CN111690581B - 利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法。所述重组大肠杆菌是将冰核蛋白基因或冰核蛋白基因表达盒，通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的，且所述重组大肠杆菌中不含有抗生素抗性基因。本发明克服了现有冰核活性蛋白产生菌多为植物条件致病菌，对生态有潜在危害的缺点。采用本发明的发酵策略和方法生产的冰核活性蛋白产品具有活性高，生产方法操作简单、成本低廉、重复性好等优点，对环境无害，生产强度高，适用于稳定地大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及微生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法。
背景技术
冰核活性细菌是一类能在低温条件下催化诱发植物体内水分产生冰核而引起霜冻的细菌。冰核活性细菌广泛附生于植物表面(尤其是叶面上)。正常情况下植物由于细胞中存在游离水，即使处于-7～-8℃的低温下也不结冰，而产生过冷现象；当冰核活性细菌存在时这种微生物作为最强的异质冰核因子，诱发冰晶的生成而使植物组织中失去了过冷的作用，进而引起对宿主植物的冻伤损害。冰核活性细菌是革兰氏阴性细菌，分属于假单孢菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)和黄单孢菌属(Xanthomonas)。冰核活性细菌的种类和数量受地理纬度、气候条件、植物种类及不同季节的影响和制约而在地球上存在着明显差异。我国幅员辽阔基本涵盖冰核活性细菌的种类，目前在我国发现的冰核活性细菌共有3个属17个种或变种。
对各种冰核活性细菌的研究表明，冰核活性细菌可以产生一种特殊的蛋白质--冰核活性蛋白，该蛋白是由inp基因编码的，经低温和一些营养因子诱导表达的一种与细胞膜结合的糖蛋白复合物，它具有类似冰晶的立体结构，因此可以充当模板的作用，促使冰晶提早形成。
由于冰核活性蛋白具有在较高温度下使水结冰的能力，近年来也被应用于人工造雪、食品冷冻干燥、冷冻浓缩等领域，具有十分广阔的市场前景。
高密度发酵是提升蛋白表达的重要途径，而生产工艺是控制蛋白产量及有效活性的重要影响因素。适宜的表达量和较高的活性，能够有效地提高生产效率和生产稳定性。然而，采用常规的高密度发酵蛋白方法生产冰核活性蛋白时，会出现冰核活性蛋白表达量过高、活性低，难以稳定生产的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种产冰核蛋白的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将冰核蛋白基因或冰核蛋白基因表达盒，通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的，且所述重组大肠杆菌中不含有抗生素抗性基因。
其中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌B系菌株或K12系菌株。所述冰核蛋白基因来自于具有冰核活性的革兰氏阴性菌，包括丁香假单胞菌(Psudomonas syringae)，或者泛菌属(Pantoea sp.)、黄单胞菌属(Xanthanmonas sp.)中的菌种。优选丁香假单胞菌。丁香假单胞菌冰核蛋白基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
第二方面，本发明提供产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp001，其构建方法如下：
1)从丁香假单胞菌中克隆得到冰核蛋白基因；
2)将步骤1)所得基因构建到质粒pBAD/His A上，得到重组表达质粒；
3)以步骤2)所得重组表达质粒为模板扩增带有阿拉伯糖诱导启动子的冰核蛋白基因片段；同时以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增得到galR基因上、下游片段knock-in-up和knock-in-down；
4)将步骤3)所得三个基因片段通过重叠延伸PCR得到基因编辑片段；
5)构建靶向大肠杆菌galR基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体；
6)将步骤4)所得基因编辑片段和步骤5)所得CRISPR/Cas9基因编辑载体共同导入大肠杆菌BW25113(或其它K12系菌株)中，得到重组大肠杆菌TDTC-inp001。
其中，步骤3)中用于PCR扩增所述knock-in-up和knock-in-down的引物分别如SEQID NO:3-4和SEQ ID NO:5-6所示。
步骤5)中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体是基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA作用位点的核酸序列为5′-TTGCACTATGCACAGCCAGC-3′(SEQ ID NO:9)。
第三方面，本发明提供产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp004，其构建方法如下：
1)从丁香假单胞菌中克隆得到冰核蛋白基因；
2)将步骤1)所得基因构建到质粒pBAD/His A上，得到重组表达质粒；
3)以步骤2)所得重组表达质粒为模板扩增带有阿拉伯糖诱导启动子的冰核蛋白基因片段；同时以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增得到galR基因上、下游片段knock-in-up和knock-in-down；
4)将步骤3)所得三个基因片段通过重叠延伸PCR得到基因编辑片段；
5)构建靶向大肠杆菌galR基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体；
6)将步骤4)所得基因编辑片段和步骤5)所得CRISPR/Cas9基因编辑载体共同导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌TDTC-inp004。
其中，步骤3)中用于PCR扩增所述knock-in-up和knock-in-down的引物分别如SEQID NO:3、7和SEQ ID NO:6、8所示。
步骤5)中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体是基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA作用位点的核酸序列为5′-TTGCACTATGCACAGCCAGC-3′(SEQ ID NO:9)。
第四方面，本发明提供利用上述重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法，包括在发酵培养基中对所述重组大肠杆菌TDTC-inp001或TDTC-inp004进行培养，以生产冰核蛋白。
发酵过程中，待重组大肠杆菌进入对数中前期，向发酵培养基中补加终浓度为0.1-0.5g/L的天冬氨酸。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
1)菌种活化(斜面活化)；
2)种子液的制备(摇瓶培养)；
3)发酵培养(发酵罐高密度发酵)；
4)发酵结束后将发酵液迅速降温至12-18℃，以激活所述冰核蛋白。
其中，步骤3)还包括采用合适的碳源进行补料发酵。
优选地，步骤1)具体为：从-80℃冰箱中取出菌种保存管，接种1-2环菌种，均匀涂布于活化斜面，24-37℃培养10-48h，然后转接第二代活化斜面，24-37℃培养10-48h。
所述活化斜面使用的培养基为SY固体培养基，其组成为：KH2PO4 2-10g/L、MgSO4·7H2O 0.2-2g/L、蔗糖5-30g/L、酵母粉1-10g/L、酵母蛋白胨1-10g/L、玉米浆干粉1-10g/L、琼脂粉10-30g/L，pH 6.0-7.5(用氨水调节pH值)。以水配制，115℃高压蒸汽灭菌30min。
优选地，步骤2)具体为：将步骤1)活化的菌种接入SY液体培养基，24-37℃，150-300rpm震荡培养至OD600＝3-10。
所述SY液体培养基的组成为：KH2PO4 2-10g/L、MgSO4·7H2O 0.2-2g/L、蔗糖5-30g/L、酵母粉1-10g/L、酵母蛋白胨1-10g/L、玉米浆干粉1-10g/L，消泡剂0.01-1g/L，pH6.0-7.5(用氨水调节pH值)。以水配制，115℃高压蒸汽灭菌30min。
优选地，所述SY液体培养基的组成为：KH2PO4 3g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、蔗糖20g/L、酵母粉5g/L、酵母蛋白胨5g/L、玉米浆干粉5g/L，消泡剂0.05g/L。
本发明中，消泡剂优选聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
优选地，步骤3)具体为：将步骤2)中制备的重组大肠杆菌TDTC-inp001的种子液按照5-20％v/v接种量接入发酵培养基中，开始发酵时，通入无菌空气，通气比0.5-3VVM；发酵过程中用氨水控制pH在6.0-7.5；温度维持33-37℃；溶氧维持在10-30％；当发酵培养基中的葡萄糖消耗完之后，以每升发酵液每小时3-8g的恒定速度流加葡萄糖水溶液(以葡萄糖质量计)，控制残糖浓度低于0.1g/L，发酵周期40-48h。
其中，所述发酵培养基(无有机氮高硫酸根葡萄糖培养基)的组成为：K2HPO42-18g/L，(NH4)2SO4 2-8g/L，柠檬酸铁氨1-10g/L，葡萄糖10-20g/L，MgSO4 0.1-1g/L，K2SO4 1-2g/L，锰和钼的无机盐。其中，锰离子终浓度0.1～1g/L，钼离子终浓度0.01～0.1g/L。
优选地，所述发酵培养基(无有机氮高硫酸根葡萄糖培养基)的组成为：K2HPO414g/L，(NH4)2SO4 4g/L，柠檬酸铁氨1.8g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4 0.6g/L，K2SO4 2g/L，锰离子终浓度0.1g/L，钼离子终浓度0.02g/L。
优选地，步骤3)具体为：将步骤2)中制备的重组大肠杆菌TDTC-inp004的种子液按照5-20％v/v接种量接入SY液体培养基中，开始发酵时，通入无菌空气，通气比0.5-3VVM；发酵过程中用氨水控制pH在6.0-7.5；温度维持33-37℃；溶氧维持在10-30％；当SY液体培养基中的蔗糖消耗完之后，以每升发酵液每小时3-8g的恒定速度流加蔗糖水溶液(以蔗糖质量计)，控制残糖浓度低于0.1g/L，发酵周期40-48h。
本发明中，所述冰核活性蛋白活性激活需在发酵结束后将发酵液迅速降温至12-18℃，同时降低通气量至溶氧维持在3～5％的水平，降低搅拌速度至0～50rpm，将葡萄糖水溶液的流加速度降至降温前的1/10左右，维持2-6h。
本发明的生产方法可应用于突变体大肠杆菌工程菌株，发酵INP突变体蛋白。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供了可以产冰核活性蛋白(ice nucleation active protein，INP)的大肠杆菌重组工程菌株发酵INP的方法，INP可以来源于任何具有冰核活性的革兰氏阴性菌。重组后的大肠杆菌菌株通过斜面活化、摇瓶培养种子液、发酵罐高密度发酵、冰核活性蛋白活性激活工艺步骤发酵生产冰核活性蛋白。本发明克服了现有冰核活性蛋白产生菌多为植物条件致病菌，对生态有潜在危害的缺点。采用本发明的发酵策略和方法生产的INP表达量适中，高密度发酵可产生高活性INP。应用本方法生产的冰核活性蛋白产品具有活性高，生产方法操作简单、成本低廉、重复性好等优点，对环境无害，生产强度高，适用于稳定地大规模工业化生产。
(二)本发明提供一种经济且简单的SY培养基，其生产冰核蛋白种子具有活力高、转接发酵后延滞期短的优点。另外菌种为BW25113等K12系菌株时，发酵过程中采用的底料培养基为无有机氮源高硫酸根培养基，可以完成高密度发酵，菌体密度可达150OD以上；菌种为BL21等B系菌株时，发酵过程中采用的底料培养基为SY液体培养基，可以完成高密度发酵，菌体密度可达75OD以上。
(三)本发明的生产方法在发酵罐高密度发酵中采用适宜的恒定速度流加方式可以控制适宜的冰核活性蛋白表达量，从而保证较高的营养物质利用率。
(四)本发明的生产方法的冰核活性蛋白活性激活，可以显著提高冰核活性蛋白活性，从而保证较高的生产强度。
附图说明
图1为本发明实施例1中发酵罐高密度发酵生长曲线及温度曲线。OD可达到200以上。
图2为本发明实施例2中发酵罐高密度发酵生长曲线及温度曲线。OD可达到90以上。
图3为本发明实施例1和2中两种菌发酵后的冰点检测结果。其中，“27H”为BL21，“43H”为BW25113，分别为实施例2和实施例1的样品稀释到10-4g/L(0.5OD)和10-5g/L(0.05OD)后10ul冻滴结果，如图中标识所示，BW25113和BL21都在10-4g/L的浓度-1.8℃开始结冰，而10-5g/L则在-2℃开始结冰。-3℃两个菌株的发酵的冰核蛋白可以使水100％都结冰，而自来水对照需在-8.5℃才开始结冰。
图4为本发明实施例1中产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp001发酵的蛋白胶图(SDS-PAGE)，显示INP大小为150KD左右。INP为可溶性蛋白。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中，50％冻滴温度的测量方法如下：
将菌体样品用蒸馏水稀释至菌体OD600＝0.1±0.02，均匀地在控温金属板上滴10μL小液滴100个。0℃预冷5min，每次迅速降低控温金属板温度0.1±0.02℃，并在该温度下维持1min后，计数结冰的小液滴数量；当结冰小液滴数量达到50±5个时的温度即为该样品的50％冻滴温度。所用蒸馏水50％冻滴温度为-8.5℃。
以下实施例中使用的消泡剂为聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
实施例1利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法
1、产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp001的构建
1.1冰核蛋白基因inp的扩增
以丁香假单胞菌(Psudomonas syringae)TDTC-IN 13的基因组DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增：
inp-F：ctaacaggaggaattaaccatgaatctcgacaaggcgttg
inp-R：gagctcggatccccatcgatctactcgacctctatccagtc
采用南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的高效保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增。PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃2min，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物跑电泳后切胶，使用Omega公司的凝胶回收试剂盒进行切胶回收(根据试剂盒说明书操作)，得到基因片段inp。
1.2重组表达载体的构建
将步骤1.1所得的基因片段inp与经过限制性内切酶NcoI和ClaI双酶切处理的pBAD/His A质粒经Gibson连接(质粒与DNA片段的摩尔比约为1：3，50℃1h)，然后将连接产物转化DH5α。转化后从平板上挑取5-10个的单克隆，取37℃摇床培养1h之后的菌液，利用相应的引物进行PCR验证并对正确的转化子进行测序，从验证正确的转化子提取得到重组表达质粒pBAD-inp。
1.3以步骤1.2所得的重组表达质粒pBAD-inp为模板，用以下引物进行PCR扩增：
ara-inp-F：cattcccacgatgaaaacacgccgtgcctgtcaaatggacgaag
ara-inp-R：ggcgctggaattgctttaactgcctactcgacctctatccagtc
PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃2.5min，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到ara-inp。
以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增：
galRuF：ccttcaatacgcacaggaataac
galRuR：cttcgtccatttgacaggcacggcgtgttttcatcgtgggaatg
PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃30s，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到galR基因上游片段galR-up。
用以下引物进行PCR扩增：
galRdF：gactggatagaggtcgagtaggcagttaaagcaattccagcgcc
galRdR：agatgttatcgatcaggcgacgc
PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃30s，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到galR基因下游片段galR-down。
将galR的基因序列导入sgRNA在线设计网站(http://crispr.dbcls.jp/)，设计得到其对应的N20为：TTGCACTATGCACAGCCAGC，用以下引物进行退火延伸：
galRN20-F：gtcctaggtataatactagtttgcactatgcacagccagcgttttagagctagaaatagc
galRN20-R：gctatttctagctctaaaacgctggctgtgcatagtgcaaactagtattatacctaggac
20μL反应体系含有2μL galRN20-F，2μL galRN20-R和16μL ddH2O，反应条件为90℃10min，Touch down程序降温降至16℃得到galRN20。
1.4打靶基因片段和pTargetF-galR的构建
将步骤1.3所得的三个基因片段ara-inp、galR-up和galR-down进行重叠延伸PCR，先在10μL体系中取galR-up、galR-down和ara-inp各100ng，其它如加酶等一切照常，但先不加两端引物。扩增条件为95℃30s；95℃15s，50℃15s，72℃1min，5个循环；72℃5min。然后，以上述PCR产物为模板，取1μL至50μL体系中(加入引物galRuF和galRdR)，扩增条件为95℃30s；95℃15s，52℃30s，每循环降0.5℃，72℃3.5min，10个循环；95℃15s，48℃30s，72℃3.5min，25个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到打靶基因片段ΔgalR∷ara-inp。
以pTargetF(Addgene 62226)质粒为模板，用以下引物进行PCR扩增：
Target-F：gttttagagctagaaatagc
Target-R：actagtattatacctaggac
PCR扩增程序为：95℃30s；95℃15s，58℃15s，72℃1min，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到pTarget。将步骤1.3所得的galRN20与pTarget经Gibson连接(质粒与DNA片段的摩尔比约为1：3，50℃1h)，然后将连接产物转化DH5α。转化后从平板上挑取5-10个单克隆，取37℃摇床培养1h后的菌液，利用相应的引物进行PCR验证，从验证正确的菌株提取得到pTargetF-galR质粒。
1.5电转打靶基因片段至大肠杆菌BW25113
先将pCas(Addgene 62225)质粒转化菌株E.coli BW25113，涂布卡那霉素(50μg/mL)抗性平板。然后将含有pCas的BW25113菌株制备成电转感受态，电转感受态制备方法如下：挑取平板上单克隆，接入含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基(氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)30℃培养过夜。将过夜培养的菌液以1％的接种量接种至装有50mL液体LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中。30℃，220rpm条件下培养1-2h，待OD600长至0.15-0.2左右，加入阿拉伯糖(终浓度为0.2％)。当OD600值达到0.5～0.6时，取出摇瓶冰浴10-15min。然后，4℃，4100rpm离心10min收集菌体。弃上清液，加入25mL预冷的10％甘油重悬菌体。然后重复离心并重悬菌体两次。弃上清液，用10％甘油重悬浮细胞至最终体积为500μL，即为电转感受态细胞。然后，按100μL每份装入1.5mL ep管，-80℃冻存备用。
添加步骤1.4得到的pTargetF-galR质粒约100ng和打靶片段ΔgalR∷ara-inp约500-1000ng至100μL电转感受态细胞中，冰上放置约5min。然后，转移至2mm电转杯中。调整电转仪(Bio-Rad MicroPluser)为细菌模式，加载EC2，对电转杯进行电击。电击后立即添加1mL的LB液体培养基至电转杯中。转移电转杯中菌液至新的ep管中，置于30℃，180rpm，复苏约2h。取全部菌液涂布到含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的LB平板，对转化子进行PCR验证。
用以下引物进行PCR扩增：
galRu1239：ctccgaagcggtacattg
araCF113：accgctgggaatgaaagg
PCR扩增程序为：95℃30s；95℃15s，58℃15s，72℃1min，30个循环；72℃5min。能扩增出大小为2.0kb条带的转化子是已经将冰核蛋白基因整合到大肠杆菌基因组的正确转化子。
1.6产冰核蛋白重组大肠杆菌的获得
将步骤1.5验证正确的转化子接入3mL的LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素和1mM IPTG，isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，置于30℃摇床200rpm培养过夜。将菌液稀释后涂布含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板。将获得的单克隆，分别点种在含卡那霉素(50μg/mL)或壮观霉素(50μg/mL)的LB平板以得到对壮观霉素敏感的菌株。将对壮观霉素敏感的转化子接入3mL的LB液体培养基，置于42℃摇床200rpm培养过夜。将菌液稀释后涂布LB平板。将获得的单克隆分别点种在含有或不含卡那霉素(50μg/mL)LB平板以得到对卡那霉素敏感的菌株。对卡那霉素敏感的菌株就是不携带抗生素抗性基因的产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp001。
挑取实施例1构建好的TDTC-inp001单克隆至3mL的LB液体培养基，置于37℃摇床200rpm培养过夜。以1：100的比例接种菌液至10mL ZYM自诱导培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO4·12H2O 8.95g/L，KH2PO4 3.4g/L，NH4Cl 2.67g/L，Na2SO4 0.71g/L，甘油5ml/L，MgSO4 0.24g/L，50％葡萄糖1ml/L，终浓度0.2％的阿拉伯糖，微量元素(1000倍储液)1ml/L；其中微量元素(1000倍储液)为FeCl3 50mM，CaCl2 20mM，MnCl2 10mM，ZnSO4 10mM，CoCl2、NiCl2、NaMO4、NaSeO3和H3BO3各2mM)中，置于37℃摇床200rpm培养过夜以诱导冰核蛋白的表达。表达后的INP蛋白如图4所示。
2、以重组大肠杆菌TDTC-inp001作为发酵菌种，用于高密度发酵生产冰核活性蛋白INP
2.1试管斜面活化，将菌种保存管从-80℃深冷冰箱中取出，接种1环菌种，均匀涂布于活化斜面，32℃培养24h，转接第二代活化斜面，32℃培养24h。
斜面活化使用培养基为SY固体培养基。SY固体培养基组成为：KH2PO4 3g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、蔗糖20g/L、酵母粉5g/L、酵母蛋白胨5g/L、玉米浆干粉5g/L、琼脂粉15g/L，其余为水，用氨水调节pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。
2.2摇瓶培养种子液，将试管活化斜面好的菌种接入摇瓶培养，260rpm震荡培养，32℃培养至OD600达到8。
摇瓶培养种子液使用培养基为SY液体培养基。SY液体培养基组成为：KH2PO4 3g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、蔗糖20g/L、酵母粉5g/L、酵母蛋白胨5g/L、玉米浆干粉5g/L，消泡剂0.05g/L，其余为水，用氨水调节pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。
2.3发酵罐高密度发酵，将种子液按照10％v/v接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，通入新鲜的无菌空气，通气比2VVM；发酵过程中使用氨水控制pH稳定在7.0；温度维持33℃；溶氧维持25％。当培养基中葡萄消耗完之后，以每升发酵液每小时5g恒定速度(以葡萄糖质量计)流加葡萄糖水溶液，在对数中前期额外补加终浓度为0.2g/L的天冬氨酸。发酵周期48h。
发酵培养基为无有机氮高硫酸根培养基：培养基是K2HPO4 14g/L，(NH4)2SO4 4g/L，柠檬酸铁氨1.8g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4 0.6g/L，K2SO4 2g/L，另外任何含有锰和钼的无机盐作为微量元素。其中，锰离子终浓度0.1g/L，钼离子终浓度0.02g/L。
2.4冰核活性蛋白活性激活，发酵结束后将发酵液迅速降温至15℃，同时降低通气比至溶氧维持在3～5％的水平，降低搅拌速度(0～50rpm)，降低葡萄糖水溶液流加速度至每升发酵液每小时0.5g，维持5h。
2.5离心，收集菌体后保存。
利用上述方法生产冰核活性重组菌的生长曲线及温度曲线如图1所示。最终发酵罐高密度发酵菌体OD600为167，冰核活性蛋白活性激活菌体OD600为152；50％冻滴温度为-1.8℃。
实施例2利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法
1、产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp004，其构建方法如下：
1.1冰核蛋白基因inp的扩增
以丁香假单胞菌(Psudomonas syringae)TDTC-IN 13的基因组DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增：
inp-F：ctttaagaaggagatataccatgaatctcgacaaggcgttg
inp-R：gcaagcttgtcgacctgcagctactcgacctctatccagtc
采用南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的高效保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增。PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃2min，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物跑电泳后切胶，使用Omega公司的凝胶回收试剂盒进行切胶回收(根据试剂盒说明书操作)，得到基因片段inp。
1.2重组表达载体的构建
将步骤1.1所得的基因片段inp与经过限制性内切酶NcoI和PstI双酶切处理的pETDuet-1质粒经Gibson连接(质粒与DNA片段的摩尔比约为1：3，50℃1h)，然后将连接产物转化DH5α。转化后从平板上挑取5-10个的单克隆，取37℃摇床培养1h之后的菌液，利用相应的引物进行PCR验证并对正确的转化子进行测序，从验证正确的转化子提取得到重组表达质粒pET-inp。
1.3以步骤1.2所得的重组表达质粒pET-inp为模板，用以下引物进行PCR扩增：
T7-inp-F：cattcccacgatgaaaacacgccgctgactgggttgaaggctc
T7-inp-R：ggcgctggaattgctttaactgccggatatagttcctcctttc
PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃2.5min，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到T7-inp。
以大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增：
galRuF：ccttcaatacgcacaggaataac
galRuR1：gagccttcaacccagtcagcggcgtgttttcatcgtgggaatg
PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃30s，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到galR基因上游片段galR-up。
用以下引物进行PCR扩增：
galRdF1：gaaaggaggaactatatccggcagttaaagcaattccagcgcc
galRdR：agatgttatcgatcaggcgacgc
PCR扩增程序为：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃30s，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到galR基因下游片段galR-down。
将galR的基因序列导入sgRNA在线设计网站(http://crispr.dbcls.jp/)，设计得到其对应的N20为：TTGCACTATGCACAGCCAGC，用以下引物进行退火延伸：
galRN20-F：gtcctaggtataatactagtttgcactatgcacagccagcgttttagagctagaaatagc
galRN20-R：gctatttctagctctaaaacgctggctgtgcatagtgcaaactagtattatacctaggac
20μL反应体系含有2μL galRN20-F，2μL galRN20-R和16μL ddH2O，反应条件为90℃10min，Touch down程序降温降至16℃得到galRN20。
1.4打靶基因片段和pTargetF-galR的构建
将步骤1.3所得的三个基因片段T7-inp、galR-up和galR-down进行重叠延伸PCR，先在10μL体系中取galR-up、galR-down和T7-inp各100ng，其它如加酶等一切照常，但先不加两端引物。扩增条件为95℃30s；95℃15s，50℃15s，72℃1min，5个循环；72℃5min。然后，以上述PCR产物为模板，取1μL至50μL体系中(加入引物galRuF和galRdR)，扩增条件为95℃30s；95℃15s，52℃30s，每循环降0.5℃，72℃3.5min，10个循环；95℃15s，48℃30s，72℃3.5min，25个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到打靶基因片段ΔgalR∷T7-inp。
以pTargetF(Addgene 62226)质粒为模板，用以下引物进行PCR扩增：
Target-F：gttttagagctagaaatagc
Target-R：actagtattatacctaggac
PCR扩增程序为：95℃30s；95℃15s，58℃15s，72℃1min，30个循环；72℃5min。将所得的PCR产物经过切胶回收后得到pTarget。将步骤1.3所得的galRN20与pTarget经Gibson连接(质粒与DNA片段的摩尔比约为1：3，50℃1h)，然后将连接产物转化DH5α。转化后从平板上挑取5-10个单克隆，取37℃摇床培养1h后的菌液，利用相应的引物进行PCR验证，从验证正确的菌株提取得到pTargetF-galR质粒。
1.5电转打靶基因片段至大肠杆菌BL21(DE3)
先将pCas(Addgene 62225)质粒转化菌株E.coli BL21(DE3)，涂布卡那霉素(50μg/mL)抗性平板。然后将含有pCas的BL21(DE3)菌株制备成电转感受态，电转感受态制备方法如下：挑取平板上单克隆，接入含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基(氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)30℃培养过夜。将过夜培养的菌液以1％的接种量接种至装有50mL液体LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中。30℃，220rpm条件下培养1-2h，待OD600长至0.15-0.2左右，加入阿拉伯糖(终浓度为0.2％)。当OD600值达到0.5～0.6时，取出摇瓶冰浴10-15min。然后，4℃，4100rpm离心10min收集菌体。弃上清液，加入25mL预冷的10％甘油重悬菌体。然后重复离心并重悬菌体两次。弃上清液，用10％甘油重悬浮细胞至最终体积为500μL，即为电转感受态细胞。然后，按100μL每份装入1.5mL ep管，-80℃冻存备用。
添加步骤1.4得到的pTargetF-galR质粒约100ng和打靶片段ΔgalR∷T7-inp约500-1000ng至100μL电转感受态细胞中，冰上放置约5min。然后，转移至2mm电转杯中。调整电转仪(Bio-Rad MicroPluser)为细菌模式，加载EC2，对电转杯进行电击。电击后立即添加1mL的LB液体培养基至电转杯中。转移电转杯中菌液至新的ep管中，置于30℃，180rpm，复苏约2h。取全部菌液涂布到含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的LB平板，对转化子进行PCR验证。
用以下引物进行PCR扩增：
galRu1239：ctccgaagcggtacattg
lacIF996：caatacgcaaaccgcctc
PCR扩增程序为：95℃30s；95℃15s，58℃15s，72℃1min，30个循环；72℃5min。能扩增出大小为1.4kb条带的转化子是已经将冰核蛋白基因整合到大肠杆菌基因组的正确转化子。
1.6产冰核蛋白重组大肠杆菌的获得
将步骤1.5验证正确的转化子接入3mL的LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素和1mM IPTG，isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，置于30℃摇床200rpm培养过夜。将菌液稀释后涂布含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板。将获得的单克隆，分别点种在含卡那霉素(50μg/mL)或壮观霉素(50μg/mL)的LB平板以得到对壮观霉素敏感的菌株。将对壮观霉素敏感的转化子接入3mL的LB液体培养基，置于42℃摇床200rpm培养过夜。将菌液稀释后涂布LB平板。将获得的单克隆分别点种在含有或不含卡那霉素(50μg/mL)LB平板以得到对卡那霉素敏感的菌株。对卡那霉素敏感的菌株就是不携带抗生素抗性基因的产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp004。
2、以重组大肠杆菌TDTC-inp004作为发酵菌种，用于高密度发酵生产冰核活性蛋白INP
2.1试管斜面活化，将菌种保存管从-80℃深冷冰箱中取出，接种1环菌种，均匀涂布于活化斜面，32℃培养24h，转接第二代活化斜面，32℃培养24h。
斜面活化使用培养基为SY固体培养基。SY固体培养基组成为：KH2PO4 3g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、蔗糖20g/L、酵母粉5g/L、酵母蛋白胨5g/L、玉米浆干粉5g/L、琼脂粉15g/L，其余为水，用氨水调节pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。
2.2摇瓶培养种子液，将试管活化斜面好的菌种接入摇瓶培养，260rpm震荡培养，32℃培养至OD600达到8。
摇瓶培养种子液使用培养基为SY液体培养基。SY液体培养基组成为：KH2PO4 3g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、蔗糖20g/L、酵母粉5g/L、酵母蛋白胨5g/L、玉米浆干粉5g/L，消泡剂0.05g/L，其余为水，用氨水调节pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。
2.3发酵罐高密度发酵，将种子液按照10％v/v接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，通入新鲜的无菌空气，通气比2VVM；发酵过程中使用氨水控制pH稳定在7.0；温度维持32℃；溶氧维持25％。当培养基中蔗糖消耗完之后，以每升发酵液每小时5g恒定速度(以蔗糖质量计)流加蔗糖水溶液，在对数中前期额外补加终浓度为0.2g/L的天冬氨酸。发酵周期24h。
发酵培养基使用SY液体培养基。
2.4冰核活性蛋白活性激活，发酵结束后将发酵液迅速降温至15℃，同时降低通气比至0.5VVM，降低搅拌速度(0～50rpm)，降低葡萄糖水溶液流加速度至每升发酵液每小时0.5g，维持5h。
2.5离心，收集菌体后保存。
利用上述方法生产冰核活性蛋白的生长曲线及温度曲线如图2所示。最终发酵罐高密度发酵菌体OD600为91，冰核活性蛋白活性激活菌体OD600为84；50％冻滴温度为-2.0℃。
实施例1和2中两种菌发酵后的冰点检测结果见图3。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法
<130> KHP191111283.7
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4023
<212> DNA
<213> 丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)
<400> 1
atgaatctcg acaaggcgtt ggtgctgcgt acctgtgcaa ataacatggc cgatcattgc 60
ggccttatat ggcccgcttc tggcacggtg gaatccaaat actggcagtc aaccaggcgg 120
catgagaatg gtctggtcgg tttactgtgg ggcgctggaa ccagcgcttt tctgagcgtg 180
catgccgatg cgcgatggat tgtctgtgaa gtcgccgttg ccgacatcat cagtctggaa 240
gaaccgggaa tggtcaagtt tccgcgggcc gaggtggttc atgtcggcga caggatcagc 300
gcgtcacact ttatttcggc acgtcaggcc gatcctgcat caacgccaac gccaatgacc 360
gcggccacgc ccccacccac gcccgcgaca gcaaatgtca cgttaccggt ggccgaacag 420
gccagtcatg aagtgttcga tgtggcgttg gtcagcgcgg ctgccccccc ggtaaatacc 480
ctgccggtga cgaccccgca gaatttgcag accgccactt acggcagcac gttgagcggc 540
gacaaccaca gtcgactcat tgccggttat ggcagtaacg agactgctgg caaccacagt 600
gatctgattg ccggttatgg aagtacgggc accgccggct ccgacagctc gctggtagca 660
ggctatggaa gcacccagac cgccggtggg gacagcgcgc tgacggcggg ttacggcagc 720
acccagaccg cccgcgaagg cagcaacctg acggccgggt atggcagtac gggaacagct 780
ggctcggata gttcgttgat cgccggttac ggcagtactc agacttccgg ggaagacagc 840
tcgctcacag cgggttacgg cagcacgcaa acggctcagg aaggcagcaa cctgacggcc 900
gggtacggca gcaccggcac ggcgggctcc gatagctcgc tgatcgccgg ttatggcagt 960
acacagacct ctggaggtga cagctcgctg acggcgggtt acggcagcac gcagacggcc 1020
caggaaggca gtaacctgac ggccgggtac ggcagcacag gcacggcggg ctcggatagt 1080
tcgttgatcg ccggttacgg cagtactcag acttccggag aagacagctc gctcacggcg 1140
ggttacggca gcacgcaaac ggctcaggaa ggcagcaatc tcaccgcagg gtatggcagt 1200
accggcactg cgggctcgga tagctcgttg atcgccggtt acggcagtac ccaaacttcg 1260
ggcggcgaca gttcgctgac cgcaggctac ggcagcacgc agacggctca ggaaggcagc 1320
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ggctatggca gcacgcagac ttcgggaagc gacagcgccc tgaccgcagg ttacggcagc 1440
acgcaaactg ctcaggaagg cagcaatctc actgcagggt atggcagcac cggcacggca 1500
ggttccgaca gctcgctgat cgccggtcac ggcagcacgc aaacctcggg cagcgacagt 1560
tcgctcacgg cgggttacgg cagtacgcag acggcccagg agggcagcaa tctgacggcg 1620
gggtacggca gcacgagtac agcaggtgtc gacagctctc tgatcgcggg atacggcagc 1680
acgcagacct cgggaagtga cagtgcgctg acagcaggtt acggcagtac acagacggct 1740
caggaaggca gcaacctgac tgcgggctac ggcagcactg gcacagcagg tgccgacagt 1800
tcgctgatcg cgggatacgg cagcacgcag acctcgggaa gtgacagtgc gctgacggca 1860
ggttacggca gtacacagac cgcccaggag ggcagcaacc tgactgcggg ctacggcagt 1920
actggaacgg caggtgccga cagttcgctg atcgcaggat atggcagcac gcagacatca 1980
ggcagcgaaa gttcgctcac cgcaggctat ggcagtaccc agactgcccg tgaaggcagc 2040
accctgacgg ccgggtatgg cagtacggga acagctggcg ctgacagctc gttgatcgcc 2100
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ggctattcca gttccttgat cgccggctat ggcagcacgc agacggcagg ctacgggagc 2760
accttgacga ccggttatgg cagtacgcaa accgctcagg aaaacagctc gctcaccaca 2820
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acccagacgg caggctacga gagcacgttg accgccggtt acggcagtac gcaaaccgcg 2940
caggagcgca gtgacctggt gacaggttat ggcagtactt ccactgctgg ctacgcgagt 3000
tcgttgattg cgggttatgg cagtacgcag actgcggggt acgagagcac cttgaccgcc 3060
ggttacggca gtacgcaaac cgcacaggaa aacagctcgc tcaccaccgg ctacggaagt 3120
acttccactg ccggctttgc cagctcgctg atcgccggtt atggcagtac gcagacagcc 3180
ggctataaaa gtacccttac ggccggttac ggcagtactc agaccgcaga gtacggaagc 3240
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ggttatggca gctccctgac cagcggaatc aggagttttc tgaccgcagg ctatggcagt 3360
acgctgatcg ccggacttcg cagcgttttg atcgccggct atggcagtag ccttacatcg 3420
ggcattcgca gcacattgac tgcgggttat ggcagtaacc agattgcaag ttatggcagc 3480
tcgttgattg caggccatga aagcattcag gtcgccggaa ataaaagcat gctgatcgcc 3540
ggcaagggca gctcgcagac agcaggtttt cgcagcacgc tgattgccgg tgcgggcagc 3600
gtacaactgg cgggtgatcg cagcaggttg attgccggtg cagacagtaa tcagaccgcg 3660
ggtgaccgca gcaaactact ggccggtaat aacagttatc tgactgccgg cgatagaagc 3720
aaactgaccg gcggacatga ctgcaccttg atggcgggag accaaagcag attgaccgct 3780
ggaaagaaca gtatcttgac ggcaggcgcg cgtagcaagc ttattggcag tgaaggctcg 3840
acgctctcgg cgggagaaga ctccacgctt attttcaggc tctgggacgg gaagaggtac 3900
aggcaattgg ttgccagaac gggtgagaac ggtgttgaag ccgacatacc gtattacgtg 3960
aacgaagagg acgatattgt cgataaaccc gacgaggatg atgactggat agaggtcgag 4020
tag 4023
<210> 2
<211> 1340
<212> PRT
<213> 丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)
<400> 2
Met Asn Leu Asp Lys Ala Leu Val Leu Arg Thr Cys Ala Asn Asn Met
1 5 10 15
Ala Asp His Cys Gly Leu Ile Trp Pro Ala Ser Gly Thr Val Glu Ser
20 25 30
Lys Tyr Trp Gln Ser Thr Arg Arg His Glu Asn Gly Leu Val Gly Leu
35 40 45
Leu Trp Gly Ala Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ser Val His Ala Asp Ala
50 55 60
Arg Trp Ile Val Cys Glu Val Ala Val Ala Asp Ile Ile Ser Leu Glu
65 70 75 80
Glu Pro Gly Met Val Lys Phe Pro Arg Ala Glu Val Val His Val Gly
85 90 95
Asp Arg Ile Ser Ala Ser His Phe Ile Ser Ala Arg Gln Ala Asp Pro
100 105 110
Ala Ser Thr Pro Thr Pro Met Thr Ala Ala Thr Pro Pro Pro Thr Pro
115 120 125
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130 135 140
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgcactatg cacagccagc 20
Claims (1)
1.利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法，其特征在于，包括在发酵培养基中对产冰核蛋白的重组大肠杆菌进行培养，以生产冰核蛋白；
发酵过程中，待重组大肠杆菌进入对数中前期，向发酵培养基中补加终浓度为0.1-0.5g/L的天冬氨酸；
产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp001，其构建方法如下：
1)从丁香假单胞菌中克隆得到冰核蛋白基因；
2)将步骤1)所得基因构建到质粒pBAD/His A上，得到重组表达质粒；
3)以步骤2)所得重组表达质粒为模板扩增带有阿拉伯糖诱导启动子的冰核蛋白基因片段；同时以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增得到galR基因上、下游片段knock-in-up和knock-in-down；
4)将步骤3)所得三个基因片段通过重叠延伸PCR得到基因编辑片段；
5)构建靶向大肠杆菌galR基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体；
6)将步骤4)所得基因编辑片段和步骤5)所得CRISPR/Cas9基因编辑载体共同导入大肠杆菌BW25113中，得到重组大肠杆菌TDTC-inp001；
其中，步骤3)中用于PCR扩增所述knock-in-up和knock-in-down的引物分别如SEQ IDNO:3-4和SEQ ID NO:5-6所示；
步骤5)中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体是基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA作用位点的核酸序列为5′-TTGCACTATGCACAGCCAGC-3′；或者，
产冰核蛋白的重组大肠杆菌TDTC-inp004，其构建方法如下：
1)从丁香假单胞菌中克隆得到冰核蛋白基因；
2)将步骤1)所得基因构建到质粒pBAD/His A上，得到重组表达质粒；
3)以步骤2)所得重组表达质粒为模板扩增带有阿拉伯糖诱导启动子的冰核蛋白基因片段；同时以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增得到galR基因上、下游片段knock-in-up和knock-in-down；
4)将步骤3)所得三个基因片段通过重叠延伸PCR得到基因编辑片段；
5)构建靶向大肠杆菌galR基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体；
6)将步骤4)所得基因编辑片段和步骤5)所得CRISPR/Cas9基因编辑载体共同导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌TDTC-inp004；
其中，步骤3)中用于PCR扩增所述knock-in-up和knock-in-down的引物分别如SEQ IDNO:3、7和SEQ ID NO:6、8所示；
步骤5)中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体是基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA作用位点的核酸序列为5′-TTGCACTATGCACAGCCAGC-3′；
具体地，利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法包括以下步骤：
(1)菌种活化；
(2)种子液的制备；
(3)发酵培养；
(4)发酵结束后将发酵液迅速降温至12-18℃，以激活所述冰核蛋白；
其中，步骤(3)还包括采用合适的碳源进行补料发酵；
步骤(1)具体为：从-80℃冰箱中取出菌种保存管，接种1-2环菌种，均匀涂布于活化斜面，24-37℃培养10-48h，然后转接第二代活化斜面，24-37℃培养10-48h；
所述活化斜面使用的培养基为SY固体培养基，其组成为：KH2PO4 2-10g/L、MgSO4·7H2O0.2-2g/L、蔗糖5-30g/L、酵母粉1-10g/L、酵母蛋白胨1-10g/L、玉米浆干粉1-10g/L、琼脂粉10-30g/L，pH 6.0-7.5；
步骤(2)具体为：将步骤(1)活化的菌种接入SY液体培养基，24-37℃，150-300rpm震荡培养至OD600＝3-10；
所述SY液体培养基的组成为：KH2PO4 2-10g/L、MgSO4·7H2O 0.2-2g/L、蔗糖5-30g/L、酵母粉1-10g/L、酵母蛋白胨1-10g/L、玉米浆干粉1-10g/L，消泡剂0.01-1g/L，pH 6.0-7.5；
步骤(3)具体为：将步骤(2)中制备的重组大肠杆菌TDTC-inp001的种子液按照5-20％v/v接种量接入发酵培养基中，开始发酵时，通入无菌空气，通气比0.5-3VVM；发酵过程中用氨水控制pH在6.0-7.5；温度维持33-37℃；溶氧维持在10-30％；当发酵培养基中的葡萄糖消耗完之后，以每升发酵液每小时3-8g的速度流加葡萄糖水溶液，控制残糖浓度低于0.1g/L，发酵周期40-48h；
其中，所述发酵培养基的组成为：K2HPO4 2-18g/L，(NH4)2SO4 2-8g/L，柠檬酸铁氨1-10g/L，葡萄糖10-20g/L，MgSO4 0.1-1g/L，K2SO4 1-2g/L，锰和钼的无机盐；其中，锰离子终浓度0.1～1g/L，钼离子终浓度0.01～0.1g/L；或者，
步骤(3)具体为：将步骤(2)中制备的重组大肠杆菌TDTC-inp004的种子液按照5-20％v/v接种量接入SY液体培养基中，开始发酵时，通入无菌空气，通气比0.5-3VVM；发酵过程中用氨水控制pH在6.0-7.5；温度维持33-37℃；溶氧维持在10-30％；当SY液体培养基中的蔗糖消耗完之后，以每升发酵液每小时3-8g的速度流加蔗糖水溶液，控制残糖浓度低于0.1g/L，发酵周期40-48h。
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