WO2016192871A1 - Souches mutantes du genre clostridium beijerinckii - Google Patents

Souches mutantes du genre clostridium beijerinckii Download PDF

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cncm
rue
france
clostridium beijerinckii
isopropanol
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PCT/EP2016/057236
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Hadrien MATE DE GERANDO
Laetitia RUDANT
Marcel Ropars
Nicolas Lopes Ferreira
Ana Maria LOPEZ CONTRERAS
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IFP Energies Nouvelles
Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek
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Definitions

  • the present invention relates to bacteria of the genus Clostridium beijerinckii improved by random mutagenesis and to a process for producing a mixture comprising butanol and isopropanol using these bacteria.
  • platforms composed of 2 to 6 carbon atoms are mainly produced from fossil resources. These basic molecules are used for the production of intermediate compounds whose uses are varied, such as for the synthesis of polymers, pharmaceutical molecules, in fuel formulations or in the perfume industry.
  • Propylene is the second most used molecule in petrochemicals. It is mainly derived from petroleum and is especially obtained by steam cracking, by catalytic cracking or by the dehydrogenation of propane.
  • One of the possible ways to produce propylene otherwise than from petroleum is to dehydrate the isopropanol obtained by biological fermentation of sugars extracted from biomass, known fermentation fermentation IBE (Isopropanol, Butanol, Ethanol) .
  • IBE Isopropanol, Butanol, Ethanol
  • Clostridia are gram-positive bacilli capable of forming endospores and belonging to the phylum Firmicutes. These bacteria are anaerobic strict and ubiquitous, they can be found in the intestines of animals, soils etc. They can degrade different sugars and produce solvents from a wide variety of substrates.
  • the final products can vary depending on whether it is a type ABE fermentation (production of acetone, butanol and ethanol) or IBE (production of isopropanol) , butanol and ethanol).
  • Clostridium acetobutylicum ATCC 824 isolated from soil in 1924 in Connecticut (Weyer & Rettger, 1927, J. Bacteriol 14, 399-424).
  • Clostridium beijerinckii DSMZ 6423 (NRRL B593), because it is capable of to produce an Isopropanol / Butanol / Ethanol solvent mixture by reducing acetone to isopropanol by virtue of the presence in its genome of an NADPH-dependent primary / secondary alcohol-dehydrogenase (adh) (Ismaiel et al., 1993, J. Bacteriol. , 175 (16), 5097-105).
  • the main constraint related to the development of industrial processes for the production of solvents by Clostridium strains is the final title in solvents, a problem which is mentioned as early as the first constructions of industrial units (Jones, DT, Woods, DT, 1986, Microbiological. 50 (4), 484-524).
  • the main cause of the low solvent content is the toxicity of the end products, particularly butanol.
  • a butanol concentration greater than 10-12 g / L in the culture medium is known to limit the growth of Clostridium strains (Zheng et al., 2009, J. Ind.Microb. & Biotechnol. 36: 1,127-1 138)
  • the present invention relates to:
  • the mutant bacteria CMCM I-4985, CNCM I-4986, CNCM I-4987 were obtained from the strain Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 after treatment of the latter with a mutagenic agent, N-methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidine (NTG), and selection in a medium containing a large amount of isopropanol, or methyl bromobutyrate or ethyl bromobutyrate to select potentially interesting mutants for the production of a mixture of isopropanol and butanol.
  • NTG N-methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidine
  • the selected bacteria showed a benefit in terms of the final title in Isopropanol and Butanol solvents after fermentation of sugars.
  • the invention also relates to a mutant bacterium of the genus Clostridium beijerinckii, deposited on May 27, 2015 at the Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Dondel Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) under the number CNCM I-4988.
  • the CNCM strain I-4988 is the result of a genetic mixing step carried out with strains CNCM I-4986 and CNCM I-4987 followed a selection step based on the ability of the mutants to tolerate a high concentration of isopropanol in its environment.
  • the CNCM 1-4988 strain used in fermentation has the capacity to produce a mixture of solvents whose isopropanol and butanol concentration is improved relative to the strain Clostridium beijerinckii DSMZ-6423.
  • the invention also relates to a process for producing a mixture of isopropanol and butanol, by anaerobic fermentation carried out at a temperature of between 25 and 37 ° C, in a culture medium containing sugars by means of a selected bacterium among the bacteria CNCM 1-4985, CNCM 1-4986, CNCM 1-4987 and CNCM 1-4988.
  • the method according to the invention can also implement a bacterium selected from CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 and CNCM 1-5029 bacteria.
  • the CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 and CNCM 1-5029 bacteria were obtained by genetic mixing with strains mutated with the NTG mutagenic agent.
  • the culture medium contains sugar as glucose.
  • the culture medium contains a hydrolysed starchy substrate.
  • the culture medium may contain carboxylic acid.
  • the culture medium contains acetic acid and / or butyric acid.
  • the mutagenesis technique used consists in carrying out in a liquid medium contacting of the mutagenic agent with the bacterial strain, and then spreading on different solid culture media, for example in petri dishes, the strains resulting from the treatment with the bacterial strain.
  • Culture media include levels of isopropanol, or methyl bromobutyrate or ethyl bromobutyrate that are toxic to the native Clostridium beijerinckii strain DSMZ-6423.
  • the selection of strains is based on the principle of looking for risopropanol resistant mutants in the event that they bear an accumulation of isopropanol during IBE fermentation tests.
  • methyl bromobutyrate or ethyl bromobutyrate as a screening product is based on the article by Clark, S.W., Bennett, G.N., & Rudolph, F. B. (1989). Of Acetacetyl-Coenzyme A: Acetate / Butyrate: Coenzyme A-Transferase (EC 2.8.3.9) and Other Solvent Pathway Enzymes. Appl. About. Microbiol., 55 (4), 970-6) in which there are described mutants of Clostridium acetobutylicum ATCC824, selected for their resistance to 2-bromobutyrate, and which have modified butyraldehyde and butanol dehydrogenase activities. The inventors have assumed that strains with a modified butyraldehyde activity are likely to produce risopropanol in an improved manner insofar as the metabolic reactions involved in the ABE fermentation are close to those of an IBE fermentation.
  • the mutated strains recovered after the culturing step have thus seen their genome modified to acquire a resistance to toxic products and potentially better fermentative faculties for the production of solvents (more particularly in isopropanol and butanol).
  • the resistant strains were then cultured in a growth medium containing glucose or a hydrolysed starchy substrate to determine their actual ability to produce risopropanol and butanol.
  • a mutant strain CNCM I-4988 also deposited according to the Budapest Treaty at the Pasteur Institute was obtained by genetic mixing (or "shuffling genome” according to the English terminology) of mutant strains.
  • fusions are induced between Clostridium beijerinckii mutants. This genetic exchange between different populations thus mimics the recombinations characteristic of sexual reproduction.
  • the daughter cells obtained after mixing are again selected by looking for an evolution of their fermentation profiles.
  • the process of "shuffling" can be repeated over several generations (or brewing round) until an improved final strain is obtained for its ability to to produce solvents, isopropanol and butanol in particular, and to tolerate large concentrations of isopropanol in its environment.
  • the CNCM 1-4988 mutant strain was obtained after a brewing run carried out with mutant strains CNCM 1-4986 and CNCM 1-4987 and with a selection of strains for improved tolerance to isopropanol (beyond 40%). g / L isopropanol).
  • the mutagenesis method used to obtain the strains that are the subject of the invention is described in detail below.
  • the starting strain also designated by the term "wild-type" according to English terminology, is Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 deposited with Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
  • the strain was precultured in a medium called GAPES whose composition is detailed in Table 1.
  • the preculture step was carried out at a temperature of 35-37 ° C for 24 hours.
  • CGM medium Clotridi Growth Medium
  • NVG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • the wild strain of Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 recovered in the exponential growth phase that is to say after 3 to 4 hours of culture, is brought into contact at a temperature of 35-37 ° C. C in a test tube with NTG added in the CGM medium to obtain a concentration of 50 ⁇ g / ml of NTG.
  • the contact with the NTG is 1 hour.
  • the selection medium is a CGM medium containing ethyl bromobutyrate at a concentration of 0.5 mIJL as the selection agent. Incubation in the selection medium is carried out at a temperature of 35-37 ° C and for 24-48 hours. After 24 to 48 hours of culture, mutants exhibiting resistance to the selection agent were selected.
  • the performances of the different mutants thus selected are then tested in vials under anaerobic conditions and with the aid of two different fermentation media, namely the GAPES medium described in Table 1 and in GAPES medium, to which the glucose has been replaced by a hydrolysed starch substrate (GRITZ) corresponding to a concentration of 70 g / L equivalent glucose in said medium.
  • the anaerobic fermentations are conducted at a temperature of 37 ° C for 48 hours and with stirring.
  • the wild strain of Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 is cultured in the medium CGM and collected in exponential phase, that is to say after 3 to 4 hours of culture, then is contacted with 75 ⁇ g / mL of NTG.
  • the mutants were then selected under the same conditions as mentioned above but using as selective agent isopropanol at a concentration of 40 g / l.
  • the mutants thus selected which have acquired resistance to isopropanol are then tested under fermentation under anaerobic conditions in flasks in the medium described in Table 1 and in GAPES medium to which a substrate has been added in place of glucose. hydrolyzed starch (GRITZ) to provide 70 g / L glucose equivalent.
  • the anaerobic fermentations are conducted at a temperature of 37 ° C for 48 hours and with stirring.
  • the wild strain of Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 is cultured in the CGM medium and collected in the exponential phase, that is to say after 3 to 4 hours of culture, and is then contacted. 50 ⁇ g / mL of NTG.
  • the mutants are selected by means of a CGM culture solution containing in addition 40 g / l of isopropanol.
  • the mutants resistant to isopropanol are then tested in fermentation under anaerobic conditions in flasks in the medium described in Table 1 and in GAPES medium containing, in place of glucose, hydrolysed starch substrate (GRITZ) providing 70 g / L glucose equivalent.
  • the anaerobic fermentations are conducted at a temperature of 37 ° C for 48 hours and with stirring.
  • Table 3 summarizes the results of analysis of solvents produced after 48 hours of anaerobic fermentation in GAPES medium.
  • the solvents are determined by gas chromatography (Varian® apparatus), with a CP-PoraBOND Q column and a flame ionization detector (FID: Flame Ionization Detector according to the English terminology).
  • FID Flame Ionization Detector according to the English terminology.
  • Propan-1-ol is used as an internal standard.
  • Table 3 Concentration of solvents after fermentation on GAPES medium from mutant strains obtained by random mutagenesis using NTG. Mutant strains that have been deposited under the Budapest Treaty are indicated in Table 3 by an asterisk.
  • the 9 * strain corresponds to the CNCM I-4985 strain deposited on May 27, 2015 at the Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Dondel Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France).
  • the 6 * strain corresponds to the CNCM strain I-4986 filed on May 27, 2015 at the Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Dondel Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France).
  • the strain 7 * corresponds to the CNCM strain I-4987 deposited on May 27, 2015 at the Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Do Budapest Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France).
  • Table 4 gives the concentrations of solvents produced by mutant strains of Clostridium beijerinckii CNCM 1-4985, CNCM 1-4986 and CNCM 1-4987 by fermentation in GAPES medium to which the glucose was replaced by a hydrolysed starch substrate (GRITZ). at 70 g / L glucose equivalent.
  • the glucose contents are determined by HPLC (Varian®) with an Aminex®HPX-87P column (Biorad, 300 mm long and 7.8 mm in diameter) at 80 ° C.
  • the eluent used is water with a flow rate of 0.4 ml / min.
  • the detector is a refractometer (Varian® 350 RI).
  • the sample volume injected is 35 ⁇ .
  • the solvents are analyzed by gas chromatography as mentioned above.
  • Table 4 Concentration in solvents after fermentation in GAPES medium containing a hydrolysed starch substrate (GRITZ) (70 g / L glucose equivalent) as a glucose substitute It is found that the fermentation conducted with strains CNCM 1-4985, CNCM 1-4986 and CNCM 1-4987 produce a fermentation broth having higher concentrations of isopropanol and butanol than that produced by the wild strain Clostridium beijerinckii DSMZ 6423.
  • GRITZ hydrolysed starch substrate
  • mutant strains obtained after the random mutagenesis step at NTG and selected for their resistance to isopropanol at 40 g / L or to ethyl bromobutyrate at 0.5 mIJL, were used for a genetic mixing step according to US Pat. protocol described by Gao, X., Zhao, H., Zhang, G., He, K. & Jin, Y. (2012). Genome shuffling of Clostridium acetobutylicum CICC 8012 for improved production of acetone-butanol-ethanol (ABE). Curr. Microbiol., 65 (2), 128-32.
  • the mutant strains are first brought separately in the exponential phase in a CGM medium and taken after 3 to 4 hours of culture. The cultures are then centrifuged for 10 minutes at 4000 g and washed twice with a solution of sodium maleate monohydrate No. 1 (MMS 1) at pH 6.5 containing 0.5 M sucrose, 20 mM sodium maleate monohydrate and 20 mM MgCl 2 .
  • MMS 1 sodium maleate monohydrate No. 1
  • the collected cells are contacted at 35 ° C. for 1 h with a solution of sodium maleate monohydrate No. 2 which has the following composition: 0.5 M sucrose, 20 mM sodium maleate monohydrate, 20 mM of MgCl 2, 1 g / L of cysteine, 1 g / L of glutathione to which 15 mg / mL of lysozyme was added.
  • a solution of sodium maleate monohydrate No. 2 which has the following composition: 0.5 M sucrose, 20 mM sodium maleate monohydrate, 20 mM of MgCl 2, 1 g / L of cysteine, 1 g / L of glutathione to which 15 mg / mL of lysozyme was added.
  • the cells are collected, washed with the solution of sodium maleate monohydrate No. 1 and centrifuged at 4000 G for 5 min.
  • the different populations are then mixed in 10 ml of a solution of sodium maleate monohydrate No. 3 (0.5 M sucrose, 20 mM sodium maleate monohydrate, 20 mM MgCl 2, 1 g / l cysteine, 1 g / L of glutathione, 50 mM CaCl2) supplemented with 30% w / v (30g per 100mL) PEG 4000 and incubated for 20 min at a temperature of 35-37 ° C to induce fusion between protoplasts.
  • the fused cells are suspended in CGM medium and regenerated on CGM agar for 40 hours.
  • Table 5 compares the solvent concentrations of the must of fermentation, after 48 hours of fermentation, obtained with the strain CNCM 1-4988, filed May 27, 2015 at the Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Dondel Roux, F- 75724 PARIS Cedex 15, France) and the wild strain Clostridium beijerinckii DSMZ 6423.
  • the fermentations were carried out in GAPES medium containing hydrolysed starch substrate (GRITZ, 70 g / L glucose equivalent) in replacement of glucose.
  • the strain CNCM I-4988 is derived from a single round of genetic mixing with strains CNCM I-4986 and CNCM I-4987.
  • strain CNCM 1-4988 produces more butanol than the wild strain, while maintaining an identical level of production of isopropanol.
  • the CNCM 1-5027 strain was isolated as described below.
  • a genetic mixing step was carried out with the CNCM 1-4985 strain and with a strain resulting from a mutagenesis with a solution of NTG at 75 ⁇ g / mL and then selected for its resistance to a CGM medium containing 40 g / L of isopropanol.
  • mutated cells were selected using a CGM selection medium containing 40 g / L isopropanol.
  • Incubation in the selection medium is carried out at a temperature of 35-37 ° C and for 24 hours. After 24 hours of culture, resistant mutants were selected and again incubated at 35-37 ° C and for 24 hours in CGM medium containing 50 g / L isopropanol.
  • the CNCM 1-5027 strain is the result of this second selection step.
  • the CNCM I-5028 strain it is the result of a genetic mixing step carried out with the CNCM I-4985 strain and with two other strains which have undergone a prior step of mutagenesis with NTG (75 ⁇ g / ml). selected in a CGM selection medium containing 40 g / L of isopropanol.
  • the CNCM I-5028 strain is derived from two selection steps using a CGM medium containing 40 g / l of isopropanol and then a CGM selection medium containing 50 g / l of isopropanol.
  • the strain CNCM I-5029 was isolated by applying the protocol described above but in which the genetic mixing step was carried out with two strains resulting from NTG mutagenesis (75 ⁇ / ⁇ ) and selected for their resistance in a CGM selection medium containing 40 g / l of isopropanol. As before, the isolation of the CNCM 1-5029 strain was carried out in two selection steps using a CGM medium containing 40 g / l of isopropanol and then a CGM selection medium containing 50 g / l of isopropanol.
  • Table 6 gives the solvent concentrations of the fermentation must, after 48 hours of fermentation at 37 ° C., obtained with strains CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 and CNCM 1-5029.
  • the fermentations were carried out in GAPES medium, the composition of which is given in Table 1.
  • strains CNCM I-5027, CNCM I-5028 and CNCM I-5029 are capable of producing more isopropanol than the reference strain DSM 6423. Moreover, CNCM I-5028 and CNCM I-5029 make it possible to produce more of butanol relative to strain DSMZ 6423.

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Abstract

La présente invention concerne des bactéries mutantes du genre Clostridium beijerinckii, CNCM I-4985, CNCM I-4986, CNCM I-4987 et CNCM I-4988, déposées le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) et CNCM I-5027, cNCM I-5028 et CNCM I-5029 déposées le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) qui sont utiles dans la fermentation de sucres pour la production d'isopropanol et de butanol.

Description

SOUCHES MUTANTES DU GENRE CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII La présente invention concerne des bactéries du genre Clostridium beijerinckii améliorées par mutagénèse aléatoire ainsi qu'un procédé de production d'un mélange comprenant du butanol et de l'isopropanol au moyen de ces bactéries.
Etat de la technique
De nombreuses molécules chimiques dites "plateformes" composées de 2 à 6 atomes carbones sont principalement produites à partir de ressources fossiles. Ces molécules de base servent à la production de composés intermédiaires dont les utilisations sont variées, comme par exemple pour la synthèse de polymères, de molécules pharmaceutiques, dans les formulations de carburants ou encore dans l'industrie des parfums.
Cependant pour certaines raisons environnementales, mais surtout pour répondre à la diminution inéluctable des ressources pétrolières, des procédés alternatifs sont développés pour permettre la production de ces molécules "plateformes" à partir de matière première renouvelable.
Le propylène (ou propène) est la seconde molécule la plus utilisée dans la pétrochimie. Elle est principalement issue du pétrole et est notamment obtenue par vapocraquage, par craquage catalytique ou par la déshydrogénation du propane.
Une des voies possibles pour produire du propylène autrement qu'à partir de pétrole est de réaliser la déshydratation de l'isopropanol obtenu par fermentation biologique de sucres extraits de la biomasse, fermentation connue sous le nom de fermentation IBE (Isopropanol, Butanol, Ethanol).
Les fermentations dites « fermentation solvantogène » sont réalisées par des microorganismes du genre Clostridium. Les Clostridia sont des bacilles de gram positif capables de former des endospores et appartenant au phylum des Firmicutes. Ces bactéries sont anaérobies strictes et ubiquitaires, elles peuvent être retrouvées dans les intestins des animaux, dans les sols etc. Elles peuvent dégrader différents sucres et produire des solvants à partir d'une large variété de substrats. A l'issue de cette fermentation "solvantogène", les produits finaux peuvent varier selon qu'il s'agisse d'une fermentation de type ABE (production d'Acétone, de Butanol et d'Éthanol) ou IBE (production d'Isopropanol, de Butanol et d'Éthanol).
La souche "ABE" la plus étudiée est Clostridium acetobutylicum ATCC 824, isolée du sol en 1924 dans le Connecticut (Weyer & Rettger, 1927, J. Bacteriol. 14, 399-424). Une autre souche très étudiée est Clostridium beijerinckii DSMZ 6423 (NRRL B593), car capable de produire un mix de solvants Isopropanol/Butanol/Ethanol en réduisant l'acétone en isopropanol grâce à la présence dans son génome d'une alcool-déshydrogénase (adh) primaire/secondaire NADPH dépendante (Ismaiel et al., 1993, J. Bacteriol., 175(16), 5097- 105).
La principale contrainte liée au développement de procédés industriels de production de solvants par des souches de Clostridium est le titre final en solvants, problème qui est mentionné dès les premières constructions d'unités industrielles (Jones, D.T., Woods, D.T., 1986, Microbiological. Reviews. 50(4), 484- 524). La principale cause du faible titre en solvants est la toxicité des produits finaux et particulièrement du butanol. Une concentration en butanol supérieure à 10-12 g/L dans le milieu de culture est connue pour limiter la croissance des souches de Clostridium (Zheng et al., 2009, J. Ind.Microb. & Biotechnol. 36:1 127-1 138)
La majorité des travaux scientifiques effectués jusqu'à aujourd'hui, vise à améliorer la synthèse de butanol par les souches de Clostridium. Pour cela, plusieurs approches ont été appliquées pour améliorer la tolérance au butanol dont celle basée sur la mutagenèse et la sélection de souches de Clostridium capables de résister à des teneurs plus élevées en butanol (US 4,757,010). La technique de mutagenèse aléatoire permet de modifier le patrimoine génétique des souches pour les faire évoluer vers un caractère particulier en exerçant une pression de sélection environnementale. La technique optimise et accélère ainsi le phénomène de sélection naturelle.
Une autre technique qui peut être employée est celle du "brassage génétique" ("génome shuffling" selon la terminologie anglo-saxonne) qui permet de combiner et recombiner l'ADN de génomes entiers de multiples organismes en imitant le processus reproductif mais à plus grande échelle. Le phénomène de recombinaison s'effectue par fusion de protoplastes de souches ayant été par exemple sélectionnées à la suite d'un traitement mutagène et étalement sur milieu sélectif. La combinaison des deux techniques peut favoriser l'obtention de souches présentant une production améliorée de métabolites, une meilleure assimilation du substrat, une plus grande tolérance aux produits formés. A l'heure actuelle, il existe encore un besoin pour de nouvelles souches bactériennes, qui, cultivées dans des conditions de fermentation adéquates, permettent d'obtenir des concentrations améliorées d'un mélange d'isopropanol et de butanol. Résumé de l'invention
La présente invention se rapporte à :
• une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-4985
• une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-4986
· une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-4987
• une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM 1-5027
• une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-5028
• une bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15,
France) sous le n° CNCM I-5029
Les bactéries mutantes CMCM I-4985, CNCM I-4986, CNCM I-4987 ont été obtenues à partir de la souche Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 après traitement de cette dernière avec un agent mutagène, le N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), et sélection dans un milieu contenant une quantité importante d'isopropanol, ou de méthyl bromobutyrate ou d'éthyl bromobutyrate afin de sélectionner les mutants potentiellement intéressants pour la production d'un mélange d'isopropanol et de butanol. Par comparaison avec la souche mère Clostridium beijerinckii DSMZ-6423, les bactéries sélectionnées ont démontré un bénéfice en termes de titre final en solvants Isopropanol et Butanol après fermentation de sucres.
L'invention concerne également une bactérie mutante du genre Clostridium beijerinckii, déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-4988. La souche CNCM I-4988 est issue d'une étape de brassage génétique réalisée avec les souches CNCM I-4986 et CNCM I-4987 suivie d'une étape de sélection reposant sur l'aptitude des mutants à tolérer une concentration importante d'isopropanol dans son environnement.
La souche CNCM 1-4988 mise en œuvre en fermentation a la capacité de produire un mélange de solvants dont la concentration en isopropanol et butanol est améliorée par rapport à la souche Clostridium beijerinckii DSMZ-6423.
L'invention concerne également un procédé de production d'un mélange d'isopropanol et de butanol, par fermentation anaérobie réalisée à une température comprise entre 25 et 37°C, dans un milieu de culture contenant des sucres au moyen d'une bactérie choisie parmi les bactéries CNCM 1-4985, CNCM 1-4986, CNCM 1-4987 et CNCM 1-4988.
Le procédé selon l'invention peut également mettre en œuvre une bactérie choisie parmi les bactéries CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 et CNCM 1-5029. Les bactéries CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 et CNCM 1-5029 ont été obtenues par brassage génétique avec des souches mutées au moyen de l'agent mutagène NTG.
De préférence le milieu de culture contient comme sucre le glucose.
Selon un mode de réalisation, le milieu de culture contient un substrat amylacé hydrolysé. Selon l'invention, le milieu de culture peut contenir de l'acide carboxylique. Par exemple, le milieu de culture contient de l'acide acétique et/ou de l'acide butyrique.
Description détaillée de l'invention Pour améliorer les performances de la souche naturellement productrice d'IBE Clostridium beijerinckii DSMZ-6423, les inventeurs ont procédé à un traitement par un agent mutagène, le N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), de ladite souche afin de modifier son contenu génétique.
La technique de mutagénèse utilisée consiste à effectuer en milieu liquide une mise en contact de l'agent mutagène avec la souche bactérienne, puis à étaler sur différents milieux de culture solide, par exemple dans des boites de Pétri, les souches issues du traitement par le mutagène. Les milieux de culture comprennent des taux d'isopropanol, ou de méthyl bromobutyrate ou d'éthyl bromobutyrate qui sont toxiques pour la souche native de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423. La sélection des souches est fondée sur le principe de recherche de mutants résistant à risopropanol dans l'hypothèse où ces derniers supporteraient une accumulation d'isopropanol lors des essais de fermentation IBE.
L'utilisation du méthyl bromobutyrate ou de l'éthyl bromobutyrate comme produit de sélection se base sur l'article de Clark, S. W., Bennett, G. N., & Rudolph, F. B. {(1989). Isolation and Characterization of Mutants of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Déficient in Acetoacetyl-Coenzyme A:Acetate/Butyrate:Coenzyme A-Transferase (EC 2.8.3.9) and in Other Solvent Pathway Enzymes. Appl. Environ. Microbiol., 55(4), 970-6) dans lequel il est décrit des mutants de Clostridium acetobutylicum ATCC824, sélectionnés pour leur résistance au 2-bromobutyrate, et qui présentent des activités butyraldéhyde et butanol déshydrogénases modifiées. Les inventeurs sont partis de l'hypothèse que des souches ayant une activité butyraldéhyde modifiée sont susceptibles de produire de façon améliorée de risopropanol dans la mesure où les réactions métaboliques impliquées dans la fermentation ABE sont proches de celles d'une fermentation IBE.
Les souches mutées récupérées après l'étape de culture ont vu ainsi leur génome modifié pour acquérir une résistance aux produits toxiques et potentiellement de meilleures facultés fermentaires pour la production de solvants (plus particulièrement en isopropanol et butanol). Les souches résistantes ont alors été cultivées dans un milieu de croissance contenant du glucose ou un substrat amylacé hydrolysé afin de déterminer leur aptitude réelle à produire de risopropanol et du butanol. A l'issue de ces étapes de fermentation, trois souches mutantes de Clostridium beijerinckii ont pu être sélectionnées et ont fait l'objet de dépôts selon le traité de Budapest, auprès de l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F- 75724 PARIS Cedex 15, France), le 27 mai 2015, et qui portent respectivement les références CNCM I-4985, CNCM I-4986 et CNCM I-4987.
Selon l'invention, une souche mutante CNCM I-4988 également déposée selon le traité de Budapest auprès de l'Institut Pasteur a été obtenue par brassage génétique (ou "génome shuffling" selon la terminologie anglo-saxonne) de souches mutantes.
Pour initier l'étape de brassage, des fusions sont induites entre des mutants de Clostridium beijerinckii. Cet échange génétique entre différentes populations mime ainsi les recombinaisons caractéristiques de la reproduction sexuée. Les cellules filles obtenues après brassage sont de nouveau sélectionnées par recherche d'une évolution de leurs profils de fermentation. Le processus de « shuffling » peut être répété sur plusieurs générations (ou tour de brassage) jusqu'à l'obtention d'une souche finale améliorée pour sa capacité à produire des solvants, isopropanol et butanol en particulier, et à tolérer des concentrations importante d'isopropanol dans son environnement.
Ainsi la souche mutante CNCM 1-4988 a été obtenue après un tour de brassage réalisé avec les souches mutantes CNCM 1-4986 et CNCM 1-4987 et avec une sélection de souches pour une tolérance améliorée à l'isopropanol (au-delà de 40 g/L d'isopropanol).
La méthode de mutagénèse employée pour obtenir les souches qui font l'objet de l'invention est décrite de manière détaillée ci-après. La souche départ, également désignée par le terme "wild-type" selon la terminologie anglo- saxonne, est Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 déposée auprès de Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
La souche a été mise en préculture dans un milieu dit GAPES dont la composition est détaillée dans le tableau 1 . L'étape de préculture a été effectuée à une température de 35- 37°C pendant 24 heures.
Figure imgf000007_0001
Tableau 1 : Composition du milieu GAPES
Cette préculture est ensuite utilisée pour initier une culture en milieu CGM (Clostridi Growth Médium), dont la composition est donnée au tableau 2. Composé Concentration [g/L]
Extrait de levure 5
K2HP04 0,75
KH2P04 0,75
MgS04,7H20 0,4
MnS04,H20 0,01
FeS04,7H20 0,01
NaCI 1
Asparagine 2
(NH4)2S04 2
Cystéine 0,125
Glucose 12,5
Tableau 2 : Composition du milieu CGM
Une fois cultivée, la souche sauvage de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 a été soumise à différentes conditions de mutation par contact en milieu liquide CGM avec du N-méthyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidine (NTG ; Sigma-AIdrich) qui est connu pour ses propriétés mutagènes.
Dans une première série de test, la souche sauvage de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 récupérée en phase de croissance exponentielle, c'est-à-dire après 3 à 4 heures de culture, est mise en contact à une température de 35-37°C dans un tube à essai avec du NTG ajouté dans le milieu CGM pour obtenir une concentration de 50 μg/mL de NTG. La mise en contact avec le NTG est de 1 heure.
Les cellules sont lavées deux fois avec une solution tampon de phosphate de potassium (pH = 6,6) avant de les reprendre en milieu CGM frais pour réaliser une étape de régénération de 1 à 3 h à 35°C. Pour l'opération de sélection, les cellules mutées sont étalées sur boîtes de sélection après l'étape de régénération. Le milieu de sélection est un milieu CGM contenant comme agent de sélection l'éthyl bromobutyrate à une concentration de 0,5 mIJL. L'incubation dans le milieu de sélection est effectuée à une température de 35-37°C et pendant 24-48 heures. Au bout de 24 à 48 heures de culture, des mutants présentant une résistance à l'agent de sélection ont été sélectionnés.
Les performances des différents mutants ainsi sélectionnés sont ensuite testées dans des fioles en conditions anaérobies et à l'aide de deux milieux de fermentation différents, à savoir le milieu GAPES décrit dans le tableau 1 et en milieu GAPES auquel on a remplacé le glucose par un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) correspondant à une concentration de 70 g/L équivalent glucose dans ledit milieu. Les fermentations anaérobies sont conduites à une température de 37°C pendant 48 heures et sous agitation.
Dans une seconde série de test, la souche sauvage de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 est mise en culture dans le milieu CGM et recueillie en phase exponentielle, c'est-à-dire après 3 à 4 heures de culture, puis est mise contact avec 75 μg/mL de NTG. Les mutants ont été ensuite sélectionnés dans les mêmes conditions que mentionnées plus haut mais en utilisant comme agent de sélection l'isopropanol à une concentration de 40 g/L.
Les mutants ainsi sélectionnés qui ont acquis une résistance à l'isopropanol sont ensuite testés en fermentation dans des conditions anaérobies en fioles dans le milieu décrit dans le tableau 1 et ainsi qu'en milieu GAPES auquel on a ajouté à la place du glucose un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) afin d'apporter 70 g/L équivalent glucose. Les fermentations anaérobies sont conduites à une température de 37°C pendant 48 heures et sous agitation. Dans une troisième série de test, la souche sauvage de Clostridium beijerinckii DSMZ-6423 est mise en culture dans le milieu CGM et recueillie en phase exponentielle, c'est-à-dire après 3 à 4 heures de culture, puis est mise contact avec 50 μg/mL de NTG. Les mutants sont sélectionnés au moyen d'une solution de culture CGM contenant en outre 40 g/L d'isopropanol.
Les mutants résistants à l'isopropanol sont ensuite testés en fermentation dans des conditions anaérobies en fioles dans le milieu décrit dans le tableau 1 et ainsi qu'en milieu GAPES contenant, à la place du glucose, le substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) apportant 70 g/L d'équivalent glucose. Les fermentations anaérobies sont conduites à une température de 37°C pendant 48 heures et sous agitation.
Le tableau 3 ci-dessous regroupe les résultats d'analyse des solvants produits après 48 heures de fermentation anaérobies en milieu GAPES.
Les solvants sont dosés par une chromatographie en phase gazeuse (appareil Varian®), avec une colonne CP-PoraBOND Q et un détecteur à ionisation de flamme (FID : Flamme Ionisation Detector selon la terminologie anglo-saxonne). Le propan-1 -ol est utilisé comme étalon interne.
Les paramètres de la chromatographie sont les suivants :
Colonne : longueur 25 mètres ; Diamètre interne (ID) : 0,32 mm ; diamètre extérieur (ED) : 0,45 mm ; épaisseur du film : 5 μ\- - Température de l'injecteur : de 90°C à 250°C, 150°C/min Débit du gaz vecteur 1 ,6 mL/min (6,8 psi)
- Température de la colonne : de 50°C à 250°C, 50°C/min
- Température du détecteur FID : 80°C
- Volume d'injection : 1 μΙ_
Ethanol Acétone Isopropanol Butanol
[Solvant] en g/L
C. beijerinckii DS Z 6423 0,1 0,1 2,4 7,3
Concentration en
NTG /
Milieu de sélection N° Souche
6 0,1 0,1 2,8 7,2
50 μ9/ιηΙ_ όθ NTG 7 0,2 0,1 2,5 7,1
/ 8 0,1 0 2,4 7
Milieu de sélection 9* 0,2 0 2,8 10,5
contenant de l'éthyl
bromobutyrate à 0,5
m LA 10 0,1 0,1 2,4 7,2
1 0,2 0,1 2,8 8,3
3 0,2 0 0,3 6,6
NTG 75 xg/ml
5 0,1 0 1 ,9 5,3
1
6* 0,1 0,1 2,3 5,5
Milieu de sélection
7 0,1 0,1 1 ,9 7,8 contenant de
8 0,1 0 0,6 0,7 l'isopropanol à 40g/L
9 0,1 0 2,3 6,5
10 0,1 0 2,2 6,2
1 0,1 0,1 2,5 7,1
NTG 50 xg/ml 2 0,1 0 2,3 6,6
1 3 0,1 0,1 2,7 6,4
Milieu de sélection 4 0,4 0,1 2,4 7
contenant de 5 0,1 0 1 ,9 6,5 l'isopropanol à 40g/L 6 0,2 0 2,4 7,3
7* 0 0 3,9 9,3
Tableau 3 : Concentration en solvants après fermentation en sur milieu GAPES à partir de souches mutantes obtenues par mutagénèse aléatoire au moyen de NTG. Les souches mutantes qui ont fait l'objet d'un dépôt selon le traité de Budapest sont indiquées dans le tableau 3 par un astérisque.
La souche 9* correspond à la souche CNCM I-4985 déposée le 27 mai 2015 auprès de l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France).
La souche 6* correspond à la souche CNCM I-4986 déposée le 27 mai 2015 auprès de l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France).
La souche 7* correspond à la souche CNCM I-4987 déposée le 27 mai 2015 auprès de l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France). Le tableau 4 donne les concentrations en solvants produits au moyen des souches mutantes de Clostridium beijerinckii CNCM 1-4985, CNCM 1-4986 et CNCM 1-4987 par fermentation en milieu GAPES auquel on a remplacé le glucose par un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) à 70 g/L équivalent glucose.
Après fermentation anaérobie pendant 48 heures, les teneurs en glucose sont déterminées par HPLC (Varian®) avec une colonne Aminex®HPX-87P {Biorad, 300 mm de long et 7,8 mm de diamètre) à 80°C. L'éluant utilisé est de l'eau avec un débit de 0,4 mL/min. Le détecteur est un refractomètre (Varian® 350 RI). Le volume d'échantillon injecté est 35 μί. Les solvants sont analysés par chromatographie en phase gazeuse comme mentionné ci- dessus.
Figure imgf000011_0001
Tableau 4 : Concentration en solvants après fermentation en milieu GAPES contenant un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ) (70 g/L équivalent glucose) en remplacement du glucose On constate que la fermentation conduites avec les souches CNCM 1-4985, CNCM 1-4986 et CNCM 1-4987 produisent un moût de fermentation ayant des concentrations plus élevées en isopropanol et en butanol que celui produit par la souche sauvage Clostridium beijerinckii DSMZ 6423.
Les souches mutantes obtenues après l'étape de mutagénèse aléatoire au NTG et sélection pour leur résistance à l'isopropanol à 40 g/L ou à l'éthyl bromobutyrate à 0,5 mIJL, ont été utilisées pour une étape de brassage génétique selon le protocole décrit par Gao, X., Zhao, H., Zhang, G., He, K. & Jin, Y. (2012). Génome shuffling of Clostridium acetobutylicum CICC 8012 for improved production of acetone-butanol-ethanol (ABE). Curr. Microbiol., 65(2), 128- 32.
Les souches mutantes sont d'abord amenées séparément en phase exponentielle en milieu CGM et prélevées après 3 à 4 heures de culture. Les cultures sont ensuite centrifugées pendant 10 minutes à 4000 G et lavées deux fois avec une solution de maléate de sodium monohydrate n°1 (SMM 1 ) à pH 6,5 contenant 0,5 M de sucrose, 20 mM de maléate de sodium monohydrate, et 20 mM de MgCI2.
Les cellules recueillies sont mises en contact, à 35°C pendant 1 h, avec une solution de maléate de sodium monohydrate n°2 qui a la composition suivante : 0,5 M de sucrose, 20 mM de maléate de sodium monohydrate, 20 mM de MgCI2, 1 g/L de cystéine, 1 g/L de glutathione à laquelle on a ajouté 15 mg/mL de lysozyme. A l'issue du traitement, les cellules sont recueillies, lavées avec la solution de maléate de sodium monohydrate n°1 et centrifugées à 4000 G pendant 5 min.
Les différentes populations sont ensuite mélangées dans 10mL d'une solution de maléate de sodium monohydrate n°3 (0,5 M de sucrose, 20 mM de maléate de sodium monohydrate, 20 mM de MgCI2, 1 g/L de cystéine, 1 g/L de glutathione, 50 mM CaCI2) additionnée de 30% w/v (30g pour 100mL) de PEG 4000 et incubées pendant 20 min à une température de 35-37°C afin d'induire une fusion entre protoplastes. Les cellules fusionnées sont mises en suspension en milieu CGM et régénérées sur CGM agar pendant 40 heures.
Plusieurs croisements par fusion de protoplastes ont été réalisés à partir de souches mutantes traitées au NTG. Les souches génétiquement brassées ont été ensuite sélectionnées pour une tolérance accrue à l'isopropanol en milieu CGM (de 45 à 50 g/L d'isopropanol).
Le tableau 5 compare les concentrations en solvants du moût de fermentation, après 48 heures de fermentation, obtenues avec la souche CNCM 1-4988, déposée le 27 mai 2015 auprès de l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) et la souche sauvage Clostridium beijerinckii DSMZ 6423. Les fermentations ont été effectuées en milieu GAPES contenant du substrat amylacé hydrolysé (GRITZ ; 70 g/L équivalent glucose) en remplacement du glucose. La souche CNCM I-4988 est issue d'un seul tour de brassage génétique avec les souches CNCM I-4986 et CNCM I-4987.
Figure imgf000013_0001
Tableau 5 : Concentration en solvants après fermentation en milieu GAPES contenant un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ ; 70 g/L équivalent glucose) en remplacement du glucose
On constate que la souche CNCM 1-4988 produit plus de butanol que la souche sauvage, tout en maintenant un niveau de production en isopropanol identique.
Différentes souches mutantes ont été également obtenues après deux tours de brassage génétique, puis ont été ensuite testées en fermentation anaérobie dans un milieu GAPES additionné d'un substrat amylacé hydrolysé (70 g/L équivalent glucose) en remplacement du glucose.
La souche CNCM 1-5027 a été isolée de la manière décrite ci-dessous.
On a réalisé une étape de brassage génétique avec la souche CNCM 1-4985 et avec une souche issue d'une mutagenèse avec une solution de NTG à 75 μg/mL puis sélectionnée pour sa résistance à un milieu CGM contenant 40 g/L d'isopropanol. Après le tour de brassage, des cellules mutées ont a été sélectionnées en utilisant un milieu de sélection CGM contenant 40 g/L d'isopropanol. L'incubation dans le milieu de sélection est effectuée à une température de 35-37°C et pendant 24 heures. Au bout de 24 heures de culture, des mutants présentant une résistance ont été sélectionnés et ont de nouveau subi une incubation à une température de 35-37°C et pendant 24 heures dans une milieu CGM contenant 50 g/L d'isopropanol. La souche CNCM 1-5027 est le résultat de cette seconde étape de sélection. Quant à la souche CNCM I-5028, elle est le résultat d'une étape de brassage génétique réalisée avec la souche CNCM I-4985 et avec deux autres souches qui ont subi une étape préalable de mutagenèse avec du NTG (75 μg/mL) sélectionnées dans un milieu de sélection CGM contenant 40 g/L d'isopropanol. Comme plus haute, la souche CNCM I-5028 est issue de deux étapes de sélection mettant en œuvre un milieu CGM contenant 40 g/L d'isopropanol puis un milieu de sélection CGM contenant 50 g/L d'isopropanol.
La souche CNCM I-5029 a été isolée en appliquant le protocole décrit ci-dessus mais dans lequel l'étape de brassage génétique a été réalisée avec deux souches issues de la mutagénèse au NTG (75 μηι/ΓΤΐί) et sélectionnées pour leur résistance dans un milieu de sélection CGM contenant 40 g/L d'isopropanol. Comme précédemment, l'isolement de la souche CNCM 1-5029 a été faite en deux étapes de sélection mettant en œuvre un milieu CGM contenant 40 g/L d'isopropanol puis un milieu de sélection CGM contenant 50 g/L d'isopropanol.
Le tableau 6 donne les concentrations en solvants du moût de fermentation, après 48 heures de fermentation à 37°C, obtenues avec les souches CNCM 1-5027, CNCM 1-5028 et CNCM 1-5029. Les fermentations ont été effectuées en milieu GAPES dont la composition est donnée Tableau 1 .
Figure imgf000014_0001
Tableau 6 : Concentration en solvants après fermentation à 37°C en milieu GAPES contenant un substrat amylacé hydrolysé (GRITZ ; 70 g/L équivalent glucose) en
remplacement du glucose On observe que les souches CNCM I-5027, CNCM I-5028 et CNCM I-5029 sont capables de produire plus d'isopropanol que la souche de référence DSM 6423. Par ailleurs CNCM I- 5028 et CNCM I-5029 permettent de produire plus de butanol par rapport à la souche DSMZ 6423.
Figure imgf000016_0001
du mandataire 7080/00/PS
1 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
1-1 Numéro de paragraphe
1-3 Identification du dépôt
1 -3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM)
1 -3-2 Adresse de l'institution de dépôt Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cédex 15, France
1 -3-4 Numéro d'ordre CNCM CNCM 1-4985
1-5 Etats désignés pour lesquels les
indications sont données De toutes les désignations
2 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
2-1 Numéro de paragraphe
2-3 Identification du dépôt
2-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM)
2-3-2 Adresse de l'institution de dépôt Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cédex 15, France
2-3-4 Numéro d'ordre CNCM CNCM 1-4986
2-5 Etats désignés pour lesquels les
indications sont données De toutes les désignations
3 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
3-1 Numéro de paragraphe
3-3 Identification du dépôt
3-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM)
3-3-2 Adresse de l'institution de dépôt Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cédex 15, France
3-3-4 Numéro d'ordre CNCM CNCM 1-4987
3-5 Etats désignés pour lesquels les
indications sont données De toutes les désignations 4 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
4-1 Numéro de paragraphe
4-3 Identification du dépôt
4-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM)
4-3-2 Adresse de l'institution de dépôt Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cédex 15, France
4-3-4 Numéro d'ordre CNCM CNCM 1-4988
4-5 Etats désignés pour lesquels les
indications sont données De toutes les désignations
5 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
5-1 Numéro de paragraphe
5-3 Identification du dépôt
5-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM)
5-3-2 Adresse de l'institution de dépôt Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cédex 15, France
5-3-4 Numéro d'ordre CNCM CNCM 1-5027
5-5 Etats désignés pour lesquels les
indications sont données De toutes les désignations
6 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
6-1 Numéro de paragraphe
6-3 Identification du dépôt
6-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM)
6-3-2 Adresse de l'institution de dépôt Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cédex 15, France
6-3-4 Numéro d'ordre CNCM CNCM 1-5028
6-5 Etats désignés pour lesquels les
indications sont données De toutes les désignations
7 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
7-1 Numéro de paragraphe
7-3 Identification du dépôt
7-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM)
7-3-2 Adresse de l'institution de dépôt Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cédex 15, France
7-3-4 Numéro d'ordre CNCM CNCM 1-5029
7-5 Etats désignés pour lesquels les
indications sont données De toutes les désignations
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0-4 Cette feuille a été reçue en même
temps que la demande internationale
OUI
(oui ou non)
0-4-1 Fonctionnaire autorisé
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0-5 Cette feuille est parvenue au Bureau
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-4985.
2. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-4986.
3. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-4987.
4. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 27 mai 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-4988.
5. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-5027.
6. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-5028.
7. Bactérie du genre Clostridium beijerinckii déposée le 26 novembre 2015 à l'Institut Pasteur (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France) sous le n° CNCM I-5029.
8. Procédé de production d'un mélange d'isopropanol et de butanol par fermentation anaérobie, à une température comprise entre 25 et 37°C, dans un milieu de culture contenant des sucres au moyen d'une bactérie selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel les sucres du milieu de culture est le glucose.
10. Procédé selon les revendications 8 ou 9, dans lequel le milieu de culture contient un substrat amylacé hydrolysé.
1 1 . Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, dans lequel le milieu de culture contient de l'acide carboxylique.
12. Procédé selon la revendication 1 1 , dans lequel le milieu l'acide carboxylique est de l'acide acétique ou de l'acide butyrique
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