CN106834200B - 一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法 - Google Patents

一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106834200B
CN106834200B CN201710117371.1A CN201710117371A CN106834200B CN 106834200 B CN106834200 B CN 106834200B CN 201710117371 A CN201710117371 A CN 201710117371A CN 106834200 B CN106834200 B CN 106834200B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tfu
fermentation
gene
escherichia coli
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710117371.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106834200A (zh
Inventor
邓禹
赵梅
毛银
张晓娟
黄荻萱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201710117371.1A priority Critical patent/CN106834200B/zh
Publication of CN106834200A publication Critical patent/CN106834200A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106834200B publication Critical patent/CN106834200B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01035—3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (1.1.1.35)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01009—Acetyl-CoA C-acetyltransferase (2.3.1.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01001—Acetate-CoA ligase (6.2.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法，属于生物工程领域。本发明是以敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达β‑酮硫解酶基因、3‑羟酰基‑辅酶A脱氢酶基因、3‑羟基己二酰脱氢酶基因、5‑羧基‑2‑戊烯酰辅酶A还原酶基因、己二酰辅酶A，己二酸的产量可达到25.57g/L。此重组菌还可进行循环发酵，最终经过十次循环，己二酸产量累积量达18.94g/L；这对于工业上连续化的大生产有着重要作用，可以减少菌体生长时间，直接利用循环菌体发酵省时，快速，节约成本。

Description

一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法，属于生物工程领域。
背景技术
己二酸(Adipic acid，adipate)又称肥酸，是一种重要的有机二元酸，广泛应用于化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造等方面。
目前己二酸的主要生产方式是化学合成，但是该方法的产品收率并不高。此外，在己二酸的化学合成过程中主要以苯为原料，通过化学方法合成，原料和中间产物毒性很强，而且过程中产生大量的N2O等温室气体，环境污染严重且不可持续。
为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基础工作。目前报道的主要生物合成己二酸的方法有生物催化法和全生物合成方法。主要的生物催化法主要是利用微生物催化合成己二酸前体顺，顺-粘康酸，然后再利用金属催化剂催化合成己二酸。全生物合成己二酸的方法包括：大肠杆菌以葡萄糖为底物利用乙酰CoA和琥珀酰CoA作为底物全生物合成；酿酒酵母利用脂肪酸氧化法全生物合成己二酸。以葡萄糖为底物全生物合成己二酸具有工艺流程简单、总投入成本低、可循环利用等突出优点，因此备受研究人员青睐。虽然目前在大肠杆菌中已经实现了利用葡萄糖全生物合成己二酸，但是该途径需要10步以上的酶促反应，途径冗长且存在可逆反应，最终己二酸的产量极低(低于1mg/L)，经优化目前已报道的己二酸的最高产量为2.5g/L。
发明内容
本发明首先提供了一种产己二酸的重组大肠杆菌，是以大肠杆菌BL21(DE3)或敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自褐色喜热裂孢菌的异源基因β-酮硫解酶基因(Tfu_0875)，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因(Tfu_2399)，3-羟基己二酰脱氢酶基因(Tfu_0068)，5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因(Tfu_1648)，己二酰辅酶A合成酶(Tfu_2576，Tfu_2577)；其中，基因Tfu_0875、Tfu_2399以pRSFDuet-1为表达载体；基因Tfu_0068、Tfu_1648以pTrc99a为表达载体；基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1为表达载体。
本发明还提供一种构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)以质粒pRSFDuet-1为骨架载体，连接基因片段Tfu_0875、Tfu_2399，得到重组质粒pAD-1；
(2)以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段Tfu_0068、Tfu_1648，得到重组质粒pAD-4；
(3)以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段Tfu_2576、Tfu_2577，得到重组质粒pAD-6；
(4)将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌Mad2ΔatoB。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)将基因片段Tfu_0875及质粒pRSFDuet-1都用EcoR I和Hind III双酶酶切处理后，以T4 DNA连接酶连接得到重组质粒pRSF-Tfu_0875；将Tfu_2399及重组质粒pRSF-Tfu_0875都用Bgl II和Kpn I双酶切处理，再用T4 DNA连接酶连接，得到连接了基因片段Tfu_0875、Tfu_2399的重组质粒即pAD-1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)，基因片段Tfu_0068、Tfu_1648通过Nco Ⅰ、Hind Ⅲ连接到质粒pTrc99a上形成pAD-4质粒。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)，基因片段Tfu_2576、Tfu_2577通过Nco Ⅰ、Hind Ⅲ连接到质粒pCDFDuet-1上形成pAD-6质粒。
本发明的第三个目的在于提供一种应用所述重组大肠杆菌Mad2ΔatoB发酵生产己二酸的方法，是以SOB培养基为发酵培养基，将重组大肠杆菌Mad2ΔatoB于35～37℃培养至OD600为0.6-0.8时加1mM IPTG并降温至30℃诱导培养。
在本发明的一种实施方式中，当发酵培养基中的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述SOB培养基的成分为2g/100ml胰蛋白胨、0.5g/100ml酵母粉、0.05g/100ml NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、0.8g/100ml葡萄糖、50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml链霉素。
在本发明的一种实施方式中，以2％的接种量，将重组大肠杆菌Mad2ΔatoB接种至装有3L SOB培养基的5L发酵罐中，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2M NaOH维持pH为6.8～7.2，发酵温度37℃，培养至OD600为0.6-0.8时加1mM IPTG，降温至30℃诱导；待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L。
在本发明的一种实施方式中，种子液的制备方法是将甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。次日取500μl菌液转接于60ml LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD600达到0.6-0.8时，接种于5L发酵罐中。
本发明提供的重组大肠杆菌Mad2ΔatoB还可以用于连续循环发酵生产己二酸。例如，发酵到一定时间，将发酵体系中的重组菌菌体分离收集起来，转接到新鲜培养基中，如此循环往复，可降低制备种子液的成本、缩短发酵时间。
本发明的优点在于：与化学法相比，大肠杆菌全生物法合成己二酸，首先产品的回收更加方便简单，而且极大程度地降低了对环境的污染程度。与前期已报道的生物法合成己二酸相比，本发明中所提到发酵工艺实现了大肠杆菌BL21(DE3)高产己二酸。
以葡萄糖为唯一碳源，Mad2的摇瓶发酵产量分别为1.64g/L、发酵罐发酵产量达4.34g/L。我们发现在以Mad2为生产菌株发酵的过程中，发酵液中还有大量的副产物丁酸，通过敲除atoB基因，我们减少了副产物丁酸的产量，通过补料发酵将己二酸的产量进一步提升到25.57g/L。由于构建的重组大肠杆菌Mad2ΔatoB生长状况比较好，能长时间在SOB培养基中生长，因此我们利用此重组菌进行循环发酵，发现此重组菌不但可以继续生长，而且可以产我们想要的产物己二酸。最终经过十次循环摇瓶发酵，己二酸产量累积量达18.94g/L；这对于工业上连续化的大生产有着重要作用，可以减少菌体生长时间，直接利用循环菌体发酵省时，快速，节约成本。
附图说明
图1为己二酸合成途径。
图2为pAD-1质粒图谱。
图3为pAD-3质粒图谱。
图4为pAD-4质粒图谱。
图5为pAD-6质粒图谱。
图6为pRSF-Tfu_0875质粒酶切验证图谱，1：Marker，2：EcoR I/Hind III双酶切pRSF-Tfu_0875质粒，3：EcoR I/Hind III双酶切pRSFDuet-1质粒。
图7为pAD-1质粒菌落pcr验证图谱，1：Marker，2-5：均为pAD-1菌落pcr验证Tfu_2399。
图8为在OD 0.6，IPTG 0.8mM时不同培养基下Mad1发酵结果图谱。
图9为在SOB培养基，IPTG 0.8mM时不同OD下Mad1发酵结果图谱。
图10为在SOB培养基，OD 0.6时不同浓度IPTG诱导下Mad1发酵结果图谱。
图11为BL21(DE3)敲除atoB的菌落pcr验证图谱，1-2：敲除atoB的菌株，3：未敲除atoB的对照菌株，4：Marker。
图12为Mad2ΔatoB上罐发酵结果图谱。
具体实施方式
表1下述实施例涉及的引物序列表
实施例1：重组质粒pAD-1构建及重组大肠杆菌的获得。
Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648、Tfu_2576、Tfu_2577的序列已于申请日前在NCBI中公布。
EcoR I和Hind III双酶切质粒pRSFDuet-1，切胶回收目的基因片段(3798bp)，用同样的酶酶切质粒pUC57-Tfu_0875，切胶回收得到目的基因片段Tfu_0875，然后将两个目的片段用T4 DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pRSF-Tfu_0875。Bgl II和Kpn I酶切质粒pRSF-Tfu_0875，切胶回收4936bp的目的基因片段，用同样的酶酶切质粒pUC57-Tfu_2399，切胶回收目的基因片段，然后将两个目的片段用T4 DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pAD-1。
其他质粒使用同样的方法进行构建，最终片段Tfu_0068、Tfu_1648分别通过NcoⅠ、Hind Ⅲ，以及Nde Ⅰ、Avr Ⅱ连接到质粒pETDuet-1上形成pAD-3质粒；Tfu_0068、Tfu_1648通过Nco Ⅰ、Hind Ⅲ连接到质粒pTrc99a上形成pAD-4质粒；Tfu_2576、Tfu_2577通过Nco Ⅰ、Hind Ⅲ连接到质粒pCDFDuet-1上形成pAD-6质粒。
将pAD-1、pAD-3、pAD-6转入BL21(DE3)制备重组大肠杆菌Mad1；将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入BL21(DE3)制备重组大肠杆菌Mad2。
实施例2：重组大肠杆菌Mad1初步摇瓶发酵条件优化。
发酵培养基：
SOB培养基，成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mMMgCl2+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素。
M9培养基：M9盐溶液+8g/L葡萄糖+2mM MgSO4+0.1mM CaCl2+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素。
LB培养基：1％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+1％NaCl+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素。
MOPS培养基：40mM MOPS+0.3％NH4Cl+0.1％K2HPO4+2mM MgSO4+0.1mM CaCl2+50mMNaCl+100mM Bis-Tris+134μM EDTA+31μM FeCl3+6.2μM ZnCl3+0.76μM CuCl2+0.42μM H3BO3+0.081μM MnCl2+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素。
TB培养基：1.2％胰蛋白胨+2.4％酵母粉+17mM KH2PO4+72mM K2HPO4+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素。
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。
发酵条件：2％接种量(1ml)，接种于摇瓶发酵培养基中，使其初始OD600为0.1。37℃、250r/min培养至OD600分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0时分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM IPTG诱导Mad1，改为30℃、250rpm/min培养。发酵策略：使用上述不同的发酵培养基，诱导时的OD及IPTG浓度分别设定为以下梯度。OD600梯度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，IPTG浓度梯度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM。最终在OD6000.6，IPTG 0.8mM时不同发酵培养基下发酵；在SOB培养基，IPTG 0.8mM时不同OD600下发酵；在SOB培养基，OD6000.6时不同浓度IPTG诱导下发酵。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10,000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm。最终发现SOB培养基，OD600在0.6、0.8时用1.0mM IPTG诱导产己二酸的效率最高。
实施例3：Mad1、Mad2摇瓶发酵及结果分析。
发酵培养基：SOB培养基，成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mMKCl+10mM MgCl2+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素。
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜。
发酵条件：2％接种量，接种于摇瓶发酵培养基SOB中，使其初始OD600为0.1。37℃、250r/min培养至OD600为0.6-0.8左右时加入相应的诱导剂诱导表达1mM IPTG诱导Mad1和Mad2，改为30℃、250rpm/min培养。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10,000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm。Mad1、Mad2上罐发酵己二酸产量分别为0.119g/L，1.64g/L，故之后选用组合Mad2菌株进行生产己二酸。
实施例4：Mad2上罐发酵及结果分析。
3L培养基：SOB培养基，成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mM MgCl2+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素，补料加100g/L甘油。
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。次日取500μl菌液转接于60ml LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD600达到0.6-0.8时，接种于5L发酵罐中。
发酵条件：2％接种量，37℃培养至OD600为0.6-0.8左右时加1mM IPTG 30℃诱导，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2M NaOH维持pH为6.8～7.2。待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10,000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm。最终Mad2上罐发酵己二酸产量为4.34g/L。
实施例5：BL21(DE3)中乙酰CoA硫解酶(atoB)的敲除。
制备电转BL21(DE3)感受态：挑取BL21(DE3)的单菌落在LB固体培养基划线分离，于37℃倒置过夜培养16h；在划线平板上挑取单菌落接种至含20mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，37℃，200r/min振荡培养6-8h；取1％的接种量转入含50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，37℃，200r/min摇床培养至OD600＝0.4-0.6；将细菌培养物转移到预冷的50mL离心管中，置于一冰水混合物中骤冷(至少15min)，4℃条件下4000r/min离心10min，弃上清收集菌体；每管加入1ml预冷到4℃的无菌超纯水，轻微振荡使菌体悬浮，再加入超纯水到10mL，4℃条件下4000r/min离心10min，弃上清收集菌体；用30％甘油清洗菌体，加入1ml冷到4℃的30％的甘油，轻微振荡使菌体悬浮，再加入30％甘油到10mL，4℃条件下4000r/min离心10min，弃上清收集菌体，甘油重复洗一次；最后用1ml 30％甘油重悬菌体，进行分装，每管100μl，-80℃冰箱保存备用。
电转pcas质粒(该质粒购自Addgene)进入BL21(DE3)感受态：从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，取1μl纯化后的质粒于1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯仪器置于冰上预冷，将100μl解冻的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部。将电极杯推入电转仪，按一下pulse键，听到蜂鸣后，向电极杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移至1.5ml的离心管中。37℃，250rpm复苏1小时。取转化产物4000r/min离心3min，倒去上清后重新悬浮后涂在有50μg/ml硫酸卡那霉素的平板上，放入30℃过夜培养，次日查看转化结果。
将转有pcas质粒的BL21(DE3)做电转感受态，但是要在OD600＝0.2时加L-阿拉伯糖，其余操作同上。转化时需要控制pTarget F质粒(该质粒购自Addgene)与atoB基因上下游同源500bp的摩尔比是1:4，然后一同电转入含有pcas质粒的BL21(DE3)感受态中，其余步骤同上。挑取单菌落于2ml LB培养基中培养至4-6小时后取1μl菌液作为pcr模板，进行pcr然后琼脂糖凝胶电泳以验证基因是否敲除成功。在验证敲除成功的重组菌中加入IPTG就可以利用pcas将pTarget F消除掉，消除pTarget F后，37℃消除pcas，得到BL21(DE3)ΔatoB菌株。将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入BL21(DE3)ΔatoB制备重组大肠杆菌Mad2ΔatoB。
表2菌落PCR反应体系
Figure BDA0001235994710000081
胶的制作：称取0.3g琼脂糖溶于25mL 1×TAE缓冲液中，加热30-60s使其完全溶化，加入5μL EB，摇匀后倒入已插好梳子的水平胶框中，避免产生气泡，放置待其凝固。
跑胶：轻轻地拔出梳子，将胶放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液使其没过胶块，根据上样量加入适量的10×Loading Buffer，垂直点入上样孔中，插好电极后开始跑胶，100V跑30min后结束，取出胶块放入凝胶成像仪中进行拍照。
实施例6：Mad2ΔatoB上罐发酵及结果分析。
3L培养基：SOB培养基，成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mM MgCl2+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素，补料加100g/L甘油。
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。次日取500μl菌液转接于60ml LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD600达到0.6-0.8时，接种于5L发酵罐中。
发酵条件：2％接种量，37℃培养至OD600为0.6-0.8左右时加1mM IPTG 30℃诱导，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2M NaOH维持pH为6.8～7.2。待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10,000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm。Mad2ΔatoB上罐发酵己二酸产量为25.57g/L。
实施例7：Mad2ΔatoB摇瓶循环发酵及结果分析。
培养基：SOB培养基，成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mM MgCl2+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素。
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜。
发酵条件：2％接种量，接种于摇瓶发酵培养基SOB中，使其初始OD600为0.1。37℃、250r/min培养至OD600为0.6-0.8左右时加入相应的诱导剂诱导表达1mM IPTG诱导Mad2ΔatoB，改为30℃、250rpm/min培养。培养至72小时时停止发酵，取10ml菌液进行4℃、4000r/min离心10min，后用新鲜的50ml培养基重新悬浮菌体，继续进行发酵。每次循环培养至72小时均进行此操作。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10,000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm。
Mad2ΔatoB循环发酵己二酸产量为1.22g/L，3.82g/L，3.52g/L，1.29g/L，1.15g/L，1.73g/L，1.84g/L，1.20g/L，1.91g/L，1.23g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 1
cggaattcat gaccgatgtt tatattctgg a 31
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 2
cccaagcttt taacgatgca gaacgacgg 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 3
gaagatctat ggttgaggaa attaataaag 30
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 4
ggggtacctt aactccgcag agtgtcct 28
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 5
catgccatgg atgggtgaat ttatccgctt tg 32
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 6
cccaagcttt tattcttttt tatttttgcg cgcc 34
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 7
gggaattcca tatgatgtct gattttgatc tgtaccgg 38
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 8
cctaggttac tttttaagca gctgccg 27
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 9
catgccatgg atggcgatct ttctgaccaa 30
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 10
cccaagcttt tatttcttca gcagctggc 29
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 11
actttaataa ggagatatac cat 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 12
ccgacgtcag cgatcgcgtg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 13
cccctgtaga aataattttg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 14
ataaacaaat aggggttccg 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 15
actttaagaa ggagatatac catg 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 16
caagacccgt ttagaggccc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 17
cccctctaga aataattttg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 18
attgctgata aatctggagc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 19
tcaggcagcc atcggaagct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 20
ttgctcttgc ccggcgtcaa 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 21
caattcccct gtagaaataa 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 22
agagaacata gcgttgcctt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 23
gcactcggta tcgcttacct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，用于PCR
<400> 24
aagcttggct ggtggtcaac 20

Claims (4)

1.一种产己二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，是以敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自褐色喜热裂孢菌的异源基因β-酮硫解酶基因Tfu_0875，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因Tfu_2399，3-羟基己二酰脱氢酶基因Tfu_0068、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因Tfu_1648，己二酰辅酶A合成酶Tfu_2576、Tfu_2577；其中，基因Tfu_0875、Tfu_2399以pRSFDuet-1为表达载体；基因Tfu_0068、Tfu_1648以pTrc99a为表达载体；基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1为表达载体；
所述重组大肠杆菌的构建方法包括以下步骤：
(1)将基因片段Tfu_0875及质粒pRSFDuet-1都用EcoR I和Hind III双酶酶切处理后，以T4 DNA连接酶连接得到重组质粒pRSF-Tfu_0875；将Tfu_2399及重组质粒pRSF-Tfu_0875都用Bgl II和Kpn I双酶切处理，再用T4 DNA连接酶连接，得到连接了基因片段Tfu_0875、Tfu_2399的重组质粒即pAD-1；
(2)将基因片段Tfu_0068、Tfu_1648通过NcoⅠ、HindⅢ连接到质粒pTrc99a上，得到重组质粒pAD-4；
(3)将基因片段Tfu_2576、Tfu_2577通过NcoⅠ、HindⅢ连接到质粒pCDFDuet-1上，得到重组质粒pAD-6；
(4)将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌Mad2△atoB。
2.一种应用权利要求1所述重组大肠杆菌发酵生产己二酸的方法，其特征在于，是以SOB培养基为发酵培养基，将重组大肠杆菌于35～37℃培养至OD600为0.6-0.8时加1mM IPTG并降温至30℃诱导培养，当发酵培养基中的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L；所述SOB培养基成分为：2％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，0.05％NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，8g/L葡萄糖，5 0μg/mL硫酸卡那霉素，50μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL链霉素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以2％的接种量，将重组大肠杆菌Mad2△atoB接种至装有3L SOB培养基的5L发酵罐中，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2M NaOH维持pH为6.8～7.2，发酵温度37℃，培养至OD600为0.6-0.8时加1mM IPTG，降温至30℃诱导；待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵到一定时间，将发酵体系中的重组大肠杆菌菌体分离收集起来，转接到新鲜发酵培养基中，如此循环往复。
CN201710117371.1A 2017-03-01 2017-03-01 一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法 Active CN106834200B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710117371.1A CN106834200B (zh) 2017-03-01 2017-03-01 一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710117371.1A CN106834200B (zh) 2017-03-01 2017-03-01 一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106834200A CN106834200A (zh) 2017-06-13
CN106834200B true CN106834200B (zh) 2020-02-18

Family

ID=59138407

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710117371.1A Active CN106834200B (zh) 2017-03-01 2017-03-01 一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106834200B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109112090B (zh) * 2017-06-29 2021-07-27 江南大学 一种戊二酸的全生物合成的方法
CN107382706B (zh) * 2017-07-27 2019-09-03 江南大学 一种从发酵液中提取己二酸的方法
CN107312758B (zh) * 2017-07-27 2019-09-17 江南大学 一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶突变体
CN108004275B (zh) * 2017-11-16 2020-12-29 江南大学 一种产己二酸的大肠杆菌重组菌及其应用
EP3719121A4 (en) * 2017-11-30 2021-12-15 Toray Industries, Inc. GENE-MODIFIED MICROORGANISM FOR THE PRODUCTION OF 3-HYDROXYADIPIC ACID, -HYDROMUCONIC ACID AND / OR ADIPIC ACID AND THE MANUFACTURING METHOD FOR THESE CHEMICAL PRODUCTS
CN111484942A (zh) * 2019-12-02 2020-08-04 江南大学 一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法
CN113817782B (zh) * 2021-09-27 2023-08-25 江南大学 一种庚二酸的全生物合成方法
CN114107153A (zh) * 2021-11-26 2022-03-01 江南大学 一种生产己二酸的重组菌、构建方法和应用
CN115197887B (zh) * 2022-03-15 2023-08-25 江南大学 一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112436A (zh) * 2015-06-29 2015-12-02 江南大学 一种己二酸的全生物合成方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112436A (zh) * 2015-06-29 2015-12-02 江南大学 一种己二酸的全生物合成方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Production of adipic acid by the native-occurring pathway in Thermobifida fusca B6;邓禹;《2015年中国化工学会年会论文集》;20151017 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106834200A (zh) 2017-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106834200B (zh) 一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法
KR20170020703A (ko) 전세포 촉매작용에 의해 1,5-펜탄다이아민을 생산하는 대장균 공정균 및 이의 응용
CN107916283B (zh) 一种烟酰胺的生产工艺
CN113564090B (zh) 一种用于产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用
CN109112090B (zh) 一种戊二酸的全生物合成的方法
CN108315289B (zh) 一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法
CN114277068B (zh) 一种r-3-羟基丁酸乙酯微生物发酵制备方法
CN108004275B (zh) 一种产己二酸的大肠杆菌重组菌及其应用
CN111394289A (zh) 一种基因工程菌及其应用，生产前列腺素e2的方法
CN115725520A (zh) 一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法
CN111690581B (zh) 利用重组大肠杆菌发酵生产冰核蛋白的方法
CN109370969B (zh) 一种重组克雷伯氏杆菌在制备1，3-丙二醇中的应用
CN111500479B (zh) 一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用
CN110951760B (zh) 一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用
CN113930376A (zh) 一种用于催化生产d-对羟基苯甘氨酸的工程菌、高密度培养方法及催化生产方法
Galindo et al. Improved production of large plasmid DNA by enzyme-controlled glucose release
CN114685629A (zh) 一种提高5-羟基色氨酸微生物转化浓度的方法
CN112779205A (zh) 一种利用微生物发酵生产l-脯氨酸的方法
CN110628800A (zh) 一种手性醇高效生产重组菌的构建方法及其应用
CN117946984B (zh) 泛酸合成酶突变体及其制备方法、构建体及其构建方法、泛酸生产菌株和应用及泛酸的制备方法
CN115011537B (zh) 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯l-乳酸的工程菌及其制备方法与应用
CN108949760A (zh) 一种复合启动子及其在提高肺炎克雷伯氏杆菌的3-羟基丙酸产量中的应用
CN117586356B (zh) 多肽及其用途
CN114276970B (zh) 一种产1,3-丙二醇的基因工程菌
CN113736813A (zh) 重组大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的载体和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant