CN114686529B - 一种丙酮生物加氢制备异丙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丙酮生物加氢制备异丙醇的方法，包括（1）制备生物催化剂：配置含氮源、无机盐和维生素的营养液，灭菌后加入拜氏梭菌XH0906种子液，制得生物催化剂；（2）在生物催化剂和糖类碳水化合物存在下，以丙酮为底物，构建生物催化体系并进行生物加氢反应制备异丙醇。本发明以丙酮为底物通过生物加氢制备异丙醇，在常温、常压即可进行，无需通入氢气作为还原剂，具有异丙醇收率高、副产物少、绿色环保等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丙酮生物加氢制备异丙醇的方法。
背景技术
异丙醇是重要的化工产品和原料，主要用于制药、化妆品、塑料、香料、涂料等。异丙醇生产均采用化学法，包括间接水合法、直接水合法和丙酮加氢法。直接水合法采用丙烯与硫酸反应先得到硫酸氢异丙酯，然后硫酸氢异丙酯再经水解而成异丙醇。丙烯水合法采用丙烯和水在催化剂存在下加温、加压进行水合反应。丙酮加氢法为2005年以后兴起的，主要源于丙酮过剩，丙酮与异丙醇价格倒挂（传统上异丙醇的消费用途之一就是脱氢制丙酮）。
我国异丙醇主要采用丙酮法和丙烯水合法两种工艺，有效产能分别为52万吨/年和23万吨/年。因为丙烯成本较高，2019年大部分异丙醇都采用丙酮法生产，约35.8万吨，开工率达到70%～80%，而丙烯法仅4.8万吨，因受原料成本因素，丙烯法装置全部处于长时间停车状况。
CN98121050.3公开了一种丙酮加氢制异丙醇的方法，该方法采用压片成型的CuO-ZnO氧化物混合物为催化剂，在装有该催化剂的固定床反应器内，丙酮加氢制备异丙醇。加氢反应的工艺条件为温度：150～250℃，加氢反应的压力：1.0～5.0MPa，进料氢气与丙酮的摩尔比：1.5～4.5，丙酮进料的液时体积空速：0.5～4.0 h-1。丙酮的转化率达到99.9%，异丙醇的选择性可达99.9%。但是该方法需要在高温、高压下进行，且制备过程中需要通入氢气作为还原剂，制备条件比较苛刻。
CN109486868A公开了一种以木质纤维素为原料发酵生产异丙醇和丁醇的方法，首先在120-160℃，0.8-1.3MPa下对木质纤维素原料进行蒸汽爆破预处理；再对预处理后物料进行酶解，得到纤维素和半纤维素水解混合糖液；再以水解混合糖液为碳源，补加氮源、营养盐和维生素制备发酵培养基；将拜氏梭菌XH0906的种子液接入到发酵培养基中，发酵生产丁醇和异丙醇。该发明先对木质纤维素原料进行蒸汽爆破预处理，再利用拜氏梭菌XH0906发酵生产丁醇和异丙醇，具有制备工艺简单，发酵产率高等特点。但是，该方法虽然有助于诱导拜氏羧菌XH0906联产异丙醇和丁醇，减少丁醇代谢通量，而异丙醇代谢通量增加，但是最终二者的比例接近4:5-1:1，异丙醇产量有待进一步提高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种丙酮生物加氢制备异丙醇的方法。本发明以丙酮为底物通过生物加氢制备异丙醇，在常温、常压即可进行，无需通入氢气作为还原剂，具有异丙醇收率高、副产物少、绿色环保等特点。
本发明提供的丙酮生物加氢制备异丙醇的方法，包括以下步骤：
（1）制备生物催化剂：配置含氮源、无机盐和维生素的营养液，灭菌后加入拜氏梭菌XH0906种子液，制得生物催化剂；
（2）在生物催化剂和糖类碳水化合物存在下，以丙酮为底物，构建生物催化体系并进行生物加氢反应制备异丙醇。
本发明中，所述的氮源可以采用微生物增殖所需的各种氮源，优选地，包括有机氮源和无机氮源，有机氮源为牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米浆和豆粕水解液等中的至少一种，优选蛋白胨和牛肉膏；无机氮源为醋酸铵、硝酸钠和硫酸铵等中的至少一种，优选为硫酸铵和/或醋酸铵，更优选硫酸铵。所述的无机盐可以采用微生物增殖所需的各种无机盐，优选地，无机盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸镁、氯化钙和硫酸锰等中的至少一种，优选磷酸盐。所述的维生素作为微生物增殖所需的生长因子，包括维生素B1、生物素和对氨基苯甲酸等中的一种或多种。
本发明中，以每L营养液计，有机氮源的用量为1-20g，优选为10-18g；无机氮源的用量为0.1-10g，优选为0.5-5g；无机盐的用量为0.01-10g，优选为2.5-5g；维生素的用量为0.01-0.2g，优选为0.04-0.12g；对氨基苯甲酸用量为0.01-0.1g，优选为0.04-0.08g；生物素用量为0.01-0.1g，优选为0.04-0.08gL。营养液的初始pH调节为5.5-8.5，优选为6-8。配置完成后115℃-121℃条件下灭菌20-30 min。
本发明中，所述的拜氏梭菌XH0906（Clostridium beijerinckii），保藏编号为CGMCC No. 9124，已经在CN201510638879.7中申请公开，并提交了保藏及存活证明。
本发明中，所述拜氏梭菌XH0906种子液的制备包括菌种活化和种子培养，优选地，菌种活化在厌氧条件下进行，种子培养在兼氧条件下进行。进一步的，菌种活化为：将拜氏梭菌接种至固体培养基，在厌氧条件下，28-42℃培养12-48h；种子培养为：将活化菌接种至种子培养基，在兼氧条件下，28-42℃静置培养12-48h，得到拜氏梭菌XH0906种子液。所述的种子培养基是在营养液中加入碳水化合物制得，固体培养基是在液体培养基中加入1wt%-2wt%的琼脂制得，培养基配制完成后分别在115-121℃条件下灭菌20-30 min。
本发明中，生物催化剂剂中，拜氏梭菌XH0906种子液为营养液体积的2%-20%，优选5%-15%。
本发明中，所述的糖类碳水化合物为葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖、低聚木糖等中的至少一种，优选木糖和低聚木糖。
本发明中，以生物催化剂体系为基准，糖类碳水化合物添加量为5-20g/L，丙酮加入量为15-30g/L。构建的生物催化体系的初始阶段pH 5-8，优选6-7。
本发明中，所述的生物加氢反应在兼氧/厌氧条件下进行，控制反应温度为20-42℃，优选为32-38℃；搅拌速度为5-200rpm，优选为10-100rpm；反应时间为48-120h，优选为60-80h。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）拜氏梭菌XH0906（Clostridium beijerinckii）具有独特的生物性，该菌株耐氧能力强，能够在兼氧/厌氧条件下利用碳源发酵制备丁醇和异丙醇，产物中二者的配比接近1:1，异丙醇相对较少。为了提高异丙醇产量和选择性，本申请以拜氏梭菌XH0906（Clostridium beijerinckii）种子液作为生物催化剂，以碳水化合物提供还原力，丙酮为底物通过生物加氢制备异丙醇，在常温、常压下即可实现，无需通入氢气作为还原剂，具有异丙醇收率高、副产物少、绿色环保等特点。
（2）本发明以丙酮为底物，利用碳水化合物代谢过程中产生的NADH为氢源和还原力，减少丁醇代谢通量，而异丙醇代谢通量增加，从而提高了异丙醇产量和选择性。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案和效果进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。
豆粕水解液的制备方法包括：称取适量豆粕，加入5倍质量的水，混合均匀。按水量体积的2%加入质量浓度为98%的浓硫酸，迅速混合均匀，勿使物料局部碳化。通入蒸汽，使物料温度升至100℃，保温20小时，其间，每隔1小时搅拌5分钟。水解结束后，得到呈酱红色、具果香味的豆粕水解液。
本发明实施例通过液相色谱仪对发酵液中的产物和副产物进行分析，以计算其中主要成分的浓度：液相色谱仪（安捷伦1200），色谱柱为伯乐HPX-87H（300mm×7.8mm），流动相为0.005mol/L H2SO4溶液，流速为0.6mL/min，柱温箱为65℃，检测器为示差检测器（安捷伦1200），检测器温度为45℃，进样量为5μL。
异丙醇收率=反应得到的异丙醇浓度/（反应前丙酮浓度-发酵后丙酮浓度）×100%。
实施例1
营养液成分：豆粕水解液 10g/L、硫酸铵0.9 g/L、氯化钠0.5 g/L、硫酸铁0.1 g/L、硫酸镁0.3 g/L、氯化钙0.1 g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钠2 g/L、对氨基苯甲酸0.04g/L、维生素B1 0.04 g/L和生物素0.004g/L，pH 7.0，在121℃下灭菌30min，备用。
种子培养基是在营养液中加入木糖，固体培养基是在种子培养基中加入1wt%的琼脂制得，培养基配制完成后分别在115-121℃条件下灭菌20-30 min，备用。
拜氏梭菌XH0906种子液的制备：包括菌种活化和种子培养，菌种活化为：将拜氏梭菌接种至固体培养基，在厌氧条件下，28-42℃培养12-48h；种子培养为：将活化菌氨体积比10%接种至种子培养基，在兼氧条件下，28-42℃静置培养12-48h，得到拜氏梭菌XH0906种子液。
将拜氏梭菌XH0906种子液按照体积比10%加入到营养液中，制得生物催化剂。
取生物催化剂3L加入到5L反应器中，木糖添加量10g/L，丙酮加入量25g/L，初始阶段pH 7。在兼氧条件下进行，控制反应温度为37℃，搅拌速度为150 rpm，反应时间为72h。
经检测，产物中丁醇浓度1.5 g/L，异丙醇浓度为26.9 g/L。
实施例2
同实施例1，不同在于：氮源采用蛋白胨和牛肉膏，各5g/L。经检测，产物中丁醇浓度1.3g/L，异丙醇浓度为27.1g/L。
实施例3
同实施例1，不同在于：碳水化合物采用半乳糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖、低聚木糖代替木糖。结果如表1所示。
表1
实施例4
同实施例1，不同在于：取3L生物催化剂加入到5L反应器中，木糖添加量10g/L，丙酮加入量25g/L，初始阶段pH=6。在兼氧条件下进行，控制反应温度为32℃，搅拌速度为150rpm，反应时间为80h。经检测，产物中丁醇浓度0.8g/L，异丙醇浓度为25.4g/L。
实施例5
同实施例1，不同在于：取生物催化剂3L加入到5L反应器中，木糖添加量10g/L，丙酮加入量25g/L，初始阶段pH=8。在厌氧条件下进行，控制反应温度为38℃，搅拌速度为200rpm，反应时间为60h。经检测，产物中丁醇浓度1.3g/L，异丙醇浓度为26.8g/L。
比较例1
同实施例1，不同在于采用CN105713851A公开的拜氏梭菌CM20，保藏编号为CGMCCNo.9354。经检测，丁醇浓度1.98g/L，异丙醇未检测到，丙酮0.36 g/L，乙醇0.12 g/L 。
比较例2
同实施例1，不同在于：碳水化合物采用乳糖。经检测，丁醇浓度未检测到，异丙醇浓度未检测到。
Claims (16)
1.一种丙酮生物加氢制备异丙醇的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）制备生物催化剂：配置含氮源、无机盐和维生素的营养液，灭菌后加入拜氏梭菌XH0906种子液，制得生物催化剂；生物催化剂中，拜氏梭菌XH0906种子液为营养液体积的2%-20%；所述的氮源包括有机氮源和无机氮源；（2）在生物催化剂和糖类碳水化合物存在下，以丙酮为底物，构建生物催化体系并进行生物加氢反应制备异丙醇；所述的糖类碳水化合物为葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖、低聚木糖中的至少一种；以生物催化体系为基准，糖类碳水化合物添加量为5-20g/L，丙酮加入量为15-30g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的有机氮源为牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米浆和豆粕水解液中的至少一种；无机氮源为醋酸铵、硝酸钠和硫酸铵中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的有机氮源为蛋白胨和牛肉膏；无机氮源为硫酸铵和/或醋酸铵。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的无机盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸镁、氯化钙和硫酸锰中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的无机盐为磷酸盐。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的维生素作为微生物增殖所需的生长因子，包括维生素B1、生物素和对氨基苯甲酸中的一种或多种。
7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其特征在于：以每L营养液计，有机氮源的用量为1-20g，无机氮源的用量为0.1-10g，无机盐的用量为0.01-10g，维生素的用量为0.01-0.2g，对氨基苯甲酸用量为0.01-0.1g，生物素用量为0.01-0.1g，营养液的初始pH调节为5.5-8.5。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：以每L营养液计，有机氮源的用量为10-18g；无机氮源的用量为0.5-5g；无机盐的用量为2.5-5g；维生素的用量为0.04-0.12g；对氨基苯甲酸用量为0.04-0.08g；生物素用量为0.04-0.08g；营养液的初始pH调节为6-8。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述拜氏梭菌XH0906种子液的制备包括菌种活化和种子培养，菌种活化在厌氧条件下进行，种子培养在兼氧条件下进行。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：菌种活化为：将拜氏梭菌接种至固体培养基，在厌氧条件下，28-42℃培养12-48h；种子培养为：将活化菌接种至种子培养基，在兼氧条件下，28-42℃静置培养12-48h，得到拜氏梭菌XH0906种子液。
11.根据权利要求1、9或10所述的方法，其特征在于：生物催化剂中，拜氏梭菌XH0906种子液为营养液体积的5%-15%。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的糖类碳水化合物为木糖和低聚木糖。
13. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：构建的生物催化体系的初始阶段pH 5-8。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：构建的生物催化体系的初始阶段pH为6-7。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：生物加氢反应在兼氧/厌氧条件下进行，控制反应温度为20-42℃，搅拌速度为5-200rpm，反应时间为48-120h。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：生物加氢反应在兼氧/厌氧条件下进行，控制反应温度为32-38℃；搅拌速度为10-100rpm；反应时间为60-80h。
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