CN102093989A - 微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所述的一种微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶的方法是将产生生淀粉糖化酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的生淀粉糖化酶产生菌在14～20℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在14～20℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温生淀粉糖化酶微生物发酵生产方法。该发明生产的低温生淀粉糖化酶主要应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织工业、医药行业以及其它淀粉糖化酶应用行业。可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。
背景技术
生淀粉糖化酶是指能将不经过蒸煮糊化的生淀粉直接水解成葡萄糖的酶类，其作用特点是能够将淀粉糖化传统工艺中的糊化、液化、糖化三步合并为一步(王岁楼，食品与发酵工业，1988)。生淀粉糖化酶作为生物制剂，已经广泛应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织工业、医药行业以及其它淀粉糖化酶应用行业。国内外对生淀粉糖化酶进行了大量的工作，目前应用的生淀粉糖化酶主要为中温和高温生淀粉糖化酶，研究主要集中在中温生淀粉糖化酶高效菌株选育、发酵条件优化等(Haiyan Sun，et al.Appl Biochem Biotechnol，2009)。有关低温生淀粉糖化酶的研究及其产业化、规模化生产和应用还未见报道。低温生淀粉糖化酶与高温、中温生淀粉糖化酶相比具有很大的应用优势，因为低温生淀粉糖化酶在低温条件下具有高酶活力及高催化效率；可减少加工工艺，缩短加工过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理可使低温酶的活力丧失；低温或适温处理有助于提高产品品质和质量(朱非等，微生物学报，2002)，低温生淀粉糖化酶上述特性有助于其推广和应用。低温生淀粉糖化酶的应用将对传统的粮食加工、食品、酿造、发酵、纺织品、医药等领域产生深远的影响，利用微生物发酵生产的低温生淀粉糖化酶，按原料重量0.1‰～0.5‰的量添加于生料发酵、食品加工和多孔淀粉生产等领域中，在8～20℃处理0.5～1.5h，可以提高原料的转化率13.5％～22.6％，降低了生产成本，改善并提高产品质量。可以从根本上摆脱中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。低温生淀粉糖化酶将为人类摆脱发展中所面临的资源、能源危机以及环境污染等问题提供现实的机遇。低温生淀粉糖化酶具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在14～20℃液体发酵生产低温生淀粉糖化酶的方法，这种生产方法获得的低温生淀粉糖化酶粗酶液活性可以达到140U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。当该酶制剂活性为1000U/mL或1000U/g，0.1‰～0.5‰的量应用于生料发酵、食品加工和多孔淀粉生产等领域中，在8～20℃处理0.5～1.5h，可以提高原料的转化率13.5％～22.6％。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
本发明所述的一种微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶的方法具体包括以下步骤：
(1)将产生生淀粉糖化酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(2)按常规方法将低温驯化后的生淀粉糖化酶产生菌在14～20℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入产酶培养基中，在14～20℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶结束；
(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。生淀粉糖化酶产生菌(例如，CGMCC菌种编号：1.2323T或1.447或1.504或3.2790等)，菌株先活化，再经过逐级低温驯化，进行低温生淀粉糖化酶发酵生产时按本发明方法进行培养。低温驯化后的菌株斜面在4℃环境中可保存2个月，用25～45％甘油制成的菌悬液在零下80℃条件下可以长期保藏。
具体实施方式：
实施例一：
(1)、培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：生淀粉0.5～5.0g，蛋白胨0.1～2.0g，牛肉膏0.1～2.0g，NH4NO30.5～5.0g，K2HPO40.5～5.0g，MgSO4.7H2O 0.1～2.0g，FeSO4.7H2O 0.01～0.5g，KCl 0.1～2.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。其中生淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。
③液体种子培养基：蛋白胨5.0～20.0g，酵母膏5.0～20.0g，葡萄糖0.5～2.0g，K2HPO41.0～5.0g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
④产酶培养基：玉米生淀粉30.0～100.0g，牛肉膏10.0～20.0g，NaCl 3.0～5.0g，FeSO4·7H2O 0.01～0.2g，K2HPO43.0～5.0g，MgSO4·7H2O 0.2～2.0g，自来水1.0L，pH值6.0，121℃高压蒸气灭菌30min。其中生玉米淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。
(2)将产生生淀粉糖化酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的生淀粉糖化酶产生菌在14～16℃培养48～72h，按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3～5％的接种量接入10L的产酶培养基中，在14～16℃培养120～144h时，即微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温生淀粉糖化酶制剂。
实施例二：
(1)、培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：生淀粉0.5～5.0g，蛋白胨0.1～2.0g，牛肉膏0.1～2.0g，NH4NO30.5～5.0g，K2HPO40.5～5.0g，MgSO4.7H2O 0.1～2.0g，FeSO4.7H2O 0.01～0.5g，KCl 0.1～2.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。其中生淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。
③液体种子培养基：蛋白胨5.0～20.0g，酵母膏5.0～20.0g，葡萄糖0.5～2.0g，K2HPO41.0～5.0g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
④产酶培养基：玉米生淀粉30.0～100.0g，牛肉膏10.0～20.0g，NaCl 3.0～5.0g，FeSO4·7H2O 0.01～0.2g，K2HPO43.0～5.0g，MgSO4·7H2O 0.2～2.0g，自来水1.0L，pH值6.0，121℃高压蒸气灭菌30min。其中生玉米淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。
(2)将产生生淀粉糖化酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的生淀粉糖化酶产生菌在16～18℃培养48～72h，按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5～7％的接种量接入50L的产酶培养基中，在16～18℃培养96～120h时，即微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温生淀粉糖化酶制剂。
实施例三：
(1)、培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：生淀粉0.5～5.0g，蛋白胨0.1～2.0g，牛肉膏0.1～2.0g，NH4NO30.5～5.0g，K2HPO40.5～5.0g，MgSO4.7H2O 0.1～2.0g，FeSO4.7H2O 0.01～0.5g，KCl 0.1～2.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。其中生淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。
③液体种子培养基：蛋白胨5.0～20.0g，酵母膏5.0～20.0g，葡萄糖0.5～2.0g，K2HPO41.0～5.0g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
④产酶培养基：玉米生淀粉30.0～100.0g，牛肉膏10.0～20.0g，NaCl 3.0～5.0g，FeSO4·7H2O 0.01～0.2g，K2HPO43.0～5.0g，MgSO4·7H2O 0.2～2.0g，自来水1.0L，pH值6.0，121℃高压蒸气灭菌30min。其中生玉米淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。
(2)将产生生淀粉糖化酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的生淀粉糖化酶产生菌在18～20℃培养48～72h，按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7～9％的接种量接入100L的产酶培养基中，在18～20℃培养72～96h时，即微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温生淀粉糖化酶制剂。
实施例四：
按实施例一、二和三方法生产的低温生淀粉糖化酶制剂，平均酶活性为1000U/mL，将活性为1000U/mL或1000U/g的低温生淀粉糖化酶制剂，按原料重量0.1‰～0.5‰的量添加于生料发酵、食品加工和多孔淀粉生产等领域中，在8～20℃处理0.5～1.5h，可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。低温生淀粉糖化酶应用部分实验结果见下表。
| 实验物料 | 低温生淀粉糖化酶添加量(‰) | 处理时间(h) | 转化率(％) | 处理温度(℃) |
| 玉米生淀粉 | 0.1～0.5 | 1.5 | +15.8 | 8～20 |
| 小麦生淀粉 | 0.1～0.5 | 1.2 | +16.4 | 8～20 |
| 高粱生淀粉 | 0.1～0.5 | 1 | +13.5 | 8～20 |
| 木薯淀粉 | 0.1～0.5 | 0.5 | +14.6 | 8～20 |
| 大麦生淀粉 | 0.1～0.5 | 0.5 | +15.1 | 8～20 |
| 马铃薯生淀粉 | 0.1～0.5 | 0.5 | +13.8 | 8～20 |
| 大米生淀粉 | 0.1～0.5 | 1.5 | +22.6 | 8～20 |
实验结果表明：低温生淀粉糖化酶应用于生料发酵、食品加工和多孔淀粉生产等领域中，可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量；同时也说明低温生淀粉糖化酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低；可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
Claims (2)
1.一种微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶的方法，其包括以下步骤：
(1)将产生生淀粉糖化酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低温环境中生长良好；
(2)按常规方法将低温驯化后的生淀粉糖化酶产生菌在14～20℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在14～20℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶结束；
(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中菌种低温驯化培养基、液体种子培养基、产酶培养基分别为：
(1)菌种低温驯化培养基：生淀粉0.5～5.0g，蛋白胨0.1～2.0g，牛肉膏0.1～2.0g，NH4NO3 0.5～5.0g，K2HPO4 0.5～5.0g，MgSO4.7H2O 0.1～2.0g，FeSO4.7H2O 0.01～0.5g，KCl 0.1～2.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。其中生淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。
(2)液体种子培养基：蛋白胨5.0～20.0g，酵母膏5.0～20.0g，葡萄糖0.5～2.0g，K2HPO4 1.0～5.0g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
(3)产酶培养基：玉米生淀粉30.0～100.0g，牛肉膏10.0～20.0g，NaCl 3.0～5.0g，FeSO4·7H2O 0.01～0.2g，K2HPO4 3.0～5.0g，MgSO4·7H2O 0.2～2.0g，自来水1.0L，pH值6.0，121℃高压蒸气灭菌30min。其中生玉米淀粉在105℃下干热灭菌2h，然后在常温下无菌操作加入。
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