CN102093988A - 微生物发酵生产低温脂肪酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明所述的一种微生物发酵生产低温脂肪酶的方法是将产生脂肪酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的脂肪酶产生菌在14～20℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在14～20℃培养48～120h，即微生物发酵生产低温脂肪酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

Description

微生物发酵生产低温脂肪酶的方法
技术领域
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温脂肪酶微生物发酵生产方法。该发明生产的低温脂肪酶主要应用于洗涤行业、食品工业、纺织、印染、造纸工业及医药行业等其它脂肪酶应用行业。可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。
背景技术
脂肪酶(甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)是可催化天然底物油脂(甘油三脂)水解，产生脂肪酸和甘油的一类特殊酯键水解酶(孙谧，微生物学报，2004)。脂肪酶作为生物制剂，已经广泛应用于洗涤行业、食品工业、纺织、印染、造纸工业及医药行业等其它脂肪酶应用行业。目前应用的脂肪酶主要为高温和中温型脂肪酶，而关于低温脂肪酶的研究相对较少，仍处于起步阶段，主要是研究菌种选育、产酶条件优化、酶学性质及相关基因克隆等(宋欣等，微生物学通报，2002；董宏伟，海洋与沼泽，2004；孙新城等，食品科技，2009)。有关低温脂肪酶产业化、规模化生产及应用方面还未见报道。低温脂肪酶与高温、中温型脂肪酶相比具有巨大应用优势，因为低温脂肪酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理可使低温酶的活力丧失；低温或适温处理有助于提高产品品质和质量。低温脂肪酶的应用将对传统的食品、医药、化工、能源和环保等领域产生深远的影响。利用微生物发酵生产的低温脂肪酶，用于食品洗涤剂、食品乳化剂、化妆品、药品等领域可以显著的提高生产效率，降低生产成本，改善并提高产品质量，可以从根本上摆脱中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。低温脂肪酶将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如资源、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇。低温脂肪酶具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温脂肪酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在14～20℃液体发酵生产低温脂肪酶的方法，这种生产方法获得的低温脂肪酶粗酶液活性可以达到180U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
本发明所述的一种微生物发酵生产低温脂肪酶的方法具体包括以下步骤：
(1)将产生脂肪酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(2)按常规方法将低温驯化后的脂肪酶产生菌在14～20℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入产酶培养基中，在14～20℃培养48～120h，即微生物发酵生产低温脂肪酶结束；
(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。脂肪酶产生菌(CGMCC菌种编号：1.504或1.775或1.893或1.2172等)，菌株先活化，再经过逐级低温驯化，发酵生产低温脂肪酶时按本发明方法进行培养，低温驯化后的菌株斜面在4℃环境中可保存2个月，用10～25％甘油制成的菌悬液、在零下80℃条件下可以长期保藏。
具体实施方式：
实施例一：
(1)、培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：蛋白胨5.0g～50.0g，橄榄油5.0g～8.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
③液体种子培养基：蛋白胨5.0g～50.0g，酵母提取物5.0g～8.0g，橄榄油4.0～8.0g，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g，KH2PO41.0～5.0g，自来水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
④产酶培养基：2.0g～50.0g，牛肉浸膏10.0g～50.0g，KH2PO41.0～5.0g，MgSO4·7H2O0.5～1.0g，橄榄油4.0g～8.0g，自来水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
(2)将产生脂肪酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的脂肪酶产生菌在14～20℃培养24～48h，按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3～5％的接种量接入10L的产酶培养基中，在14～16℃培养96～120h，即微生物发酵生产低温脂肪酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温脂肪酶制剂。
实施例二：
(1)、培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：蛋白胨5.0g～50.0g，橄榄油5.0g～8.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
③液体种子培养基：蛋白胨5.0g～50.0g，酵母提取物5.0g～8.0g，橄榄油4.0～8.0g，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g，KH2PO41.0～5.0g，自来水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
④产酶培养基：2.0g～50.0g，牛肉浸膏10.0g～50.0g，KH2PO41.0～5.0g，MgSO4·7H2O0.5～1.0g，橄榄油4.0g～8.0g，自来水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
(2)将产生脂肪酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的脂肪酶产生菌在14～20℃培养24～48h，按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5～7％的接种量接入50L的产酶培养基中，在16～18℃培养72～96h，即微生物发酵生产低温脂肪酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温脂肪酶制剂。
实施例三：
(1)、培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：蛋白胨5.0g～50.0g，橄榄油5.0g～8.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
③液体种子培养基：蛋白胨5.0g～50.0g，酵母提取物5.0g～8.0g，橄榄油4.0～8.0g，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g，KH2PO41.0～5.0g，自来水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
④初始产酶培养基：2.0g～50.0g，牛肉浸膏10.0g～50.0g，KH2PO41.0～5.0g，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g，橄榄油4.0g～8.0g，自来水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
(2)将产生脂肪酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的脂肪酶产生菌在18～20℃培养24～48h，按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7～9％的接种量接入100L的产酶培养基中，在18～20℃培养48～72h，即微生物发酵生产低温脂肪酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温脂肪酶制剂。

Claims (2)

1.一种微生物发酵生产低温脂肪酶的方法，其包括以下步骤：
(1)将产生脂肪酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(2)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在14～20℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入产酶培养基中，在14～20℃培养48～120h，即微生物发酵生产低温脂肪酶结束；
(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中菌种低温驯化培养基、液体种子培养基、产酶培养基分别为：
(1)菌种低温驯化培养基：蛋白胨5.0g～50.0g，橄榄油5.0g～8.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
(2)液体种子培养基：蛋白胨5.0g～50.0g，酵母提取物5.0g～8.0g，橄榄油4.0～8.0g；MgSO4·7H2O 0.5～1.0g，KH2PO4 1.0～5.0g；自来水1.0L，pH自然，121℃蒸气火菌30min。
(3)产酶培养基：2.0g～50.0g；牛肉浸膏10.0g～50.0g，KH2PO4 1.0～5.0g；MgSO4·7H2O 0.5～1.0g，橄榄油4.0g～8.0g，自来水1.0L，pH自然，121℃蒸气灭菌30min。
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