CN107287143A - 高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供的重组菌，包括如下步骤：1)抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性，得到目的菌A；2)在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A，得到目的菌B；3)抑制所述目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性，得到重组菌。本发明的实验证明，在大肠杆菌体内构建丁醇合成途径后，敲除相关副产物基因并加强丁醇途径基因的表达可以大幅度提高丁醇的产量。

Description

高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高产丁醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
能源与环境是当今社会关注的焦点。随着化石能源的日渐枯竭和自然环境的污染，人类对可再生能源的需求越来越强烈。利用微生物转化或发酵可再生资源高效生产可再生能源是今后的能源发展趋势，这种通过生物法生产化学品的方式是可持续的且环境友好的。
丁醇是一种重要的化工品和原料，可直接用作有机溶剂，是合成多种酯类化合物的前体，广泛应用于各种塑料和橡胶制品中。同时，丁醇也是优良的可替代汽油的生物燃料。它具有和汽油相当的热值与辛烷值，可与汽油以任意比例混合；在运输过程中，不易腐蚀管道；与乙醇相比，其蒸汽压低，安全性高，因此是一种极具潜力的新型生物燃料。目前，丁醇的年市场需求大约在百万吨级别。
丁醇可由生物合成是巴斯德于1861年首次发现的，1912年，魏兹曼(Weizmann)发现了一种梭菌Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇。之后，很多研究便集中于改造丙酮丁醇梭菌，以期得到可用于工业化生产丁醇的工程菌株。但是，丙酮丁醇梭菌是一种严格厌氧生长的革兰氏阳性细菌，其遗传操作系统复杂，不利于进行实验室的研究和工业的生产。2008年，Shota Atsumi,James C.Liao等首先在大肠杆菌中实现了丁醇的合成(Atsumi S,Cann A F,Connor M R,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli for 1-butanol production.Metabolicengineering,2008,10(6):305-311.)，该研究组将丙酮丁醇梭菌体内的丁醇合成途径转移至大肠杆菌内，致使其可产生少量丁醇。随后，该研究组对整条途径进行了优化，将以NADH为还原力，催化可逆反应巴豆酰辅酶A生成丁酰辅酶A的丁酰辅酶A脱氢酶复合物(Bcd-EtfAB complex)替换为来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的催化不可逆反应的反式烯酰辅酶A还原酶(Ter)；催化乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A的酶，由乙酰乙酰辅酶A硫解酶(Thl)换为大肠杆菌中活性更强的乙酰辅酶A乙酰转移酶(AtoB)，由此形成了NADH和乙酰辅酶A的驱动力，丁醇产量大幅度提高。
目前的丁醇生产菌株都是基于质粒表达基因，并且使用诱导型启动子，所以不适用于大规模的工业化生产。适合大规模生产丁醇的工业菌株需要所有的基因操作在染色体水平进行以保持遗传稳定性，不需要诱导剂，并且要有较高的产量和得率以降低分离成本和原料成本，这样的菌株目前还未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种构建重组菌的方法。
本发明提供的重组菌，包括如下步骤：
1)抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性，得到目的菌A；
2)在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A，得到目的菌B；
3)抑制所述目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性，得到重组菌。
上述方法中，所述抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上pykA基因；
所述提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性为增加所述出发菌基因组中fdh基因的拷贝数；
所述抑制目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上的yieP、stpA、yqeG和yagM基因全部或部分片段；
所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性为增加目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数。
上述方法中，所述增加出发菌基因组中fdh基因的拷贝数为将fdh基因及其启动子整合到所述出发菌基因组上；
所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数为将ter基因及其RBS和crt基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组上。
上述方法中，所述敲除或整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；
所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；
所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。
上述方法中，所述敲除出发菌基因组上pykA基因为采用λ-red同源重组系统将所述出发菌基因组上的pykA基因替换为FRT；
所述FRT为序列14第59-106位；
所述将fdh基因及其启动子整合到目的菌A基因组为采用整合质粒将所述出发菌基因组上maeB基因替换为含有fdh及其启动子的片段1，且将所述出发菌基因组上位于mdh基因位点的FRT替换为含有fdh及其启动子的片段2；
位于mdh基因位点的FRT为在制备出发菌时，将初始菌中的mdh基因替换为FRT。
所述含有fdh及其启动子的片段1的核苷酸序列具体为序列23第941-2535位核苷酸；
所述含有fdh及其启动子的片段2的核苷酸序列具体为序列24第931-2525位核苷酸；
所述敲除出发菌基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因部分片段为采用CRISPR/Cas系统分别敲除yieP基因序列第70-619位核苷酸、stpA基因序列第74-373位核苷酸、yqeG基因序列第1-695位核苷酸、yagM基因序列第121-855位核苷酸；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的靶基因分别为yieP、stpA、yqeG、yagM基因；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的sgRNA的核苷酸序列分别为序列33、序列34、序列35、序列27；
所述将ter基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组为采用CRISPR/Cas系统将含有ter基因及其RBS的片段替换所述目的菌B基因组上yciA基因；
所述含有ter基因及其RBS的片段的核苷酸序列为序列25；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的靶基因为yciA基因；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的sgRNA的核苷酸序列为序列28；
所述将crt基因及其RBS整合到目的菌B基因组为将所述含有crt基因及其RBS的片段采用CRISPR/Cas系统替换目的菌B基因组上poxB基因；
所述含有crt基因及其RBS的片段的核苷酸序列为序列26；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的靶基因为poxB基因；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的sgRNA的核苷酸序列为序列29。
上述方法中，
步骤2)中，所述在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A包括如下步骤：
2)-1，将所述目的菌A在葡萄糖为碳源的M9培养基中转接驯化，得到丁醇产量大于6g/L的菌株；其中，转接驯化的次数为52次，每次转接驯化的培养时间为1天；
2)-2，将2)-1得到的所述丁醇产量大于6g/L的菌株在葡萄糖酸作为碳源的改良M9培养基转接驯化直到得到丁醇产量不变菌株；其中，转接驯化的次数为49次，每次转接驯化培养1天；
2)-3，将2)-2得到的丁醇产量不变菌株在所述葡萄糖为碳源的M9培养基转接驯化直到得到丁醇产量不变菌株；命名为目的菌B。其中，转接驯化的次数为14次，每次转接驯化培养1天。
上述方法中，
所述生产丁醇的出发菌为生产丁醇的大肠杆菌，所述生产丁醇的大肠杆菌为将丙酮丁醇梭菌体内的丁醇合成途径转移至初始大肠杆菌得到的菌；所述生产丁醇的大肠杆菌具体为将atoB、hbd、crt、adhE2、ter、fdh整合到初始大肠杆菌的基因组中，且所述初始大肠杆菌中的hyc-hyp基因替换为FRT、fdhF基因替换为fdh、mdh基因替换为FRT。所述生产丁醇的大肠杆菌尤其具体为EB216CGMCC No.11590。
所述初始大肠杆菌具体为大肠杆菌BW25113。
由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组菌EB243的保藏号为CGMCC No.12191。
EB243菌已于2016年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.12191，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
上述方法或上述重组菌在生产丁醇或提高丁醇产量中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种生产丁醇的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述重组菌，得到丁醇。
所述pykA基因的核苷酸序列如序列表中序列12所示；
所述maeB基因的核苷酸序列如序列表中序列30所示；
所述mdh基因的核苷酸序列如序列表中序列11所示；
所述yieP基因的核苷酸序列如序列表中序列17所示；
所述stpA基因的核苷酸序列如序列表中序列18所示；
所述yqeG基因的核苷酸序列如序列表中序列15所示；
所述yagM基因的核苷酸序列如序列表中序列16所示；
所述yciA基因的核苷酸序列如序列表中序列31所示；
所述poxB基因的核苷酸序列如序列表中序列32所示。
本发明的实验证明，在大肠杆菌体内构建丁醇合成途径后，敲除相关副产物基因并加强丁醇途径基因的表达可以大幅度提高丁醇的产量。经Tn5转座子筛选且敲除或抑制筛选到的基因和驯化所得到的产丁醇菌株丁醇产量进一步提高。将其中关键酶基因进行RBS优化后，最终的工程菌可高产丁醇并有较高的得率，是目前报道的表现最好的菌株。
附图说明
图1为生产丁醇的大肠杆菌体内的丁醇生产途径。
图2为EB204体内基因替换的电泳图。
图3为发酵液使用高效液相色谱分析的结果示意图。
图4为菌株EB228及驯化后菌株的丁醇产量和得率比较图。
图5为菌株EB232及Tn5转座子突变体菌株的丁醇产量比较图。
图6为菌株EB234及其突变体菌株的丁醇产量和得率比较图。
图7为菌株EB238、EB242、EB243的丁醇产量比较图。
图8为菌株EB243发酵过程图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述葡萄糖为碳源的M9培养基的配方为：17.1g/l Na2HPO4·12H2O、3.0g/lKH2PO4、0.5g/l NaCl、1.0g/l NH4Cl、0.5mg/l维生素B1、22g/l C6H12O6·H2O、2mM MgSO4·7H2O、0.1mM CaCl2和水。
葡萄糖酸为碳源的改良M9培养基为将葡萄糖为碳源的M9培养基中的葡萄糖替换为葡萄糖酸得到的培养基。
下述TB培养基的配方为：12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母提取物、4ml/l甘油、2.31g/lKH2PO4、12.54g/l K2HPO4、22g/l C6H12O6·H2O和水。
实施例1、生产丁醇出发菌EB216的构建
大肠杆菌EB216为将atoB、hbd、crt、adhE2、ter、fdh整合到初始大肠杆菌BW25113的基因组中，且所述初始大肠杆菌中的hyc-hyp基因替换为FRT、fdhF基因替换为fdh、mdh基因替换为FRT得到的菌，EB216已于2015年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.11590，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli。
具体构建方法如下：
下面的实施例用的是sacB基因介导筛选的同源重组系统进行基因在染色体上的替换或插入；pSM2-Pcpc560ter记载在如下文献中：Zhou,Jie,et al.Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins incyanobacteria.Scientific reports 4(2014)；pITF记载在如下文献中：Dong,Hongjun,etal.Engineering Clostridium strain to accept unmethylated DNA.PLoS One 5.2(2010):e9038；
atoB基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；
hbd基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
crt基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；
adhE2基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示；
ter基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示；
fdh基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。
一、基础丁醇生产菌株EB204和EB205
A、基础丁醇生产菌株EB204和EB205的构建过程
1、大肠杆菌BW25113感受态细胞的制备
BW25113感受态细胞：在三角瓶中培养至对数生长中期的200ml BW25113菌液，冰浴30min。4℃，3000g离心5min。弃掉上清液，用预冷的无菌10％甘油重悬菌体，洗涤两次。最后加入1ml预冷的10％甘油重悬菌体，50μl每管分装至预冷的1.5ml无菌离心管中备用，得到BW25113感受态细胞。
2、将丁醇途径转移至BW25113构建基础丁醇生产菌株
以大肠杆菌BW25113基因组为模板，用引物234-(yqhD::atoB)-3(ATCGGGATCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGACGGCACC)/235-(yqhD::atoB)(GCTCGTATAATGTGTGGAATTGACGGCACCCCTACAAACAGAAGGAATATAAAATGAAA)/236-(yqhD::atoB)-4(ATCGTCTAGATTAATTCAACCGTTCAATCACCATCGCAAT)扩增出丁醇合成途径基因atoB；
以丙酮丁醇梭菌DSM1731(购自Leibniz Institute DSMZ-German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)基因组为模板，分别用引物917-miniPtac-hbd-1
(ATCGCATATGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGAATTTAGGGAGGTCTGTTTAATGAAAAAGG)/918-miniPtac-hbd-2(ATCGTCTAGATTATTTTGAATAATCGTAGAAACCTTTTC)、940-(ackA-pta)::crt-3a
(ATCGCATATGTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGATTTTAG)/941-(ackA-pta)::crt-3b
(GCTCGTATAATGTGTGGAATTGATTTTAGGAGGATTAGTCATGGAACTAAACAATGTC)/942-(ackA-pta)::crt-4(ATCGTCTAGACTATCTATTTTTGAAGCCTTCAATTTTTCTTTTCTC)、225-(frdBC::adhE2)-3a
(ATCGTCTAGATGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTTATAAAG)/226-(frdBC::adhE2)-3b
(CTCGTATAATGTGTGGAATTGTTATAAAGGAGTGTATATAAATGAAAGTTACAAATCA)/227-(frdBC::adhE2)-4(ATCGGTCGACTTAAAATGATTTTATATAGATATCCTTAAG)分别扩增出丁醇合成途径基因hbd、crt、adhE2；
以含有ter基因的质粒pSM2-Pcpc560ter为模板，用引物216-(adhE::ter)-3a(ATCGCATATGTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGGAGGTA)/217-(adhE::ter)3b(TCGTATAATGTGTGGAATTGTGGAGGTATGATATGATTGTGAAACCCATGGTGCGCAAC)/218-(adhE::ter)-4(ATCGTCTAGATTAAATGCGATCAAAGCGTTCCACTTCGGCTTC)扩增出丁醇合成途径基因ter；
以含有fdh基因的质粒pITF为模版，用引物975-fdh-1(ATCGGGTACCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTAAGAAGG)和976-fdh-2(ATGTGTGGAATTGTAAGAAGGAGATATACCATGAAGATCGTTTTAGTCTTATATGGTGC)扩增出丁醇合成途径基因fdh。
然后再以大肠杆菌BW25113基因组为模版，分别用引物232-(yqhD::atoB)-1(ATCGCTCGAGGGCCTTCATGCCGTCATGGATGATCATCATC)/233-(yqhD::atoB)-2(ATCGGGATCCCAGCGATTGCGCCTTTACCAAACAGAATGCG)和237-(yqhD::atoB)-5(ATCGTCTAGAGAGCACGGCATGACCCAACTGGGCGAAAATC)/238-(yqhD::atoB)-6(ATCGCTGCAGACCGGGAGAATTTGCATGTTAGCCGCCGAAC)分别扩增出基因yqhD的上游片段和下游片段；分别用引物910-ldhA-1(ATCGCTCGAGGACCATCGCTTACGGTCAATTGTTGACGAG)/916-ldhA-2(ATCGCATATGGTGATGTTGAATCACATTTAAGCTAC)和919-ldhA-3(ATCGTCTAGACTGGAAAAAGGCGAAACCTGCCCGAACG)/915-ldhA-4(ATCGCTGCAGTTTAGCAAATGGCTTTCTTCTGCATTTTCG)分别扩增出基因ldhA的上游片段和下游片段；分别用引物938-(ackA-pta)::crt-1(ATCGCTCGAGTCCATTGTTGACTCCTGTATCACTCTACTACG)/939-(ackA-pta)::crt-2(ATCGCATATGCAGTGAAGAACTACCGCAGTTCAGAACC)和943-(ackA-pta)::crt-5(ATCGTCTAGACCCGTGGCGCACTGGTTGACGATATCGTC)/944-(ackA-pta)::crt-6(ATCGCTGCAGAATCAGAGTGGCGATAACCCACACCACGATGC)分别扩增出基因ackA-pta的上游片段和下游片段；分别用引物223-(frdBC::adhE2)-1(ATCGGGATCCCCGAAAAACAAATATATGGAACTGGGTC)/224-(frdBC::adhE2)-2(ATCGTCTAGAGGTATCGACTTCCGGGTTATAGCGCACCAC)和228-(frdBC::adhE2)-5(ATCGGTCGACCCAGAGCCAATTATCAAAAGTCTCTGGGCGG)/229-(frdBC::adhE2)-6(ATCGAAGCTTAAACCGATACTGGAGTTGGCATACAGACGTTG)分别扩增出基因frdBC的上游片段和下游片段；分别用引物214-(adhE::ter)-1(ATCGCTCGAGCAACAACATAAAGCGAACAATGCAATAGCCAC)/215-(adhE::ter)-2(ATCGCATATGCTGGGCTTTTTTTACACGCTCTACGAGTGC)和219-(adhE::ter)-5(ATCGTCTAGAGATTATGTAGAAGGTGAAACTGCAGCGAAGA)/220-(adhE::ter)-6(ATCGGTCGACGATGGTCGGGGGCGTTTTGTTATGAACACC)分别扩增出基因adhE的上游片段和下游片段；分别用引物957-eutE::fdh-1(ATCGGAATTCCCGGAAATATTGGTTACAAAATCGCACAAC)/958-eutE::fdh-2(ATCGGGTACCGATGTTCTGCCTTATTTGTGGAAAATTACC)和977-eutE-arm2-1(ATCGGAGCTCCTGTGTATTAGTCGATGCGTTTCGCATTG)/978-eutE-arm2-2(ATCGTCTAGACCGTTGCAGATTCAGGGTATCGAACGCCTG)分别扩增出基因eutE的上游片段和下游片段。
以pKD46(GenBank:AY048746.1)为模板，用引物890-Ts-1(CAAAGAGCTCAGGGGCTGTATGCACAAAGCATCTTCTGTTG)和891-Ts-2(ATCGGGATCCCATATGGAATTCCTCGAGCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGC)PCR扩增出约1.7kb的片段。使用SacI和BamHI酶切质粒pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1)，使用Omega胶回收试剂盒回收4kb大小的片段，该片段与同样使用SacI和BamHI酶切了的上述1.7kb片段连接，形成的新质粒命名为pKmTsSacB。
上述扩增的atoB基因以BamHI和XbaI酶切位点连接在yqhD基因的上下游片段之间，形成的新片段随后以XhoI和PstI酶切位点连接到pKmTsSacB温敏型质粒中，构建出染色体整合质粒；上述扩增的hbd和crt基因均以NdeI和XbaI酶切位点分别连接在ldhA和ackA-pta基因的上下游片段之间，形成的新片段随后均以XhoI和PstI酶切位点连接到pKmTsSacB温敏型质粒中，构建出染色体整合质粒；上述扩增的adhE2基因以XbaI和SalI酶切位点连接在frdBC基因的上下游片段之间，形成的新片段随后以BamHI和HindIII酶切位点连接到pKmTsSacB温敏型质粒中，构建出染色体整合质粒；上述扩增的ter基因以NdeI和XbaI酶切位点连接在adhE基因的上下游片段之间，形成的新片段随后以XhoI和SalI酶切位点连接到pKmTsSacB温敏型质粒中，构建出染色体整合质粒；上述扩增的fdh基因以KpnI和SacI酶切位点连接在eutE基因的上下游片段之间，形成的新片段随后以EcoRI和XbaI酶切位点连接到pKmTsSacB温敏型质粒中，构建出染色体整合质粒。最后，上述所有染色体整合质粒依次电击转化到大肠杆菌BW25113中，电击转化参数为：电压2.5kV，25μF，电阻200Ω。筛选突变体的过程是先在30℃条件下筛选卡那霉素抗性转化子，转化子在液体LB培养基中42℃条件下培养过夜，然后涂布于含有卡那霉素和蔗糖的平板，在42℃条件下培养，挑取生长出的菌落进行PCR验证筛选双交换突变体，结果如图2所示(1：ΔldhA::miniPtac-hbd 2：Δ(ackA-pta)::miniPtac-crt 3：ΔadhE::miniPtac-ter 4：ΔfrdBC::miniPtac-adhE2 5：ΔyqhD::miniPtac-atoB)。对应验证筛选atoB、hbd、crt、adhE2、ter、fdh等基因的验证引物分别为239-(yqhD::atoB)-F(TTTAAACTCACGGCTAAATTGCGATGCGCTTTC)/240-(yqhD::atoB)-R(CGAGGGGAATAAATGATTTCTGAAAAGTCCGG)、933-ldhA-F(CGTCCGCTGACCAGAGCGTTCTCAAGCCCTG)/934-ldhA-R(CAACCGCGCCATTACCGTCAATAGTAATCATATG)、945-ackA-pta-F(AATCCGTAACCACGCTCAATAATTGTTTGCAGG)/946-ackA-pta-R(AATCAGAGTGGCGATAACCCACACCACGATGC)、230-(frdBC::adhE2)-F(AAAAATGGCTACCGTTATCTGCAAGATTACGG)/231-(frdBC::adhE2)-R(TCGCCTGCTCAAAACTCAAACCAGACGGCTTC)、221-(adhE::ter)-F(TGATGCCGGTCTGGCGTAAAACCCGTACCAG)/222-(adhE::ter)-R(TATGTTTCACAGGATAACGGGTTTTTGATATC)、963-eutE-F(AAGCGCCTGCCAGCCCGCTACAGGGCAAGG)/964-eutE-R(ATCACGAACAGATGTTTCAGCCCACGCGTTTG)。经过上述过程得到的整合有atoB、hbd、crt、adhE2、ter基因的大肠杆菌菌株命名为EB204，在EB204基础上整合有fdh基因的菌株命名为EB205。图1为其体内的丁醇生产途径。
上述涉及的PCR均使用全式金公司的EasyTaq DNA聚合酶，PCR程序为表1：
表1为PCR程序
B、基础丁醇生产菌株EB204和EB205的发酵测试
上述得到的两个菌株分别在M9培养基和TB培养基中发酵48小时，发酵产物利用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测采用Agilent 1260液相色谱仪，示差折光检测器，BioRadAminexHPX-87H有机酸柱，柱温15℃，流动相为5mmol/l硫酸水溶液，流速0.5ml/min，进样量10μl。
具体发酵方法为：灭菌后的培养基分装至15ml离心管(BD Biosciences)内，每管分装10ml。接种0.5ml过夜活化的种子液，拧紧离心管的螺旋盖后再拧松半圈，置于37℃静置发酵48小时。
HPLC分析的标准品为葡萄糖、丁醇，保留时间依次为10.2min，41.0min左右，发酵液上清在相应时间也有峰出现，说明发酵液上清中确实含有葡萄糖、丁醇。
根据标准品浓度与峰面积的对应关系，确定的计算公式为：
葡萄糖浓度的计算公式：y＝194111x，R2＝0.9999，其中x表示葡萄糖浓度(g/L)，y表示实际峰面积；
丁醇浓度的计算公式：y＝138232x，R2＝0.9998，其中x表示丁醇浓度(g/L)，y表示实际峰面积。
液相色谱图如图3所示，检测结果如表2所示，可以看出两个菌株都具备了丁醇生产能力，表达fdh基因可以明显增加丁醇的产量和得率(丁醇产量/葡萄糖消耗量)。
表2HPLC分析EB204和EB205的丁醇产量表
大肠杆菌EB205菌已于2016年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.11985，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
二、去除基础丁醇生产菌株EB204和EB205宿主自身的甲酸降解途径
下面的实施例用的是λ-red同源重组系统进行基因敲除，其中涉及的质粒：
pKD4记载在如下文献中：Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；
pKD46记载在如下文献中：Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；
pCP20记载在如下文献中：Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；
下面的实施例用的是整合质粒pGFPduv8介导的同源重组系统进行基因在染色体上的替换或插入，其中涉及的整合质粒pGFPduv8构建过程见下述；
fdhF基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示；
hyc-hyp基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示。
A、去除宿主自身的甲酸降解途径构建菌株EB210、EB211、EB212和EB215
1、EB205及EB205(pKD46)感受态细胞的制备
EB205感受态细胞的制备同上述一中BW25113感受态细胞的制备；
EB205(pKD46)重组菌：取1μl pKD46与上述EB205感受态细胞混合，冰浴5min，将混合物转移至2mm电击杯内进行转化，电击转化参数同上述实施例1。电击转化完毕后，立即将菌液转移至1ml LB中，30℃复壮1h，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，30℃培养12h，得到EB205(pKD46)重组菌；
EB205(pKD46)感受态细胞：将上述涂布的平板上长出的EB205(pKD46)重组菌菌落转接至含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB中，30℃培养至OD600值约为0.2时，加入终浓度为10mmol/l的阿拉伯糖进行诱导，诱导至对数生长中期的菌体按照上述制备EB205的方法制备EB205(pKD46)感受态细胞。
2、敲除EB205内的甲酸降解途径
为了防止发酵过程中甲酸以H2和CO2的形式释放掉，从而造成还原力供给不足，敲除EB205菌株中的fdhF和hyc-hyp基因。
1)、fdhF同源重组片段的制备
以pKD4为模板，以敲除引物1074-fdhF-KoF(GTCGATAACGGCAAAATCGTCCGGGCGGAGGCAGCGCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)和1075-fdhF-KoR(GTCAATCACGTACTGCTCGGCGGCGCGCTGATCGGCGATCTGGGAATTAGCCATGGTCC)进行PCR扩增，得到1574bp的PCR扩增产物，为fdhF同源重组片段，经过测序，fdhF同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列9。
fdhF同源重组片段包括fdhF基因上游同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游FRT和fdhF基因下游同源臂；其中，fdhF基因上游同源臂为序列9第1-40位、上游FRT为序列9第59-106位、卡那霉素抗性基因为序列9第468-1262位、下游FRT为序列9第1453-1498位和fdhF基因下游同源臂为序列9第1535-1574位。
2)、通过同源重组敲除fdhF
将1μl上述1)制备的fdhF同源重组片段与上述一制备的EB205(pKD46)感受态细胞混合，按照以上电击转化方法进行转化，30℃复壮1.5h，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养24h，得到中间菌。
将中间菌作为模板，用验证引物1076-fdhF-1(ATGAAAAAAGTCGTCACGGTTTGCCCCTATTG)和1077-fdhF-2(TTACGCCAGTGCCGCTTCGCGCAGGCGAG)进行PCR扩增。以EB205(pKD46)为对照。
将上述PCR产物电泳检测，得到约1.5kb片段的中间菌为fdhF替换为两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段(序列9第41-1534位)的中间菌EB205△fdhF：：kan；EB205(pKD46)得到约2.1kb片段。
将上述fdhF替换为卡那霉素抗性基因的中间菌EB205△fdhF：：kan接至含50μg/ml卡那霉素的液体LB中，37℃培养至对数生长中期时制备感受态细胞，电击转化质粒pCP20至其中，30℃复壮1h，涂布于含30μg/ml氯霉素的LB平板上，30℃培养12h，使pCP20质粒上的FRT替换中间菌中的卡那霉素抗性基因。
上述涂布的平板上长出的菌落转接至无抗的液体LB中，42℃培养，经过两次传代培养后，稀释涂布于无抗平板上，37℃培养12h，经过2次42℃培养去除了温敏质粒pCP20(氯霉素抗性)和pKD46(氨苄青霉素抗性)。
挑取上述稀释涂布平板上的单菌落依次划线至卡那霉素抗性平板、氯霉素抗性平板、无抗平板，37℃培养12h。之后，筛选出只在无抗平板上生长，在其他两种平板上对应不生长的菌落即为fdhF基因敲除成功的重组菌，命名为EB210。
将EB210用上述验证引物和进行菌落PCR验证，电泳验证得到300bp以下的片段即为目的重组菌。
将EB210进行测序，结果该重组菌为将EB205基因组上的fdhF基因替换为FRT(序列9第59-106位)得到的重组菌。
3)、敲除hyc-hyp基因构建菌株EB211
敲除hyc-hyp基因的重组菌制备方法与上述敲除fdhF基因的过程基本相同，不同的仅是敲除引物、同源片段和验证引物，具体如下：
重组菌EB211为将EB205基因组上的hyc-hyp基因替换为FRT(序列10第59-106位)得到的重组菌。
所需的敲除引物、同源片段和验证引物如下：
hyc-hyp敲除引物：
1070-Hyd-KoF：TTGATAAACGGTTTCTACCGCATCTTTAATCGGCTGGGTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
1071-Hyd-KoR：ACAGCAGGGTCGTGCGTTTCAGCCCCAGACGTTGCGCAGCTGGGAATTAGCCATGGTCC
hyc-hyp同源重组片段的核苷酸序列为序列10，包括hyc-hyp基因上游同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游FRT和hyc-hyp基因下游同源臂；其中，hyc-hyp基因上游同源臂为序列10第1-40位、上游FRT为序列10第59-106位、卡那霉素抗性基因为序列10第468-1262位、下游FRT为序列10第1453-1498位和hyc-hyp基因下游同源臂为序列10第1535-1574位。
hyc-hyp验证引物，得到约1.6kb为阳性中间菌：
1072-Hyd-1：CTACTCTTCTTCCACCGCTAACTGCGCGAAG
1073-Hyd-2：TTAAATCAATGCCGATTTATCAATTCCCAGCCGC
4)、在EB211的基础上敲除fdhF基因构建EB212
按照上述制备感受态细胞的方法制备EB211和EB211(pKD46)感受态细胞，电转上述敲除fdhF基因所需的同源片段即序列9至其中，在EB211的基础上敲除fdhF形成EB212。
EB212为将EB205基因组上的hyc-hyp基因替换为FRT(序列10第59-106位)、fdhF基因替换为FRT(序列9第59-106位)得到的重组菌。
3、在EB212的fdhF位点整合fdh构建EB215
以含有fdh基因的质粒pUC57-fdhcb为模板，用引物1107-fdhcb-1(GCGTGATTTGATTAACTGGAGCGAGACCGATGAAGATTGTGCTGGTGCTGTACGACGC)和1108-fdhcb-2(GTATTACGCCAGTGCCGCTTCGCGCAGGCGATTACTTCTTGTCATGCTTGCCGTAGGCC)扩增出丁醇合成途径基因fdh。
上述质粒pUC57-fdhcb由金唯智公司合成，于实验室保存。
以大肠杆菌BW25113基因组为模版，分别用引物1103-fdhF-1(ATCGCTCGAGTTCTGGCGGTCGATAAACAAATTGTTGCCG)/1104-fdhF-2(GCGTCGTACAGCACCAGCACAATCTTCATCGGTCTCGCTCCAGTTAATCAAATCACGC)和1105-fdhF-3(GGCCTACGGCAAGCATGACAAGAAGTAATCGCCTGCGCGAAGCGGCACTGGCGTAATAC)/1106-fdhF-4(ATCGCTGCAGGCCTGATGCGACGCTTAACGCGTCTTATC)分别扩增出fdhF基因的上游片段和下游片段。
以合成的DNA序列36(序列表中序列36)为模板，用引物1081-GFPduv-1(GATGCCTAGGTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTG)和1082-GFPduv-2(ATCGGAGCTCCAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTC)PCR扩增出约1kb的miniPthl-gfpduv操纵子片段，该片段与质粒pKmTsSacB共同使用AvrII和SacI酶切，连接后形成的新质粒命名为pGFPduv8。
以上述扩增出的fdh基因与fdhF基因的上、下游片段为模板，用引物1103-fdhF-1(ATCGCTCGAGTTCTGGCGGTCGATAAACAAATTGTTGCCG)和1106-fdhF-4(ATCGCTGCAGGCCTGATGCGACGCTTAACGCGTCTTATC)进行融合PCR扩增出新的片段，该片段以XhoI和PstI酶切位点连接到整合质粒pGFPduv8中，形成染色体整合质粒。该质粒按照实施例1的电转方法电转至EB212中。突变体的筛选过程和实施例1中的方法相同，所得的双交换菌株为fdh基因替换了fdhF的重组菌，该菌株命名为EB215。
EB215为将EB205基因组上的hyc-hyp基因替换为FRT(序列10第59-106位)、fdhF基因替换为fdh(序列6)得到的重组菌。
上述PCR使用的DNA聚合酶和PCR程序同实施例1中一所述。
B、去除宿主自身的甲酸降解途径的菌株发酵测试
上述构建的菌株EB210、EB211、EB212、EB215连同EB205在TB培养基中按照上述一的方法发酵48小时，并按照上述一的HPLC检测方法进行检测，结果见表3。
HPLC分析甲酸标准品的保留时间为16.8min左右，甲酸浓度的计算公式：y＝76445x，R2＝0.9999，其中x表示甲酸浓度(g/L)，y表示实际峰面积。
表3去除宿主自身的甲酸降解途径的菌株甲酸与丁醇产量表
结果显示，相比于EB205出发菌株，敲除大肠杆菌本身的甲酸降解途径，可以使得甲酸的积累量增加，但是丁醇的产量降低。说明甲酸的积累抑制了细胞代谢，解决此问题需要进一步地把甲酸转化为NADH供给丁醇合成途径。
三、出发菌EB216
A、出发菌EB216的构建
分析相关代谢途径的基因，发现mdh基因编码的苹果酸脱氢酶负责催化草酰乙酸到苹果酸的反应，消耗还原力NADH，造成与丁醇合成途径竞争还原力。因此，在EB215的基础上采用λ-red同源重组系统敲除上述基因。
mdh基因的核苷酸序列如序列表中序列11所示。
敲除mdh的重组菌制备方法与上述二中敲除fdhF基因的过程基本相同，不同的仅是敲除引物、同源片段和验证引物，具体如下：
重组菌EB216为将EB215基因组上的mdh基因替换为FRT(序列13第59-106位)得到的重组菌。
所需的敲除引物、同源片段和验证引物如下：
mdh敲除引物：
1032-mdh-KoF：AAAACCCAACTGCCTTCAGGTTCAGAACTCTCTCTGTATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
1033-mdh-KoR：CGTTTTTACCCAGCAGCAGCGGTTGAGAGAAGAAACGGGCTGGGAATTAGCCATGGTCC
mdh同源重组片段的核苷酸序列为序列13，包括mdh基因上游同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游FRT和mdh基因下游同源臂；其中，mdh基因上游同源臂为序列13第1-40位、上游FRT为序列13第59-106位、卡那霉素抗性基因为序列13第468-1262位、下游FRT为序列13第1453-1498位和mdh基因下游同源臂为序列13第1535-1574位。
mdh验证引物，得到约1.7kb为阳性中间菌：
1034-mdh-1：ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGC
1035-mdh-2：GTTCTGTTCAAATGCGCTCAGGGTACCGAT
B、发酵
上述构建的菌株EB216连同EB215在M9培养基中按照上述一的方法发酵72小时，并按照上述一的HPLC检测方法进行检测，结果见表4。
表4敲除其它代谢途径基因构建菌株的丁醇产量表
结果显示敲除mdh基因可以增加丁醇的产量和得率。
实施例2、重组菌243的构建
一、敲除pykA基因得到重组菌EB222
A、重组菌EB222的构建
分析相关代谢途径的基因，发现pykA基因可以以其它NDP为底物合成NTP，从而可能降低胞内ATP的水平，不利于细胞生长。因此，在EB216的基础上采用λ-red同源重组系统敲除上述基因。
pykA基因的核苷酸序列如序列表中序列12所示。
敲除pykA基因的重组菌制备方法与实施例1的二中敲除fdhF基因的过程基本相同，不同的仅是敲除引物、同源片段和验证引物，具体如下：
重组菌EB222为将EB216基因组上的pykA基因替换为FRT(序列14第59-106位)得到的重组菌。
所需的敲除引物、同源片段和验证引物如下：
pykA敲除引物：
pykA-KoF：CTGGGGCGTCATGTGGCTATTCTGGGTGACCTCCAGGGGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
pykA-KoR：AGAGCTGATACGGGAGGTCATCAGCGCGGTACGACCCGATTGGGAATTAGCCATGGTCC
pykA同源重组片段的核苷酸序列为序列14，包括pykA基因上游同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游FRT和pykA基因下游同源臂；其中，pykA基因上游同源臂为序列14第1-40位、上游FRT为序列14第59-106位、卡那霉素抗性基因为序列14第468-1262位、下游FRT为序列14第1453-1498位和pykA基因下游同源臂为序列14第1535-1574位。
pykA验证引物，得到约1.9kb为阳性中间菌：
pykA-F：GATAATAATCTTGAAAAAGTTATCGCGGCG
pykA-R：TTCGCTGGCAGCTGCTACGCCGTCATTAGC
上述PCR使用的DNA聚合酶和PCR程序同实施例1。
B、敲除其它代谢途径基因构建菌株的发酵测试
上述构建的菌株EB222连同EB216在M9培养基中按照实施例1中一的方法发酵72小时，并按照实施例1中一的HPLC检测方法进行检测，结果见表5。
表5敲除其它代谢途径基因构建菌株的丁醇产量表
结果显示敲除pykA基因可以增加丁醇的产量和得率。
二、加强表达fdh基因得到EB223、EB225和EB228
下面的实施例用的是整合质粒pGFPduv9介导的同源重组系统进行基因在染色体上的替换或插入，pGFPduv9的构建方法见下述。
A、加强表达fdh基因构建菌株EB223、EB225和EB228
为了增强丁醇合成的还原力供给能力，需要加强fdh基因的表达水平。在EB222的基础上，选择大肠杆菌本身ydfZ基因的启动子(PydfZ)来启动fdh基因的表达。
以实施例1的二中含有fdh基因的质粒pUC57-fdhcb为模版，用引物1399-ydfZ-fdh-1(GAAAGGATCCATTGCCATTGAGCGCAAGCAACTGGATG)/1400-ydfZ-fdh-2(GCGTCGTACAGCACCAGCACAATCTTCATAGGTGTTTTCTCCTTTCTGATTTACAGTCG)和1401-ydfZ-fdh-3(CGACTGTAAATCAGAAAGGAGAAAACACCTATGAAGATTGTGCTGGTGCTGTACGACGC)/1335-fdhcb-2(AGAATCTAGATTACTTCTTGTCATGCTTGCCGTAGGCCTTTG)分别PCR扩增出DNA片段后，再以这两个片段为模板，用引物1399-ydfZ-fdh-1(GAAAGGATCCATTGCCATTGAGCGCAAGCAACTGGATG)和1335-fdhcb-2(AGAATCTAGATTACTTCTTGTCATGCTTGCCGTAGGCCTTTG)融合PCR扩增含有启动子PydfZ的fdh基因片段1；用引物1427-ydfZ-fdh-1(ATCGGAATTCATTGCCATTGAGCGCAAGCAACTGGATG)/1400-ydfZ-fdh-2(GCGTCGTACAGCACCAGCACAATCTTCATAGGTGTTTTCTCCTTTCTGATTTACAGTCG)和1401-ydfZ-fdh-3(CGACTGTAAATCAGAAAGGAGAAAACACCTATGAAGATTGTGCTGGTGCTGTACGACGC)/1389-fdhcb-2(ATCGGGATCCTTACTTCTTGTCATGCTTGCCGTAGGCCTTTG)分别PCR扩增出DNA片段后，再以这两个片段为模板，用引物1427-ydfZ-fdh-1(ATCGGAATTCATTGCCATTGAGCGCAAGCAACTGGATG)/1389-fdhcb-2(ATCGGGATCCTTACTTCTTGTCATGCTTGCCGTAGGCCTTTG)融合PCR扩增含有启动子PydfZ的fdh基因片段2。然后以大肠杆菌BW25113的基因组为模板，分别用引物1332-maeB-1(AGGGCTCGAGCTTCCACCACATACGGGTCCATCGGCTTGCGTG)/1333-maeB-2(AACAGGATCCTTTCCCTGGAACTGGAAATTCATGGAAATCAAG)和1336-maeB-3(GTAATCTAGATTCTGGTGATGCCGAACATGGAAGCTGCCC)/1337-maeB-4(ATGCCTGCAGGTTAAAATATTCACCCGGCGTATCAATATCG)分别扩增出基因maeB的上游片段和下游片段；分别用引物1370-mdh-1(ATCGCTCGAGCATTTTCCCCGCCGTCAGAAACGACGGGGC)/1371-mdh-2(ATCGGAATTCTTATTATATTGATAAACTAAGATATGTTGC)和1372-mdh-3(ATCGGGATCCGTATGCTGGATACGCTGAAGAAAGATATCG)/1373-mdh-4(ATCGTCTAGAATCATGGATCAACGCGGTTATATCATCACC)分别扩增出基因mdh的上游片段和下游片段。
以pR6Kan(购自Biomedal公司)为模版，用引物1222-R6K-1(ATCGGAGCTCCAACCATCATCGATGAATTGCTTCGTTAATACAG)和1223-R6K-2(ATCGCTCGAGATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGAC)PCR扩增出R6K ori片段，该片段与质粒pGFPduv8共同使用SacI和XhoI酶切，连接后形成的新质粒命名为pGFPduv9。
上述扩增的的fdh基因片段1以BamHI和XbaI酶切位点连接在maeB基因的上下游片段之间，形成的新片段随后以XhoI和PstI酶切位点连接到pGFPduv9整合质粒中，构建出染色体整合质粒1；
经过测序，染色体整合质粒1为将序列23所示的片段插入pGFPduv9整合质粒的XhoI和PstI酶切位点间得到的载体。
序列23所示的片段包括maeB基因上游同源臂(序列23第1-940位核苷酸)、含有启动子PydfZ的fdh基因片段1(序列23第941-2535位核苷酸)和maeB基因下游同源臂(序列23第2536-3525位核苷酸)。
上述扩增的fdh基因片段2以EcoRI和BamHI酶切位点连接在mdh基因的上下游片段之间，形成的新片段随后以XhoI和XbaI酶切位点连接到pGFPduv9整合质粒中，构建出染色体整合质粒2；
经过测序，染色体整合质粒2为将序列24所示的片段插入pGFPduv9整合质粒的XhoI和PstI酶切位点间得到的载体。
序列24所示的片段包括mdh基因上游同源臂(序列24第1-930位核苷酸)、含有启动子PydfZ的fdh基因片段2(序列24第931-2525位核苷酸)和mdh基因下游同源臂(序列24第2526-3465位核苷酸)。
上述染色体整合质粒1电击转化到大肠杆菌EB222中，电击转化参数为：电压2.5kV，25μF，电阻200Ω，在30℃条件下筛选卡那霉素抗性转化子，转化子在液体LB培养基中42℃条件下培养过夜，然后涂布于含有卡那霉素和蔗糖的平板，在42℃条件下培养，挑取生长出的菌落进行PCR验证筛选双交换突变体，鉴定引物为1332-maeB-1(AGGGCTCGAGCTTCCACCACATACGGGTCCATCGGCTTGCGTG)/1337-maeB-4(ATGCCTGCAGGTTAAAATATTCACCCGGCGTATCAATATCG)，若得到约3.5kb条带，则为阳性菌，命名为大肠杆菌EB223。
经过测序，大肠杆菌EB223为将含有启动子PydfZ的fdh基因片段1(序列23第941-2535位核苷酸)替换大肠杆菌EB222基因组中的maeB基因(核苷酸序列为序列30)得到的重组菌。
将染色体整合质粒2采用上述方法电击转化到大肠杆菌EB222中，在30℃条件下筛选卡那霉素抗性转化子，转化子在液体LB培养基中42℃条件下培养过夜，然后涂布于含有卡那霉素和蔗糖的平板，在42℃条件下培养，挑取生长出的菌落进行PCR验证筛选双交换突变体，鉴定引物为1370-mdh-1(ATCGCTCGAGCATTTTCCCCGCCGTCAGAAACGACGGGGC)/1373-mdh-4(ATCGTCTAGAATCATGGATCAACGCGGTTATATCATCACC)，若得到约3.5kb条带，则为阳性菌，命名为大肠杆菌EB225。
经过测序，大肠杆菌EB225为将含有启动子PydfZ的fdh基因片段2(序列24第931-2525位核苷酸)替换大肠杆菌EB222基因组中的位于mdh基因位点的FRT得到的重组菌。
将染色体整合质粒2采用上述方法电击转化到大肠杆菌EB223中，在30℃条件下筛选卡那霉素抗性转化子，转化子在液体LB培养基中42℃条件下培养过夜，然后涂布于含有卡那霉素和蔗糖的平板，在42℃条件下培养，挑取生长出的菌落进行PCR验证筛选双交换突变体，鉴定引物为1370-mdh-1(ATCGCTCGAGCATTTTCCCCGCCGTCAGAAACGACGGGGC)/1373-mdh-4(ATCGTCTAGAATCATGGATCAACGCGGTTATATCATCACC)，若得到约3.5kb条带，则为阳性菌，命名为大肠杆菌EB228。
经过测序，大肠杆菌EB228为将含有启动子PydfZ的fdh基因片段2(序列24第931-2525位核苷酸)替换大肠杆菌EB223基因组中的mdh基因(核苷酸序列为序列11)得到的重组菌。
B、加强表达fdh基因构建菌株的发酵测试
上述构建的菌株EB223、EB225、EB228连同EB222在M9培养基中按照实施例1的方法发酵72小时，并按照实施例1的HPLC检测方法进行检测，结果见表6。
表6加强表达fdh基因构建菌株的丁醇产量表
结果显示相对于出发菌株EB222，加强表达fdh基因的菌株的丁醇产量得到明显增加，但是丁醇得率增加不明显，说明还原力供给是丁醇合成途径的限速步骤，但是基因组上两个拷贝的fdh基因并不能进一步增加丁醇产量，说明还有其它限速步骤。
三、丁醇生产菌株的驯化得到EB234
为了从全局的角度增强丁醇的生产能力，采取连续培养驯化的手段。为得到生长加快的突变体菌株，从而使得丁醇在较短时间内产量提高，在含葡萄糖为碳源的M9中转接驯化：具体为出发菌株EB228在10ml葡萄糖为碳源的M9培养基进行发酵24小时后，取100μl转接到新鲜的M9培养基中，再进行发酵24小时，重复此过程52次后，稀释涂布获得单菌落，挑选15个克隆在M9培养基中进行发酵测试，发酵48小时后获得的丁醇产量约为6g/L的菌株命名为EB232。
还原力利用的增强则有可能会促进丁醇合成能力的增强，为提供还原力的扰动，期望获得还原力利用能力增强的突变体菌株，EB232菌株又相继在葡萄糖酸为碳源的改良M9培养基和葡萄糖为碳源的M9培养基中转接驯化。具体为EB232菌株在在葡萄糖酸作为碳源的改良M9培养基(将实施例1中的M9培养基的配方中的碳源由葡萄糖换为葡萄糖酸)中进行驯化49次后，得到丁醇产量不变菌株命名为EB233。
EB233又在葡萄糖为碳源的M9培养基中驯化14次后，得到丁醇产量不变菌株命名为EB234。
各驯化菌株的丁醇生产能力见图4，结果显示经过驯化过程后，丁醇产量得到了明显提升，但是得率没有明显变化。
四、敲除转座子插入位点基因制备重组菌
A、Tn5转座子筛选可促进丁醇生产的基因
下面的实施例用的是双亲接合的方法来制备产丁醇大肠杆菌突变文库，双亲接合所用供体为含有pUTmini-Tn5质粒(购自Biomedal公司，产品目录号：KT-3229)(卡那霉素抗性)的大肠杆菌S17-1λpir(购自Biomedal公司，产品目录号：KT-3229)，受体为含有pACYC184质粒(氯霉素抗性)的EB234菌株；
pACYC184记载在如下文献中：Li,Jin-Kun,and Jenn Tu.Ssp RFI,a novelclass-II restriction endonuclease from Synechococcus RF-1 recognizing 5'TT/CGAA-3'.Nucleic acids research 19.17(1991):4770-4770；
下面的实施例用的是CRISPR/Cas系统介导筛选的λ-red同源重组系统进行基因敲除，其中涉及的质粒：
pCas记载在如下文献中：Jiang,Yu,et al.Multigene editing in theEscherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Applied and environmentalmicrobiology 81.7(2015):2506-2514；
pTargetF记载在如下文献中：Jiang,Yu,et al.Multigene editing in theEscherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Applied and environmentalmicrobiology 81.7(2015):2506-2514；
yieP基因的核苷酸序列如序列表中序列17所示；
stpA基因的核苷酸序列如序列表中序列18所示；
yqeG基因的核苷酸序列如序列表中序列15所示；
yagM基因的核苷酸序列如序列表中序列16所示。
1、突变体文库制备
在含有0.1M柠檬酸的LB平板中心放置一张0.45μm的无菌滤膜，将上述双亲接合的两种细菌混合并添加至无菌滤膜上，在超净工作台吹干后于30℃的培养箱中培养8h。利用灭菌后的牙签将滤膜上的菌苔刮下，并用少量无菌水进行清洗，涂布于含有卡那霉素以及氯霉素的LB平板上进行选择培养，所得菌落为突变体。
2、突变体的发酵筛选
随机挑取4400个上述突变体菌落分别接种进10ml M9培养基中按照实施例1的方法进行发酵，利用Agilent 1260液相色谱仪，示差折光检测器，BioRad快速酸分析柱，柱温30℃，流动相为5mmol/l硫酸水溶液，流速0.8ml/min，进样量10μl，进行丁醇的快速检测。HPLC分析的标准品为丁醇，保留时间为8.8min左右，发酵液上清在相应时间也有峰出现，说明发酵液上清中确实含有丁醇。
根据标准品浓度与峰面积的对应关系，确定的丁醇计算公式为：
y＝88162x，R2＝0.9997，其中x表示丁醇浓度(g/L)，y表示实际峰面积。
经过初筛和复筛，最终筛选出六株丁醇产量明显提高的菌株，结果见图5。
3、突变体菌株的突变位点鉴定
通过二代测序技术对这六株细菌进行测序，发现了五个插入位点，其中yieP位点插入在两个菌株中都有发现。具体插入位点见表7。
表7Tn5转座子突变体菌株转座子插入位点
B、依次敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的重组菌
1、敲除yieP基因制备EB235
1)、EB234(pCas)重组菌的制备
将质粒pCas导入EB234中，得到EB234(pCas)，按照实施例1中制备EB205(pKD46)感受态细胞的方法制备EB234(pCas)感受态细胞。
2)、质粒pTargetF-yieP的构建及yieP同源片段的制备
以质粒pTargetF为模板，用引物1961-yieP-target(TCCTAGGTATAATACTAGTTTCATAGATATGCTCATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和1876-pTargetF-F2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增出线性片段，用DpnI酶消化模板质粒后电转至DH5α中自连，37℃复壮1h，涂布于含50μg/ml壮观霉素的LB平板上，37℃培养12h。挑取长出的菌落接至含50μg/ml壮观霉素的LB液体中，37℃过夜培养后使用Omega质粒提取试剂盒提取质粒。质粒经测序后，选择含有正确N20序列(TTCATAGATATGCTCATGCC，即为sgRNA序列的上游，sgRNA如序列33所示)的为阳性质粒，命名为pTargetF-yieP。
以大肠杆菌BW25113的基因组为模板，分别用引物1966-yieP-1(GACTCACGGCAAGGGTAAAAATGCGACGCG)/1967-yieP-2(CTTTCGTATGTTCTGGCTGAGAAGCTGGCGATGCGATTATCCAAAGCGATGGCGACGCG)和1968-yieP-3(CGCGTCGCCATCGCTTTGGATAATCGCATCGCCAGCTTCTCAGCCAGAACATACGAAAG)/1969-yieP-4(TCTGCCGGAGTTCTCAGGAGAACCCCGCTG)扩增出yieP的两个片段，然后以这两个片段为模板，用引物1966-yieP-1(GACTCACGGCAAGGGTAAAAATGCGACGCG)和1969-yieP-4(TCTGCCGGAGTTCTCAGGAGAACCCCGCTG)融合PCR扩增出yieP的同源片段(序列19)。
3)、yieP的敲除
将1μl上述2)制备的pTargetF-yieP和1μl上述2)制备的yieP同源片段与上述1)制备的EB234(pCas)感受态细胞混合，按照实施例1中电击转化方法进行转化，30℃复壮1h，涂布于含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml壮观霉素的LB平板上，30℃培养24h，得到中间菌。挑取适量中间菌，用引物1966-yieP-1(GACTCACGGCAAGGGTAAAAATGCGACGCG)和1969-yieP-4(TCTGCCGGAGTTCTCAGGAGAACCCCGCTG)进行菌落PCR验证yieP的敲除，使用EB234(pCas)作对照。电泳得到约600bp大小条带的为yieP敲除成功的菌落，对照的条带大小为约为1.1kb。此时中间菌中含pCas和pTargetF-yieP两种质粒。
4)、pTargetF-yieP质粒的去除
挑取上述3)中yieP敲除成功的中间菌接至含50μg/ml卡那霉素和0.5mM IPTG的LB中30℃过夜活化。用灭菌的牙签蘸取活化后的菌液在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上进行单菌落划线，30℃培养12h。挑取几个长出的单菌落依次在含50μg/ml壮观霉素和含50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，30℃培养6h。筛选出在含壮观霉素平板上不长、在对应的含卡那霉素平板上长的菌落即为pTargetF-yieP质粒已去除的中间菌。此时中间菌中仍含有pCas质粒。
5)、pCas质粒的去除
挑取上述4)得到的中间菌转接至无抗的液体LB中，42℃培养，经过两次传代培养后，稀释涂布于无抗平板上，37℃培养12h，经过2次42℃培养去除了温敏质粒pCas。
挑取上述稀释涂布平板上的单菌落依次划线至卡那霉素抗性平板和无抗平板，37℃培养6h。之后，筛选出在卡那霉素抗性平板上不长、在对应的无抗平板上长的菌落即为去除了质粒pCas、最终的yieP基因敲除成功的重组菌，命名为EB235。
EB235为将EB234基因组上的yieP基因中间的片段(序列17的第70-619位核苷酸)敲除得到的重组菌。
2、依次敲除stpA、yqeG和yagM基因
stpA、yqeG和yagM的敲除过程和yieP基本相同，不同的是构建各自的pTargetF质粒所用的上游引物(下游引物均为上述引物1876-pTargetF-F2)以及构建各自的同源片段所用的引物。具体列在如下：
构建pTargetF-stpA(N20序列为TGTACGGCCCTGACCGGTCC，即为sgRNA序列的上游，sgRNA如序列34所示)所用的上游引物为1962-stpA-target(TCCTAGGTATAATACTAGTTGTACGGCCCTGACCGGTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)，构建stpA同源片段所用的引物为1970-stpA-1(GGATTGATGGCTGGAAAAAAGCAGGATTGC)/1971-stpA-2(GTGCGATGGCTCGCGAATTCTCCATTGACGAAGGTAAATCTCTCGACGATTTCCTGATC)和1972-stpA-3(GATCAGGAAATCGTCGAGAGATTTACCTTCGTCAATGGAGAATTCGCGAGCCATCGCAC)/1973-stpA-4(CAGGCTTGCGGAATTAGCGAGCAGAGAGCG)。
stpA的同源片段如序列表中序列20所示。
在EB235基础上敲除stpA得到的重组菌PCR(引物为1970-stpA-1(GGATTGATGGCTGGAAAAAAGCAGGATTGC)/1973-stpA-4(CAGGCTTGCGGAATTAGCGAGCAGAGAGCG))得到约600bp的条带，对照EB235(pCas)约为800bp，重组菌命名为EB236。
EB236为将EB235基因组上的stpA基因中间的片段(序列18的第74-373位核苷酸)敲除得到的重组菌。
构建pTargetF-yqeG(N20序列为CTGTGGAGTTTCGCGCTCTA，即为sgRNA序列的上游，sgRNA如序列35所示)所用的上游引物为1963-yqeG-target(TCCTAGGTATAATACTAGTCTGTGGAGTTTCGCGCTCTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)，构建yqeG同源片段所用的引物为1974-yqeG-1(CACGGCGGAATGACCCGCTAACGCACCACG)/1975-yqeG-2(AGATGATGAGATAAGCGACTTTCATAATTGAACGTATCATCTACAAATTAAACAAAATG)和1976-yqeG-3(CATTTTGTTTAATTTGTAGATGATACGTTCAATTATGAAAGTCGCTTATCTCATCATCT)/1977-yqeG-4(AGCGATACCAACATAATTGATAGTGCGCGG)。
yqeG的同源片段如序列表中序列21所示。
在EB236基础上敲除yqeG得到的重组菌PCR(引物为1974-yqeG-1(CACGGCGGAATGACCCGCTAACGCACCACG)/1977-yqeG-4(AGCGATACCAACATAATTGATAGTGCGCGG))得到约600bp的条带，对照EB236(pCas)约为1.2kb，重组菌命名为EB237。
EB237为将EB236基因组上的yqeG基因中间的片段(序列15的第1-695位核苷酸)敲除得到的重组菌。
构建pTargetF-yagM(N20序列为GTTCTGCTCTCTTGTGAGTA，即为sgRNA序列的上游，sgRNA如序列27所示)所用的上游引物为1964-yagM-target(TCCTAGGTATAATACTAGTGTTCTGCTCTCTTGTGAGTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)，构建yagM同源片段所用的引物为1978-yagM-1(GTGTCCTGCCGGTTCATTTCATGATGAATC)/1979-yagM-2(CAGACTACTCCCATAAAAAAACACTCAGTCGAGGTAACAAAGAAGGACAAACAATTATG)和1980-yagM-3(CATAATTGTTTGTCCTTCTTTGTTACCTCGACTGAGTGTTTTTTTATGGGAGTAGTCTG)/1981-yagM-4(ACAAATCAATGGCCGCCATTACTGGTTACG)。
yagM的同源片段如序列表中序列22所示。
在EB237基础上敲除yagM得到的重组菌PCR(引物为1978-yagM-1(GTGTCCTGCCGGTTCATTTCATGATGAATC)/1981-yagM-4(ACAAATCAATGGCCGCCATTACTGGTTACG))得到约600bp的条带，对照EB237(pCas)约为1.2kb，重组菌命名为EB238。
EB238为将EB237基因组上的yagM基因中间的片段(序列16的第121-855位核苷酸)敲除得到的重组菌。
C、依次敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的重组菌的发酵
上述B构建的菌株EB235、EB236、EB237、EB238连同EB234在M9培养基中发酵48小时，并按照HPLC检测方法进行检测，结果见图6。结果显示菌株EB238比出发菌株的丁醇产量提高了15％。
五、增强表达丁醇途径的ter和crt基因制备重组菌EB243
为了进一步增强丁醇合成能力，选择丁醇途径中较为关键的ter和crt基因在菌株EB238染色体上再次整合表达，对于每个基因表达所用的核糖体结合位点(RBS)，通过UTRLibraryDesigner软件设计RBS文库，来调控ter和crt的表达水平。
A、ter基因RBS文库的构建
ter基因前端的非翻译区(UTR)设计为TGGAATTGTAAGRAKGAKATATAYM。以大肠杆菌BW25113基因组为模板，分别用引物2092-yciA::ter-1(TTCGCTTTCGTAAGGTTGAGAAGATGGCCC)/2093-yciA::ter-2(TTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAACGTTATGTGTTGTAGACATG)和2096-yciA::ter-5(GAGGTTGAACGCTTCGATCGTATCTAACTATAAAGCGACAGAAGCATTATTTAAGTATG)/2097-yciA::ter-6(AACCGCCAAAAGAAGCACCGGTGGTCATTG)分别扩增出基因yciA的上游片段和下游片段；以含有ter基因的质粒pSM2-Pcpc560ter为模板，用引物2094-yciA::ter-3(AATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATGGAATTGTAAGRAKGAKATATAYMATG)和2095-yciA::ter-4(CATACTTAAATAATGCTTCTGTCGCTTTATAGTTAGATACGATCGAAGCGTTCAACCTC)PCR扩增出ter基因片段；以上述yciA基因上、下游片段和ter基因片段为模板，用引物2092-yciA::ter-1(TTCGCTTTCGTAAGGTTGAGAAGATGGCCC)和2097-yciA::ter-6(AACCGCCAAAAGAAGCACCGGTGGTCATTG)融合PCR把yciA基因上、下游片段和ter基因片段连接在一起。在这个过程中通过引物把RBS文库连接到了ter基因的前端，形成了ter基因文库。然后以pTargetF质粒为模板，用引物2052-pTarget-yciA(TCCTAGGTATAATACTAGTACGGTCGCGTAGTGACTGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和1876-pTargetF-F2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增出线性pTargetF-yciA，自连得到含有N20序列为ACGGTCGCGTAGTGACTGTG(sgRNA，序列28)的质粒pTargetF-yciA。
将上述ter基因文库和pTargetF-yciA质粒转化至EB238(pCas)中。长出的菌落使用引物2092-yciA::ter-1(TTCGCTTTCGTAAGGTTGAGAAGATGGCCC)和2097-yciA::ter-6(AACCGCCAAAAGAAGCACCGGTGGTCATTG)进行PCR验证筛选，EB238(pCas)作为对照。重组菌得到约1.5kb条带，对照约为2.2kb。经过同源重组把ter基因操作子整合到yciA位点，获得不同表达强度的突变体菌株文库。
B、ter基因RBS突变体文库的发酵筛选
按照前面发酵筛选方法，通过HPLC筛选ter基因突变体文库，获得丁醇产量最高的菌株命名为EB242，比起对照菌株(EB238)，丁醇产量提高12％，结果见图7。
经过测序，EB242为将含有ter基因及其RBS的片段(序列25)整合到EB238基因组的yciA基因位点(序列31)得到的菌。
含有ter基因及其RBS的片段包括RBS(序列25的第1-25位核苷酸)和ter基因(序列25的第26-1219位核苷酸)。
C、crt基因RBS文库的构建
同样地，crt基因前端的UTR设计为TGGAATYSTAAGAASSAKATATACC。以大肠杆菌BW25113基因组为模板，分别用引物2086-poxB::crt-1(TTCACGTACCGTGATGACCTGCGGCCCGGC)/2087-poxB::crt-2(TTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTGCAACCGTTTGTTTCATG)和2090-poxB::crt-5(GATCGAGGGCTTCAAAAACCGCTAATGGCAGCGGCTATTTCCAGGAAACCCACCC)/2091-poxB::crt-6(TCGGGTAGAAGGCGCGGTAGGGAAATTGCG)分别扩增出基因poxB的上游片段和下游片段；以丙酮丁醇梭菌DSM1731基因组为模板，用引物2088-poxB::crt-3(AATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATGGAATYSTAAGAASSAKATATACCATG)和2089-poxB::crt-4(GGGTGGGTTTCCTGGAAATAGCCGCTGCCATTAGCGGTTTTTGAAGCCCTCGATC)PCR扩增出crt基因片段；以上述poxB基因上、下游片段和crt基因片段为模板，用引物2086-poxB::crt-1(TTCACGTACCGTGATGACCTGCGGCCCGGC)和2091-poxB::crt-6(TCGGGTAGAAGGCGCGGTAGGGAAATTGCG)融合PCR把poxB基因上、下游片段和crt基因片段连接在一起。在这个过程中通过引物把RBS文库连接到了crt基因的前端，形成了crt基因文库。然后以pTargetF质粒为模板，用引物2051-pTarget-poxB(TCCTAGGTATAATACTAGTGGCGCTGAAGCACAACTTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和1876-pTargetF-F2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增出线性pTargetF-poxB，自连得到含有N20序列为GGCGCTGAAGCACAACTTAG(sgRNA,序列29)的质粒pTargetF-poxB。
将上述crt基因文库和pTargetF-poxB质粒转化至EB242(pCas)中。长出的菌落使用引物2086-poxB::crt-1(TTCACGTACCGTGATGACCTGCGGCCCGGC)和2091-poxB::crt-6(TCGGGTAGAAGGCGCGGTAGGGAAATTGCG)进行PCR验证筛选，EB242(pCas)作为对照。重组菌得到1.9kb条带，对照约为1.3kb。经过同源重组把crt基因操作子整合到poxB位点，获得不同表达强度的突变体菌株文库。
D、crt基因RBS突变体文库的发酵筛选得到重组菌EB243
按照上述发酵筛选方法，通过HPLC筛选crt基因突变体文库，获得丁醇产量最高的菌株命名为EB243，比起对照菌株EB242，丁醇产量又提高9％，结果见图7。
经过测序，菌株EB243为将含有crt基因及其RBS的片段整合到EB242基因组的poxB基因位点(序列32)得到的菌。
含有crt基因及其RBS的片段包括RBS(序列26的第1-25位核苷酸)和crt基因(序列26的第26-811位核苷酸)。
EB243菌已于2016年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.12191，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。
六、重组菌EB243的发酵
为了控制发酵过程中的pH，以及采取先好氧生长获得较多的细胞量然后再进行丁醇厌氧发酵的策略来进一步提高丁醇产量，采用NBS公司BioFlo 110发酵系统进行丁醇发酵，发酵罐体积为7L，装液量3L，重组菌EB243接种量5％，发酵罐培养温度37℃，转速500rpm，pH控制为6.30，发酵培养基为M9。具体为：首先以2vvm水平通空气12小时，使OD600值达到15-20，然后关闭空气，50rpm搅拌发酵。
发酵结果如图8所示，最终丁醇产量可达到20g/L，得率为34％。
表8为所有菌及其构建方式

Claims (10)

1.一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：
1)抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因表达和/或活性，且提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性，得到目的菌A；
2)在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A，得到目的菌B；
3)抑制所述目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性，且提高所述目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性，得到重组菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述抑制生产丁醇的出发菌基因组上pykA基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上pykA基因；
所述提高所述出发菌基因组上fdh基因的表达和/或活性为增加所述出发菌基因组中fdh基因的拷贝数；
所述抑制目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性为敲除所述出发菌基因组上的yieP、stpA、yqeG和yagM基因全部或部分片段；
所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性为增加目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述增加出发菌基因组中fdh基因的拷贝数为将fdh基因及其启动子整合到所述出发菌基因组上；
所述提高目的菌B中ter基因和crt基因的拷贝数为将ter基因及其RBS和crt基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述敲除或整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；
所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；
所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
所述敲除出发菌基因组上pykA基因为采用λ-red同源重组系统将所述出发菌基因组上的pykA基因替换为FRT；
所述FRT具体为序列14第59-106位；
所述将fdh基因及其启动子整合到目的菌A基因组为采用整合质粒将所述出发菌基因组上maeB基因替换为含有fdh及其启动子的片段1，且将所述出发菌基因组上位于mdh基因位点的FRT替换为含有fdh及其启动子的片段2；
所述含有fdh及其启动子的片段1的核苷酸序列具体为序列23第941-2535位核苷酸；
所述含有fdh及其启动子的片段2的核苷酸序列具体为序列24第931-2525位核苷酸；
所述敲除出发菌基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因部分片段为采用CRISPR/Cas系统分别敲除yieP基因序列第70-619位核苷酸、stpA基因序列第74-373位核苷酸、yqeG基因序列第1-695位核苷酸、yagM基因序列第121-855位核苷酸；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的靶基因分别为yieP、stpA、yqeG、yagM基因；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除yieP、stpA、yqeG、yagM基因的sgRNA的核苷酸序列分别为序列33、序列34、序列35、序列27；
所述将ter基因及其RBS整合到所述目的菌B基因组为采用CRISPR/Cas系统将含有ter基因及其RBS的片段替换所述目的菌B基因组上yciA基因；
所述含有ter基因及其RBS的片段的核苷酸序列为序列25；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的靶基因为yciA基因；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除yciA基因的sgRNA的核苷酸序列为序列28；
所述将crt基因及其RBS整合到目的菌B基因组为将所述含有crt基因及其RBS的片段采用CRISPR/Cas系统替换目的菌B基因组上poxB基因；
所述含有crt基因及其RBS的片段的核苷酸序列为序列26；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的靶基因为poxB基因；
所述采用CRISPR/Cas系统敲除poxB基因的sgRNA的核苷酸序列为序列29。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
步骤2中，所述在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A包括如下步骤：
2)-1，将所述目的菌A在葡萄糖为碳源的M9培养基中转接驯化，得到丁醇产量大于6g/L的菌株；
2)-2，将2)-1得到的所述丁醇产量大于6g/L的菌株在葡萄糖酸作为碳源的改良M9培养基转接驯化直到得到丁醇产量不变菌株；
2)-3，将2)-2得到的丁醇产量不变菌株在所述葡萄糖为碳源的M9培养基转接驯化直到得到丁醇产量不变菌株；命名为目的菌B。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述生产丁醇的出发菌为生产丁醇的大肠杆菌，所述生产丁醇的大肠杆菌为将丙酮丁醇梭菌体内的丁醇合成途径转移至初始大肠杆菌得到的菌；
所述生产丁醇的大肠杆菌具体为EB216 CGMCC No.11590；
所述初始大肠杆菌具体为大肠杆菌BW25113。
8.由权利要求1-7中任一所述方法制备的重组菌。
9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌的保藏号为CGMCCNo.12191。
10.权利要求1-7中任一所述方法或权利要求8或9所述重组菌在生产丁醇或提高丁醇产量中的应用；
或一种生产丁醇的方法，发酵权利要求8或9所述重组菌，得到丁醇。
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