷伯氏肺炎杆菌342(Klebsiella pneumoniae 342)中基因阅读框如SEQ ID NO.1所示，其中1-756为葡萄糖酸脱氢酶亚基III基因阅读框，759-2543为葡萄糖酸脱氢酶黄素蛋白亚基编码基因，2554-3894为葡萄糖酸脱氢酶细胞色素C亚基编码基因。

所述葡萄糖酸脱氢酶的失活通过葡萄糖酸脱氢酶编码基因中的一个或多个基因失活来实现。

所述基因失活利用基因重组方法对一个基因或几个基因同时进行重组失活。

本发明还提供了克雷伯氏肺炎杆菌同时生产木糖酸和葡萄糖酸的方法。该方法是：将克雷伯氏肺炎杆菌接种到含有木糖和葡萄糖的培养基中，在好氧条件下培养，将木糖转化成木糖酸，同时将葡萄糖转化成葡萄糖酸。

优选地，将葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌接种到含有木糖和葡萄糖的培养基中，在好氧条件下培养，转化木糖生产木糖酸，同时将葡萄糖转化成葡萄糖酸。

优选地，将野生型克雷伯氏肺炎杆菌或葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌接种到含有木糖和葡萄糖的培养基中，在好氧条件下培养，第一个阶段控制发酵培养基的pH处于中性条件，使得菌体大量生长，待菌体生长到一定浓度，将发酵培养的pH调整到酸性条件，菌体生长受到抑制，大量木糖转化成木糖酸，同时大量葡萄糖转化成葡萄糖酸。

进一步优选地，将野生型克雷伯氏肺炎杆菌或葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌接种到含有木糖和葡萄糖的培养基中，好氧培养条件为：溶解氧大于1％，发酵温度25-45℃，第一个阶段控制发酵培养基的pH处于6-8，使得菌体大量生长，待菌体生长到一定浓度，将发酵培养的pH调整到4-6，菌体生长受到抑制，大量木糖转化成木糖酸，同时大量葡萄糖转化成葡萄糖酸。

发酵培养基的组成包括：葡萄糖5-100g/L，木糖5-200g/L，氮源0.5-50g/L，无机盐0-10g/L。所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐；所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明利用克雷伯氏肺炎杆菌在好氧条件下发酵培养，将培养基中的木糖转化成木糖酸，利用葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌在好氧条件下转化木糖生产木糖酸。利用两段pH控制发酵工艺，第一阶段先进行菌体生长，第二阶段再大量转化木糖生产木糖酸。当培养基中同时含有葡萄糖和木糖时，利用克雷伯氏肺炎杆菌在好氧培养条件下，可以同时合成葡萄糖酸和木糖酸。本发明提供的方法中，木糖转化成木糖酸转化率高，产物终浓度高，生产强度大。木糖和葡萄糖混合物可以同时转化成葡萄糖酸和木糖酸，转化率高，产物终浓度高，生产强度大。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1

利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌葡萄糖酸脱氢酶基因进行失活，来实现葡萄糖脱氢酶活性失活。

本实施例中的克雷伯氏肺炎杆菌采用编号CGMCC 1.6366的菌株(该菌株也称为TUAC01或AC01)，CGMCC 1.6366的菌株已经在授权发明专利ZL201210093993中公开，另外在公开文献(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinase assisted genereplacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:1219–1226)中也已经公开该菌株。该菌株是一株用于生产1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。该菌分离自土壤，分离过程及性状描述见公开文献(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganismsable to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal ofMicrobiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。

对克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366菌株的葡萄糖酸脱氢酶基因进行失活的步骤如下：

1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌葡萄糖酸脱氢酶部分基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。

克雷伯氏肺炎杆菌342是一株用于固氮研究的克雷伯氏肺炎杆菌，其全基因组已经测序，并且提交到了genebank。根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，其中葡萄糖酸脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.1所示，其中1-756为葡萄糖酸脱氢酶亚基III基因阅读框，759-2543为葡萄糖酸脱氢酶黄素蛋白亚基编码基因，2554-3894为葡萄糖酸脱氢酶细胞色素C亚基编码基因。根据该基因序列设计PCR引物，上游引物gad-s1序列为：CTACATGTACTCCAAAGCCTCGCCGAACGT(SEQ ID NO.2所示)，下游引物gad-a1序列为：GGCGCAGTTATCAACGTACAGCGCGGCGCC(SEQ ID NO.3所示)。

通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得葡萄糖酸脱氢酶部分基因序列，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-gad1质粒，该质粒上连接有来自克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的葡萄糖酸脱氢酶部分基因，序列测定结果如SEQ ID NO.4所示。所述pMD18T-gad1质粒中1-935的序列为葡萄糖酸脱氢酶黄素蛋白亚基编码基因部分序列，946-2036为葡萄糖酸脱氢酶细胞色素C亚基编码基因部分序列。

2)利用步骤1克隆到的基因，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

本步骤中的操作，采用在大肠杆中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-gad1质粒进行同源重组，获得pMD18T-gad1质粒上重组缺失的部分序列，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长同源臂的DNA片段，该片段两侧连有葡萄糖酸脱氢酶基因同源的序列，中间连接抗性盒。

本步骤操作原理和使用的质粒和菌株等材料可参见(Wei et.al.Redrecombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具体步骤如下：

a.pMD18T-gad1质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-gad1。

b.设计引物gad-s2和gad-a2，其中gad-s2序列为：GGGCAGCAAATGGAAAGCGGCGGTGGCCGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.5所示)，gad-a2序列为：ACAGCGGCCACGGGATGTCGGTGTCCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.6所示)。

利用引物gad-s2和gad-a2，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A。该片段的两端分别具有与gad基因序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段A转化DH5α-pMD18T-gad1感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。

DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-gad1上的gad同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-Δgad2质粒。

d.利用引物gad-s1(SEQ ID NO.2所示)和gad-a1(SEQ ID NO.3所示)，以pMD18T-Δgad2质粒为模板进行PCR扩增，获得2.4Kb的DNA片段B。

DNA片段B两端分别具有gad基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上gad基因重组的线性DNA片段。

3)利用电击转化法将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中，DNA片段B与染色体上的葡萄糖酸脱氢酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体葡萄糖酸脱氢酶小亚基重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，将转化有pDK6-red质粒的CGMCC 1.6366命名为CGMCC 1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株即为葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株，将其命名为Kp-gad^-，该菌株的葡萄糖酸脱氢酶黄素蛋白亚基和细胞色素C亚基基因通过同源重组而失活。

实施例2

将野生型菌株克雷伯氏肺炎杆菌和实施例1中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-进行摇瓶批次发酵实验。

将野生型菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和实施例1中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml木糖酸发酵培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温25℃进行好氧发酵培养。

发酵培养基组分为：木糖5g/L，玉米浆0.5g/L，碳酸钙1g每瓶。

培养24小时，测定发酵液中组分。采用液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测。流动相0.05mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱60℃。木糖酸和木糖酸盐在本发明中不做区分，以木糖酸计。各菌株发酵结果如表1所示。

表1，摇瓶发酵实验中各菌株的发酵数据结果

菌株	木糖(g/L)	木糖酸(g/L)	乙酸(g/L)
				CGMCC 1.6366	0	2.5	0.5
Kp-gad<sup>-</sup>	0	3.6	0.1

从表1的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和Kp-gad^-均可利用木糖好氧培养合成木糖酸，并产生少量的副产物乙酸。

实施例3

将野生型菌株克雷伯氏肺炎杆菌和实施例1中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-进行摇瓶批次发酵实验

将野生型菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和实施例1中获得的Kp-gad^-分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml葡萄糖和木糖混合物的发酵培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温45℃进行好氧发酵培养。

培养基组分为：葡萄糖10g/L,木糖5g/L，酵母提取物0.5g/L，碳酸钙1g每瓶。

培养24小时，测定发酵液中组分。采用实施例2中的方法检测产物。葡萄糖酸和葡萄糖酸盐在本发明中不做区分、木糖酸和木糖酸盐在本发明中不做区分，都以葡萄糖酸、木糖酸计。各菌株发酵结果如表2所示。

表2，摇瓶发酵实验中各菌株的发酵数据结果

从表2的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366可利用木糖和葡萄糖混合物好氧培养合成木糖酸、葡萄糖酸和2-酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-可利用葡萄糖和木糖合成高水平的葡萄糖酸和木糖酸，并产生少量乙酸。

实施例4

将野生型菌株克雷伯氏肺炎杆菌和实施例1中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和Kp-gad^-接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L，碳酸钙1g每瓶。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，发酵培养基组成为：木糖200g/L，蛋白胨50g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。

发酵过程保持溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度的1％，发酵温度50℃，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在6.0，发酵培养1小时后将发酵液的pH控制在4.0，发酵48小时结束，采用实施例2方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表3所示。

表3，5L发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果

菌株	木糖(g/L)	木糖酸(g/L)	乙酸(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
					CGMCC 1.6366	50	123	9	7
Kp-gad<sup>-</sup>	30	162	3	2

从表3的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366利用高浓度木糖速率较慢，葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-利用高水平木糖速率快，均主要合成木糖酸，以及少量乙酸。

实施例5

将野生型菌株克雷伯氏肺炎杆菌和实施例1中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和Kp-gad^-接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L，碳酸钙1g每瓶。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，木糖60g/L，玉米浆5g/L，豆饼粉10g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。

发酵过程保持溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度的1％，发酵温度40℃，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在8.0，发酵培养10小时后将发酵液的pH控制在6.0，发酵24小时结束，采用实施例2方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表4所示。

表4，5L发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果

从表4的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366可以利用含有葡萄糖和木糖的培养基发酵生产葡萄糖酸和木糖酸。葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-能够利用含有葡萄糖和木糖的培养基生产高水平的葡萄糖酸和木糖酸。两株菌都合成少量乙酸和2,3-丁二醇。

实施例6

将野生型菌株克雷伯氏肺炎杆菌和实施例1中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和Kp-gad^-接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L，碳酸钙1g每瓶。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，木糖200g/L，酵母提取物10g/L，尿素5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。

发酵过程保持溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度的10％，发酵温度35℃，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在7.0，发酵培养5小时后将发酵液的pH控制在5.0。

发酵25小时结束，采用实施例2方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表5所示。

表5，5L发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果

从表5的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366可以利用含有葡萄糖和木糖的培养基发酵生产葡萄糖酸和木糖酸。葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-能够利用含有葡萄糖和木糖的培养基生产高水平的葡萄糖酸和木糖酸。两株菌都合成少量乙酸和2,3-丁二醇。

实施例7

将野生型菌株克雷伯氏肺炎杆菌和实施例1中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和Kp-gad^-接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L，碳酸钙1g每瓶。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，发酵培养基组成为：木糖200g/L，玉米浆5g/L，硫酸铵8g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁4g/L。

发酵过程保持溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度的1％，发酵温度35℃，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在6.5，发酵培养4小时后将发酵液的pH控制在5.5。

发酵20小时结束，采用实施例2方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表6所示。

表6，5L发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果

从表6的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366可以利用含有木糖的培养基发酵生产木糖酸。葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-能够利用含有木糖的培养基生产高水平的木糖酸。

实施例8

将野生型菌株克雷伯氏肺炎杆菌和实施例1中获得的葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366和Kp-gad^-接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L，碳酸钙1g每瓶。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，发酵培养基组成为：木糖100g/L，硝酸钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁4g/L。

发酵过程保持溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度的1％，发酵温度35℃，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在7.5，发酵培养8小时后将发酵液的pH控制在4.5。

发酵36小时结束，采用实施例2方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表7所示。

表7，5L发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果

从表7的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366可以利用含有木糖的培养基发酵生产木糖酸，葡萄糖酸脱氢酶活性消除的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Kp-gad^-能够利用含有木糖的培养基生产高水平的木糖酸。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法

<130> 2015

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3894

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎杆菌342

<400> 1

atgatgtcga gcgagaaaac caacaattcc aggcgtgatt tcctggtgaa atcgatggcg 60

ctgatcccga cggtggtgat cggcggcgcg ggagcagggg ccattggcgt ggccaccagc 120

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atctgtcgaa aagcactgtc accatccggc ataacaccag ccagcaggcg gtgccgtatc 1020

gccagctggc ggccttcctg ccgggtaccg gcgtgggcgg cgccgggctg cactggtccg 1080

gcgtgcattt ccgcgtcgat cccatcgaac tgcggatgcg cagccactat gaagaacgct 1140

acggcaaaaa cttcattccc caggatatga tcatccagga tttcggtgtc acctacgacg 1200

agctggaacc gttcttcgat aaagcggaaa aagtgttcgg cacctccggg accgcctggt 1260

cgatcaaagg caaggtggtc ggcaaaggcc gcggcggcaa cgccttcgcc ccggaccgct 1320

cagacgactt cccgctgccg gcgcagaaaa acacctggtc ggcgcagctg tttgaaaaag 1380

cggcgctgga agtggggtat cacccctata acctgccgtc ggccaacact tccgactcct 1440

ataccaaccc ctacggcgcg cagatgggcc cgtgcaactt ctgcggtttc tgcagcggct 1500

acgcctgcta catgtactcc aaagcctcgc cgaacgtgaa catcctgccg gcgctgcgcc 1560

aggaaaaacg ctttgagctg cggaccaacg ccaacgtgct gaaggtcaac ctgaccgacg 1620

acaaatcccg cgccaccggc gtgacctacg tcgacggcca ggggcgcgaa atggaacagc 1680

cggcggacct ggtgattatc ggcgccttcc agttccacaa cgtgcacctg atgctgctct 1740

ccgggatcgg caaaccgtac aatccggaga ccggcgaagg ggtggtgggg cgtaacttcg 1800

cctaccagaa catgaccacc atcaaggcca ttttcgacaa agacacctat accaacccgt 1860

ttatcggcgc gggcggcaac ggcgtcgggg tcgacgactt caacgccgac aacttcgacc 1920

acggcgcggc gggctttgtg ggcggttcgc cattctgggt caaccaggcc gggaccaagc 1980

ccatctccgg tttcccggta ccgccgggca ccccggcgtg gggcagcaag tggaaagcgg 2040

cggttgccga tacctacacc catcacctgt cgatggatgc ccacggcgcg caccagtcct 2100

atcggcagaa ctacctcgat cttgatccga actacaaaaa cgtcttcggc cagccgctgc 2160

tgcgcatgac cttcgactgg caggaaaacg acatcaagat ggcgcagttt atgttcgata 2220

agatggcgcc gatcgccaaa gcgatgaagc cgaaatatat cctcggcagc ccgaaaaacg 2280

ccaacagcca ctttgatacc accacctacc agaccaccca tatgaacggc ggggcggtga 2340

tgggggaaga tccgaaaacc agcgccgtta accgttatct gcaaagctgg gacgtgcata 2400

atgtcttcgt catcggcgcc tccgcgttcc cgcaggggct gggctacaac ccaaccggca 2460

cggtggccgc gctggcctac tggtcagcga aggcgatccg cgagcagtat ctgaaaaatc 2520

cgggacccct ggtgcaggca taaaggaagg cagatgatga aaatgcaatg gttatcggcc 2580

ctggtgcttg gggcattgag ctgcgcggct tttgccgaag aggcgcctgc ggacagcaat 2640

ctgattaagc agggggagta tctggcgcgg gcgggggact gtgtcgcctg ccacaccaac 2700

ggcaaagcgg ggaaaccttt cgccggcggt ttgccgatgg agacgccgat cggcaccatc 2760

tactccacca atatcacgcc ggataaagaa cacggcatcg gcgggtacac cttcgaagag 2820

tttgacgacg cagtgcgtaa gggcgtgcgg aaagacggtt ccacgctcta tccggcgatg 2880

ccgtatccct cgttcgcgcg gatcagtgaa gcggacatgc gcgccatgta cgcctacttt 2940

atgcatggcg tggaaccggt gaatgccgcc aacaaggaca ccgacatccc gtggccgctg 3000

tcgatgcgct ggccgctggc gttctggcgc ggcatcttcg ccccgacgcc gagcgacttt 3060

gtcgccaacc cgcaggttga cccggtgctg gagcgcggcc gctatctggt ggaaggcctg 3120

ggccactgcg gtgcctgcca taccccgcgc agtctgacga tgcaggaaaa agcgctcagc 3180

gaaagcgaag gcgatgatta cctggcgggc agcaatgcgc cgattgacgg ctgggtcgcc 3240

tccagcctgc gcggcgaaaa ccgcgacggt ctggggacct ggagcgaggc tgagctggcc 3300

gagttcctga aaaccggacg caacgataaa tcggtggtct tcggcggcat gagcgatgtg 3360

gtggagcaca gtctgcagta tctttctgat gacgacatca ccgccatcgc ccgctatctg 3420

aagtcgctcc cgccgcgcgg cggcaaacag accccagccc cggtggaaga cagcgtggcg 3480

aaagatctgt ggaagggtaa cgacagtaaa accggcgccg cgctgtacgt tgataactgc 3540

gccgcctgcc accgcaccga cggcgcgggc tataaacgcg ccttcccgtc gctgaagggc 3600

aacccggtgg tacagaccga agatgccact tcgcttatcc atatcgttct gaccgggagc 3660

accacgccgg cggtgaaaga tgcggtctcc aacctgacca tgccgtcgtt cggctggcgt 3720

ctggacgacc agcaggtggc ggatgtggtc aacttcatcc gcaccagctg gggcaacaat 3780

gcgccggcgg tcagcgccag cgatgtggcg aaggtgcgta aggagaccgc ggcgcacgat 3840

gagaaggcgt taggcaacgc cgatatctcg aagctgccgg gggccggaca gtaa 3894

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctacatgtac tccaaagcct cgccgaacgt 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcgcagtta tcaacgtaca gcgcggcgcc 30

<210> 4

<211> 2036

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366

<400> 4

ctacatgtac tccaaagcct cgccgaacgt gaacattctg ccggcgctgc gccaggaaaa 60

acgctttgag ctgcggacca acgccaacgt gctgaaggtc aacctgaccg acgacaaatc 120

ccgtgccacc ggcgtgacct acgtcgacgg ccaggggcgc gaaatggagc agccggcgga 180

cctggtgatc atcggcgcct tccagttcca taacgtgcac ctgatgctgc tctccgggat 240

cggcaaaccc tacaatccgg agaccggcga aggggtggtg gggcgtaact tcgcctacca 300

gaacatgacc accattaagg ccattttcga caaagacacc tacaccaacc cgtttatcgg 360

cgcgggcggc aacggcgtcg gcgtcgacga cttcaacgcc gacaacttcg accacggcgc 420

ggcgggcttt gtcggcggtt cgccgttctg ggtcaaccag gccgggacca agcccatctc 480

cggtttcccg gtaccgccgg gcaccccggc gtggggcagc aaatggaaag cggcggtggc 540

cgatacctac acccatcacc tgtcgatgga tgctcacggc gcgcaccagt cctatcggca 600

gaactacctc gatcttgatc cgaactacaa aaacgtcttt ggccagccgc tgctgcgcat 660

gacctttgac tggcaggaaa acgacatcaa gatggcgcag tttatgttcg ataagatggc 720

gccgatcgcc aaagcgatga agccgaaata tatcctcggc agcccgaaaa acgccaacag 780

ccactttgat accaccacct accagaccac ccatatgaac ggcggggcgg tgatggggga 840

ggatccgaaa accagcgccg ttaaccgtta tctgcaaagc tgggacgtgc ataacgtctt 900

cgtcatcggc gcctccgctt tcccgcaggg gctgggctat aacccaaccg gcacggtggc 960

cgcgctggcg tactggtcag cgaaggcgat ccgcgagcag tatctgaaaa atccgggtcc 1020

cctggtgcag gcataaagga aggcagatga tgaaaatgca atggttatcg gccctggtgc 1080

ttggggcatt gagctgcgcg gccttcgccg aagaggcgcc tgcggacagc aatctgatta 1140

agcaaggaga gtatctggcg cgggcggggg actgtgtcgc ctgccacacc aacggcaaag 1200

cgggcaaacc tttcgccggc ggtctgccga tggaaacgcc gatcggcacc atctactcca 1260

ccaatatcac gccggataaa gaacacggca tcggcgggta caccttcgaa gagttcgacg 1320

acgcggtgcg caagggtgtg cggaaagacg gttccacgct ctatccggca atgccgtatc 1380

cctcattcgc gcggatcagt gaagcggaca tgcgcgccat gtacgcctac tttatgcatg 1440

gcgtggagcc ggtgaatgtc gccaacaagg acaccgacat cccgtggccg ctgtcgatgc 1500

gctggccgct ggcgttctgg cgcggcatct tcgccccgac gccgagcgac tttgtcgcca 1560

acccgcaggt tgacccggtg ctggagcgcg gtcgctatct ggtggaaggc ctgggccact 1620

gcggcgcctg tcataccccg cgtagcctga cgatgcagga aaaagcgctc agcgaaagcg 1680

aaggcgatga ttacctggcg ggcagcaatg cgccgattga cggctgggtc gcctccagcc 1740

tgcgcggcga aaatcgcgac ggtctgggga cctggagcga agccgagctg gctgagttcc 1800

tgaaaaccgg acgtaacgat aaatcggtgg tcttcggcgg catgagcgat gtggtggagc 1860

acagtctgca gtatctctct gatgacgaca tcaccgccat cgcccgctat ctgaagtcgc 1920

tcccgccgcg cggcggcaaa cagaccccag ccccggtgga agacagcgtg gcgaaagatc 1980

tgtggaaggg taacgacagc aaaaccggcg ccgcgctgta cgttgataac tgcgcc 2036

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggcagcaaa tggaaagcgg cggtggccga ttccggggat ccgtcgacc 49

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acagcggcca cgggatgtcg gtgtccttgt gtaggctgga gctgcttc 48

Claims (8)

1.一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法，该方法包括如下步骤：将克雷伯氏肺炎杆菌接种到含有木糖的培养基中，在好氧条件下培养，克雷伯氏肺炎杆菌将木糖转化成木糖酸；好氧条件培养过程中，第一阶段控制发酵液pH处于中性条件，第二阶段控制发酵液pH处于酸性条件；所述第一阶段控制发酵液pH值为6-8，第二阶段控制发酵液pH值为4-6。

2.如权利要求1所述的一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法，其特征在于：所述克雷伯氏肺炎杆菌为处于细胞周质空间内膜上的葡萄糖酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

3.如权利要求1所述的一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法，其特征在于：所述培养基中还含有葡萄糖，在好氧条件下培养，木糖转化成木糖酸的同时，葡萄糖转化成葡萄糖酸。

4.如权利要求1-3任一项所述的一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法，其特征在于，所述培养条件为：将克雷伯氏肺炎杆菌接种到培养基中，发酵温度为25-50℃，保持发酵过程中溶解氧浓度大于饱和溶氧的1％，第一阶段控制发酵液pH值为6-8，培养时间为1-10小时，第二阶段控制发酵液pH值为4-6。

5.如权利要求1-3任一项所述的一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成包括：葡萄糖0-100g/L，木糖5-200g/L，氮源0.5-50g/L，无机盐0-10g/L。

6.如权利要求5所述的一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法，其特征在于：所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐；所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

7.如权利要求2所述的一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖酸脱氢酶失活通过葡萄糖酸脱氢酶基因失活来实现。

8.如权利要求2所述的一种克雷伯氏肺炎杆菌生产木糖酸的方法，其特征在于：所述的葡萄糖酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。