CN105368863B - 一种构建高产丁醇菌株的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构建高产丁醇菌株的方法与应用。本发明提供一种构建重组菌的方法，为抑制或沉默生产丁醇的出发菌的基因组上的丙酮酸激酶pykA基因表达，得到重组菌。实验证明本发明的工程菌发酵产生的丙酮酸产量明显下降，丁醇产量明显上升，工程菌细胞的一系列生理指标均发生了不同程度的变化。

Description

一种构建高产丁醇菌株的方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种构建高产丁醇菌株的方法与应用。

背景技术

能源与环境是当今社会关注的焦点。随着化石能源的日渐枯竭和自然环境的污染，人类对可再生能源的需求越来越强烈。利用微生物转化或发酵可再生资源高效生产可再生能源是今后的能源发展趋势，这种通过生物法生产化学品的方式是可持续的且环境友好的。

丁醇是一种重要的化工品和原料，可直接用作有机溶剂，是合成多种酯类化合物的前体，广泛应用于各种塑料和橡胶制品中。同时，丁醇也是优良的可替代汽油的生物燃料。它具有和汽油相当的热值与辛烷值，可与汽油以任意比例混合；在运输过程中，不易腐蚀管道；与乙醇相比，其蒸汽压低，安全性高，因此是一种极具潜力的新型生物燃料。目前，丁醇的年市场需求大约在百万吨级别。

丁醇可由生物合成是巴斯德于1861年首次发现的。1912年，魏兹曼(Weizmann)发现了一种梭菌Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇。之后，很多研究便集中于改造丙酮丁醇梭菌，以期得到可用于工业化生产丁醇的工程菌株。但是，丙酮丁醇梭菌是一种严格厌氧生长的革兰氏阳性细菌，其遗传操作系统复杂，不利于进行实验室的研究和工业的生产。2008年，Shota Atsumi,James C.Liao等首先在大肠杆菌中实现了丁醇的合成(Atsumi S,Cann A F,Connor M R,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli for 1-butanol production.Metabolicengineering,2008,10(6):305-311.)，该研究组将丙酮丁醇梭菌体内的丁醇合成途径转移至大肠杆菌内，致使其可产生少量丁醇。随后，该研究组对整条途径进行了优化，将以NADH为还原力，催化可逆反应巴豆酰辅酶A生成丁酰辅酶A的丁酰辅酶A脱氢酶复合物(Bcd-EtfAB complex)替换为来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的催化不可逆反应的反式烯酰辅酶A还原酶(Ter)；催化乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A的酶，由乙酰乙酰辅酶A硫解酶(Thl)换为大肠杆菌中活性更强的乙酰辅酶A乙酰转移酶(AtoB)，由此形成了NADH和乙酰辅酶A的驱动力，丁醇产量大幅度提高。

目前，在提高大肠杆菌产丁醇方面，多数研究集中于改造来自丙酮丁醇梭菌的丁醇途径，但这并不是唯一的策略。丁醇途径是与糖酵解耦联的，除丁醇途径外，基因组上可能仍存在多个有利于丁醇生产的靶点，而关于此类靶点的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种构建重组菌的方法。

本发明提供的方法，为抑制或沉默生产丁醇的出发菌的基因组上的丙酮酸激酶pykA基因表达，得到重组菌。

上述方法中，所述抑制或沉默生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因表达为敲除生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因。

上述方法中，所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因采用λ-red同源重组系统、sacB基因介导筛选的同源重组或CRISPR/Cas系统。优先采用λ-red同源重组系统进行实施。

上述方法中，所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因为采用λ-red同源重组系统将生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因替换为FRT(Flp重组酶识别靶点序列)；

所述FRT的核苷酸序列为序列5第59-106位。

上述方法中，所述生产丁醇的出发菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌具体为大肠杆菌BW25113或其突变体EB216 CGMCC No.11590。

上述方法中，所述丙酮酸激酶pykA的氨基酸序列为序列表中序列1。

上述方法中，所述丙酮酸激酶pykA基因pykA的核苷酸序列为序列3。

上述方法中，所述抑制或沉默大肠杆菌EB216基因组上的丙酮酸激酶基因表达包括如下步骤：

1)将含有丙酮酸激酶基因pykA的上游同源臂、抗性基因和丙酮酸激酶基因pykA的下游同源臂的DNA分子导入EB216(pKD46)，得到pykA替换为两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段的中间菌；

所述EB216(pKD46)为将质粒导入EB216中得到的菌；

2)将质粒pCP20转入所述中间菌，使所述pCP20质粒上的FRT替换了中间菌中的卡那霉素，得到去除卡那霉素的中间菌；

3)将所述去除卡那霉素的中间菌先在37℃培养去除了温敏质粒pCP20和pKD46，得到去除温敏质粒的中间菌；

4)将所述去除温敏质粒的中间菌分别在卡那霉素抗性培养基、氯霉素抗性培养基、无卡那霉素且无氯霉素平板培养基中培养，选取只在所述无卡那霉素且无氯霉素平板培养基上生长，且在所述卡那霉素抗性培养基和所述氯霉素抗性培养基均不生长的菌，为重组菌；

所述两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段的核苷酸序列为序列5第41-1534位；

所述丙酮酸激酶基因pykA的上游同源臂为序列5第1-40位；

所述丙酮酸激酶基因pykA的下游同源臂为序列5第1535-1574位。

由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。

上述方法或上述重组菌在生产丁醇或提高丁醇产量中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种生产丁醇的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述重组菌，得到丁醇。

本发明所提供的丙酮酸激酶缺陷型的菌株EB216 CGMCC No.11590源自大肠杆菌，EB216菌株是在大肠杆菌BW25113的基础上引入丙酮酸到丁醇的生物合成途径，并缺失一些副产物代谢途径获得的，其基因型为ΔldhA::hbd,ΔadhE::ter,ΔfrdBC::adhE2,Δ(ackA-pta)::crt,ΔyqhD::atoB,ΔeutE::fdh,ΔfdhF::fdhcb,Δ(hyc-hyp)::FRT,Δmdh::FRT，其丁醇生产途径见图1。在EB216菌株的基础上，敲除丙酮酸激酶基因，构建丙酮酸激酶缺陷型的突变体，该突变体的丁醇产量得到提高。

所述敲除丙酮酸激酶基因的方法，是借助pKD4，pKD46，pCP20等3个质粒进行实施的(示意图见图2)。

所述pKD4是PCR扩增卡那霉素抗性基因及其FRT的模板；

所述pKD46是用来表达λ-red同源重组酶的质粒，该酶对应基因的表达需用阿拉伯糖诱导；

所述pCP20是用来表达Flp重组酶以消除筛选标签卡那霉素抗性基因的质粒。

生理指标均使用商业化的试剂盒进行测试。

上述突变体菌株在小管中按照如下条件进行发酵：微好氧静置发酵；发酵温度为37℃；发酵时间为72h。

上述突变体菌株在发酵罐中按照如下条件进行发酵：转速200rpm；发酵温度为37℃；发酵时间为72h。

本发明实验证明，本发明通过的将生产丁醇的出发菌EB216 CGMCC No.11590基因组上的丙酮酸激酶pykA基因替换为FRT，得到重组菌，该重组菌发酵产生的丙酮酸产量明显下降，丁醇产量明显上升，工程菌细胞的一系列生理指标均发生了不同程度的变化。

附图说明

图1为EB216体内的丁醇生产途径。

图2为基因敲除的过程示意图。

图3为表示pykA和pykF基因敲除成功的PCR验证结果。

图4为野生型与突变体菌株在小管中发酵的丙酮酸产量和丁醇产量。

图5为野生型与工程菌在发酵罐中发酵的丙酮酸生产曲线和丁醇生产曲线。

图6为使用高效液相色谱(HPLC)分析发酵液的结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大肠杆菌EB216菌已于2015年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.11590，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。

图1为EB216体内的丁醇生产途径。

实施例1、敲除大肠杆菌EB216中丙酮酸激酶基因制备重组菌

下面的实施例用的是λ-red同源重组系统进行敲除丙酮酸激酶基因(图2)，其中设计的质粒：

pKD4记载在如下文献中：Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；

pKD46记载在如下文献中：Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；

pCP20记载在如下文献中：Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；

丙酮酸激酶PykA的氨基酸序列为序列1，其编码基因pykA的核苷酸序列为序列3；

丙酮酸激酶同工酶PykF的氨基酸序列为序列2，其编码基因pykF的核苷酸序列为序列4。

一、重组菌EB216(pKD46)的制备

EB216感受态细胞：在三角瓶中培养至对数生长中期的200ml EB216菌液，冰浴30min。4℃，3000g离心5min。弃掉上清液，用预冷的无菌10％甘油重悬菌体，洗涤两次。最后加入1ml预冷的10％甘油重悬菌体，50μl每管分装至预冷的1.5ml无菌离心管中备用，得到EB216感受态细胞。

EB216(pKD46)重组菌：取1μl pKD46与上述EB216感受态细胞混合，冰浴5min，将混合物转移至2mm电击杯内进行转化，电击转化参数为：电压2.5kV，25μF，电阻200Ω。电击转化完毕后，立即将菌液转移至1ml LB中，30℃复壮1h，涂布 于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，30℃培养12h，得到EB216(pKD46)重组菌。

EB216(pKD46)感受态细胞：将上述涂布的平板上长出的EB216(pKD46)重组菌菌落转接至含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB中，30℃培养至OD₆₀₀值约为0.2时，加入终浓度为10mmol/l的阿拉伯糖进行诱导，诱导至对数生长中期的菌体按照上述制备EB216感受态细胞的方法制备EB216(pKD46)感受态细胞。

二、敲除pykA的重组菌EB216△pykA

1、pykA同源重组片段的制备

以pKD4为模板，以敲除引物pykA-KoF和pykA-KoR进行PCR扩增，得到1574bp的PCR扩增产物，为pykA同源重组片段，经过测序，pykA同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列5。

pykA同源重组片段包括pykA基因上游同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游FRT和pykA基因下游同源臂；其中，pykA基因上游同源臂为序列5第1-40位、上游FRT为序列5第59-106位、卡那霉素抗性基因为序列5第468-1262位、下游FRT为序列5第1453-1498位和pykA基因下游同源臂为序列5第1535-1574位。

上述引物为：

pykA-KoF:CTGGGGCGTCATGTGGCTATTCTGGGTGACCTCCAGGGGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

pykA-KoR:AGAGCTGATACGGGAGGTCATCAGCGCGGTACGACCCGATTGGGAATTAGCCATGGTCC

上述使用的DNA聚合酶为MCLAB I5高保真聚合酶，上述PCR程序如表1：

表1 为PCR程序

2、通过同源重组敲除pykA

将1μl上述1制备的pykA同源重组片段与上述一制备的EB216(pKD46)感受态细胞混合，按照以上电击转化方法进行转化，30℃复壮1.5h，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养24h，得到中间菌。

将中间菌作为模板，用引物pykA-F和pykA-R进行PCR扩增。以EB216(pKD46)为对照。

pykA-F:GATAATAATCTTGAAAAAGTTATCGCGGCG

pykA-R:TTCGCTGGCAGCTGCTACGCCGTCATTAGC

上述PCR使用GenStar Taq PCR StarMix，PCR程序为表2：

表2 为PCR程序

将上述PCR产物电泳检测，结果如图3A，得到约1.9kb片段的中间菌为pykA替换为两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段(序列5第41-1534位)的中间菌EB216△pykA：：kan；EB216(pKD46)得到约1.2kb片段。

将上述pykA替换为卡那霉素抗性基因的中间菌EB216△pykA：：kan接至含50μg/ml卡那霉素的液体LB中，37℃培养至对数生长中期时制备感受态细胞，电击转化质粒pCP20至其中，30℃复壮1h，涂布于含30μg/ml氯霉素的LB平板上，30℃培养12h，使pCP20质粒上的FRT替换中间菌中的卡那霉素抗性基因。

上述涂布的平板上长出的菌落转接至无抗的液体LB中，37℃培养，经过两次传代培养后，稀释涂布于无抗平板上，37℃培养12h，经过2次37℃培养去除了温敏质粒pCP20(氯霉素抗性)和pKD46(氨苄青霉素抗性)。

挑取上述稀释涂布平板上的单菌落依次划线至卡那霉素抗性平板、氯霉素抗性平板、无抗平板，37℃培养12h。之后，筛选出只在无抗平板上生长，在其他两种平板上对应不生长的菌落即为pykA基因敲除成功的重组菌，命名为EB216△pykA。

将EB216△pykA用验证引物pykA-F和pykA-R进行菌落PCR验证，电泳验证得到300bp以下的片段(图3A)，即为目的重组菌。

将EB216△pykA进行测序，结果该重组菌为将EB216基因组上的pykA基因替换为FRT得到的重组菌。

三、敲除pykF的重组菌EB216△pykF

1、pykF同源重组片段的制备

以pKD4为模板，以敲除引物pykF-KoF和pykF-KoR进行PCR扩增，得到1574bp 的PCR扩增产物，为pykF同源重组片段，经过测序，pykF同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列6。

pykF同源重组片段包括pykF基因上游同源臂、上游FRT、卡那霉素抗性基因、下游FRT和pykF基因下游同源臂；其中，pykF基因上游同源臂为序列6第1-40位、上游FRT为序列6第59-106位、卡那霉素抗性基因为序列6第468-1262位、下游FRT为序列6第1453-1498位和pykF基因下游同源臂为序列6第1535-1574位。

上述引物为：

pykF-KoF:gccgctatcctgcttgataccaaaggtccggaaatccgcatgtaggctggagctgcttc

pykF-KoR:ggtcagtgccaggatggtggcatccgggaagtatttacgttgggaattagccatggtcc

2、通过同源重组敲除pykF

将1μl上述1制备的pykF同源重组片段与上述一制备的EB216(pKD46)感受态细胞混合，按照以上电击转化方法进行转化，30℃复壮1.5h，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养24h，得到中间菌。

将上述中间菌作为模板，用引物pykF-F和pykF-R进行PCR扩增。以EB216(pKD46)为对照。

pykF-F:gctaaaatgctggacgctggcatgaacgtt

pykF-R:gctctgcagagccagttctttacccagacg

将上述PCR产物电泳检测，结果如图3B，得到约1.9kb片段的中间菌为pykF替换为两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段(序列6第41-1534位)的中间菌EB216△pykF：：kan；EB216(pKD46)得到约1.2kb片段。

将上述pykF替换为卡那霉素抗性基因的中间菌EB216△pykF：：kan接至含50μg/ml卡那霉素的液体LB中，37℃培养至对数生长中期时制备感受态细胞，电击转化质粒pCP20至其中，30℃复壮1h，涂布于含30μg/ml氯霉素的LB平板上，30℃培养12h，使pCP20质粒上的FRT替换中间菌中的卡那霉素抗性基因。

上述涂布的平板上长出的菌落转接至无抗的液体LB中，37℃培养，经过两次传代培养后，稀释涂布于无抗平板上，37℃培养12h，经过2次37℃培养去除了温敏质粒pCP20(氯霉素抗性)和pKD46(氨苄青霉素抗性)。

挑取上述稀释涂布平板上的单菌落依次划线至卡那霉素抗性平板、氯霉素抗性平板、无抗平板，37℃培养12h。之后，筛选出只在无抗平板上生长，在其他两种平板上对应不生长的菌落即为pykF基因敲除成功的重组菌，命名为EB216△pykF。

将EB216△pykF用验证引物pykF-F和pykF-R进行菌落PCR验证，电泳验证得到300bp以下的片段(图3B)，即为目的重组菌。

将EB216△pykF进行测序，结果该重组菌为将EB216基因组上的pykF基因替换为FRT得到的重组菌。

因此，EB216△pykF和EB216△pykA为EB216的突变体。

实施例2、重组菌的发酵

一、EB216与两个突变体的小管发酵测试

将实施例1得到的重组菌EB216△pykF、EB216△pykA和EB216接种至含20g/L葡萄糖的M9培养基中进行小管微好氧发酵72h。

上述含20g/L葡萄糖的M9培养基配制方法如下：分别称取6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，0.5g NaCl，1g NH₄Cl溶于一定量的蒸馏水，称取20g葡萄糖溶于一定量的蒸馏水，两者的总体积为1升。在121℃条件下灭菌15min，冷却后将两者混合，并添加已灭菌的终浓度分别为0.5mg/l的维生素B1和1g/l的酪蛋白水解液，得到含20g/L葡萄糖的M9培养基。

将上述含20g/L葡萄糖的M9培养基分装至无菌的15ml离心管(BD Biosciences)内，每管分装9.5ml培养基。接种0.5ml过夜活化的重组菌EB216△pykF、EB216△pykA和EB216至其中，每个菌株设置三个平行，拧紧离心管的螺旋盖后再拧松半圈，置于37℃静置发酵72h。

发酵结束后，取发酵液离心后的上清液经孔径大小为0.22μm的过滤器过滤后进行高效液相色谱分析。采用Agilent 1260液相色谱仪，示差折光检测器，BioRad Aminex HPX-87H有机酸柱，柱温15℃，流动相为5mmol/l硫酸溶液，流速0.5ml/min，进样量10μl。

标准品为葡萄糖、丙酮酸、丁醇，保留时间依次为10.2min，11.8min，39.8min左右，样品在相应时间也有峰出现，说明样品中确实含有葡萄糖、丙酮酸、丁醇。

根据标准品浓度与峰面积的对应关系，计算得到的各菌株的丙酮酸与丁醇产量如下表3、图4(A为丙酮酸产量、B为丁醇产量)和图6所示：

表3 HPLC分析EB216及其两个丙酮酸激酶基因突变体的丙酮酸与丁醇产量表

菌株	基因型	丙酮酸产量(g/L)	丁醇产量(g/L)
				EB216		1.34±0.06	1.13±0.01
EB216△pykF	ΔpykF	1.28±0.03	1.06±0.04
				EB216△pykA	ΔpykA	0.73±0.01	2.07±0.03

从上述可以看出，敲除EB216的丙酮酸激酶基因pykA可以促进丁醇产量，降低丙酮酸产量。

二、EB216△pykA的发酵罐发酵测试

接种200ml过夜活化的EB216△pykA(OD600值约为2.500)到含20g/L葡萄糖 的M9培养基，发酵总体积为4L，转速控制为200rpm，温度为37℃，发酵时间72h。

发酵结束后的发酵液仍按上述方法进行高效液相色谱分析，根据标准品浓度与峰面积的对应关系，计算得到的EB216与EB216△pykA的丙酮酸与丁醇产量如下表4和图5(A为丙酮酸生产曲线，B为丁醇生产曲线)所示：

表4 HPLC分析EB216与工程菌EB216△pykA的丙酮酸与丁醇产量表

菌株	丙酮酸产量(g/L)	丁醇产量(g/L)
			EB216	1.34±0.04	1.70±0.03
EB216△pykA	0.50±0.02	4.15±0.04

三、重组菌EB216△pykF、EB216△pykA和EB216的丙酮酸激酶酶活、胞内丙酮酸含量、胞内ATP含量、胞内NADH含量等生理指标的测试

将重组菌EB216△pykF、EB216△pykA和EB216的丙酮酸激酶酶活、胞内丙酮酸含量分别使用丙酮酸激酶试剂盒pyruvate kinase kit和丙酮酸试剂盒pyruvate assay kit(BioAssay Systems,Hayward,CA)进行测试；胞内ATP含量、胞内NADH含量分别使用ATP试剂盒ATP fluorometric assay kit和NADH试剂盒NADH fluorometric assay kit(BioVisionIncorporated,Milpitas,CA)进行测试，结果如下表5所示：

表5 EB216与两个突变体的生理指标列表

U：在25℃、pH为7.5的条件下，每分钟内由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和ADP生成1μmol丙酮酸和1μmol ATP所需要的酶量。

可以看出，在敲除pykF后，丙酮酸激酶的酶活明显降低，而敲除pykA后，丙酮酸激酶的酶活没有明显变化，反而略有上升。胞内丙酮酸的含量也是pykA突变体较高，但不明显。胞内ATP的含量则是pykA突变体明显高于EB216，pykF突变体低于EB216。这与两个丙酮酸激酶的反应偏好相关，PykA可催化ADP、CDP、GDP和UDP生成ATP、CTP、GTP和UTP，而PykF倾向只催化ADP生成ATP，因此，敲除pykA后，胞内的ATP含量会上升。与ATP相反，胞内NADH的含量是pykA突变体最少，这是因为pykA突变体产生的丁醇多，消耗的还原力多。

Claims (10)

1.一种构建重组菌的方法，为抑制或沉默生产丁醇的出发菌的基因组上的丙酮酸激酶pykA基因表达，得到重组菌；所述生产丁醇的出发菌为大肠杆菌突变体EB216 CGMCCNo.11590。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制或沉默生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因表达为敲除生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因采用λ-red同源重组系统、sacB基因介导筛选的同源重组或CRISPR/Cas系统。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因为采用λ-red同源重组系统将生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因替换为FRT；

所述FRT的核苷酸序列为序列5第59-106位。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述丙酮酸激酶pykA的氨基酸序列为序列表中序列1。

6.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述丙酮酸激酶pykA基因pykA的核苷酸序列为序列3。

7.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述抑制或沉默生产丁醇的出发菌的基因组上的丙酮酸激酶基因表达包括如下步骤：

1）将含有丙酮酸激酶基因pykA的上游同源臂、抗性基因和丙酮酸激酶基因pykA的下游同源臂的DNA分子导入EB216/pKD46，得到pykA替换为两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段的中间菌；

所述EB216/pKD46为将质粒pKD46导入EB216中得到的菌；

2）将质粒pCP20转入所述中间菌，使所述pCP20质粒上的FRT替换了中间菌中的卡那霉素，得到去除卡那霉素的中间菌；

3）将所述去除卡那霉素的中间菌先在37℃培养去除了温敏质粒pCP20和pKD46，得到去除温敏质粒的中间菌；

4）将所述去除温敏质粒的中间菌分别在卡那霉素抗性培养基、氯霉素抗性培养基、无卡那霉素且无氯霉素平板培养基中培养，选取只在所述无卡那霉素且无氯霉素平板培养基上生长，且在所述卡那霉素抗性培养基和所述氯霉素抗性培养基均不生长的菌，为重组菌；

所述两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段的核苷酸序列为序列5第41-1534位；

所述丙酮酸激酶基因pykA的上游同源臂为序列5第1-40位；

所述丙酮酸激酶基因pykA的下游同源臂为序列5第1535-1574位。

8.由权利要求1-7中任一所述方法制备的重组菌。

9.权利要求1-7中任一所述方法或权利要求8所述重组菌在生产丁醇或提高丁醇产量中的应用。

10.一种生产丁醇的方法，发酵权利要求8所述重组菌，得到丁醇。