CN109112090A - 一种戊二酸的全生物合成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种戊二酸的全生物合成的方法，属于生物工程领域。本发明是大肠杆菌为宿主，分模块过量表达β‑酮硫解酶基因、3‑羟酰基‑辅酶A脱氢酶基因、3‑羟基己二酰脱氢酶基因、5‑羧基‑2‑戊烯酰辅酶A还原酶基因、己二酰辅酶A，戊二酸的产量可达到3.61g/L。此重组菌发现了一种在大肠杆菌中全生物合成戊二酸的新方法，并且提供了一种新的检测戊二酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种戊二酸的全生物合成的方法，属于生物工程领域。
背景技术
戊二酸(Glutaric acid，1,3-Propanedicarboxylic acid；1,5-Pentanedioicacid；Pentanedioic acid；Pentanedioate)又称胶酸，a,γ-丙烷二羧酸，1,3-丙二羧酸，是一种重要的有机化工原料和中间体，它和它的衍生物在化学、医药、建筑、农业等方面都有着广泛而重要的用途。
目前戊二酸的工业生产主要是从生产己二酸的副产物中回收戊二酸，但此方法依赖于己二酸的生产，产量无法保证。戊二酸的实验室制备方法也主要采用毒性大、成本高的强氧化剂多步氧化法，这些方法路线复杂，原料不易获得，价格偏高，限制了大规模推广。以环戊烯为原料、以含钨化合物为催化剂、环境友好的双氧水为氧化剂的戊二酸合成路线，反应条件温和，清洁无毒，原料来源广泛，戊二酸得率较高，开辟了一条全新的戊二酸合成路线，尤其是为其工业化生产提供了可能性。目前关于这方面的研究还较少。Noyori等虽然报道过一种广泛适用于环烯烃氧化制备二元羧酸的方法，但由于使用昂贵的无商业生产的甲基三辛基硫酸氢铵作相转移催化剂，没有工业应用的前景。
为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成戊二酸的道路上，且做了大量的基础工作。如图9A、图9B表示，目前报道的生物合成戊二酸的方法主要有两种方法：一种以L-赖氨酸为底物合成戊二酸，主要在重组大肠杆菌WL3110中过量表达恶臭假单胞菌的davA，davB，gabT，gabD基因，最终利用20g/L葡萄糖、10g/L赖氨酸、10g/L a-酮戊二酸生产了1.7g/L戊二酸，该方法需要外源添加L-赖氨酸，成本比较高；另一种方法则是在大肠杆菌BW25113中以葡萄糖为碳源，仍过量表达恶臭假单胞菌的davA，davB，gabT，gabD基因，最终产生0.85g/L戊二酸，此方法虽不需要外源添加L-赖氨酸，但是产量低，不适用于大规模生产。
发明内容
针对上述问题，本发明首先提供了一种产戊二酸的重组大肠杆菌，是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自褐色喜热裂孢菌的异源基因β-酮硫解酶基因(Tfu_0875)，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因(Tfu_2399)，3-羟基己二酰脱氢酶基因(Tfu_0068)，5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因(Tfu_1648)，己二酰辅酶A合成酶(Tfu_2576，Tfu_2577)；其中，基因Tfu_0875、Tfu_2399以pRSFDuet-1为表达载体；基因Tfu_0068、Tfu_1648以pTrc99a为表达载体；基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1为表达载体。
本发明还提供一种构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)以质粒pRSFDuet-1为骨架载体，连接基因片段Tfu_0875、Tfu_2399，得到重组质粒pAD-1；
(2)以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段Tfu_0068、Tfu_1648，得到重组质粒pAD-4；
(3)以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段Tfu_2576、Tfu_2577，得到重组质粒pAD-6；
(4)将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)将基因片段Tfu_0875及质粒pRSFDuet-1都用EcoR I和HindIII双酶酶切处理后，以T4DNA连接酶连接得到重组质粒pRSF-Tfu_0875；将Tfu_2399及重组质粒pRSF-Tfu_0875都用BglII和Kpn I双酶切处理，再用T4DNA连接酶连接，得到连接了基因片段Tfu_0875、Tfu_2399的重组质粒即pAD-1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)，基因片段Tfu_0068、Tfu_1648通过NcoⅠ、HindⅢ连接到质粒pTrc99a上形成pAD-4质粒。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)，基因片段Tfu_2576、Tfu_2577通过NcoⅠ、HindⅢ连接到质粒pCDFDuet-1上形成pAD-6质粒。
本发明的第三个目的在于提供一种应用所述重组大肠杆菌发酵生产己二酸的方法，是以SOB培养基为发酵培养基，将重组大肠杆菌于35～37℃培养至OD600为0.6-0.8时加1mM IPTG并降温至30℃诱导培养48小时。
在本发明的一种实施方式中，当发酵结束时放于-80度冰箱冷冻5小时后利用冷冻干燥进行干燥直至干燥结束。
在本发明的一种实施方式中，所述SOB培养基的成分为2g/100ml胰蛋白胨、0.5g/100ml酵母粉、0.05g/100ml NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、0.8g/100ml葡萄糖、50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml链霉素。
在本发明的一种实施方式中，以2％的接种量，将重组大肠杆菌接种至装有50mlSOB培养基中，搅拌转速200rpm，发酵温度37℃，培养至OD600为0.6-0.8时加1mM IPTG，降温至30℃诱导；待当发酵结束时放于-80度冰箱冷冻5小时后，利用冷冻干燥仪器进行干燥直至干燥结束。
在本发明的一种实施方式中，种子液的制备方法是将甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。次日取1ml菌液转接于50ml LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD600达到0.6-0.8时，转接种于50ml SOB发酵培养基中。
本发明的优点在于：与化学法相比，大肠杆菌全生物法合成戊二酸，首先产品的回收只需利用乙酸乙酯萃取，方便简单，而且极大程度地降低了对环境的污染程度。与前期已报道的生物法合成戊二酸相比，本发明中所提到途径，不需要利用L-赖氨酸作为前提，更不需要外源表达恶臭假单胞菌的davA，davB，gabT，gabD基因，仅仅过量表达来自褐色喜热裂孢菌的6个基因就可以利用葡萄糖合成戊二酸，方法简单，发酵工艺成熟使大肠杆菌BL21(DE3)高产戊二酸成为可能，而且此方法操作方便，成本低。
附图说明
图1为戊二酸合成途径。
图2为pAD-1质粒图谱。
图3为pAD-4质粒图谱。
图4为pAD-6质粒图谱。
图5为pRSF-Tfu_0875质粒酶切验证图谱，1：Marker，2：EcoR I/Hind III双酶切pRSF-Tfu_0875质粒，3：EcoR I/Hind III双酶切pRSFDuet-1质粒。
图6为pAD-1质粒菌落pcr验证图谱，1：Marker，2-5：均为pAD-1菌落pcr验证Tfu_2399。
图7为戊二酸气相质谱检测图谱。
图8为在SOB培养基，IPTG 1mM时重组大肠杆菌发酵结果图谱。
图9现有基因工程菌生产戊二酸的途径。
具体实施方式
表1下述实施例涉及的引物序列表
实施例1：重组质粒pAD-1构建及重组大肠杆菌的获得。
Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648、Tfu_2576、Tfu_2577的序列记载在NCBI中。
EcoR I和HindIII双酶切质粒pRSFDuet-1，切胶回收目的基因片段(3798bp)，用同样的酶酶切质粒pUC57-Tfu_0875，切胶回收得到目的基因片段Tfu_0875，然后将两个目的片段用T4DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pRSF-Tfu_0875。Bgl II和Kpn I酶切质粒pRSF-Tfu_0875，切胶回收4936bp的目的基因片段，用同样的酶酶切质粒pUC57-Tfu_2399，切胶回收目的基因片段，然后将两个目的片段用T4DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pAD-1。
其他质粒使用同样的方法进行构建，最终片段Tfu_0068、Tfu_1648通过NcoⅠ、HindⅢ连接到质粒pTrc99a上形成pAD-4质粒；Tfu_2576、Tfu_2577通过NcoⅠ、HindⅢ连接到质粒pCDFDuet-1上形成pAD-6质粒。
将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入BL21(DE3)制备重组大肠杆菌。
实施例2：重组大肠杆菌的摇瓶发酵及结果分析。
发酵培养基：
SOB培养基，成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mMMgCl2+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素。
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。
发酵条件：2％接种量(1ml)，接种于摇瓶发酵培养基中，使其初始OD600为0.1。37℃、250r/min培养至OD600分别为0.6时加入1.0mM IPTG诱导重组菌，改为30℃、250rpm/min培养。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10,000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm。最终发酵戊二酸产量为3.61g/L。
实施例3：戊二酸气相质谱检测及结果分析。
发酵样品先于-80℃冰箱冷冻2-3小时确保完全结冻后放于冷冻干燥机中冷冻干燥2天直至完全干燥为止。取出完全干燥的样品，加3ml蒸馏水，超声溶解不容物。完全溶解后加3ml的乙酸乙酯萃取2min，静置分层后将乙酸乙酯层移入另一玻璃反应试管，若乳化现象严重，不能分层，可移入玻璃离心管，以10,000r/min离心2min；下层继续用5ml乙酸乙酯重复萃取两次，收集所有的乙酸乙酯层，在30℃下氮气吹干。向吹干提取物的反应管中加入0.5ml乙腈，超声溶解，再加入硅烷化试剂(BSTFA:TMCS＝99:1)0.5ml，盖紧塞子于涡旋混合器上混匀，于30℃反应2-3小时，反应结束后在30℃下氮气吹干。吹干后加入正己烷复溶，供气相质谱检测。
气相质谱条件：载体：高纯氮气(99.999％)，流速为1ml/min；辅助气：氢气流速为30ml/min；空气流速为400ml/min；氮气尾吹：30ml/min；进样口温度：250℃；柱温：恒温210℃，检测器温度：250℃；进样体积：1μL；分流进样：分流比：50:1。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种戊二酸的全生物合成的方法
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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Claims (10)
1.一种产戊二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，是以大肠杆菌为宿主，分模块过量表达β-酮硫解酶基因，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因，3-羟基己二酰脱氢酶基因，5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因，己二酰辅酶A合成酶基因。
2.根据权利要求1所述的一种产戊二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，编码β-酮硫解酶的基因Tfu_0875、编码3-羟酰基-辅酶A脱氢酶的基因Tfu_2399、编码3-羟基己二酰脱氢酶的基因Tfu_0068、编码5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶的基因Tfu_1648、编码己二酰辅酶A合成酶的基因Tfu_2576及Tfu_2577来自褐色喜热裂孢菌；其中，基因Tfu_0875、Tfu_2399以pRSFDuet-1为表达载体；基因Tfu_0068、Tfu_1648以pTrc99a为表达载体；基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1为表达载体。
3.一种构建权利要求2所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以质粒pRSFDuet-1为骨架载体，连接基因片段Tfu_0875、Tfu_2399，得到重组质粒pAD-1；
(2)以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段Tfu_0068、Tfu_1648，得到重组质粒pAD-4；
(3)以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段Tfu_2576、Tfu_2577，得到重组质粒pAD-6；
(4)将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)将基因片段Tfu_0875及质粒pRSFDuet-1都用EcoR I和Hind III双酶酶切处理后，以T4 DNA连接酶连接得到重组质粒pRSF-Tfu_0875；将Tfu_2399及重组质粒pRSF-Tfu_0875都用Bgl II和Kpn I双酶切处理，再用T4 DNA连接酶连接，得到连接了基因片段Tfu_0875、Tfu_2399的重组质粒即pAD-1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)，基因片段Tfu_0068、Tfu_1648通过Nco Ⅰ、Hind Ⅲ连接到质粒pTrc99a上形成pAD-4质粒。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)，基因片段Tfu_2576、Tfu_2577通过Nco Ⅰ、Hind Ⅲ连接到质粒pCDFDuet-1上形成pAD-6质粒。
7.一种应用权利要求1或2所述重组大肠杆菌发酵生产戊二酸的方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以SOB培养基为发酵培养基，将重组大肠杆菌于35～37℃培养至OD600为0.6-0.8时加IPTG并降温诱导培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵结束后，将发酵液冷冻，利用冷冻干燥进行干燥直至干燥结束。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以2％的接种量，将重组大肠杆菌接种至SOB培养基中，搅拌转速180～200rpm，发酵温度36～37℃，培养至OD600为0.6-0.8时加IPTG，降温至28～30℃诱导；发酵结束后，于-80度冷冻，然后利用冷冻干燥进行干燥直至干燥结束。
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