CN105274041B - 一株重组大肠杆菌及其在生产2-丁醇中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株重组大肠杆菌，所述菌株命名为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet‑fdh‑adh，该菌株含有甲酸脱氢酶基因fdh和醇脱氢酶基因adh，其中所述fdh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述adh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；该菌株已于2015年9月23日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M 2015572。本发明还公开了所述菌株作为生物催化剂在催化2‑丁酮生产2‑丁醇中的应用，实验证实应用本发明的菌株制备的2‑丁醇浓度可达18.2克/升(转化率达0.68g/g)以上，并且实现辅因子的再生，极具工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株基因重组菌及其应用，具体的说，涉及一株共表达甲酸脱氢酶(FDH)基因fdh和醇脱氢酶(ADH)基因adh的重组大肠杆菌及其在催化2-丁酮生产2-丁醇中的应用。
背景技术
2-丁醇为无色透明液体，有葡萄酒香味。能与醇、酯、醚、芳香烃等多种有机溶剂混溶，是一种有价值的生物燃料，具有较高的辛烷值，低吸湿性，比乙醇更高的能量密度，与汽油相同的功能【1】。当2-丁醇转化成2-丁烯时，可在聚酯和其它生物塑料的合成中使用【2,3】。
已报道的2-丁醇生产方法分为传统的化学法和生物法。化学方法通常采用正丁烯水合法【4】，该过程使用的起始原料来自石油化工产品，通常既昂贵又不环保。利用生物法生产2-丁醇具有原材料成本低、反应条件温和等优势。文献【5】报道利用乳杆菌生产2-丁醇的研究，筛选42种不同乳酸菌菌株，证明了其利用meso-2,3-丁二醇产生2-丁醇的能力，文献【6】利用酿酒酵母共表达来自乳酸菌的B12-醇脱水酶和来自大头茶属的仲醇脱氢酶，转化meso-2,3-丁二醇生产4mg/L 2-丁醇。
近年来，研究者也进行利用基因工程改造微生物从葡萄糖生产2-丁醇的研究，文献【7】报道基因工程改造肺炎克雷伯氏菌生产2-丁醇，共表达来自肺炎克雷伯氏菌的乙酰乳酸合酶(ILVIH)、酮酸苯双甲吗啉异构酶(ILVC)、二羟酸脱水酶(ILVD)和来自乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶(KIVD)和醇脱氢酶(ADHA)，以葡萄糖为底物可生产320mg/L 2-丁醇。该肺炎克雷伯氏菌经过进一步改造，共表达二醇脱水酶和仲醇脱氢酶，敲除副产物乳酸合成基因ldhA，添加辅因子B12，2-丁醇产量提高至1030mg/L【8】。但是该菌株生产2-丁醇产量较低且工艺繁琐，并有副产物如乳酸、乙偶姻的生成，降低了产物纯度，增加了后期分离纯化的成本。基于此，迫切需要寻找更好的方法或途径，以实现2-丁醇的高效生产。
参考文献：
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发明内容
针对上述现有方法中，产品的生产率低，成本高，难以大规模生产的不足。本发明要解决的问题是提供一株共表达甲酸脱氢酶基因fdh和醇脱氢酶基因adh的重组大肠杆菌及其在催化2-丁酮生产2-丁醇中的应用。
本发明所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-fdh-adh，该菌株含有甲酸脱氢酶(FDH)基因fdh和醇脱氢酶(ADH)基因adh，其中所述fdh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述adh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述菌株已于2015年9月23日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M 2015572。
上述重组大肠杆菌为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，该菌的较佳培养温度为37±1℃，可以在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上生长。具有能催化2-丁酮产生2-丁醇的特性。
上述重组大肠杆菌以如下方法制得：
克隆甲酸脱氢酶(FDH)基因fdh，构建重组质粒pETDuet-fdh；将醇脱氢酶(ADH)基因adh连接到pETDuet-fdh上，得到质粒pETDuet-fdh-adh；将该质粒经转化导入宿主E.coliBL21(DE3)中得到重组基因工程菌株——大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-fdh-adh。
本发明所述重组大肠杆菌作为生物催化剂在催化2-丁酮生产2-丁醇中的应用。
上述应用涉及的操作步骤顺序如下：
(1)平板培养：将大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-fdh-adh划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂并含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37±1℃培养12±1小时；
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比为1～2％的接种量，接种到100mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(4)摇瓶培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为5～10％的接种量接种到1L的LB液体培养基中，37±1℃培养约2小时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃诱导10～12小时；
其中：上述步骤(1)～(4)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH 7.0；115℃灭菌20分钟；
(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物6,000±500转/分钟离心10分钟；并用pH 7.4、1/15M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到磷酸盐缓冲液中，使细胞的终浓度以OD600nm计为5～35，即得到生物催化剂；或将其置于4℃的冰箱中冻存待用；
(6)转化实验制备产物：
将制得的生物催化剂在30℃，pH 5.5～8.5厌氧条件下，转化浓度为100～600mM的2-丁酮和甲酸钠；50±5转/分钟振荡1～6小时，即得到含2-丁醇的转化液。
上述应用中：步骤(6)所述生物催化剂优选在转化液中的细胞浓度以OD600nm计为30，所述2-丁酮和甲酸钠的浓度优选为400mM，所述pH优选为6.0。
将上述得到的含2-丁醇的转化液以13,000±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，然后用终浓度10％的三氯乙酸溶液进行蛋白降解，离心过滤后的上清进行高效液相色谱分析，测定转化产物中2-丁醇的浓度。具体的检测方法如下：
向步骤(6)中得到的去除生物催化剂的含2-丁醇的转化液样品中加入终浓度10％的三氯乙酸溶液，35℃水浴放置10分钟，13,000±500转/分离心15～20分钟，取上层样品过滤后进行液相检测。对于样品中底物2-丁酮、甲酸钠和产物2-丁醇浓度的液相检测条件如下：
所用高效液相色谱仪的型号是Agilent 1100 Hewlett-Packard，配备示差折光检测器和Bio-Rad Aminex HPX-87H分析柱(300×7.8mm)，柱温55℃，流动相10mM H2SO4，流速0.6mL/min，进样体积5μL。
检测结果：最终2-丁醇浓度达到18.2g/L，转化率达0.68g/g。
本发明提供了一株共表达甲酸脱氢酶基因fdh和醇脱氢酶基因adh的重组大肠杆菌，并公开了利用该重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-fdh-adh的全细胞作为生物催化剂催化2-丁酮生产2-丁醇的应用。其中该菌表达的醇脱氢酶(ADH)催化2-丁酮生成2-丁醇，表达的甲酸脱氢酶(FDH)提供醇脱氢酶所需的辅因子NADH，实现辅因子的再生。该重组大肠杆菌转化2-丁酮生产2-丁醇的转化原理示意图见图1。本发明提供的重组大肠杆菌菌株要求的培养基简单、成本低，其作为生物催化剂进行转化，反应条件温和，操作方便，并具有产物浓度和底物转化效率高的特点，检测证实最终2-丁醇浓度达到18.2g/L，转化率达0.68g/g。同时本发明所述的生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，后续精馏分离提取费用低廉，极具工业应用前景。
附图说明
本发明所述菌株大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-fdh-adh已于2015年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏号为：CCTCCNO：M 2015572。
图1：本发明所述重组大肠杆菌转化2-丁酮生产2-丁醇的转化原理示意图。
图2：本发明所述重组大肠杆菌的蛋白电泳图
其中M：Marker；1：E.coli BL21(DE3)；2：E.coli BL21/pETDuet-1；3：E.coliBL21/pETDuet-fdh；4：E.coli BL21/pETDuet-fdh-adh。
图3：本发明所述重组大肠杆菌催化2-丁酮生产2-丁醇过程曲线图。
具体实施方式
本发明涉及的甲酸脱氢酶基因fdh来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)NCYC1513(购自英国酵母菌文化收藏中心，菌株编号为：NCYC 1513)；醇脱氢酶基因adh来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(由生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成)；E.coli BL21(DE3)(购自北京全式金生物技术有限公司)。
实施例1：共表达甲酸脱氢酶基因fdh和醇脱氢酶基因adh的大肠杆菌的构建
(1)基因fdh的克隆：采用常规的方法制备菌株博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)NCYC 1513的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中基因组的小量制备的方法，提取Candida boidinii NCYC 1513的基因组DNA；使用合成的引物从Candida boidinii NCYC 1513的基因组DNA中PCR扩增得到甲酸脱氢酶基因fdh；
Candida boidinii NCYC 1513作为fdh基因的来源菌，根据已测序的该菌的基因组序列，设计引物，引入能插入质粒pETDute-1(Novagen)的NdeI和XhoI限制性酶切位点，引物序列如下：
上游引物5’-CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTATATGATGCTGGTA-3’，携带一个NdeI位点；
下游引物5’-CTCGAGTTATTTCTTATCGTGTTTACCGTAAGCTTTG-3’，携带一个XhoI位点。
将步骤(1)PCR扩增得到的片段连接到pEasy-T上，得到重组质粒pEasy-T-fdh，使用NdeI、XhoI双酶切质粒pETDuet-1和pEasy-T-fdh，回收片段fdh及pETDuet-1，连接，得到重组质粒pETDuet-fdh；
(2)基因adh的克隆及连接：通过生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成来自近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)的adh基因，引入能插入质粒pETDute-1的BamHI和SalI限制性酶切位点，连接adh到pETDuet-fdh上，得到质粒pETDuet-fdh-adh；
(3)将上述质粒经转化导入宿主E.coli BL21(DE3)中得到重组工程菌株——大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-fdh-adh。
上述菌株在含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2小时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃诱导10小时，得到同时表达有FDH和ADH的细胞，经12.5％的SDS-PAGE验证，结果如图2所示。
上述菌株含有甲酸脱氢酶基因fdh和醇脱氢酶基因adh，其中所述fdh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(序列长度为1095个碱基)，所述adh基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示(序列长度为1024个碱基)；所述菌株已于2015年9月23日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M 2015572。
上述重组大肠杆菌为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，该菌的较佳培养温度为37±1℃，可以在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上生长。具有能催化2-丁酮产生2-丁醇的特性。
实施例2：全细胞催化剂的制备
(1)平板培养：将大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-fdh-adh划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂并含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37±1℃培养12±1小时；
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比为1～2％的接种量，接种到100mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(4)摇瓶培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为5～10％的接种量接种到1L的LB液体培养基中，37±1℃培养约2小时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃诱导10～12小时；
其中：上述步骤(1)～(4)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH 7.0；115℃灭菌20分钟；
(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物6,000±500转/分钟离心10分钟；并用pH 7.4、1/15M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到磷酸盐缓冲液中，使细胞的终浓度以OD600nm计为5～35，即得到生物催化剂；或将其置于4℃的冰箱中冻存待用。
实施例3：利用实施例2得到的生物催化剂制备2-丁醇
转化实验：在30℃，pH6.0厌氧条件下，以实施例2制得的生物催化剂转化浓度为400mM的2-丁酮和甲酸钠，其中生物催化剂即大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-fdh-adh在转化液中的细胞浓度以OD600nm计为30；50转/分钟振荡反应6小时，得到含2-丁醇的转化液。
转化过程中，可随时取转化液，以6,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清液中甲酸钠、2-丁酮和2-丁醇的含量。
反应结束时收集得到的含2-丁醇的转化液以13,000±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，然后加入终浓度10％的三氯乙酸溶液，35℃水浴放置10分钟，13,000±500转/分离心15～20分钟，取上层样品过滤后进行高效液相色谱检测。对于样品中底物2-丁酮、甲酸钠和产物2-丁醇浓度的液相检测条件如下：
所用高效液相色谱仪的型号是Agilent 1100 Hewlett-Packard，配备示差折光检测器和Bio-Rad Aminex HPX-87H分析柱(300×7.8mm)，柱温55℃，流动相10mM H2SO4，流速0.6mL/min，进样体积5μL。
液相检测样品的HPLC结果见图3，消耗2-丁酮26.8g/L，产生2-丁醇18.2g/L，转化率达0.68g/g。
Claims (1)
1.一种以重组大肠杆菌作为生物催化剂在催化2-丁酮生产2-丁醇中的应用，步骤是：
（1）平板培养：将重组大肠杆菌划线到含有质量体积比为1.5～1.8%琼脂并含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37±1°C培养12±1小时；
（2）一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤（1）平板上的一个单菌落，然后接种到5 mL的含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1°C摇床振荡培养12±1小时；
（3）二级种子：在无菌条件下，取步骤（2）所培养的菌液以体积比为1～2%的接种量，接种到100 mL含有100 μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1°C摇床振荡培养12±1小时；
（4）摇瓶培养：在无菌条件下，取步骤（3）所得的菌液以体积比为5～10%的接种量接种到1 L的LB液体培养基中，37±1°C培养2小时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG，16°C诱导10～12小时；
其中：上述步骤（1）～（4）中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；NaCl10 g/L，pH 7.0；115°C 灭菌20分钟；
（5）收集菌体：将步骤（4）培养得到的培养物6,000±500转/分钟离心10分钟；并用pH7.4、1/15 M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到磷酸盐缓冲液中，使细胞的终浓度以OD600nm计为5～35，即得到生物催化剂；或将其置于4°C的冰箱中冻存待用；
（6）转化实验制备产物2-丁醇：
其特征在于：
所述重组大肠杆菌为大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pETDuet-fdh-adh，该菌株含有甲酸脱氢酶基因fdh和醇脱氢酶基因adh，其中所述fdh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述adh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述菌株已于2015年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2015572；
所述转化实验制备产物2-丁醇的方法是：将制得的生物催化剂在30°C，pH 6厌氧条件下，转化浓度为400 mM的2-丁酮和甲酸钠；同时使生物催化剂在转化液中的细胞浓度以OD600nm计为30，50±5转/分钟振荡1～6小时后，即得到含2-丁醇的转化液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |