CN109022505B - 一种利用木糖为原料生产乙二醇和乙醇酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用木糖为原料生产乙二醇和乙醇酸的方法。该方法中，利用木糖为原料通过酶转化法或发酵转化法生成木糖酸，利用阴沟肠杆菌和大肠杆菌以木糖酸为底物，在中性pH及好氧条件下发酵生产乙醇酸和乙二醇。本发明采用的两种生产菌株为野生型菌，遗传稳定性高，生长力顽强。这两种菌株生产乙醇酸和乙二醇具有生产过程简便、底物转化率高、副产物含量低等优点，具有很好的应用价值和经济效益。

Description

一种利用木糖为原料生产乙二醇和乙醇酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及将木糖转化成木糖酸，再以阴沟肠杆菌或者大肠杆菌为生产菌株利用木糖酸为碳源生产乙醇酸和乙二醇。
背景技术
木糖是继葡萄糖之后自然界中含量第二丰富的单糖，其主要应用是作为生产糠醛的原料。木糖也可以作为微生物生长所使用的碳源，但是多数微生物利用木糖为碳源的生长情况不如利用葡萄糖好。如何高效利用木糖是国际上一个研究热点。木糖酸是木糖的氧化产物，木糖酸的主要应用是作为酯类的生产原料和作为螯合剂。
乙醇酸又名羟基乙酸，是一种结构较小的α羟基酸，同时包含了羟基和羧基两个基团，兼有醇与酸的双重性。乙醇酸主要用于皮肤护理以及个人护理产品，是疗效较好的去除死皮和汗毛药剂，可合成抗皮肤衰老、美白化妆品原料果酸，可以达到保湿、滋润肌肤、促进表皮更新的功效；此外，乙醇酸的分子量非常小，它可以有效地渗透皮肤毛孔，在短时间内解决皮肤老化，皱纹，黑斑，暗疮等问题。乙醇酸也可以用于制作染料、皮革等。乙醇酸还可以用作食品添加剂、清洁剂、生物相容性高分子聚合物的合成前体等，例如70％的乙醇酸溶液主要用作清洁剂，2％的乙醇酸和1％的甲酸混合酸是一种效率高、成本低的清洗剂，可以用作空调、锅炉、电厂输送管道、冷凝器、热交换器等的主要清洗原料。
在自然界中，甘蔗和甜菜中均含有一定量的乙醇酸，但是含量较低，且与其它物质共存，难以分离提纯，工业生产都采用合成法。目前，乙醇酸的合成主要是以化石燃料作为底物，通过合成气羧基化醛基而得到。化学法合成乙醇酸时会掺杂进一定量的未羧基化的醛基，该类化学物质对人体有害，因此其产品应用范围较窄。
乙二醇是最简单的二元醇，是一种重要的有机化工原料，在化学工业中应用广泛，可作为防冻剂、润滑剂、增塑剂、聚酯纤维、不饱和聚酯树脂、表面活性剂等的生产原料。近年来随着聚酯工业的迅猛发展，乙二醇的需求量在不断增加。国际上乙二醇生产都采用直接水合法亦称加压水合法的工艺路线。
目前，还未见利用野生型微生物生产乙醇酸和乙二醇的报道，常见的生物法合成乙醇酸和乙二醇的方式是以大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或其他微生物作为宿主，在细胞中构建乙二醇或乙醇酸合成途径，利用木糖或葡萄糖等为碳源发酵生产乙醇酸和乙二醇。
阴沟肠杆菌在自然界中广泛存在，是一种重要的工业微生物，具有生长力旺盛，耐受能力强，培养条件简单以及可利用的碳源广泛等特点。目前，已有报道利用阴沟肠杆菌发酵生产乙偶姻、2,3-丁二醇、双乙酰等化学品。
发明内容
本发明的目的是，提供了一种利用木糖为原料生产乙二醇和乙醇酸的方法。
本发明中木糖酸与木糖酸盐不做区分，统一以木糖酸计。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
1)利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为复合催化剂，转化木糖生产木糖酸。
转化过程为：将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶与木糖配制成反应液，其中木糖浓度10-500g/L，葡萄糖氧化酶添加量为2000-50000单位每千克木糖，过氧化氢酶添加量为40000-2000000单位每千克木糖，保持温度为25-50℃，通空气，搅拌，通过自动补碱控制反应液pH值稳定在4.5-7。木糖被氧化成木糖酸。
优选的条件为：将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶与木糖配制成反应液，其中木糖浓度50-200g/L，葡萄糖氧化酶添加量为4000-25000单位每千克木糖，过氧化氢酶添加量为80000-1000000单位每千克木糖，保持温度为30-45℃，通空气，搅拌，通过自动补碱控制反应液pH值稳定在5-6.5。木糖被氧化成木糖酸。
2)利用克雷伯氏肺炎杆菌转化木糖生产木糖酸的方法。
其过程为：以克雷伯氏肺炎杆菌为生产菌株，在供氧条件下，转化木糖生产木糖酸。
发酵培养基的组成包括：木糖10-100g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-10g/L。
发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度25-45℃，保持发酵过程中溶解氧浓度大于饱和溶氧的1％，首先控制发酵液pH值为6-8，培养1-10小时进行菌体生长，再将发酵液pH值调整为4-6，菌体将木糖转化成木糖酸。
3)木糖酸转化成乙醇酸及乙二醇的方法为：以木糖酸为碳源配制培养基，以阴沟肠杆菌或大肠杆菌为生产菌株，在好氧条件下培养菌株，菌株将木糖酸转化成乙二醇和乙醇酸。
以木糖酸为碳源通过微生物发酵生产乙二醇和乙醇酸的方法，其特征在于：将阴沟肠杆菌或大肠杆菌接种到发酵培养基中，发酵温度为25℃-45℃，发酵过程中充足供氧，维持发酵液的pH值在5-8之间。通过培养，菌体将木糖酸转化成乙二醇和乙醇酸。
优选地，以木糖酸为碳源通过微生物发酵生产乙二醇和乙醇酸的方法，发酵条件为：将阴沟肠杆菌或大肠杆菌接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6-7之间。
优选地，以木糖酸为碳源通过微生物发酵生产乙二醇和乙醇酸的方法：发酵过程中待木糖酸消耗至1-20g/L时流加高浓度木糖酸进行补料发酵。
所述发酵培养基的组成包括：木糖酸10-150g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-20g/L。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
利用克雷伯氏肺炎杆菌转化木糖生产木糖酸，或利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为复合催化剂转化木糖为木糖酸的方法具有高的生产强度和高的转化率。阴沟肠杆菌或大肠杆菌利用木糖酸作为碳源进行发酵培养时，木糖酸在胞内代谢生成乙醇酸及乙二醇，并在发酵液中积累，具有高的转化率和高的生产强度。本发明提供的方法，生产菌株均为野生型菌株，菌体生长力顽强，遗传稳定性高，无转基因带来的生物安全性问题。总体上本发明提供的方法生产乙醇酸和乙二醇工艺路线简单，具有较高的底物转化率，较低的副产物含量，生产成本低，具有很好的应用价值和经济效益。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案。本发明中所用的原料和试剂均市售可得。
实施例1
利用雷伯氏肺炎杆菌转化木糖生产木糖酸。
将克雷伯氏肺炎杆菌接种到250mL锥形瓶中，内装有50mL种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：木糖50g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。
种子培养12小时后，接种到5L发酵罐中，内装有3L发酵培养基，保持发酵过程溶解氧浓度大于饱和溶解氧浓度1％，发酵温度35℃，控制pH 6，培养5小时。调整控制发酵液pH值稳定在5，利用氨水溶液中和产生的酸，发酵12小时结束，木糖酸含量51g/L。离心去除菌体，上清液经过阴离子交换树脂交换，氨水洗脱收集目的组分，溶液浓缩后结晶获得木糖酸铵盐，经过鉴定纯度大于99％。该结晶作为后续的乙醇酸和乙二醇生产的原料。
实施例2
利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为复合催化剂，催化木糖转化生产木糖酸。
将葡萄糖氧化酶按照2000单位每千克木糖，过氧化氢酶按照40000单位每千克木糖的酶活比例加入到5L反应中，内装有10g/L木糖溶液3L。反应温度25℃，转化过程通空气，并搅拌，使用氨水维持转化过程的pH值在4.5，转化5小时结束，获得10g/L木糖酸。
将获得的木糖酸溶液作为后续的乙醇酸和乙二醇生产的原料。
实施例3
利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为复合催化剂，催化木糖转化生产木糖酸。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为工业级产品。
将葡萄糖氧化酶按照50000单位每千克木糖，过氧化氢酶按照2000000单位每千克木糖的酶活比例加入到5L反应中，内装有500g/L木糖溶液2L。反应温度50℃，转化过程通空气，并搅拌，使用氢氧化钠溶液维持转化过程的pH值在7，转化150小时结束，获得480g/L木糖酸溶液。
将获得的木糖酸溶液作为后续的乙醇酸和乙二醇生产的原料。
实施例4
利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为复合催化剂，催化木糖转化生产木糖酸。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为食品级产品。
将葡萄糖氧化酶按照4000单位每千克木糖，过氧化氢酶按照80000单位每千克木糖的酶活比例加入到5L反应中，内装有50g/L木糖溶液3L。反应温度30℃，转化过程通空气，并搅拌，使用氨水维持转化过程的pH值在5，转化12小时结束，获得50g/L木糖酸。
将获得的木糖酸溶液作为后续的乙醇酸和乙二醇生产的原料。
实施例5
利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为复合催化剂，催化木糖转化生产木糖酸。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为食品级产品。
将葡萄糖氧化酶按照25000单位每千克木糖，过氧化氢酶按照1000000单位每千克木糖的酶活比例加入到5L反应中，内装有200g/L木糖溶液2L。反应温度45℃，转化过程充足供氧，并搅拌，使用氢氧化钾维持转化过程的pH值在6.5，转化40小时结束，获得200g/L木糖酸。
将获得的木糖酸溶液作为后续的乙醇酸和乙二醇生产的原料。
实施例6
以木糖酸为碳源通过微生物发酵生产乙二醇和乙醇酸。
所用大肠杆菌、阴沟肠杆菌、絮凝肠杆菌和克雷伯氏肺炎杆菌均为野生型菌株。
将大肠杆菌、阴沟肠杆菌、絮凝肠杆菌和克雷伯氏肺炎杆菌分别接种到250mL锥形瓶中，其中装有50mL发酵培养基，室温进行摇床发酵培养。
发酵培养基1组分为：木糖酸10g/L，酵母提取物1g/L，碳酸钙1g每瓶。
发酵培养基2组分为：木糖10g/L，酵母提取物1g/L，碳酸钙1g每瓶。
发酵培养基3组分为：葡萄糖酸10g/L，酵母提取物1g/L，碳酸钙1g每瓶。
发酵培养基4组分为：葡萄糖10g/L，酵母提取物1g/L，碳酸钙1g每瓶。
所用木糖酸为实施例1制备的木糖酸铵盐晶体。
培养24小时，测定发酵液中组分。测定采用液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测。流动相为0.05mol/L的稀硫酸溶液，流速0.8mL/min，柱温箱为60℃。发酵结果如表1所示。
表1，摇瓶发酵结果
Figure BDA0001319080360000071
由表1可以看出，大肠杆菌和阴沟肠杆菌利用木糖酸为碳源能合成乙醇酸和乙二醇，阴沟肠杆菌合成水平较大肠杆菌高。絮凝肠杆菌和克雷伯氏肺炎杆菌利用木糖酸为碳源不能合成乙醇酸和乙二醇。大肠杆菌、阴沟肠杆菌、絮凝肠杆菌和克雷伯氏肺炎杆菌利用木糖、葡萄糖、葡萄糖酸为碳源均不合成乙醇酸和乙二醇。
实施例7
以木糖酸为碳源通过微生物发酵生产乙二醇和乙醇酸。
所用大肠杆菌和阴沟肠杆菌均为野生型菌株。
将大肠杆菌和阴沟肠杆菌分别接种到250mL锥形瓶中，其中装有50mL种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：木糖酸150g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。所用木糖酸为实施例3制备的木糖酸溶液。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装有3L发酵培养基，保持发酵过程保持通风和搅拌，发酵温度45℃，发酵过程利用补加氨水溶液使发酵液的pH值稳定在8，发酵72小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。发酵结果如表2所示。
表2，发酵罐发酵结果
菌株 乙醇酸(g/L) 乙二醇(g/L)
阴沟肠杆菌 13.4 22.5
大肠杆菌 6.1 10.8
由表2可以看出，大肠杆菌和阴沟肠杆菌利用木糖酸为碳源在发酵罐中能合成高水平的乙醇酸和乙二醇，阴沟肠杆菌合成水平较大肠杆菌高。
实施例8
以木糖酸为碳源通过微生物发酵生产乙二醇和乙醇酸。
所用大肠杆菌和阴沟肠杆菌均为野生型菌株。
将大肠杆菌和阴沟肠杆菌分别接种到250mL锥形瓶中，其中装有50mL种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：木糖酸50g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钠2g/L，磷酸氢二钠3g/L。所用木糖酸为实施例5制备的木糖酸溶液。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装有3L发酵培养基，保持发酵过程保持通风和搅拌，发酵温度25℃，发酵过程利用补加氢氧化钠溶液使发酵液的pH值稳定在5，发酵48小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。发酵结果如表3所示。
表3，发酵罐发酵结果
菌株 乙醇酸(g/L) 乙二醇(g/L)
阴沟肠杆菌 5.3 10.8
大肠杆菌 2.1 6.3
由表3可以看出，大肠杆菌和阴沟肠杆菌利用木糖酸为碳源在发酵罐中能合成乙醇酸和乙二醇，阴沟肠杆菌合成水平较大肠杆菌高。
实施例9
以木糖酸为碳源通过微生物发酵生产乙二醇和乙醇酸。
所用大肠杆菌和阴沟肠杆菌均为野生型菌株。
将大肠杆菌和阴沟肠杆菌分别接种到250mL锥形瓶中，其中装有50mL种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：木糖酸100g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钠2g/L，磷酸氢二钠3g/L。所用木糖酸为实施例4制备的木糖酸溶液浓缩液。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装有3L发酵培养基，保持发酵过程保持通风和搅拌，发酵温度30℃，发酵过程利用补加氢氧化钠溶液使发酵液的pH值稳定在6，发酵60小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。发酵结果如表4所示。
表4，发酵罐发酵结果
菌株 乙醇酸(g/L) 乙二醇(g/L)
阴沟肠杆菌 9.7 18.6
大肠杆菌 4.4 13.6
由表4可以看出，大肠杆菌和阴沟肠杆菌利用木糖酸为碳源在发酵罐中能合成乙醇酸和乙二醇，30℃培养，菌株具有较高的生产强度。
实施例10
以木糖酸为碳源通过微生物发酵生产乙二醇和乙醇酸。
所用大肠杆菌和阴沟肠杆菌均为野生型菌株。
将大肠杆菌和阴沟肠杆菌分别接种到250mL锥形瓶中，其中装有50mL种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：木糖酸100g/L，蛋白胨3g/L，玉米浆5g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾3g/L。所用木糖酸为实施例4制备的木糖酸溶液浓缩液。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装有3L发酵培养基，保持发酵过程保持通风和搅拌，发酵温度40℃，发酵过程利用补加氨水溶液使发酵液的pH值稳定在7，发酵60小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。发酵结果如表5所示。
表5，发酵罐发酵结果
菌株 乙醇酸(g/L) 乙二醇(g/L)
阴沟肠杆菌 10.4 20.2
大肠杆菌 6.3 13.7
由表5可以看出，大肠杆菌和阴沟肠杆菌利用木糖酸为碳源在发酵罐中能合成乙醇酸和乙二醇，40℃培养，菌株具有较高的生产强度和底物转化率。
实施例11
以木糖酸为碳源通过微生物发酵生产乙二醇和乙醇酸。
所用大肠杆菌和阴沟肠杆菌均为野生型菌株。
将大肠杆菌和阴沟肠杆菌分别接种到250mL锥形瓶中，其中装有50mL种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：木糖酸50g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。所用木糖酸为实施例2制备的木糖酸溶液浓缩液。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装有3L发酵培养基，保持发酵过程通风和搅拌，发酵温度37℃，发酵过程利用补加氨水溶液使发酵液的pH值稳定在7。待培养基中的木糖酸浓度降低到20g/L，补加高浓度木糖酸溶液至木糖酸浓度达到50g/L，共补加3次，发酵60小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。发酵结果如表6所示。
表6，发酵罐发酵结果
菌株 乙醇酸(g/L) 乙二醇(g/L)
阴沟肠杆菌 16.5 32.6
大肠杆菌 10.6 18.4
由表6可以看出，大肠杆菌和阴沟肠杆菌利用木糖酸为碳源在发酵罐中能合成乙醇酸和乙二醇，补料发酵菌株具有较高的生产强度和底物转化率。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

Claims (6)

1.一种利用木糖为原料生产乙二醇和乙醇酸的方法，其特征在于，该方法为：首先将木糖转化为木糖酸，再以木糖酸为碳源通过阴沟肠杆菌和/或大肠杆菌发酵生产乙二醇和乙醇酸。
2.一种木糖酸为碳源发酵生产乙二醇和乙醇酸的方法，其特征在于，该方法为：以木糖酸为碳源，以阴沟肠杆菌和/或大肠杆菌为生产菌株，在好氧条件下发酵培养菌株，将木糖酸转化成乙二醇和乙醇酸。
3.如权利要求1所述的利用木糖为原料生产乙二醇和乙醇酸的方法，其特征在于，所述将木糖转化为木糖酸的方法为：以木糖为原料，利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为复合催化剂，将木糖转化为木糖酸；或者，以木糖为碳源，利用克雷伯氏肺炎杆菌发酵培养，将木糖转化为木糖酸。
4.如权利要求2所述的木糖酸为碳源发酵生产乙二醇和乙醇酸的方法，其特征在于：将阴沟肠杆菌和/或大肠杆菌接种到发酵培养基中，发酵温度为25℃-45℃，发酵过程中通风，维持发酵液的pH值在5-8之间。
5.如权利要求2所述的木糖酸为碳源发酵生产乙二醇和乙醇酸的方法，其特征在于：将阴沟肠杆菌和/或大肠杆菌接种到发酵培养基中，发酵温度为30℃-40℃，发酵过程中通风，维持发酵液的pH值在6-7之间。
6.如权利要求2所述的木糖酸为碳源发酵生产乙二醇和乙醇酸的方法，其特征在于：发酵过程中待木糖酸消耗至1-20g/L时，流加木糖酸进行补料发酵。
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