CN115197887B - 一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法，属于生物工程领域。本发明以敲除了8‑氨基7‑酮壬酸合成酶(BioF)基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达了来自根瘤农杆菌的Ⅲ型3‑酮酰ACP合成酶(BioZ)、来自大肠杆菌3‑酮酰ACP还原酶(FabG)、3‑羟酰ACP脱水酶(FabA)、烯酰ACP还原酶(FabI)、乙酰辅酶A硫酯酶(′TesA)基因，成功合成了庚二酸。通过进一步优化外加戊二酸盐浓度的发酵优化，使得庚二酸的产量达到了21.7mg·L^‑1。为庚二酸的全生物合成提供了一条新路径，为实现庚二酸的全生物法合成的工业化提供了基础。

Description

一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法

技术领域

本发明涉及一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法，属于生物工程领域。

背景技术

庚二酸(Pimelic acid,Heptanedioic acid)是一种中长链二羧酸(七碳)。庚二酸在工业生产中的应用极为广泛，是制造二酯、聚酯和聚酰胺等的重要中间体，是合成润滑油、增塑剂、导热油、介电流体、燃料添加剂、漂白剂等的原料。同时，庚二酸还是合成生物素(辅酶R、维他命H)，一种重要的微量元素的前体物质。

目前庚二酸的化学合成方法主要包括氧化还酮法(利用硝酸氧化环庚酮)、利用丁二烯和丙稀晴合成、戊醇还原、利用钠裂解水杨酸制取等。但这些方法普遍具有工艺繁多、反应时间长、对环境负担重等缺点。近年来，随着代谢工程、合成生物学等领域的迅猛发展和社会对环境保护意识的增强，利用全生物法合成庚二酸收到了广泛的关注。

利用全生物合成庚二酸的方法目前主要有两种：第一种方法是通过过表达枯草芽孢杆菌中的BioI-orf2-orf3基因实现庚二酸的合成(Zhang,W.-W.,Yang,M.-M.,Li,H.-x.,and Wang,D.(2011)Construction of recombinant Bacillus subtilis strains forefficient pimelic acid synthesis.Electronic Journal of Biotechnology.14,1-1.)，但合成机理尚不明确；第二种方法是利用结合逆β-氧化的非脱羧型克雷森缩合反应，以戊二酰辅酶A和菌体内部产生的乙酰辅酶A作为前体物质，利用cat1、paaJ、paaH、paaF、tdTER基因合成庚二酸(Cheong,S.,Clomburg,J.M.,and Gonzalez,R.(2016)Energy-andcarbon-efficient synthesis of functionalized small molecules in bacteriausing non-decarboxylative Claisen condensation reactions.NatureBiotechnology.34,556-561.)。这两种方法虽然都成功合成了庚二酸，但其产量、产率和生产强度远未达到工业生产标准。在结合逆β-氧化的非脱羧型克雷森缩合反应中，PaaJ蛋白(Ⅱ型硫解酶)通过缩合庚二酰辅酶A和乙酰辅酶A生成3-酮基庚二酰ACP，构成七碳化合物骨架，再经后续的反应生成庚二酸。PaaJ蛋白来自大肠杆菌内源的苯乙酸降解途径，催化将乙酰辅酶A和丁二酰辅酶A缩合生成为3-酮基己二酰辅酶A的反应，并且已经有实验证明该蛋白对其他类型的底物的催化效果不好，有较强的底物特异性。因此，若是能找到一种能够特异性催化形成七碳化合物反应的酶，势必对庚二酸的生物合成有重大的帮助。

发明内容

在现有的研究中，报道了一种存在于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的BioZ蛋白，一种Ⅲ型3-酮基ACP合成酶，可以特异性催化将戊二酰辅酶A和丙二酰ACP缩合生成3-酮基庚二酰ACP的反应。因此，针对目前存在的问题，本发明以该基因为基础，结合逆β-氧化(部分脂肪酸合成途径基因)，设计了一条合成庚二酸的新代谢途径并且成功合成了庚二酸，分模块过表达了来自根瘤农杆菌的Ⅲ型3-酮酰ACP合成酶(BioZ)、来自大肠杆菌3-酮酰ACP还原酶(FabG)、3-羟酰ACP脱水酶(FabA)、烯酰ACP还原酶(FabI)、乙酰辅酶A硫酯酶(′TesA)，并敲除了基因bioF，通过进一步的发酵优化，显著提升了庚二酸的产量，为庚二酸的全生物合成进一步发展提供了新思路。

本发明提供了一种全生物合成庚二酸的方法，所述方法是利用基因工程菌发酵生产庚二酸；所述基因工程菌敲除了编码8-氨基7-酮壬酸合成酶的基因bioF，并分模块过表达了来自根瘤农杆菌的Ⅲ型3-酮基乙酰ACP合成酶(BioZ)、来自大肠杆菌3-酮基乙酰ACP还原酶(FabG)、3-羟基乙酰ACP水合酶(FabA)、烯酰ACP还原酶(FabI)、乙酰辅酶A硫酯酶(′TesA)

本发明的第一个目的是提供一种生产庚二酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为在大肠杆菌中敲除了编码8-氨基7-酮壬酸合成酶的基因bioF、过表达编码3-酮酰ACP还原酶(FabG)的基因，并表达编码来源于根瘤农杆菌的Ⅲ型3-酮酰ACP合成酶(BioZ)基因或是表达将所述Ⅲ型3-酮酰ACP合成酶(BioZ)第115位突变为丝氨酸的编码基因。

在一种实施方式中，还表达了编码3-羟酰ACP脱水酶的基因和编码烯酰ACP还原酶的基因，并同时再表达编码乙酰辅酶A硫酯酶的基因。

在一种实施方式中，利用质粒pRSFDuet-1表达所述编码Ⅲ型3-酮酰ACP合成酶的基因、编码3-酮ACP还原酶的基因、编码3-羟酰ACP脱水酶的基因和编码烯酰ACP还原酶的基因。

在一种实施方式中，利用质粒pCDFDuet-1表达所述编码乙酰辅酶A硫酯酶的基因。

在一种实施方式中，所述编码8-氨基7-酮壬酸合成酶的基因在KEGG中的基因号为ECD_00743。

在一种实施方式中，所述Ⅲ型3-酮酰ACP合成酶的NCBI登录号为AAK89424.2；所述3-酮酰ACP还原酶的NCBI登录号为WP_001008532；所述3-羟酰ACP脱水酶的NCBI登录号为BBS08210.1；所述烯酰ACP还原酶的NCBI登录号为WP_000506490.1；所述乙酰辅酶A硫酯酶的NCBI登录号为RDQ20295.1。

在一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

本发明的第二个目的是提供一种全细胞转化生产庚二酸的方法，所述方法是利用所述的重组大肠杆菌发酵生产庚二酸。

在一种实施方式中，将所述的重大肠杆菌的单菌落在LB培养基中培养得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中，培养至发酵培养基中OD₆₀₀为0.6-0.8时添加终浓度为1～5mM的IPTG诱导基因表达。

在一种实施方式中，将单菌落在35～40℃下培养得到种子液，并将种子液接种至发酵培养基中在35～40℃下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8；添加IPTG之后，在28～32℃下诱导基因的表达，培养72h。

在一种实施方式中，所述发酵培养基中含有3～5g·L^-1酵母粉、15～20g·L^-1胰蛋白胨、1～5g·L^-1NaCl、1～3g·L^-1MgCl₂·6H₂O、0.1～0.2g·L^-1KCl、1～4g·L^-1葡萄糖、10～50μg·mL^-1硫酸卡那霉素、10～50μg·mL^-1链霉素。

在一种实施方式中，所述发酵培养基中含有0～75mM的戊二酸。

优选地，所述发酵培养基中含有0～25mM的戊二酸；更优选地，戊二酸浓度为2～10mM。

本发明的第三个目的是提供一种构建所述基因工程菌的方法，包括以下步骤：

(1)以质粒pRSFDuet-1为骨架载体，连接基因片段bioZ、fabG，得到重组质粒pRSF-bioZ-fabG；

(2)以质粒pRSF-bioZ-fabG为骨架载体，连接基因片段fabA、fabI，得到重组质粒pRSF-bioZ-fabGAI；

(3)以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段′tesA，得到重组质粒pCDF-′tesA；

(4)将质粒pRSF-bioZ-fabG、pRSF-bioZ-fabGAI和pCDF-′tesA转入敲除bioF基因的大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌ZG、ZGAI和ZGAI-′tesA

在一种实施方式中，设计线性化引物后以pRSFDuet-1为模板通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段，再胶回收得到线性化载体后，通过同源重组的方法连接基因片段bioZ、fabG、fabA、fabI，得到重组质粒pRSF-bioZ-fabGAI

在一种实施方式中，设计线性化引物后以pCDFDuet-1为模板通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段，再胶回收得到线性化载体后，通过同源重组的方法连接基因片段′tesA，得到重组质粒pCDF-′tesA。

本发明的第四个目的是提供所述重组大肠杆菌在生产庚二酸、庚二酸的衍生物、含有庚二酸的产品或是含有庚二酸的衍生物的产品中的应用。

本发明的有益效果：本发明利用结合逆β-氧化的非脱羧型克雷森缩合反应，过表达特异性催化戊二酰辅酶A与丙二酰ACP缩合反应生成3-酮基庚二酰ACP的来自于根瘤农杆菌的bioZ基因以及其他几个源自大肠杆菌的基因合成庚二酸，相较于传统的合成步骤，机理较为清晰且特异性强，为后续的深入研究提供了基础。同时，优化了生物法合成庚二酸的工艺，确定了添加底物(戊二酸)的最优浓度，显著提升了庚二酸产量，达到了21.7mg·L^-1，为庚二酸的全生物合成提供了新的思路，同时，对于其衍生物的全生物合成也提供了较为坚实的基础。

附图说明

图1为利用克雷森缩合反应(结合逆β氧化)的庚二酸合成途径。

图2为大肠杆菌BL21(DE3)敲除8-氨基7-酮壬酸合成酶(BioF)基因的菌落PCR验证图谱；F：BL21ΔbioF(750bp)；NC：阴性对照(1905bp)。

图3为质粒pRSF-bioZ-fabG、pRSF-bioZ-fabGAI、pCDF-′tesA图谱。

图4为含不同质粒组合的BL21ΔbioF摇瓶发酵产庚二酸的产量以及OD₆₀₀，误差线表示三个平行实验的标准误差。

图5为ZG菌株庚二酸液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测结果。

图6为不同戊二酸浓度外加情况下，ZG、ZGAI菌株发酵过程中庚二酸的产量与OD₆₀₀，误差线表示三个平行实验的标准误差。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体说明。

如无特殊说明，以下实施例所涉及各原料和试剂均为国产或进口分析纯商品，涉及实验方法均为本领域常规方法。

表1下述实施例设计的引物序列表

实施例1：大肠杆菌BL21(DE3)中8-氨基7-酮壬酸合成酶(BioF)基因的敲除

大肠杆菌中的BioF在KEGG网站上的基因号为ECD_00743。

利用CRISPR/Cas9技术，根据KEGG网站上公布的目的基因的核苷酸序列设计引物，敲除bioF基因。

pTarget质粒的制备：敲除bioF基因的sgRNA为CTGGCAGGATAAAATCAACG，本实施例中通过全质粒PCR替换原有质粒的sgRNA序列。首先以pTarget-F及pTarget-R为引物，以pTarget F质粒为模板，通过全质粒PCR扩增敲除bioF基因的线性化pTarget。利用DpnI消除扩增产物中的模板质粒，随后转入JM109感受态细胞中，待长出转化子后测序验证，取测序正确的菌株提取质粒。

上下游同源臂片段的获得：以bioFup500-F、bioFup500-R和bioFdown500-F、bioFdown500-R为两对引物，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，通过PCR反应分别扩增出大小为534bp的DNA片段，该片段分别与bioF基因的上游和下游的534bp为同源序列，对扩增的DNA片段进行凝胶回收纯化，通过融合PCR将纯化的上下游片段连接成大小为1000bp的同源臂片段并进行回收纯化。

bioF基因的敲除：制作大肠杆菌BL21(DE3)电转感受态细胞。首先将pCas质粒导入感受态中，挑取转化子进行验证。将验证正确的转化子接种液体LB培养基中再次制作电转感受态细胞(LB培养基中加入终浓度为20mM的阿拉伯糖诱导蛋白表达)。将pTarget质粒以及同源臂片段以1:4的摩尔比转入感受态中，以yzbioF-F和yzbioF-R为引物，挑取转化子进行菌落PCR验证。选取具有单一条带且大小为750bp的单菌落，即为正确的敲除株(图2)。

敲除菌株pTarget以及pCas质粒的消除：将敲除成功的菌株接种于LB培养基中于30℃培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导，随后将菌液接种于含有壮观霉素的LB培养基中培养，若菌株不能耐受壮观霉素而死亡则说明pTarget质粒已消除；将已消除pTarget质粒的菌株接种于含有硫酸卡那霉素的LB培养基中培养，若菌株不生长，则说明pCas质粒已消除，将已消除质粒的菌株命名为BL21ΔbioF(简称F菌株)。

实施例2：重组质粒的构建

Ⅲ型3-酮酰ACP合成酶(BioZ)的NCBI登录号为AAK89424.2，3-酮酰ACP还原酶(FabG)的NCBI登录号为WP_001008532，3-羟酰ACP脱水酶(FabA)的NCBI登录号为BBS08210.1，烯酰ACP还原酶(FabI)的NCBI登录号为WP_000506490.1，乙酰辅酶A硫酯酶(′TesA)的NCBI登录号为RDQ20295.1。

以XXHpRSF-F与XXHpRSF-R为引物，pRSFDuet-1质粒为模板，PCR扩增得到3829bp的线性化片段，进行胶回收纯化后放置于-20℃冰箱备用，以进行下一步的质粒构建；以bioZ-F和bioZ-R为引物，以带有合成的bioZ基因的质粒为模板，PCR扩增得到带有同源臂的大小为1022bp的片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，进行胶回收纯化后放置于-20℃冰箱备用；以fabG-F和fabG-R为引物，以BL21(DE3)基因组为模板，PCR扩增得到带有同源臂的大小为770bp的片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，进行胶回收纯化后放置于-20℃冰箱备用。以pRSF线性化片段为载体，bioZ和fabG基因的胶回收片段为插入片段，利用诺唯赞C115一步克隆试剂盒，以载体0.03pmol，每个插入片段0.03pmol的用量于50℃下进行质粒构建得到重组质粒。将重组质粒利用化学转化转入大肠杆菌JM109感受态细胞中于37℃培养12-16h，挑取转化子进行菌落PCR验证，将正确的PCR产物送测序，并将测序正确的质粒命名为pRSF-bioZ-fabG。

以XXHpRSF-F1和XXHpRSF-R1为引物，pRSF-bioZ-fabG为模板，PCR扩增出5571bp的线性化片段并进行胶回收纯化，放置于-20℃冰箱备用；以fabA-F和fabA-R为引物，以BL21(DE3)基因组为模板，PCR扩增得到带有同源臂的大小为554bp的片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)，进行胶回收纯化后放置于-20℃冰箱备用；以fabI-F和fabI-R为引物，以BL21(DE3)基因组为模板，PCR扩增得到带有同源臂的大小为824bp的片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示)，进行胶回收纯化后放置于-20℃冰箱备用。以pRSF-bioZ-fabG的线性化片段为载体，bioZ和fabG基因的胶回收片段为插入片段，利用诺唯赞C115一步克隆试剂盒，以载体0.03pmol，每个插入片段0.03pmol的用量于50℃下进行同源重组。将连接产物转入JM109感受态细胞中于37℃培养12-16h，挑取转化子进行菌落PCR验证，将正确的PCR产物送测序，将测序正确的质粒命名为pRSF-bioZ-fabGAI。

用相同的方法构建其他质粒，最终′tesA片段(584bp)连接到pCDFDuet-1得到重组质粒pCDF-′tesA(图3)。

本发明使用的BioZ蛋白源自α-变形杆菌—根癌农杆菌，因而在大肠杆菌中的表达较差(常表达为包涵体)，故将BioZ蛋白的115位的半胱氨酸突变为丝氨酸以提升该蛋白在大肠杆菌中的溶解性。故将质粒pRSF-bioZ-fabG、pRSF-bioZ-fabGAI上BioZ的115位的半胱氨酸突变为丝氨酸后得到了质粒pRSF-bioZ_C115S-fabG、pRSF-bioZ_C115S-fabGAI

实施例3：庚二酸生产菌株的构建

以BioZ催化的克莱森缩合反应为基础，将上述实施例2构建完成的质粒pRSF-bioZ-fabG、pRSF-bioZ-fabGAI、pCDF-′tesA、pRSF-bioZ_C115S-fabG、pRSF-bioZ_C115S-fabGAI分别进行组合，转入菌株F中，具体操作如下：如表2所示，通过化学转化将对应的质粒转入实施例1中构建得到的F菌株中，最终得到ZG、ZGAI、ZG-′tesA和ZGAI-′tesA、ZSG、ZSGAI、ZSG-′tesA、ZSGAI-′tesA共8个菌株(表2)，以转入pRSF-bioZ-fabG质粒的大肠杆菌BL21(DE3)作为对照，验证敲基因的影响及途径的可行性。

表2发酵菌株特性

注：“√”对应质粒为该菌株所携带的质粒

实施例4：重组大肠杆菌的摇瓶发酵及结果分析

摇瓶发酵体系50ml。

发酵培养基：

SOB培养基：5g·L^-1酵母粉，20g·L^-1胰蛋白胨，5g·L^-1NaCl，2.03g·L^-1MgCl₂·6H₂O，0.186g·L^-1KCl，4g·L^-1葡萄糖，50μg·mL^-1硫酸卡那霉素，50μg·mL^-1链霉素。

种子液制备：于-80℃冰箱中利用30％甘油保藏的菌株在双抗(含有硫酸卡那霉素和链霉素)平板上划线于37℃培养12-16h，挑取单菌落接种于50ml LB液体培养基中，37℃、250rpm·min^-1培养12-16h。

发酵条件：将种子液按2％的接种量，接种于发酵培养基中，37℃、250rpm·min^-1培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加1mM IPTG诱导各基因表达，并同时将发酵温度降为30℃培养72h。

结果分析：发酵过程中每12h取一次样(1000μL)，将样品于13500rpm·min^-1下离心5min后，将菌体从发酵液分离，并利用0.22μm水系滤膜再次处理发酵液后，进行HPLC(高效液相色谱)检测，流动相为5mM稀H₂SO₄，柱温35℃，紫外检测器波长设置为218nm。

结果如图所示，与菌株ZG相比，含有pRSF-bioZ-fabG质粒的对照菌株BL21(DE3)产生了较少的庚二酸(5mg·L^-1)，证实了阻断下游代谢途径(即敲除bioF基因)对于菌株产庚二酸的积极作用。在所有得到的菌株发酵结果中，菌株ZGAI、ZG的产量最高，达到了18.9、17.4mg·L^-1(图4)。

实施例5：重组大肠杆菌的摇瓶发酵优化及结果分析

因重组菌是将戊二酸转化为庚二酸，故本实施例对外加戊二酸浓度优化，来进一步提升庚二酸的产量。利用ZGAI和ZG两个菌株来发酵生产庚二酸。

发酵培养基：SOB培养基，成分为5g·L^-1酵母粉，20g·L^-1胰蛋白胨，5g·L^-1NaCl，2.03g·L^-1MgCl₂·6H₂O，0.186g·L^-1KCl，4g·L^-1葡萄糖，50μg·mL^-1硫酸卡那霉素，50μg·mL^-1链霉素；同时向培养基中外加不同浓度(0-75mM)的戊二酸盐。

发酵条件：将种子液按2％的接种量，接种于发酵培养基中，37℃、250rpm·min^-1培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加1mM IPTG诱导各基因表达，并同时将发酵温度降为30℃培养72h。

发酵结果：结果如图6所示，在外加戊二酸浓度为10mM时，庚二酸产量最高，ZGAI和ZG分别达到了21.7mg·L^-1，21.4mg·L^-1。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种利用克雷森缩合反应生产庚二酸的全生物合成法

<130> BAA220220A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列

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ccggctcgtt gcgttcgtaa cgctgaaatc gaaacccgtc tgggtctgga agctggttgg 120

atcgaacgtc gtaccggtat ccgtacccgt tactgggctc aggaagacga aaccctgtct 180

ggtctggctg aaaaagctgg tcgtatggct ctggaaaacg ctaaaatcgg tgctaaagac 240

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tctggtttcc tgtacgctct gaccctggct gacggtttcg ttcgtaccca cggtcgtgct 420

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ctctggcggc ttccggtatc aaagacttcc gcaaaatgct ggctcattgc gaagccgtta 660

ccccgattcg ccgtaccgtt actattgaag atgtgggtaa ctctgcggca ttcctgtgct 720

ccgatctctc tgccggtatc tccggtgaag tagtccacgt tgacggcggt ttcagcatcg 780

ctgcaatgaa cgaactcgaa ctgaaataac aattggatat cggc 824

<210> 5

<211> 584

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagatatac catggatggc ggacacgtta ttgattctgg gtgatagcct gagcgccggg 60

tatcgaatgt ctgccagcgc ggcctggcct gccttgttga atgataagtg gcagagtaaa 120

acgtcggtag ttaatgccag catcagcggc gacacctcgc aacaaggact ggcgcgcctt 180

ccggctctgc tgaaacagca tcagccgcgt tgggtgctgg ttgaactggg cggcaatgac 240

ggtttgcgtg gttttcagcc acagcaaacc gagcaaacgc tgcgccagat tttgcaggat 300

gtcaaagccg ccaacgctga accattgtta atgcaaatac gtctgcctgc aaactatggt 360

cgccgttata atgaagcctt tagcgccatt taccccaaac tcgccaaaga gtttgatgtt 420

ccgctgctgc ccttttttat ggaagaggtc tacctcaagc cacaatggat gcaggatgac 480

ggtattcatc ccaaccgcga cgcccagccg tttattgccg actggatggc gaagcagttg 540

cagcctttag taaatcatga ctcataagca gcagccatca ccat 584

Claims (8)

1.一种生产庚二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，以敲除了编码8氨基7酮壬酸合成酶的基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，通过过表达编码3-酮酰ACP还原酶的基因，并表达编码来源于根瘤农杆菌的Ⅲ型3-酮酰ACP合成酶基因获得，所述编码8-氨基7-酮壬酸合成酶的基因在KEGG中的基因号为ECD_00743，所述3-酮酰ACP还原酶的NCBI登录号为WP_001008532，所述Ⅲ型3-酮酰ACP合成酶的NCBI登录号为AAK89424.2。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还表达了3-羟酰ACP脱水酶的编码基因和烯酰ACP还原酶的编码基因，所述3-羟酰ACP脱水酶的NCBI登录号为BBS08210.1，所述烯酰ACP还原酶的NCBI登录号为WP_000506490.1。

3.一种全细胞转化生产庚二酸的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的重组大肠杆菌发酵生产庚二酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组大肠杆菌的单菌落在LB培养基中培养得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中，培养至发酵培养基中OD₆₀₀为0.6-0.8时添加终浓度为1mM的IPTG诱导基因表达。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将单菌落在35～40℃下培养得到种子液，并将种子液接种至发酵培养基中在35～40℃下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8；添加IPTG之后，在28～32℃下诱导基因的表达。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有1～5g·L^-1酵母粉、5～20g·L^-1胰蛋白胨、1～5g·L^-1NaCl、1～3g·L^-1MgCl₂·6H₂O、0.1～0.2g·L^-1KCl、1～4g·L^-1葡萄糖、10～50μg·mL^-1硫酸卡那霉素、10～50μg·mL^-1链霉素。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有0～75mM的戊二酸。

8.权利要求1或2所述的重组大肠杆菌在生产庚二酸或含有庚二酸的产品中的应用。