CN102199614B

CN102199614B - 一种稳定联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN102199614B
Application number: CN2011100842631A
Authority: CN
Inventors: 董红军; 戴宗杰; 张延平; 李寅
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2011-04-02
Filing date: 2011-04-02
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2031-04-02
Also published as: CN102199614A

Abstract

本发明公开了一种稳定联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用。该工程菌的构建方法，包括如下步骤：将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，得到的重组菌即为所述工程菌。所述次级醇脱氢酶是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下功能由(a)衍生的蛋白质：将丙酮催化成异丙醇。该工程菌可以稳定地生产丁醇、异丙醇和乙醇。

Description

一种稳定联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种稳定联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

随着能源与环境危机的日益加重，迫使人们去寻找新的方法来逐步减少对于化石资源的依赖。通过微生物利用可再生资源来生产化学品是重要的途径之一。

异丙醇(isopropanol)是重要的化工产品和原料。主要用于制药、化妆品、塑料、香料、涂料及电子工业上用作脱水剂及清洗剂。异丙醇作为低成本溶剂或萃取剂在工业和消费产品中的生产中广泛应用。低品质的异丙醇还可用在汽车燃料中。在许多情况下异丙醇可代替乙醇使用。2010年我国对异丙醇的年需求总量将达到30万吨，我国异丙醇主要用作油墨、涂料和制药工业过程中的溶剂或萃取剂，其消费量约占异丙醇总消费量的60％。在化学中间体领域，我国异丙醇主要用于生产异丙胺、异丙醚以及一些酯类，其消费量约占异丙醇总消费量的25％。异丙醇在其他方面的应用主要包括电子工业清洗剂、汽车防冻液、消毒剂、洗涤用品、日化产品等，其消费量约占异丙醇总消费量的15％。

丁醇是一种优良的可替代汽油的生物燃料，这是因为丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，不会腐蚀管道，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合，因此是一种极具潜力的新型生物燃料。同时丁醇还是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，是一种高附加值化学品，全球年需求量超过140万吨。

1861年巴斯德首次发现细菌能够产生丁醇，1912年魏兹曼(Weizmann)发现了一种梭菌Clostridium acetobutylicum能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇。有研究发现拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593和NESTE 255可以在细胞内合成大约100mM的异丙醇，其合成机理是通过一种异丙醇醇脱氢酶(又称次级醇脱氢酶，secondary alcohol dehydregenase，SADH)将丙酮催化成异丙醇。

发明内容

本发明的目的是提供一种联产异丙醇和丁醇的工程菌及其构建方法与应用。

本发明所提供的工程菌，按照包括如下步骤的方法构建：将次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)整合到产丁醇梭菌的基因组中，得到的重组菌即为所述工程菌。该方法使得次级醇脱氢酶的编码基因能够随着染色体的复制而复制，实现稳定表达。

所述次级醇脱氢酶具体可为如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下功能由(a)衍生的蛋白质：将丙酮催化成异丙醇。

所述次级醇脱氢酶的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述次级醇脱氢酶的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述次级醇脱氢酶的DNA分子。

所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，可通过下述任一种方法实现：同源重组法、二型内含子整合法、特异位点整合法和随机位点整合法。但不限于这几种方法，包括任何可以在基因组中进行整合外源基因的方法。

所述同源重组方法包括使用自杀载体进行重组，也包括使用复制性质粒和线性DNA片段进行的重组方式。

所述同源重组方法的整合位点是指染色体任何可以插入外源片段的位点。

所述二型内含子整合法具体可为通过Ll.ltrB二型内含子的方法插入到产丁醇梭菌的基因组中。其中，插入位点是指产丁醇梭菌基因组中任何可以允许插入的DNA位点。

所述特异位点整合法是将次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)通过特异位点的重组酶的帮助插入到产丁醇梭菌的基因组中。

所述随机位点整合法是将次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)通过以随机方式整合到产丁醇梭菌的基因组中。所述随机方式整合包括转座子和噬菌体等机制的外源DNA整合到产丁醇梭菌基因组的方式。

所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，可通过将所述次级醇脱氢酶的编码基因整合到所述产丁醇梭菌的染色体中的如下位点实现：尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)位点或16S rDNA位点。但不限于这几个位点，包括基因组中任何可以整合外源基因的DNA位点。

所述产丁醇梭菌具体可为丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌，但不限于这两株菌，也包括其它可以生产丁醇的梭菌。产丁醇梭菌可以是野生型菌株，也可以是经过诱变或遗传改造后的菌株。

所述产丁醇梭菌包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、C.saccharoperbutylacetonicum和C.saccharobutylicum，不仅包括野生型菌株，也包括经过诱变和基因工程方法改造后的产丁醇梭菌。

所述拜氏梭菌(C.beijerinckii)具体可为拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052，所示丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)具体可为丙酮丁醇梭菌SMB009。

所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，可通过将如下片段导入所述产丁醇梭菌中实现：由所述次级醇脱氢酶的编码基因和启动所述次级醇脱氢酶的编码基因转录的启动子组成的DNA片段；所述启动子具体可为丙酮丁醇梭菌硫解酶启动子(Pthl)，序列为序列表中序列2或序列8的第287至436位，但不限于Pthl，也包括其它在产丁醇梭菌可以行使功能的启动子。

由所述次级醇脱氢酶的编码基因和启动所述次级醇脱氢酶的编码基因转录的启动子组成的DNA片段的核苷酸序列具体可为序列8的第287-1498位。

所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，可通过将pEK18-upp(8052)-sadh导入所述产丁醇梭菌中实现。所述pEK18-upp(8052)-sadh是将如下DNA片段插入pEK18-upp(8052)的多克隆位点得到的重组载体：由序列1所示的次级醇脱氢酶编码基因sadh和启动sadh转录的序列8的第287至436位或序列2所示的丙酮丁醇梭菌硫解酶启动子(Pthl)组成的DNA片段；所述pEK18-upp(8052)是将序列4所示的尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)上游片段和序列5所示的尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)下游片段插入pEK18的多克隆位点得到的中间重组载体；所述pEK18-upp(8052)中，所述尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)上游片段位于所述尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)下游片段的上游；所述pEK18为将红霉素抗性基因插入pK18mobsacB的多克隆位点得到的另一中间重组载体。

所述红霉素抗性基因的核苷酸序列具体可为序列3。

所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，还可通过将pEK18-16S(8052)-sadh导入所述产丁醇梭菌中实现。所述pEK18-16S(8052)-sadh按照如下方法构建：1)利用引物16S(8052)-1(CGCGAATTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACG)、16S(8052)-2(TATCTGCAGTACTTTCCTCTCCTGCACTCTAG)从拜氏梭菌NCIMB8052基因组中扩出0.7kb的16S rDNA基因上游片段，利用引物16S(8052)-3(CGACTCGAGCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAG)和16S(8052)-4(GCGAAGCTTAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGG)扩出0.9kb的16S rDNA基因下游片段。

先利用EcoRI和PstI位点，将0.7kb的片段连接到pEK18-upp(8052)-sadh中，得到的质粒再用XhoI和HindIII位点连入0.9kb片段，得到pEK18-16S(8052)-sadh。

所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，还可通过将pMTL009-upp-sadh导入所述产丁醇梭菌中实现。所述pMTL009-upp-sadh按照包括如下步骤的方法构建：

1)upp基因敲除质粒pMTL009-upp的构建

引物：

upp120/121s-IBS：

AAAAAAGCTTATAATTATCCTTAGCAATGCTAATGGTGCGCCCAGATAGGGTG

upp120/121s-EBS2：

TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTATTGCTCGATAGAGGAAAGTGTCT

upp120/121s-EBS1d：

CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCCTAATGGCTAACTTACCTTTCTTTGT

EBS Universal：CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC

以pMTL009质粒为模板，分别以upp120/121s-IBS和EBS Universal为一对引物，以upp120/121s-EBS1d和upp120/121s-EBS2为另一对引物，进行PCR扩增，将得到的两段PCR产物进行融合PCR(融合PCR的模板为两段产物，引物为upp120/121s-IBS和upp120/121s-EBS1d)，得到353bp的PCR产物，随后用HindIII和BsrGI对该353bp的PCR产物和pMTL009质粒进行酶切连接，得到pMTL009-upp。

2)构建sadh基因的基因组插入载体pMTL009-upp-sadh

使用引物upp120/121s-IBS和引物591-Intron-2

(ATCGACTAGTCGCCACGTAATAAATATCTGGACG)以pMTL009-upp为模板，扩增出内含子片段intron，用引物592-Pthl-sadh-1

(ATCGACGCGTTCTAGACTCGAGTATATTGATAAAAATAATAATAGTGGG)和

593-Pthl-sadh-2(ATCGACTAGTTTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC)从pSADH质粒中扩增Pthl-sadh片段，将上述两个PCR产物与pMTL009-upp载体混合，用HindIII、SpeI、MluI二型限制性内切酶进行酶切后连接得到pMTL009-upp-sadh；所述pSADH是将如下DNA片段插入pITF多克隆位点得到的重组质粒：由序列1所示的次级醇脱氢酶编码基因sadh和启动sadh转录的序列8的第287至436位或序列2所示的丙酮丁醇梭菌硫解酶启动子(Pthl)组成的DNA片段；该DNA片段的核苷酸序列具体可为序列8的第287-1498位。

由上述方法得到的工程菌具体可为将pEK18-upp(8052)-sadh导入拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052，得到的所述次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)整合到拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052的基因组中的重组菌；所述工程菌具体还可为将pEK18-16S(8052)-sadh导入拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052，得到的所述次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)整合到拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052的基因组中的重组菌；所述工程菌具体还可为将pMTL009-upp-sadh导入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB009，得到的所述次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)整合到丙酮丁醇梭菌SMB009的基因组中的重组菌，如保藏号为CGMCC No.4724的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB312。

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB312已于2011年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

上述工程菌可在如下条件下发酵生产醇：发酵温度为35℃-40℃，所述发酵温度具体为35℃、37℃或40℃；发酵时间可为55h-65h，所述发酵时间具体为55h、60h或65h；

所述发酵培养基的pH为6.5-6.95，所述发酵培养基的pH具体为6.5、6.75或6.95。

实验证明本发明的工程菌可以稳定地生产丁醇、异丙醇和乙醇。

附图说明

图1为将次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)通过同源重组方法整合到拜氏梭菌NCIMB8052基因组upp位点示意图

图2为将次级醇脱氢酶的编码基因(sadh)通过二型内含子插入方法整合到丙酮丁醇梭菌SMB009基因组upp位点

图2中，pEK-upp-sadh表示pEK18-upp(8052)-sadh

图3为菌株SMB310测序验证结果

图3中，有下横线部分表示插入的Pthl-sadh片段(粗体部分表示酶切位点)，其它序列为upp基因上、下游的染色体序列

图4为菌株SMB311测序验证结果

图4中，有下横线部分表示插入的Pthl-sadh片段(粗体部分表示酶切位点)，其它序列为染色体上16s rDNA基因序列

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、将次级醇脱氢酶的编码基因sadh通过同源重组方法整合到拜氏梭菌NCIMB8052基因组upp位点

1)次级醇脱氢酶编码基因sadh的克隆及表达元件构建

采用细菌基因组提取试剂盒提取拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593(购自ARS(NRRL)Culture Collection)的基因组DNA，以此为模板，用以下引物进行PCR扩增：

B593-1：CGCGGATCCATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGGTATTAATAA

B593-2：CCGGAATTCTTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC

使用的DNA聚合酶为TAKARAPrimerSTAR HS高保真酶，PCR扩增程序为：

将所得的PCR产物使用PCR产物回收试剂盒纯化，送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该PCR产物的基因名称为sadh(GenBank数据库中的登录号是AF157307.2的从2351到3406之间的1056bp序列，次级醇脱氢酶编码基因)。

随后用NEB公司的BamHI-HF(-HF表示高保真，以下同)和EcoRI-HF对纯化的PCR产物进行双酶切，37℃静置4h后，用DNA回收试剂盒纯化酶切后的PCR产物，-20℃保存。

采用质粒小提试剂盒提取E.coli中的pITF质粒(Wang，S.，Y.Zhang，et al.″Formic AcidTriggers the″Acid Crash″of Acetone-Butanol-Ethanol Fermentation of C.acetobutylicum.″ApplEnviron Microbiol，published online ahead of print on 7 January 2011，公众可从中国科学院微生物研究所获得)。pITF质粒由pIMP1衍生而得，含有硫解酶启动子(Pthl)的质粒，硫解酶启动子序列见列表中序列2。取适量的质粒，同样用NEB公司的BamHI-HF和EcoRI-HF对其双酶切，随后用DNA回收试剂盒纯化回收酶切后的质粒DNA，-20℃保存。

取适量的经过双酶切的PCR产物和质粒DNA(其含量比例大于5∶1)用T4DNA连接酶进行连接反应，16℃保存4-8h。取5μl的连接产物，加入100μl的高效感受态细胞(E.coli JM109)中，混匀；冰浴放置30min后，42℃水浴热激90s；冰浴放置2min，加入800μl新鲜LB培养基，37℃，150rpm，放置45min；取100μl菌液涂布于含氨苄青霉素的LB平板上。培养20-24h后，挑取单菌落少量细胞，用于菌落PCR验证阳性克隆子。将阳性克隆子划线分离，并取单菌落用于富集培养，提取质粒，送去测序，结果证明该质粒为将序列表中的序列1插入pITF质粒BamHI和EcoRI酶切位点间得到的载体，该载体命名为pSADH，其中的sadh基因表达元件称为Pthl-sadh片段。

2)自杀质粒pEK18的构建

利用引物Erm1(TGGAAGCTTGTGCTCTACGACCAAAAG)和Erm2

(AGGGCTAGCGTGAATGCGCAAAAGACAT)从pIMP1质粒(Mermelstein，L.D.，N.E.Welker，G.N.Bennett，and E.T.Papoutsakis.(1992).Expression ofcloned homologous fermentative genesin Clostridium acetobutylicum ATCC 824.Bio/Technology.10：190-195，公众可从中国科学院微生物研究所获得)中扩出红霉素抗性片段Erm(见序列表中序列3)，将所得的PCR产物采用PCR产物回收试剂盒纯化，然后使用NEB公司的HindIII和NheI将PCR产物进行双酶切，37℃温浴4h后，用DNA回收试剂盒纯化酶切后的PCR产物，-20℃保存。对于载体pK18mobsacB载体(A.et al.1994.Small mobilizable multi-purpose cloning vectorsderived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19：selection of defined deletions in thechromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene 145：69-73.公众可从中国科学院微生物研究所获得)，同样用NEB公司的HindIII和NheI对其双酶切，随后用DNA回收试剂盒纯化回收酶切后的质粒DNA，-20℃保存。

取适量的经过双酶切的PCR产物和质粒DNA(其含量比例大于5∶1)用T4DNA连接酶反应，16℃保存4-8h。转化后得到的阳性转化子提取质粒，经测序验证，结果显示该质粒为将序列表中序列3插入pK18mobsacB质粒的HindIII和NheI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pEK18。

3)构建用于敲除拜氏梭菌NCIMB8052中upp基因的重组质粒pEK18-upp(8052)

采用细菌基因组提取试剂盒提取拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052(购自NCIMBCulture Collection)的基因组DNA，以此为模板，用以下引物进行PCR扩增：

upp-up-1：CGCGAATTCGTGAATGCGCAAAAGACATAATC

upp-up-2：TATCTGCAGTATTATTCCTCCAAGTTTGCTTTTAG

upp-down-1：CGACTGCAG ACTAGT CTCGAGTTAGTAATTTATTAGAATTAAAAG

upp-down-2：GCGAAGCTTCTTGATCTAACATTTCTCTGTGTTG

得到各1000bp的upp基因上下游片段upp-up和upp-down，序列分别见序列表中序列4和5。将所得的PCR产物采用PCR产物回收试剂盒纯化，然后将二者与适量pEK18载体混合，使用NEB的EcoRI、PstI、HindIII对混合物进行酶切反应，得到的酶切产物经DNA纯化试剂盒纯化后，使用T4DNA连接酶进行连接反应，16℃连接4-8h。转化大肠杆菌后得到的阳性质粒，经测序证明该质粒为将序列表中的序列4和序列5插入到了pEK18质粒的EcoRI和HindIII酶切位点间得到的载体，两片段由PstI位点连接，该质粒命名为pEK18-upp(8052)。

4)将sadh基因表达元件Pthl-sadh连接到pEK18-upp(8052)中

利用引物Pthl-sadh-1(CGACTGCAG TATATTGATAAAAATAATAATAGTGG)和Pthl-sadh-2(CGACTGCAGCTTAATTAAAGCAGTAGTTATATTATAA)从前面构建好的pSADH载体扩出Pthl-sadh片段，得到的PCR产物采用PCR产物回收试剂盒纯化后，将之与适量pEK18-upp(8052)载体混合，然后使用NEB公司的PstI和XhoI位点进行酶切，37℃温浴2h后，对酶切产物利用DNA纯化试剂盒进行纯化，之后使用T4DNA连接酶进行连接反应，16℃连接8h。转化后得到的转化子利用引物Pthl-sadh-1和Pthl-sadh-2进行PCR筛选，对阳性转化子提取质粒，进行测序验证，最终得到的正确质粒命名为pEK18-upp(8052)-sadh。

5)pEK18-upp(8052)-sadh与拜氏梭菌NCIMB8052染色体DNA进行同源交换

制备梭菌感受态的培养基为强化梭菌培养基(RCM，每升培养基含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g，NaCl 5.0g，淀粉10.0g，乙酸钠3.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g)。拜氏梭菌NCIMB8052菌体生长至OD₆₀₀＝0.8时，收集菌体，用ETB溶液(270mM蔗糖，5mM磷酸二氢钠，pH 7.4)洗涤菌体两次，最后用适量ETB溶液悬浮菌体，分装成600μl/管待转化。所有操作保持菌体在厌氧状态及冰上(4℃离心)。

将构建好的10μl pEK18-upp(8052)-sadh与菌体混合，置于冰上10min，然后将混合物转移至4mm电击杯内进行转化，使用的电转化参数为：电压2.0kV，电容25μF，电阻∞。典型电击持续时间为12ms。电转化完毕后，立即将菌液转至10ml RCM培养基中，复壮4-6h，涂布于含25μg/ml红霉素的RCM平板上，37℃厌氧培养36h。对于长出的红霉素抗性菌落，在含50μg/ml 5-氟尿嘧啶(5-FU)的RCM固体平板中验证抗性，选择5-FU敏感的菌落接种无抗RCM液体培养基，经过三次传代培养后，稀释涂布于50μg/ml 5-氟尿嘧啶(5-FU)的RCM平板，挑选抗性菌落进行使用试剂盒提取基因组DNA做为模板，利用引物upp-up-1和upp-down-2进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分析，野生型的条带理论上为2.6kb，而突变体的条带为3.2kb。从检测的16个抗性菌落中，筛选得到了3个突变体菌落，选择其中的一个PCR产物利用引物upp-1(CAGATACATTTAGTGCCCATGCAAC)、upp-2(CTTATGCAACTATTCAAGTCCAT)进行测序分析发现(图3，序列8)，原来的upp基因确实被Pthl-sadh片段所替代。将其中的1个突变体菌株命名为C.beijerinckii SMB310。

实施例2、将次级醇脱氢酶编码基因sadh通过同源重组方法整合到拜氏梭菌NCIMB8052基因组16S rDNA位点

本实施例选择拜氏梭菌NCIMB8052基因组中的16s rDNA基因(序列信息见序列表中序列6)为sadh基因整合位点。利用引物16S(8052)-1

(CGCGAATTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACG)、16S(8052)-2

(TATCTGCAGTACTTTCCTCTCCTGCACTCTAG)从拜氏梭菌NCIMB8052基因组中扩出0.7kb的16S rDNA基因上游片段，利用引物16S(8052)-3

(CGACTCGAGCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAG)和16S(8052)-4

(GCGAAGCTTAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGG)扩出0.9kb的16S rDNA基因下游片段。

先利用EcoRI和PstI位点，将0.7kb的片段连接到pEK18-upp(8052)-sadh中，得到的质粒再用XhoI和HindIII位点连入0.9kb片段，最终得到的质粒命名为pEK18-16S(8052)-sadh。利用实施例1中的方法将这个质粒转化拜氏梭菌NCIMB8052，得到红霉素抗性菌落后，在无抗液体RCM液体培养基中连续传代3次，然后稀释涂布无抗RCM固体平板，菌体形成单菌落后，利用牙签挑取菌落，分别划线至无抗RCM固体平板和含25μg/ml红霉素的RCM固体平板，划线面积约为1平方厘米，两个菌落在平板的位置相对应，37℃厌氧培养36h形成菌落后，观察两个平板中菌落的生长情况，挑选只在无抗平板中生长而在抗性平板中不能生长的菌落做进一步验证。对于这些无抗菌落，提取基因组后利用引物Pthl-sadh-1和16S(8052)-4进行PCR验证，突变体的条带为2kb，而野生型不能扩出条带。从2000个菌落中挑选到了3个只在无抗平板上生长的菌落，利用PCR进行验证，发现其中的1个菌落为目标突变体，并且进行了测序验证(图4)，证明Pthl-sadh片段确实插入到了拜氏梭菌NCIMB8052的一个16S rNDA基因中。该突变体命名为C.beijerinckii SMB311。

实施例3、将次级醇脱氢酶编码基因sadh通过二型内含子插入方法整合到丙酮丁醇梭菌SMB009基因组upp位点

1)upp基因敲除质粒pMTL009-upp的构建

对upp基因序列进行计算和分析，设计以下引物：

upp120/121s-IBS：

AAAAAAGCTTATAATTATCCTTAGCAATGCTAATGGTGCGCCCAGATAGGGTG

upp120/121s-EBS2：

TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTATTGCTCGATAGAGGAAAGTGTCT

upp120/121s-EBS1d：

CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCCTAATGGCTAACTTACCTTTCTTTGT

EBS Universal：CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC

以pMTL009质粒(Dong，H.，Y.Zhang，et al.″Engineering C.strain to accept unmethylatedDNA.″PLoS One 5(2)：e9038，公众可从中国科学院微生物研究所获得)为模板，分别以upp120/121s-IBS和EBS Universal为一对引物，以upp120/121s-EBS1d和upp120/121s-EBS2为另一对引物，采用全式金公司的Taq酶进行PCR扩增，其PCR扩增程序均为：

将所得的PCR产物进行核酸电泳然后切胶回收，然后将两段产物进行融合PCR(融合PCR的模板为两段产物，引物为upp120/121s-IBS和upp120/121s-EBS1d)，得到的353bp产物进行PCR产物回收，随后用NEB公司的HindIII和BsrGI对纯化的PCR产物和pMTL009质粒进行混合酶切，37℃温浴4h后，用DNA回收试剂盒纯化消化的DNA产物，然后用T4DNA连接酶进行反应，16℃连接4-8h。取2μl的连接产物，加入100μl高效感受态细胞(E.coliJM109)中，混匀；冰浴放置30min后，42℃水浴热激90s；冰浴放置2min，加入800μl新鲜LB培养基，37℃，150rpm，放置45min；吸取100μl菌液涂布于含氯霉素的LB平板上。培养20h-24h后，将克隆划线分离，并取单菌落用于富集培养，提取质粒，并且测序验证，最终得到的质粒命名为pMTL009-upp。

2)构建sadh基因的基因组插入载体pMTL009-upp-sadh

使用引物upp120/121s-IBS和引物591-Intron-2

(ATCGACGCGTTCTAGACTCGAGTATATTGATAAAAATAATAATAGTGGG)和

593-Pthl-sadh-2(ATCGACTAGTTTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC)从前面构建的pSADH质粒中扩增Pthl-sadh片段，将上述两个PCR产物经试剂盒纯化后，与适量pMTL009-upp载体混合，用NEB公司的HindIII、SpeI、MluI二型限制性内切酶在NEBBuffer2中37℃酶切3h，然后利用试剂盒纯化DNA，得到的混合物用T4DNA连接酶进行连接，连接条件为16℃、8hours，然后转化大肠杆菌。用引物592-Pthl-sadh-1和593-Pthl-sadh-2筛选阳性转化子，并进行测序验证，得到的正确质粒命名为pMTL009-upp-sadh。

3)pMTL009-upp-sadh转化丙酮丁醇梭菌SMB009及sadh基因在upp位点的插入

丙酮丁醇梭菌电转感受态细胞的制备：厌氧环境下，取RCM培养基培养的对数中期的丙酮丁醇梭菌SMB009(Dong，H.，Y.Zhang，et al.″Engineering Clostridiumstrain to acceptunmethylated DNA.″PLoS One 5(2)：e9038，2010，公众可从中国科学院微生物研究所中获得)细胞液约48ml置于50ml的可密封的离心管(Nalgene)中，冰浴放置10min。4℃，2000g离心10min。厌氧环境下，去上清液，加入足量预冷的电转缓冲液(270mM蔗糖，5mM NaH₂PO₄，pH7.4)，洗涤两次，并重新悬浮到1.5ml的电转缓冲液，放置冰浴用于电转化。

丙酮丁醇梭菌的转化：取0.4cm的电转杯，放置在冰浴中冷却，加入2μg质粒pMTL009-upp-sadh和600μl新鲜配制的SMB009感受态细胞，冰浴放置2min。采用2.0kv脉冲电压和25μF的电容进行电转化；随后将电转液加到含10ml RCM培养基的厌氧瓶中静置厌氧培养4h(37℃)。离心收集细胞，并将所得细胞涂布于3-5个含氯霉素抗性的RCM琼脂培养基(氯霉素在培养基中的终浓度为30mg/l)中。培养24-36h后，挑取单菌落接入无抗性的RCM液体培养基中培养，然后吸取100μl菌液放入900μl RCM液体培养基中进行梯度稀释，然后涂布到含50μg/ml 5-氟尿嘧啶(5-FU)的RCM平板中，对于能够生长的菌落通过菌落PCR进行验证(引物为262-upp-1：CAATGGAGGAATGAAATAATGAGTAAAG、263-upp-2：GAGGAAGTTTACAGAAGTATTCTACAGG)，结果显示分析的8个菌落中有6个菌落的条带为2.5k(upp片段0.4kb+插入片段2.1kb(包括内含子0.9k和Pthl-sadh片段1.2k))，另外两个为0.4kb，是野生型条带的大小，说明upp可能发生了自发突变，使得菌体具有5-FU抗性。得到的菌落经无抗培养丢失质粒后，最终得到的菌株命名为C.acetobutylicum SMB312。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB312已于2011年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，编号为CGMCC No.4724。

实施例4、工程菌的发酵分析

方法一：

分别将实施例1得到的工程菌C.beijerinckii SMB310，实施实例2得到的工程菌C.beijerinckii SMB311，实施实例3得到工程菌C.acetobutylicum SMB312 CGMCC No.4724，进行厌氧发酵(转速150rpm，通氮气，利用发酵罐进行发酵)60h。

发酵培养基为RCM培养基，按照如下方法制备：溶质为：酵母粉(OXOID，1112852-02)：3g/L；胰蛋白胨(OXOID，955927)：10g/L；牛肉浸膏(北京化学试剂公司，69004494)：10g/L；Cys-HCl(国药集团化学试剂有限公司，62007534)：0.5g/L；无水乙酸钠(国药集团化学试剂有限公司，10018892)：3g/L；氯化钠10g/L；葡萄糖：5g/L；可溶性淀粉：5g/L(这三个为：北京现代东方精细化学品有限公司)，溶剂为水。发酵培养到对数中期，以5％-10％的接种量接种到含CGM培养基(葡萄糖70g/L；硫酸镁0.4g/L；硫酸锰0.01g/L；硫酸亚铁0.01g/L；氯化钠1g/L；酵母粉5g/L(OXOID，1112852-02)；硫酸铵2g/L；磷酸二氢钾0.75g/L；磷酸氢二钾0.75g/L；天冬氨酸2g/l；溶剂为水；115℃条件下灭菌20分钟，pH为6.75)的发酵罐中，低转速(转速150rpm)培养，发酵温度为37℃，发酵时间为60h。实验重复三次。

方法二：

与方法一基本相同，不同的是：发酵温度为35℃，发酵时间为55h；发酵培养基的pH为6.5；

每1L发酵采用的培养基CGM培养基按照如下方法制备：

75g葡萄糖、0.1g硫酸镁、0.005g硫酸锰、0.005g硫酸亚铁、0.5g氯化钠、4.5g酵母粉、1.5g硫酸铵、0.5g磷酸二氢钾、0.5g磷酸氢二钾、1.5g天冬氨酸和水混合，用水补至1L，得到的培养基。

方法三：

与方法一基本相同，不同的是：发酵温度为40℃，发酵时间为65h；发酵培养基的pH为6.95；

每1L发酵采用的培养基按照如下方法制备：

85g葡萄糖、0.8g硫酸镁、0.015g硫酸锰、0.015g硫酸亚铁、1.5g氯化钠、5.5g酵母粉、2.5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、1g磷酸氢二钾、2.5g天冬氨酸和水混合，用水补至1L，得到的培养基。

分别取方法一得到的各发酵液离心后的上清液进行高效液相色谱(HPLC)分析，Agilent1200液相色谱仪，示差检测器；BioRad Aminex HPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H₂SO₄溶液，流速0.5ml/min。以C.beijerinckii NCIMB8052为对照菌株，分析工程菌C.beijerinckii SMB310、C.beijerinckii SMB311；以C.acetobutylicumSMB009为对照菌株，分析工程菌C.acetobutylicum SMB312。

标准品为丁醇、异丙醇、丙酮、乙醇，标准品保留时间各为40分钟、24分钟、27分钟、23分钟，而样品在相应时间也有出峰，因此说明样品中含有丁醇、异丙醇、丙酮、乙醇，根据标准物质浓度与峰面积的实际关系，确定的计算公式为：乙醇，y＝74597x，R²＝0.999；丙酮，y＝98441x，R²＝0.9897；异丙醇，y＝113164x，R²＝0.9968；丁醇，y＝131478x，R²＝1；其中x表示物质的浓度(g/L)，y表示实际峰面积。

结果如下表1所示：

表1为各工程菌的构建方法及醇产量

采用上述方法检测方法二和方法三得到的发酵液，结果与方法一无显著差异。

Claims

1.一种工程菌的构建方法，包括如下步骤：将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，得到的重组菌即为所述工程菌；

所述次级醇脱氢酶是由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述次级醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，通过将如下片段导入所述产丁醇梭菌中实现：由所述次级醇脱氢酶的编码基因和启动所述次级醇脱氢酶的编码基因转录的启动子组成的DNA片段；由所述次级醇脱氢酶的编码基因和启动所述次级醇脱氢酶的编码基因转录的启动子组成的DNA片段的核苷酸序列为序列8的第287-1498位；

所述产丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将次级醇脱氢酶的编码基因整合到产丁醇梭菌的基因组中，通过下述任一种方法实现：同源重组法、二型内含子整合法、特异位点整合法和随机位点整合法。

3.权利要求1或2所述的方法得到的工程菌。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为下述a或b或c所述的重组菌：

a、将pEK18-upp(8052)-sadh导入拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052，得到的所述次级醇脱氢酶的编码基因整合到拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052的基因组中的重组菌；

b、将pEK18-16S(8052)-sadh导入拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052，得到的所述次级醇脱氢酶的编码基因整合到拜氏梭菌(C.beijerinckii)NCIMB8052的基因组中的重组菌；

c、将pMTL009-upp-sadh导入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB009，得到的所述次级醇脱氢酶的编码基因整合到丙酮丁醇梭菌SMB009的基因组中的重组菌，即保藏号为CGMCC No.4724的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB312。

5.权利要求4所述的工程菌在生产醇中的应用，所述醇为下述三种醇中的至少一种：丁醇、异丙醇和乙醇。