CN104630165A - 微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法 - Google Patents

微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法，具体为先将产生脂肪氧合酶菌种活化，再经过逐级低温驯化，使菌种在低温环境中生长良好，将低温驯化后的脂肪氧合酶产生菌在10～18℃逐级扩大培养，按发酵液体积3～9％的接种量接种于液体发酵培养基中，在10～18℃培养72～144h时，得低温脂肪氧合酶，收集到的粗酶液根据不同需要和使用对象不同，进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明生产的低温脂肪氧合酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可减少加工工艺，缩短加工时间，降低生产成本，提高生产效率，改善并提高产品质量；该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、具有广阔的开发潜力和应用前景。

Description

微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法
技术领域
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温脂肪氧合酶微生物发酵生产方法。
背景技术
脂肪氧合酶(Lipoxygenase,EC 1.13.11.12,简称LOX)是一类含有非血红素铁的双加氧酶，其催化生成的不饱和脂肪酸氢过氧化物，是面粉增白剂和增香剂、抗肿瘤药物前体、涂料与洗涤剂等的生产原料，是重要的药物合成和化学合成中间体，具有巨大的市场需求。工业使用LOX大多是植物来源的LOX，绝大部分来源于大豆。由于工艺成本的限制，大豆提取的LOX往往含有多种同工酶，对控制其催化产物特性非常不利(Casey R,et al.FoodBiotechnol,2005)。与传统提取法相比，微生物发酵得到的LOX性能稳定，其良好的同质性受到了越来越多的关注。现阶段国内外对微生物来源LOX的研究主要集中于中温LOX，研究内容包括菌种选育、发酵优化(陆信曜，食品科技，2013)、酶学性质、结构及催化特性、固定化、基因的克隆与表达以及酶蛋白分子改造等方面(Casey R,et al.Trends Food SciTech,1999；Koeduka T,et al.Curr Microbi-ol,2007；张充等，生物工程学报，2012；章栋梁等，核农学报，2012；Hansen J,et al.Appl Microbiol Biot,2013；王广圣等，食品科技，2014等)，目前，还未见有关微生物发酵生产低温LOX、低温LOX产业化、规模化生产的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在10～18℃液体发酵培养基中发酵生产低温脂肪氧合酶的方法，这种生产方法获得的低温脂肪氧合酶粗酶液酶活可以达到170U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。
本发明的技术方案如下：微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法具体包括以下步骤：
(1)将能产生脂肪氧合酶的菌种先活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基为：蛋白胨5.0～15.0g，亚油酸2.0～10.0g，NaCl 5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH值为6.0～8.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
所述的能产生脂肪氧合酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号：1.204或1.239或1.858；
(2)按常规方法将步骤(1)中低温驯化后的脂肪氧合酶产生菌在液体种子培养基中于10～18℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基为:酵母膏10.0～20.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，自来水1.0L，pH6.0～8.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
(3)将液体二级种子按发酵液体积3～9％的接种量接入液体产酶培养基中，在10～18℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温脂肪氧合酶结束；所述的液体产酶培养基为:牛肉膏3.0～10.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.0～2.0g，MgSO40.1～0.5g，CaCl20.1～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4～3.0mg，自来水1.0L，pH值6.0～7.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
(4)将步骤(3)的发酵液在4,000～10,000rpm离心收集菌体，超声破碎，收集到的上清液即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
进一步的，步骤(1)中产生脂肪氧合酶菌种的活化培养基为：酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH7.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。
本发明中脂肪氧合酶产生菌初期活化和生长条件按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供的说明进行。菌株先活化、再经过逐级低温驯化后发酵生产低温脂肪氧合酶时按本发明产酶条件进行培养。低温驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月，用10～25vt％甘油制成的菌悬液、在-80℃条件下可以长期保藏。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明利用微生物发酵生产低温脂肪氧合酶，经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理均不会影响产品的品质，特别是低温脂肪氧合酶在低温下仍具有高酶活力及高催化效率，改善并提高产品质量；
(2)本发明方法简化了生产工艺，缩短加工时间并从根本上省却中温酶使用中加热、冷却设备的环节，省却昂贵的加热或冷却费用，在节能方面有相当大的优势；
(3)本发明方法生产的脂肪氧合酶主要应用操作简单、方便、快捷、成本低，可适用于医药、食品加工、造纸与纺织、印染与洗涤、以及其它脂肪氧合酶应用行业，具有广阔的开发潜力和应用前景。
具体实施方式
实施例1
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：酵母膏5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl10.0g,琼脂20.0g,自来水1.0L,pH7.0,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：蛋白胨5.0g,亚油酸2.0g,NaCl5.0g,L-天冬氨酸0.5g,L-谷氨酸0.5g,琼脂20.0g,自来水1.0L,pH值为8.0,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。。
③液体种子培养基:酵母膏10.0g,蛋白胨5.0g,NaCl 5.0g,L-天冬氨酸0.5g,L-谷氨酸0.5g,自来水1.0L,pH值为8.0,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。
④液体产酶培养基:牛肉膏3.0g,蛋白胨5.0g,NaCl5.0g,L-天冬氨酸0.5g,L-谷氨酸0.5g,Tween800.1g,(NH4)2SO41.0g,KH2PO41.0g,MgSO40.1g,CaCl20.1g,ZnSO4·7H2O 2.4mg,自来水1.0L,pH值为7.0,于103kpa、21℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)将能产生脂肪氧合酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，驯化8天左右，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温环境中稳定生长即驯化结束；
(4)按常规方法将低温驯化后的脂肪氧合酶产生菌在液体种子培养基上于10～12℃培养48～72h后，按5vt％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3～5％的接种量接入5L的液体产酶培养基中，在10～12℃培养120～144h时，即微生物发酵生产低温脂肪氧合酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～10,000rpm离心20min收集菌体，超声破碎，收集到的上清液即为粗酶液，粗酶液酶活可以达到170U/ml；
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温脂肪氧合酶制剂。
实施例2
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：酵母膏5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl10.0g,琼脂20.0g,自来水1.0L,pH值为7.0,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：蛋白胨10.0g,亚油酸5.0g,NaCl 6.0g,L-天冬氨酸0.8g,L-谷氨酸1.0g,琼脂15.0g,自来水1.0L,pH值为6.5,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。。
③液体种子培养基:酵母膏12.0g,蛋白胨8.0g,NaCl 6.0g,L-天冬氨酸1.0g,L-谷氨酸1.0g,自来水1.0L,pH值为6.5,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。
④液体产酶培养基:牛肉膏5.0g,蛋白胨6.0g,NaCl 8.0g,L-天冬氨酸1.0g,L-谷氨酸1.0g,Tween800.2g,(NH4)2SO41.2g,KH2PO41.5g,MgSO40.3g,CaCl20.2g,ZnSO4·7H2O2.6mg,自来水1.0L,pH值为6.5,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)将产生脂肪氧合酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，驯化8天左右，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温环境中稳定生长即驯化结束；
(4)按常规方法将低温驯化后的脂肪氧合酶产生菌在液体种子培养基上于12～14℃培养48～72h后，按5vt％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5～7％的接种量接入50L的液体产酶培养基中，在12～14℃培养96～120h时，即微生物发酵生产低温脂肪氧合酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～10,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液，粗酶液酶活可以达到170U/ml；
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温脂肪氧合酶制剂。
实施例3
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：酵母膏5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl10.0g,琼脂20.0g,自来水1.0L,pH值为7.0,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
②菌种低温驯化培养基：蛋白胨15.0g,亚油酸10.0g,NaCl10.0g,L-天冬氨酸2.0g,L-谷氨酸2.0g,琼脂20.0g,自来水1.0L,pH值为6.0,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
③液体种子培养基:酵母膏20.0g,蛋白胨10.0g,NaCl10.0g,L-天冬氨酸2.0g,L-谷氨酸2.0g,自来水1.0L,pH值为6.0,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
④产酶培养基:牛肉膏10.0g,蛋白胨10.0g,NaCl10.0g,L-天冬氨酸2.0g,L-谷氨酸2.0g,Tween800.4g,(NH4)2SO41.5g,KH2PO42.0g,MgSO40.5g,CaCl20.3g,ZnSO4·7H2O3.0mg,自来水1.0L,pH值为6.0,于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
(2)将产生脂肪氧合酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，驯化8天左右，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温环境中稳定生长即驯化结束；
(4)按常规方法将低温驯化后的脂肪氧合酶产生菌在液体种子培养基上于14～16℃培养48～72h后，按5vt％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7～9％的接种量接入500L的液体产酶培养基中，在14～16℃培养72～96h时，即微生物发酵生产低温脂肪氧合酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～10,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液，粗酶液酶活可以达到170U/ml。
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温脂肪氧合酶制剂。

Claims (2)

1.一种微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将能产生脂肪氧合酶的菌种先活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃→25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基为：蛋白胨5.0～15.0g，亚油酸2.0～10.0g，NaCl 5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH值为6.0～8.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
所述的能产生脂肪氧合酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号：1.204或1.239或1.858；
(2)按常规方法将步骤(1)中低温驯化后的脂肪氧合酶产生菌在液体种子培养基中于10～18℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基为:酵母膏10.0～20.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，自来水1.0L，pH6.0～8.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
(3)将液体二级种子按发酵液体积3～9％的接种量接入液体产酶培养基中，在10～18℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温脂肪氧合酶结束；所述的液体产酶培养基为:牛肉膏3.0～10.0g，蛋白胨5.0～10.0g，NaCl5.0～10.0g，L-天冬氨酸0.5～2.0g，L-谷氨酸0.5～2.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.0～2.0g，MgSO40.1～0.5g，CaCl20.1～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4～3.0mg，自来水1.0L，pH值6.0～7.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min；
(4)将步骤(3)的发酵液在4,000～10,000rpm离心收集菌体，超声破碎，收集到的上清液即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵生产低温脂肪氧合酶的方法，其特征在于，步骤(1)中产生脂肪氧合酶菌种的活化培养基为：酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，琼脂20.0g，自来水1.0L，pH7.0，于103kpa、121℃高压蒸汽灭菌30min。
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