CN106591211A - 罗伊氏乳杆菌的低温驯化及其制备低温发酵乳的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗伊氏乳杆菌的低温驯化及其制备低温发酵乳的方法，低温驯化方法为按从高至低的温度梯度进行逐级驯化，使罗伊氏乳杆菌在20～25℃正常生长；用其制备的低温发酵乳，为发酵基料和低温驯化的罗伊氏乳杆菌混合发酵制备，包括配料、均质杀菌、接种和低温发酵、搅拌冷却、罐装和冷藏后熟，即得到低温发酵乳成品。本发明的优点是低温驯化的罗伊氏乳杆菌抗逆性增强，生物酶活性提高，用其制备低温发酵乳，活菌数量增加缓慢，延长对数期和稳定期，提高次级代谢产物的积累，增加不饱和脂肪酸含量，提高营养价值，改善质地和风味；降低了生产的热能成本；保留了发酵乳成品的肠道益生功能和其他营养成分的营养功能。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养和发酵技术领域，特别是一种罗伊氏乳杆菌的低温驯化方法及用经过低温驯化的该罗伊氏乳杆菌制备低温发酵乳的方法。
背景技术
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是普遍存在于人体肠道的有益乳酸菌，是新生儿和健康成年人肠道微生物菌群的主要成员，具有调整肠道菌群平衡，抑制腹泻，拮抗有害菌定植的功效。罗伊氏乳杆菌能产生一种被称为“罗伊氏菌素(Reuterin)”非蛋白质类广谱抗菌物质，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长。我国卫生部于2003年批准了罗伊氏乳杆菌可作为人类保健品的微生物菌种。发酵乳是益生乳酸菌最常见且经济的载体，发展罗伊氏乳杆菌等益生菌发酵乳可有效解决耐药菌株的问题，改善人体机能，提高免疫力从而促进人体健康。
现有市场上发酵乳产品包括凝固型和搅拌型，不论何种发酵乳，其生产中最重要的影响因素均为发酵菌种。发酵菌种不仅影响发酵乳的品质，也决定了发酵温度、发酵周期等工艺参数。目前，发酵乳的生产工艺中发酵温度通常为40～42℃，在此温度下发酵速度快，但在贮藏过程中会出现后酸化、乳清析出及风味改变等质量问题，也提高了生产的热能成本；同时在发酵乳的生产过程中，普遍采用了二次杀菌技术，在杀灭杂菌的同时也杀灭了内含的活性乳酸菌，从而失去了乳酸菌所特有的调节肠道菌群等益生功能，部分营养素(如蛋白质)的生物功能因频繁的热处理出现一定程度地丧失，降低了发酵乳的营养功效。
发明内容
发明目的：针对上述问题，本发明的目的是提供了一种罗伊氏乳杆菌的低温驯化方法，经过低温驯化的该罗伊氏乳杆菌在20～25℃下正常生长；同时本发明的另一目的是提供了一种应用上述经过低温驯化的罗伊氏乳杆菌制备低温发酵乳的方法，改善和保留发酵乳产品的品质和营养功效，降低热能成本。
技术方案：一种罗伊氏乳杆菌的低温驯化方法，所述罗伊氏乳杆菌的菌种型号为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RC-14，保藏编号为ATCC 55845；经过低温驯化的所述罗伊氏乳杆菌RC-14在20～25℃下正常生长；
所述罗伊氏乳杆菌RC-14的低温驯化方法具体为：
步骤一、标准培养液的配制和消毒：标准培养液的各组分及含量比例为：1g脱脂奶粉∶1.5～2.0g葡萄糖∶100ml超纯水，按配方称取三种组分，所述脱脂奶粉和葡萄糖加入超纯水中充分溶解，形成混合液；所述混合液过滤后去除不溶性杂质，然后预加热至60～65℃并充分搅拌，巴氏消毒后冷却至30℃备用，即为标准培养液；
步骤二、菌种驯化：将所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种至所述标准培养液中，按从高至低的温度梯度进行逐级驯化培养；每一温度梯度下的所述罗伊氏乳杆菌RC-14均对应相应的培养时间，培养时间共计36h，得到驯化菌种母液；
步骤三、扩大培养和分装冻存：将所述驯化菌种母液与标准培养液按体积比1∶10000混合，并在20～25℃下扩大培养24h，制备成罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液；所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液进行无菌分装，-80℃冻存。
进一步的，所述步骤二中，罗伊氏乳杆菌RC-14接种至标准培养液中的接种量为1×105CFU/ml。
进一步的，所述步骤二中，从高至低的温度梯度依次为：40℃→37℃→34℃→30℃→28℃→25℃→22℃→20℃，对应每一温度梯度，罗伊氏乳杆菌RC-14的培养时间梯度依次为：1h→1h→2h→2h→4h→6h→8h→12h，共计36h；培养终止时所述驯化菌种母液中罗伊氏乳杆菌RC-14的活菌量为1×108～1×109CFU/ml。
同时本发明还提供一种应用所述经过低温驯化的罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液制备低温发酵乳的方法，为发酵基料和所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液混合发酵制备；以质量比计，所述发酵基料的各组分为：
所述方法的具体操作步骤为：
操作一、配料：按照所述发酵基料的组分配方，称取所述原料乳、葡萄糖、甜味剂和增稠剂，在所述原料乳中加入所述葡萄糖、甜味剂和增稠剂后，将所述原料乳预加热至60～65℃，并真空循环搅拌25～35min，各组分均匀混合呈均一相后停止搅拌，得到料液；
操作二、均质杀菌：将所述料液进行均质和超高温瞬时杀菌后，冷却至30～35℃，得到均质杀菌冷却料液；均质使所述料液的液滴微细化，提高所述料液的粘度，并增强所述增稠剂的增稠、稳定效果；
操作三、发酵菌种的接种和低温发酵：在所述均质杀菌冷却料液中加入所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液，并搅拌10～15min使所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液均匀分散，接种后的所述均质杀菌冷却料液在20～25℃下保温发酵96h，至滴定酸度达到70～76°T时，终止发酵，得到低温发酵乳；
操作四、搅拌冷却：将所述低温发酵乳通过搅拌冷却至2～6℃，得到冷却发酵乳，然后将所述冷却发酵乳打入存储缸中准备灌装；
操作五、产品灌装及冷藏后熟：将已打入存储缸中的所述冷却发酵乳在无菌、负压的卫生条件下灌装至无菌包装容器中，并迅速放置于2～6℃冷藏、后熟12h～24h，得到罗伊氏乳杆菌低温发酵乳成品。
进一步的，所述原料乳为依据GB19301的要求验收、标准化的全脂生牛乳，以质量百分比计，所述全脂生牛乳中脂肪为3.1％，蛋白质为2.9％。
进一步的，所述甜味剂为支链淀粉；所述增稠剂为食品级果胶或食品级明胶，用于增加低温发酵乳的稠度。
进一步的，所述均质的均质温度为60～65℃，均质压力为18～20Mpa；所述超高温瞬时杀菌的杀菌温度为135～150℃，杀菌时间为4～6s。超高温瞬时杀菌技术的杀菌温度高但杀菌时间很短，在有效杀灭杂菌的同时，保留了大部分的罗伊氏乳杆菌RC-14和其它营养成分
进一步的，所述操作三中，以体积百分比计，罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液在均质杀菌冷却料液中的加入量为0.5％。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：第一，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)RC-14，保藏编号为ATCC 55845，经过低温驯化在20～25℃下正常生长，使用其制备低温发酵乳时，在20～25℃下低温发酵使其活菌数量增加缓慢，有利于延长菌株的对数生长期和稳定期，提高胞外多种次级代谢产物的积累，提高了低温发酵乳产品的营养价值，改善了发酵乳的质地和风味，贮藏期无乳清析出，后酸化较弱；第二，与现有的发酵乳在40～42℃下发酵相比，本发明的低温发酵乳在20～25℃下发酵，降低了生产的热能成本；第三，与现有发酵乳的二次杀菌技术相比，本发明中采用超高温瞬时杀菌技术，135～150℃下杀菌4～6s，高温杀菌时间短，避免了多次杀菌对活性乳酸菌的杀灭效应，保留了发酵乳成品的肠道益生功能和其他营养成分的营养功能；第四，罗伊氏乳杆菌RC-14自身代谢产生的“罗伊氏菌素”，有效抑制有害菌的生长，延长了用罗伊氏乳杆菌RC-14制备的低温发酵乳的货架期，提高了产品市场竞争力。
附图说明
图1是本发明罗伊氏乳杆菌RC-14的革兰氏染色菌体形态图；
图2是本发明低温发酵乳制备的工艺流程图；
图3是本发明经过低温驯化的罗伊氏乳杆菌RC-14在20～25℃条件下的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
一种罗伊氏乳杆菌的低温驯化方法，其中进行低温驯化的菌种型号为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RC-14，保藏编号为ATCC 55845；经过低温驯化的罗伊氏乳杆菌RC-14在20～25℃下正常生长。罗伊氏乳杆菌RC-14的低温驯化方法具体为：
步骤一、标准培养液的配制和消毒：标准培养液的各组分及含量比例为：1g脱脂奶粉∶1.5～2.0g葡萄糖∶100ml超纯水，按配方称取三种组分，脱脂奶粉和葡萄糖加入超纯水中充分溶解，形成混合液，然后混合液过滤去除不溶性杂质，再预加热至60～65℃并充分搅拌，巴氏消毒后冷却至30℃备用，即为标准培养液。
步骤二、菌种驯化：将罗伊氏乳杆菌RC-14接种至标准培养液中，接种量为1×105CFU/ml；罗伊氏乳杆菌RC-14在标准培养液中按从高至低的温度梯度进行逐级驯化培养，从高至低的温度梯度依次为：40℃→37℃→34℃→30℃→28℃→25℃→22℃→20℃，对应每→温度梯度，罗伊氏乳杆菌RC-14的培养时间梯度依次为：1h→1h→2h→2h→4h→6h→8h→12h，培养时间共计36h，得到驯化菌种母液；培养终止时驯化菌种母液中罗伊氏乳杆菌RC-14的活菌量为1×108～1×109CFU/ml。
步骤三、扩大培养和分装冻存：将驯化菌种母液与标准培养液按体积比1∶10000混合，并在20～25℃下扩大培养24h，制备成罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液；罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液进行无菌分装，-80℃冻存待用。
本发明以下实施例均以所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液为发酵菌种制备低温发酵乳。
实施例1：
应用经过低温驯化的所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液制备低温发酵乳的方法，为发酵基料和所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液混合发酵制备。
以质量比计，发酵基料的各组分为：
全脂生牛乳作为原料乳，按GB19301的标准要求验收、标准化，以质量百分比计，全脂生牛乳中脂肪为3.1％，蛋白质为2.9％；支链淀粉为甜味剂，食品级果胶为增稠剂，用于增加低温发酵乳的稠度。
制备低温发酵乳的具体操作步骤为：
操作一、配料：按照发酵基料的组分配方，称取全脂生牛乳、葡萄糖、支链淀粉和食品级果胶，在全脂生牛乳中加入葡萄糖、支链淀粉和食品级果胶后，预加热至60℃，并真空循环搅拌25min，各组分均匀混合呈均一相后停止搅拌，得到料液；
操作二、均质杀菌：将料液进行均质和超高温瞬时杀菌，均质温度为60℃，均质压力为18Mp，超高温瞬时杀菌的杀菌温度为135℃，杀菌时间为6s；均质和超高温瞬时杀菌完成后待料液冷却至30℃，得到均质杀菌冷却料液；
操作三、低温发酵：在均质杀菌冷却料液中加入所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液，以体积百分比计，罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液在均质杀菌冷却料液中的加入量为0.5％，并搅拌10min使罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液均匀分散；接种后的均质杀菌冷却料液在20～25℃下保温发酵96h，至滴定酸度达到70°T时，终止发酵，得到低温发酵乳；
操作四、搅拌冷却：将低温发酵乳通过搅拌冷却至2～6℃，得到冷却发酵乳，然后将冷却发酵乳打入存储缸中准备灌装；
操作五、产品灌装及冷藏后熟：将已打入存储缸中的冷却发酵乳在无菌、负压的卫生条件下灌装至无菌包装容器中，并迅速放置于2～6℃冷藏、后熟12h，得到罗伊氏乳杆菌低温发酵乳成品。
实施例2：
应用经过低温驯化的所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液制备低温发酵乳的方法，为发酵基料和所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液混合发酵制备。
以质量比计，发酵基料的各组分为：
全脂生牛乳作为原料乳，按GB19301的标准要求验收、标准化，以质量百分比计，全脂生牛乳中脂肪为3.1％，蛋白质为2.9％；支链淀粉为甜味剂，食品级明胶为增稠剂，用于增加低温发酵乳的稠度。
制备低温发酵乳的具体操作步骤为：
操作一、配料：按照发酵基料的组分配方，称取全脂生牛乳、葡萄糖、支链淀粉和食品级明胶，在全脂生牛乳中加入葡萄糖、支链淀粉和食品级明胶后，预加热至65℃，并真空循环搅拌35min，各组分均匀混合呈均一相后停止搅拌，得到料液；
操作二、均质杀菌：将料液进行均质和超高温瞬时杀菌，均质温度为65℃，均质压力为20Mp，超高温瞬时杀菌的杀菌温度为150℃，杀菌时间为4s；均质和超高温瞬时杀菌完成后待料液冷却至35℃，得到均质杀菌冷却料液；
操作三、低温发酵：在均质杀菌冷却料液中加入所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液，以体积百分比计，罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液在均质杀菌冷却料液中的加入量为0.5％，并搅拌15min使罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液均匀分散；接种后的均质杀菌冷却料液在20～25℃下保温发酵96h，至滴定酸度达到76°T时，终止发酵，得到低温发酵乳；
操作四、搅拌冷却：将低温发酵乳通过搅拌冷却至2～6℃，得到冷却发酵乳，然后将冷却发酵乳打入存储缸中准备灌装；
操作五、产品灌装及冷藏后熟：将已打入存储缸中的冷却发酵乳在无菌、负压的卫生条件下灌装至无菌包装容器中，并迅速放置于2～6℃冷藏、后熟24h，得到罗伊氏乳杆菌低温发酵乳成品。
对比例1：
发酵菌株：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TA40，为丹尼斯克(Danisco)公司出售的商业菌株，该嗜热链球菌TA40未经过低温驯化。
应用嗜热链球菌TA40制备低温发酵乳的方法，为发酵基料和嗜热链球菌TA40混合发酵制备。
以质量比计，发酵基料的各组分为：
全脂生牛乳作为原料乳，按GB19301的标准要求验收、标准化，以质量百分比计，全脂生牛乳中脂肪为3.1％，蛋白质为2.9％；支链淀粉为甜味剂，食品级果胶为增稠剂，用于增加低温发酵乳的稠度。
制备低温发酵乳的具体操作步骤为：
操作一、配料：按照发酵基料的组分配方，称取全脂生牛乳、葡萄糖、支链淀粉和食品级果胶，在全脂生牛乳中加入葡萄糖、支链淀粉和食品级果胶后，预加热至60℃，并真空循环搅拌30min，各组分均匀混合呈均一相后停止搅拌，得到料液；
操作二、均质杀菌：将料液进行均质和超高温瞬时杀菌，均质温度为60℃，均质压力为18Mp，超高温瞬时杀菌的杀菌温度为140℃，杀菌时间为6s；均质和超高温瞬时杀菌完成后待料液冷却至30℃，得到均质杀菌冷却料液；
操作三、低温发酵：在均质杀菌冷却料液中加入嗜热链球菌TA40，以体积百分比计，嗜热链球菌TA40在均质杀菌冷却料液中的加入量为0.5％，并搅拌12min使嗜热链球菌TA40均匀分散；接种后的均质杀菌冷却料液在20～25℃下保温发酵96h，至滴定酸度达到74°T时，终止发酵，得到低温发酵乳；
操作四、搅拌冷却：将低温发酵乳通过搅拌冷却至2～6℃，得到冷却发酵乳，然后将冷却发酵乳打入存储缸中准备灌装；
操作五、产品灌装及冷藏后熟：将已打入存储缸中的冷却发酵乳在无菌、负压的卫生条件下灌装至无菌包装容器中，并迅速放置于2～6℃冷藏、后熟18h，得到嗜热链球菌TA40低温发酵乳成品。
对比例2：
发酵菌株：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)BODY-2，为丹尼斯克(Danisco)公司出售的商业菌株，该嗜热链球菌BODY-2未经过低温驯化。
应用嗜热链球菌BODY-2制备低温发酵乳的方法，为发酵基料和嗜热链球菌BODY-2混合发酵制备。
以质量比计，发酵基料的各组分为：
全脂生牛乳作为原料乳，按GB19301的标准要求验收、标准化，以质量百分比计，全脂生牛乳中脂肪为3.1％，蛋白质为2.9％；支链淀粉为甜味剂，食品级明胶为增稠剂，用于增加低温发酵乳的稠度。
制备低温发酵乳的具体操作步骤为：
操作一、配料：按照发酵基料的组分配方，称取全脂生牛乳、葡萄糖、支链淀粉和食品级明胶，在全脂生牛乳中加入葡萄糖、支链淀粉和食品级明胶后，预加热至65℃，并真空循环搅拌35min，各组分均匀混合呈均一相后停止搅拌，得到料液；
操作二、均质杀菌：将料液进行均质和超高温瞬时杀菌，均质温度为65℃，均质压力为19Mp，超高温瞬时杀菌的杀菌温度为145℃，杀菌时间为5.5s；均质和超高温瞬时杀菌完成后待料液冷却至32℃，得到均质杀菌冷却料液；
操作三、低温发酵：在均质杀菌冷却料液中加入嗜热链球菌BODY-2，以体积百分比计，嗜热链球菌BODY-2在均质杀菌冷却料液中的加入量为0.5％，并搅拌15min使嗜热链球菌BODY-2均匀分散；接种后的均质杀菌冷却料液在20～25℃下保温发酵96h，至滴定酸度达到75°T时，终止发酵，得到低温发酵乳；
操作四、搅拌冷却：将低温发酵乳通过搅拌冷却至2～6℃，得到冷却发酵乳，然后将冷却发酵乳打入存储缸中准备灌装；
操作五、产品灌装及冷藏后熟：将已打入存储缸中的冷却发酵乳在无菌、负压的卫生条件下灌装至无菌包装容器中，并迅速放置于2～6℃冷藏、后熟20h，得到嗜热链球菌BODY-2低温发酵乳成品。
如附图1所示，本发明罗伊氏乳杆菌RC-14为形状轻微不规则的短杆菌，无鞭毛，无芽孢，革兰氏染色阳性，大小为0.7～1.0×2.0～5.0μm，通常单个、成对、小簇存在。罗伊氏乳杆菌RC-14为兼性厌氧菌，其在MRS固体培养基上的菌落为白色，边缘整齐，中央凸起。
如附图3所示，经过低温驯化的罗伊氏乳杆菌RC-14在20～25℃条件下有正常的生长曲线。在20～25℃时，低温驯化的罗伊氏乳杆菌RC-14的OD600值即活菌数量增加缓慢，在培养4～6h后才进入对数生长期，对数生长期为8h，稳定期至少10h，低温驯化后的罗伊氏乳杆菌RC-14的对数生长期和稳定期明显延长，从而在20～25℃低温发酵时可提高罗伊氏乳杆菌RC-14胞外多糖等次级代谢产物的积累，增加不饱和脂肪酸的含量，进而提高了低温发酵乳产品的营养价值。
对实施例1、实施例2和对比例1、对比例2按照《GB19302-2010食品安全国家标准发酵乳》进行感官要求对比。检验方法为：取适量待检样品置于50ml烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态，闻其气味，用温开水漱口，品尝滋味。对比结果如表1所示。
表1感官指标对比结果
| 样品编号 | 色泽 | 滋、气味 | 组织状态 |
| 实施例1 | 均与一致，呈乳白色 | 香味和酸味均很明显 | 组织细腻、均匀，无乳清析出 |
| 实施例2 | 均与一致，呈乳白色 | 香味和酸味均很明显 | 组织细腻、均匀，无乳清析出 |
| 对比例1 | 均与一致，呈淡乳白色 | 香味不明显，酸味较弱 | 组织均匀，有微量乳清析出 |
| 对比例2 | 均与一致，呈乳白色 | 香味不明显，酸味较弱 | 组织均匀，有微量乳清析出 |
如表1所示，本发明实施例1和实施例2制备的低温发酵乳成品，其色泽、滋、气味和组织状态均符合《GB19302-2010食品安全国家标准发酵乳》的要求。与对比例1和对比例2相比，实施例1和实施例2制备的低温发酵乳成品的香味和酸味均明显优于对比例1和对比例2；且实施例1和实施例2中均无乳清析出，而对比例1和对比例2的发酵乳成品均有微量的乳清析出，实施例1和实施例2制备的低温发酵乳成品的感官指标明显优于对比例1和对比例2。
对本发明实施例1、实施例2和对比例1、对比例2制备得到的发酵乳成品进行保质期观察，统计在2～6℃冷藏时，不同冷藏时间下发酵乳成品中的发酵菌种活菌量(CFU/ml)、涨包率和霉变率。其中，发酵菌种的活菌量(CFU/ml)按《GB 4789.35-2010食品微生物学检验乳酸菌检验》进行检验；涨包率是指包装容器鼓胀且撕开盖膜后有明显酵母发酵风味的发酵乳成品数目相对于所采集的发酵乳成品总数的百分比；霉变率是指撕开盖膜后有明显霉菌块的发酵乳成品数目相对于所采集的发酵乳成品总数的百分比。涨包表示发酵乳成品受到酵母菌的污染，霉变表示发酵乳成品受到霉菌的污染。实施例1、实施例2、对比例1和对比例2所采集的发酵乳成品总数均为200杯。2～6℃冷藏条件下，不同冷藏时间下不同发酵乳成品中的发酵菌种活菌量(CFU/ml)、涨包率和霉变率统计结果如表2所示。
表2 2～6℃下活菌量(CFU/ml)、涨包率和霉变率统计结果
在2～6℃下冷藏时，发酵乳成品在冷藏24h后作为冷藏第1d。如表2所示，实施例1制备的发酵乳成品在冷藏7d、14d、21d的不同时间阶段，活菌量从4.1×109CFU/ml降低至3.8×107CFU/ml，实施例2制备的发酵乳成品活菌量从3.9×109CFU/ml降低至2.7×107CFU/ml；但同样冷藏温度和冷藏时间条件下，对比例1制备的发酵乳成品活菌量从1.5×109CFU/ml降低至5.8×106CFU/ml，而对比例2制备的发酵乳成品活菌量从2.2×109CFU/ml降低至1.3×106CFU/ml，同样在冷藏至21d时，实施例1和实施例2制备的发酵乳成品中含有的活菌量(CFU/ml)明显高于对比例1和对比例2，表明本发明实施例1和实施例2制备的发酵乳成品在保质期内仍保持优良的产品质量。实施例1和实施例2制备的发酵乳成品在冷藏7d、14d、21d的不同时间阶段，两者的涨包率(％)和霉变率(％)均为0，表明在保质期内本发明实施例1和实施例2制备的发酵乳成品没有受到酵母菌和霉菌的污染，而对比例1制备的发酵乳成品在冷藏至21d时，涨包率为1.88％，霉变率为2.01％，对比例2制备的发酵乳成品在冷藏至21d时，涨包率为1.39％，霉变率为1.44％，说明对比例1和对比例2制备的发酵乳成品在冷藏至21d时已受到酵母菌和霉菌的污染，本发明实施例1和实施例2制备的发酵乳成品的抑菌效果明显优于对比例1和对比例2，即实施例1和实施例2制备的发酵乳成品的保质期多于对比例1和对比例2。
对本发明实施例1、实施例2和对比例1、对比例2制备得到的发酵乳成品进行保质期后酸化特性的测定。测定方法为：将发酵乳成品在2～6℃冷藏24h后作为冷藏第1d，随后分别在冷藏2d、5d、7d、14d、21d后，用PH电极测量发酵乳成品的PH至，重复这种测量三次并得到平均值，即反应发酵乳成品的后酸化特性，结果如表3所示。
表3保质期内发酵乳成品的PH值变化结果
| 样品编号 | 1d PH | 2d PH | 5d PH | 7d PH | 14d PH | 21d PH |
| 实施例1 | 4.44 | 4.43 | 4.39 | 4.36 | 4.36 | 4.30 |
| 实施例2 | 4.39 | 4.39 | 4.37 | 4.33 | 4.30 | 4.27 |
| 对比例1 | 4.58 | 4.55 | 4.50 | 4.42 | 4.38 | 4.28 |
| 对比例2 | 4.32 | 4.30 | 4.25 | 4.20 | 4.15 | 4.07 |
如表3所示，本发明实施例1和实施例2制备的发酵乳成品，在冷藏1d至21d时PH值的下降明显少于对比例1和对比例2制备的发酵乳成品，即实施例1和实施例2制备的发酵乳成品在保质期内冷藏时后酸化较弱，能有效保证成品质量。
Claims (8)
1.一种罗伊氏乳杆菌的低温驯化方法，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌的菌种型号为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RC-14，保藏编号为ATCC 55845；经过低温驯化的所述罗伊氏乳杆菌RC-14在20～25℃下正常生长；
所述罗伊氏乳杆菌RC-14的低温驯化方法具体为：
步骤一、标准培养液的配制和消毒：标准培养液的各组分及含量比例为：1g脱脂奶粉∶1.5～2.0g葡萄糖∶100ml超纯水，按配方称取三种组分，所述脱脂奶粉和葡萄糖加入超纯水中充分溶解，形成混合液；所述混合液过滤后去除不溶性杂质，然后预加热至60～65℃并充分搅拌，巴氏消毒后冷却至30℃备用，即为标准培养液；
步骤二、菌种驯化：将所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种至所述标准培养液中，按从高至低的温度梯度进行逐级驯化培养；每一温度梯度下的所述罗伊氏乳杆菌RC-14均对应相应的培养时间，培养时间共计36h，得到驯化菌种母液；
步骤三、扩大培养和分装冻存：将所述驯化菌种母液与标准培养液按体积比1∶10000混合，并在20～25℃下扩大培养24h，制备成罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液；所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液进行无菌分装，-80℃冻存。
2.根据权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌的低温驯化方法，其特征在于：所述步骤二中，罗伊氏乳杆菌RC-14接种至标准培养液中的接种量为1×105CFU/ml。
3.根据权利要求2所述的一种罗伊氏乳杆菌的低温驯化方法，其特征在于：所述步骤二中，从高至低的温度梯度依次为：40℃→37℃→34℃→30℃→28℃→25℃→22℃→20℃，对应每一温度梯度，罗伊氏乳杆菌RC-14的培养时间梯度依次为：1h→1h→2h→2h→4h→6h→8h→12h，共计36h；培养终止时所述驯化菌种母液中罗伊氏乳杆菌RC-14的活菌量为1×108～1×109CFU/ml。
4.一种应用如权利要求1所述经过低温驯化的罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液制备低温发酵乳的方法，其特征在于：为发酵基料和所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液混合发酵制备；以质量比计，所述发酵基料的各组分为：
所述方法的具体操作步骤为：
操作一、配料：按照所述发酵基料的组分配方，称取所述原料乳、葡萄糖、甜味剂和增稠剂，在所述原料乳中加入所述葡萄糖、甜味剂和增稠剂后，将所述原料乳预加热至60～65℃，并真空循环搅拌25～35min，各组分均匀混合呈均一相后停止搅拌，得到料液；
操作二、均质杀菌：将所述料液进行均质和超高温瞬时杀菌后，冷却至30～35℃，得到均质杀菌冷却料液；
操作三、发酵菌种的接种和低温发酵：在所述均质杀菌冷却料液中加入所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液，并搅拌10～15min使所述罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液均匀分散，接种后的所述均质杀菌冷却料液在20～25℃下保温发酵96h，至滴定酸度达到70～76°T时，终止发酵，得到低温发酵乳；
操作四、搅拌冷却：将所述低温发酵乳通过搅拌冷却至2～6℃，得到冷却发酵乳，然后将所述冷却发酵乳打入存储缸中准备灌装；
操作五、产品灌装及冷藏后熟：将已打入存储缸中的所述冷却发酵乳在无菌、负压的卫生条件下灌装至无菌包装容器中，并迅速放置于2～6℃冷藏、后熟12h～24h，得到罗伊氏乳杆菌低温发酵乳成品。
5.根据权利要求4所述的制备低温发酵乳的方法，其特征在于：所述原料乳为依据GB19301的要求验收、标准化的全脂生牛乳，以质量百分比计，所述全脂生牛乳中脂肪为3.1％，蛋白质为2.9％。
6.根据权利要求4所述的制备低温发酵乳的方法，其特征在于：所述甜味剂为支链淀粉；所述增稠剂为食品级果胶或食品级明胶。
7.根据权利要求4所述的制备低温发酵乳的方法，其特征在于：所述均质的均质温度为60～65℃，均质压力为18～20Mpa；所述超高温瞬时杀菌的杀菌温度为135～150℃，杀菌时间为4～6s。
8.根据权利要求4所述的制备低温发酵乳的方法，其特征在于：所述操作三中，以体积百分比计，罗伊氏乳杆菌RC-14接种母液在均质杀菌冷却料液中的加入量为0.5％。
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