CN108473942A - 拜氏梭菌的突变菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及拜氏梭菌的突变细菌：在2015年5月27日保藏于CNCM‑国家微生物保藏中心(CNCM,25 rue du Docteur Roux,F‑75724 PARIS Cedex 15,France)的CNCM I‑4985、CNCM I‑4986、CNCM I‑4987和CNCM I‑4988和在2015年11月26日保藏于CNCM‑国家微生物保藏中心(CNCM,25 rue du Docteur Roux,F‑75724 PARIS Cedex 15,France)的CNCM I‑5027、CNCM I‑5028和CNCM I‑5029，其可用于发酵糖类用于生产异丙醇和丁醇。

Description

拜氏梭菌的突变菌株
本发明涉及通过随机诱变改进的拜氏梭菌(genus Clostridium beijerinckii)的细菌以及使用这些细菌生产包含丁醇和异丙醇的混合物的方法。
背景技术
许多所谓的由2至6个碳原子组成的“平台”化学分子主要从化石资源生产。这些基础分子用于在燃料制剂或还有香料工业中的中间体化合物的生产，这些中间体化合物的用途各异，诸如例如用于合成聚合物、药物分子。
然而，由于某些环境原因，但首先为了解决石油资源不可避免的下降，正在开发替代方法以允许从可再生原料生产这些“平台”分子。
丙烯(Propylene或propene)是石油化学中使用第二多的分子。其主要源自石油，且特别是通过丙烷的蒸汽裂化、催化裂化或脱氢来获得。
除从石油以外的生产丙烯的可能途径之一是对通过从生物质萃取的糖类的生物发酵(被称为IBE(异丙醇、丁醇、乙醇)发酵的发酵)获得的异丙醇进行脱水。
被称为“产溶剂发酵”的发酵通过梭菌属微生物进行。梭菌是能够形成内生孢子且属于厚壁菌门的革兰氏阳性杆菌。这些细菌是严格厌氧且无处不在的；它们可以在动物的肠内、土壤等中找到。它们可以降解不同的糖类，并从各种各样的基质中生产溶剂。在完成该“产溶剂”发酵后，最终产物可以根据发酵是ABE类型(丙酮、丁醇和乙醇的生产)还是IBE类型(异丙醇、丁醇和乙醇的生产)而变化。
研究最多的“ABE”菌株是在1924年从康涅狄格州的土壤中分离的丙酮丁醇梭菌ATCC 824 (Weyer & Rettger, 1927, J. Bacteriol. 14, 399-424)。另一种广泛研究的菌株是拜氏梭菌DSMZ 6423 (NRRL B593)，因为由于在其基因组中存在NADPH依赖性的伯醇/仲醇脱氢酶(adh)，使该菌株能够通过将丙酮还原成异丙醇而产生异丙醇/丁醇/乙醇溶剂的混合物(Ismaiel等人, 1993, J. Bacteriol., 175(16), 5097–105)。
与通过梭菌属菌株生产溶剂的工业工艺的开发相关的主要约束是最终的溶剂滴度，这是自构建第一个工业单元以来一直被提及的问题(Jones, D.T., Woods, D.T.,1986, Microbiological. Reviews. 50(4), 484-524)。低溶剂滴度的主要原因是最终产物，且特别是丁醇的毒性。已知培养介质中大于10-12 g/L的丁醇浓度限制梭菌的菌株的生长(Zheng等人, 2009, J. Ind. Microb. & Biotechnol. 36:1127–1138)。
迄今进行的大多数科学工作旨在改进梭菌菌株对丁醇的合成。为此，已经应用了几种方法来改进对丁醇的耐受性，包括基于诱变和选择能够耐受更高丁醇含量的梭菌菌株的方法(US 4,757,010)。随机诱变的技术使得可以通过施加环境选择压力来修饰菌株的基因库，以使它们向特定特征进化。该技术优化且因此加速自然选择的现象。
另一种可以使用的技术是“基因组改组”的技术，这使其可以通过模仿生殖过程(但在更大的规模上)来组合和重组多种生物体的整个基因组的DNA。重组现象通过例如在诱变处理和铺板在选择性介质上之后已选择的菌株的原生质体的融合来进行。两种技术的组合可以有助于获得具有改善的代谢物产生、更好的基质的同化和更大的对形成的产物的耐受性的菌株。
目前，仍然需要新的细菌菌株，其在合适的发酵条件下培养，使得有可能获得改进浓度的异丙醇和丁醇的混合物。
发明概述
本发明涉及：
• 在2015年5月27日以编号CNCM I-4985保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
• 在2015年5月27日以编号CNCM I-4986保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
• 在2015年5月27日以编号CNCM I-4987保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
• 在2015年11月26日以编号CNCM I-5027保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
• 在2015年11月26日以编号CNCM I-5028保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
• 在2015年11月26日以编号CNCM I-5029保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
在用诱变剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理拜氏梭菌菌株DSMZ-6423，并在含有显著量的异丙醇或溴代丁酸甲酯或溴代丁酸乙酯的介质中进行选择，以便选择出可能用于生产异丙醇和丁醇的混合物的突变体之后，从拜氏梭菌菌株DSMZ-6423获得突变细菌CMCM I-4985、CNCM I-4986、CNCM I-4987。通过与亲本菌株拜氏梭菌DSMZ-6423的比较，所选择的细菌已展示出在糖类发酵之后溶剂异丙醇和丁醇的最终滴度方面的益处。
本发明还涉及在2015年5月27日以编号CNCM I-4988保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的突变细菌。菌株CNCM I-4988源自用菌株CNCM I-4986和CNCM I-4987进行的基因组改组的步骤，随后基于突变体在其环境中耐受显著浓度的异丙醇的能力进行选择的步骤。
用于发酵中的菌株CNCM I-4988具有生产溶剂异丙醇和丁醇的混合物的能力，所述异丙醇和丁醇的浓度相对于拜氏梭菌菌株DSMZ-6423得到改善。
本发明还涉及用于生产异丙醇和丁醇的混合物的方法，其通过在含有糖类的培养介质中，使用选自细菌CNCM I-4985、CNCM I-4986、CNCM I-4987和CNCM I-4988的细菌，在包含在25和37℃之间的温度下，进行厌氧发酵来实现。
根据本发明的方法还可以利用选自细菌CNCM I-5027、CNCM I-5028和CNCM I-5029的细菌。细菌CNCM I-5027、CNCM I-5028和CNCM I-5029通过用使用诱变剂NTG突变的菌株进行基因组改组而获得。
所述培养介质优选含有葡萄糖作为糖。
根据一个实施方案，所述培养介质含有含水解淀粉的基质。
根据本发明，所述培养介质可以含有羧酸。例如，所述培养介质含有乙酸和/或丁酸。
发明详述
为了改善天然产生IBE的菌株拜氏梭菌DSMZ-6423的性能，本发明人对所述菌株进行用诱变剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的处理，以修饰其遗传内容物。
使用的诱变技术由以下组成：使诱变剂与细菌菌株在液体介质中接触，然后将源自用诱变剂处理的菌株在不同的固体培养介质上(例如在皮氏培养皿中)铺板。所述培养介质包含对天然菌株拜氏梭菌DSMZ-6423有毒水平的异丙醇或溴代丁酸甲酯或溴代丁酸乙酯。
菌株的选择基于以下原理：寻找对异丙醇耐受的突变体，其基于以下假设，即所述突变体在IBE发酵测试期间将耐受异丙醇的累积。
使用溴代丁酸甲酯或溴代丁酸乙酯作为选择产物是基于以下文章：Clark, S.W., Bennett, G. N., & Rudolph, F. B. ((1989). Isolation and Characterization of Mutants of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Deficient in Acetoacetyl- Coenzyme A:Acetate/Butyrate:Coenzyme A-Transferase (EC 2.8.3.9) and in Other Solvent Pathway Enzymes. Appl. Environ. Microbiol., 55(4), 970–6)，其描述了针对其对2-溴代丁酸酯的耐受性选择且表现出改善的丁醛和丁醇脱氢酶活性的丙酮丁醇梭菌ATCC824的突变体。本发明人设想具有修饰的丁醛活性的菌株可以改善的方式生产异丙醇，达到在参与ABE发酵的代谢反应类似于IBE发酵的代谢反应的程度。
由此，培养步骤之后回收的突变菌株已经使其基因组得到了修饰，以便获得对毒性产物的耐受性和用于生产溶剂(更具体地异丙醇和丁醇)的潜在更好的发酵能力。
然后将耐受性菌株在含有葡萄糖或含水解淀粉的基质的生长介质中培养，以确定它们产生异丙醇和丁醇的实际能力。在完成这些发酵步骤后，可以选择出拜氏梭菌的三种突变菌株，其根据布达佩斯条约在2015年5月27日保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM,25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)，且分别具有参考号CNCMI-4985、CNCM I-4986和CNCM I-4987。
根据本发明，通过突变菌株的基因组改组获得了同样根据布达佩斯条约保藏于CNCM-国家微生物保藏中心的突变菌株CNCM I-4988。
为了起始改组步骤，在拜氏梭菌的突变体之间诱导融合。这种不同群体之间的遗传交换因此模仿有性生殖的重组特征。再次通过搜索其发酵概况的变化来选择改组之后获得的子细胞。“改组”过程可以重复几代(或几轮改组)，直至获得最终的菌株，其通过其生产溶剂(具体为异丙醇和丁醇)和在其环境中耐受显著浓度的异丙醇的能力而得到改善。
因此，在使用突变菌株CNCM I-4986和CNCM I-4987进行一轮改组，并选择对异丙醇(高于40 g/L异丙醇)的耐受性改善的菌株之后，获得了突变菌株CNCM I-4988。
下面详细描述用于获得形成本发明的主题的菌株的诱变方法。
也通过术语“野生型”指代的起始菌株是保藏于Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH的拜氏梭菌DSMZ-6423。
将菌株在被称为GAPES的介质中预培养，所述介质的组成在表1中详述。在35-37℃的温度下，经24小时进行预培养步骤。
化合物 浓度(g/L)
酵母提取物 2.5
KH2PO4 1
K2HPO4 0.6
MgSO4.7H2O 1
FeSO4.7H2O 0.0066
对氨基苯甲酸 0.1
乙酸铵 2.9
葡萄糖 60
表 1：GAPES介质的组成。
然后将该预培养物用于在CGM介质(梭菌生长介质)中开始培养，所述介质的组成在表2中给出。
化合物 浓度(g/L)
酵母提取物 5
K2HPO4 0.75
KH2PO4 0.75
MgSO4.7H2O 0.4
MnSO4.H2O 0.01
FeSO4.7H2O 0.01
NaCl 1
天冬酰胺 2
(NH4)2SO4 2
半胱氨酸 0.125
葡萄糖 12.5
表 2：CGM介质的组成。
一旦培养，通过在液体CGM介质中与其诱变性质已知的N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG ；Sigma-Aldrich)接触，使野生型菌株拜氏梭菌DSMZ-6423经受不同的突变条件。
在第一测试系列中，将在指数生长期(即在培养3至4小时后)回收的拜氏梭菌DSMZ-6423的野生型菌株在试管中在35-37℃的温度下与添加至CGM介质以获得浓度为50 µg/mL的NTG的NTG接触。与NTG的接触持续1小时。
将细胞用磷酸钾的缓冲溶液(pH = 6.6)洗涤两次，然后再次置于新鲜的CGM介质中，以便在35℃下进行1至3小时的再生步骤。对于选择操作，在再生步骤之后将突变的细胞铺板在选择培养皿中。选择介质是含有浓度为0.5 mL/L的溴代丁酸乙酯(作为选择剂)的CGM介质。在选择介质中在35-37℃的温度下经24-48小时，进行孵育。培养24-48小时后，选择对选择剂表现出耐受性的突变体。
然后，在厌氧条件下且使用两种不同的发酵介质(即表1中所述的GAPES介质，和其中葡萄糖已经替换为对应于所述介质中70 g/L葡萄糖当量的浓度的含水解淀粉的基质(GRITZ)的GAPES介质)，在小瓶中测试，由此选择的不同突变体的性能。
在搅拌下在37℃的温度下经48小时，进行厌氧发酵。
在第二测试系列中，将拜氏梭菌DSMZ-6423的野生型菌株在CGM介质中培养，并在指数期(即培养3-4小时后)收集，且然后使其与75 µg/mL NTG接触。然后在与上述相同的条件下选择突变体，但使用浓度为40 g/L的异丙醇作为选择剂。
然后在厌氧条件下在小瓶中，在表1中所述的介质中以及在已添加含水解淀粉的基质(GRITZ)以提供70 g/L的葡萄糖当量(以从而为代谢反应的程度上醇的累积来代替葡萄糖)的GAPES介质中，在发酵中测试由此选择的已获得对异丙醇的耐受性的突变体。在搅拌下在37℃的温度下经48小时，进行厌氧发酵。
在第三测试系列中，将拜氏梭菌DSMZ-6423的野生型菌株在CGM介质中培养，并在指数期(即培养3-4小时后)收集，然后使其与50 µg/mL NTG接触。使用也含有40 g/L异丙醇的CGM的培养溶液来选择突变体。
然后在厌氧条件下在小瓶中，在表1中所述的介质中以及在含有提供70 g/L的葡萄糖当量的含水解淀粉的基质(GRITZ)(以代替葡萄糖)的GAPES介质中，在发酵中测试对异丙醇的耐受性的突变体。在37℃的温度下，且在搅拌下，经48小时进行厌氧发酵。
下表3概述了在GAPES介质中厌氧发酵48小时后产生的溶剂的分析结果。
通过具有CP-PoraBOND Q柱和FID (火焰离子化检测器)的气相色谱(Varian®装置)测定溶剂。丙-1-醇被用作内部标准品。
色谱参数如下：
- 柱：长度25米；内径(ID)：0.32 mm；外径(ED)：0.45 mm；膜的厚度：5 µL
- 注入器的温度：90℃至250℃，150℃/min
- 载气的流速：1.6 mL/min (6.8 psi)
- 柱的温度：50℃至250℃, 50℃/min
- FID检测器的温度：80℃
- 注入体积：1 µL
表 3：在GAPES介质中，从通过使用NTG的随机诱变获得的突变菌株发酵后的溶剂浓度。
已根据布达佩斯条约保藏的突变菌株在表3中通过星号表示。
菌株9*对应于在2015年5月27日保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25 ruedu Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的菌株CNCM I-4985。
菌株6*对应于在2015年5月27日保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25 ruedu Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的菌株CNCM I-4986。
菌株7*对应于在2015年5月27日保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25 ruedu Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的菌株CNCM I-4987。
表4给出使用拜氏梭菌CNCM I-4985、CNCM I-4986和CNCM I-4987的突变菌株，通过在其中葡萄糖已经替换为葡萄糖当量为70g/L的含水解淀粉的基质(GRITZ)的GAPES介质中发酵产生的溶剂的浓度。
在厌氧发酵48小时后，通过具有Aminex®HPX-87P柱(Biorad，长度为300mm，且直径为7.8mm)的HPLC (Varian®)在80℃下测定葡萄糖含量。使用的洗脱剂是水，流速为0.4mL/min。检测器是折射仪(Varian® 350 RI)。注入样品的体积是35μL。
如上所述，通过气相色谱分析溶剂。
表 4：在含有代替葡萄糖的含水解淀粉的基质(GRITZ)(70g/L葡萄糖当量)的GAPES介质中发酵后的溶剂浓度。
值得注意的是，用菌株CNCM I-4985、CNCM I-4986和CNCM I-4987进行的发酵产生的发酵培养液(fermentation must)具有比由野生型菌株拜氏梭菌DSMZ 6423产生的浓度更高的异丙醇和丁醇。
将在用NTG随机诱变和针对其对40g/L的异丙醇或0.5mL/L的溴代丁酸乙酯的耐受性进行选择的步骤后获得的突变菌株，用于根据由以下描述的方案的基因组改组步骤：Gao, X., Zhao, H., Zhang, G., He, K. & Jin, Y. (2012). Genome shuffling of Clostridium acetobutylicum CICC 8012 for improved production of acetone- butanol-ethanol (ABE). Curr. Microbiol., 65(2), 128–32。
首先在指数期中将突变菌株分别引入CGM介质中，并且在培养3至4小时后收集。然后将培养物以4000 G离心10分钟，并用含有0.5M蔗糖、20mM马来酸钠一水合物和20 mMMgCl2的pH 6.5的马来酸钠一水合物的溶液No.1 (SMM 1)洗涤两次。
使收集的细胞在35℃下与马来酸钠一水合物的溶液No.2接触，所述马来酸钠一水合物的溶液No.2具有以下组成：0.5M蔗糖，20mM马来酸钠一水合物，20 mM MgCl2，1g/L半胱氨酸，1g/L谷胱甘肽，向其中已添加15mg/mL溶菌酶。处理完成后，收集细胞，用马来酸钠一水合物的溶液No.1洗涤，并以4000G离心5分钟。
然后将不同群体在10mL的其中已添加30% w/v (30g/100 mL)的PEG 4000的马来酸钠一水合物的溶液No.3 (0.5M蔗糖，20mM马来酸钠一水合物，20mM MgCl2，1g/L半胱氨酸，1g/L谷胱甘肽，50 mM CaCl2)中混合，并在35-37℃的温度下孵育20分钟以诱导原生质体之间的融合。将融合的细胞悬浮于CGM介质中并经40小时在CGM琼脂上再生。
从用NTG处理的突变菌株进行几次原生质体融合的杂交。然后选择对CGM介质中的异丙醇(45至50g/L的异丙醇)的耐受性增加的遗传改组的菌株。
表5比较用在2015年5月27日保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25 rue duDocteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的菌株CNCM I-4988和野生型菌株拜氏梭菌DSMZ 6423获得的发酵48小时后的发酵培养液的溶剂浓度。在含有代替葡萄糖的含水解淀粉的基质(GRITZ；70g/L葡萄糖当量)的GAPES介质中进行发酵。菌株CNCM I-4988源自单一轮用菌株CNCM I-4986和CNCM I-4987的基因组改组。
表 5：在含有含水解淀粉的基质(GRITZ；70g/L葡萄糖当量)代替葡萄糖的GAPES介质中发酵后的溶剂浓度。
注意到菌株CNCM I-4988比野生型菌株产生更多丁醇，同时维持相同的异丙醇生产水平。
还在两轮基因组改组之后，获得不同的突变菌株，且然后在已添加代替葡萄糖的含水解淀粉的基质(70g/L葡萄糖当量)的GAPES介质中厌氧发酵中进行后续测试。
如下所述分离菌株CNCM I-5027。
用菌株CNCM I-4985和源自用75μg/mL的NTG溶液诱变，然后针对其对含有40g/L异丙醇的CGM介质的耐受性进行选择的菌株，进行基因组改组的步骤。在改组轮之后，使用含有40g/L异丙醇的CGM选择介质选择突变细胞。在选择介质中在35-37℃的温度下且经24小时进行孵育。在培养24小时后，选择表现出耐受性的突变体，且其再次在含有50g/L异丙醇的CGM介质中在35-37℃的温度下孵育，并且进行24小时。菌株CNCM I-5027是第二选择步骤的结果。
关于菌株CNCM I-5028，它是用菌株CNCM I-4985和用在含有40g/L异丙醇的CGM选择介质中选择的已经过用NTG (75μg/mL)诱变的先前步骤的两种其它菌株进行基因组改组的步骤的结果。如上所述，菌株CNCM I-5028源自利用含有40g/L异丙醇的CGM选择介质、然后含有50g/L异丙醇的CGM选择介质的两个选择步骤。
通过应用上述方案分离菌株CNCM I-5029，但其中用源自用NTG (75μm/mL)诱变并在含有40 g/L异丙醇的CGM选择介质中针对其耐受性进行选择的两种菌株，进行基因组改组的步骤。如前所述，在利用含有40g/L异丙醇的CGM介质、然后含有50g/L异丙醇的CGM选择介质的两个步骤中进行菌株CNCM I-5029的分离。
表6给出在37℃下发酵48小时后，用菌株CNCM I-5027、CNCM I-5028和CNCM I-5029获得的发酵培养液的溶剂浓度。发酵在GAPES介质中进行，所述GAPES介质的组成在表1中给出。
表 6：在含有含水解淀粉的基质(GRITZ；70g/L葡萄糖当量)代替葡萄糖的GAPES介质中在37℃下发酵后的溶剂浓度。
观察到菌株CNCM I-5027、CNCM I-5028和CNCM I-5029能够生产比参考菌株DSM6423更多的异丙醇。此外，CNCM I-5028和CNCM I-5029使得可以生产相对于菌株DSMZ 6423更多的丁醇。

Claims (12)

1.在2015年5月27日以编号CNCM I-4985保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
2.在2015年5月27日以编号CNCM I-4986保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
3.在2015年5月27日以编号CNCM I-4987保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
4.在2015年5月27日以编号CNCM I-4988保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
5.在2015年11月26日以编号CNCM I-5027保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
6.在2015年11月26日以编号CNCM I-5028保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
7.在2015年11月26日以编号CNCM I-5029保藏于CNCM-国家微生物保藏中心(CNCM, 25rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France)的拜氏梭菌的细菌。
8.生产异丙醇和丁醇的混合物的方法，其通过使用根据权利要求1至7中任一项所述的细菌在含有糖类的培养介质中在包含在25和37℃之间的温度下的厌氧发酵进行。
9.根据权利要求8所述的方法，所述培养介质的糖类是葡萄糖。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述培养介质含有含水解淀粉的基质。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述培养介质含有羧酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述羧酸培养介质是乙酸或丁酸。
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