CN106191169B - 一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵工程领域,涉及一种提高N‑乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法。通过在N‑乙酰氨基葡萄糖发酵过程中向发酵液中流加甜菜碱溶液,刺激细胞呼吸,提高菌种的氧消耗速率,提高N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵产量和转化率。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域,特别涉及一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法。
背景技术
氨基葡萄糖的用途十分广泛,主要应用于食品、医疗、化妆品、农牧业等领域。目前,氨基葡萄糖最多的被用于关节炎的预防和治疗。氨基葡萄糖是结缔组织与软骨细胞的主要成分,如果关节发生病变,补充氨基葡萄糖可以修补受损的软骨,增加关节间的润滑。
现在,我国氨基葡萄糖的生产大多以壳聚糖为原料生产,但是存在原料来源不稳定,一些人群存在过敏反应等缺点。虽然微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖,(在含有N-乙酰氨基葡萄糖的发酵液中,加入0.1mol/L的盐酸,100℃下反应3h,可以把90%以上的N-乙酰氨基葡萄糖转化为氨基葡萄糖。)可以克服以上缺点,但微生物发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖存在产量低、转化率低和副产物乙酸、谷氨酸含量高的现象,因此,需要开发一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵新工艺,以提高N-乙酰氨基葡萄糖的发酵产量和转化率,同时降低发酵副产物乙酸、谷氨酸的含量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处,提供一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法,在N-乙酰氨基葡萄糖发酵过程中,向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加甜菜碱溶液。
优选地,所述流加甜菜碱溶液的质量浓度为5%-15%,进一步优选为10%(m/m,即质量/质量,下同)。
优选地,所述流加甜菜碱溶液的速率为0.1-0.8g/L·h,进一步优选为0.2-0.5g/L·h。
上述流加速率的含义是每1L N-乙酰氨基葡萄糖发酵液每1h流加0.1-0.8g的甜菜碱溶液(例如质量浓度10%(m/m))的甜菜碱溶液的速率为0.1-0.8g/L·h。
优选地,当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中OD660nm=28-33(优选OD660nm=30-32)时,向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加甜菜碱溶液。
进一步优选地,在流加甜菜碱溶液前先加IPTG(即异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导;具体地,当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中OD660nm=28-33(优选OD660nm=30-32)时,先向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中加入IPTG,再流加甜菜碱溶液。
优选地,所述IPTG的添加量为0.03mM-0.10mM;进一步优选为0.05mM-0.08mM。
优选地,添加IPTG进行诱导是时控制N-乙酰氨基葡萄糖发酵液的温度为33-35℃。
为进一步提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量,上述发酵方法中还包括在发酵过程中,当发酵液的残糖含量降至0.5g/L以下时,按照5-8g/L·h的流加速率向发酵液中流加葡萄糖溶液,同时向发酵液中流加尿素溶液。流加尿素时,葡萄糖仍同时流加。进一步地,所述尿素溶液的流加速率与葡萄糖溶液的流加速率之比为1:10。
进一步地,所述葡萄糖溶液的质量浓度50%-60%,优选为55%。
进一步地,所述尿素溶液的质量浓度15%-20%,优选为15%。
具体的,上述提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法包括以下步骤:
(1)种子培养
配制种子培养基,用浓度为25%(m/m)的氨水调种子培养基pH值至6.8-7.3,向种子培养基中通饱和蒸汽至121℃,保温30min;设定种子培养条件:温度37℃,罐压0.05mPa,通风比1:0.5,转速300rpm,pH值6.8-7.3;接入产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养,当种子培养基中OD660nm=3.5-5范围区间时,作为种子成熟标准;
进一步地,所述种子培养基为:葡萄糖15g/L(单消),磷酸氢二钾11g/L,磷酸二氢钾16g/L,酵母浸粉1g/L,苏氨酸0.2g/L,蛋氨酸0.15g/L,硫酸镁0.5g/L,硫酸铵5g/L,硫酸锰0.013mg/L,硫酸铁0.024mg/L,硫酸锌0.047mg/L,氯化钴0.01mg/L。
(2)发酵培养
配制发酵培养基,121℃灭菌30min;降温后设定发酵培养条件:温度37℃,罐压0.03-0.05mPa,通风比1:0.5-1:1,转速300-500rpm,pH值6.9-7.0(可在发酵全程用25%(m/m)氨水调控);将成熟的N-乙酰氨基葡萄糖种子液按照10%(V/V)接种量接种到发酵罐进行培养,发酵过程中通过调节罐压、风量、转速控制溶氧30-40%;
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵培养过程中发酵液残糖降至0.5g/L以下时,按照6g/L·h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加55%(m/m)葡萄糖溶液;同时按照0.6g/L·h的流加速率向发酵液中流加15%(m/m)尿素溶液。
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm=30-32区间时,降温至33-35℃,同时一次性加入0.05mM-0.08mM IPTG进行诱导,再按照0.2-0.5g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10%(m/m)甜菜碱溶液。
本发明根据发酵后期不产N-乙酰氨基葡萄糖或者产N-乙酰氨基葡萄糖较慢来判断发酵终点,培养52-56小时可以达到发酵终点,优选培养54小时。
进一步,所述发酵培养基为:葡萄糖5g/L(单消),磷酸氢二钾16g/L,磷酸二氢钾10g/L,酵母浸粉0.3g/L,酵母膏0.1g/L,苏氨酸0.1g/L,蛋氨酸0.15g/L,硫酸镁0.25g/L,硫酸铵3g/L,氯化钾0.1g/L,硫酸锰0.015mg/L,硫酸铁0.35mg/L,硫酸锌0.41mg/L,氯化钴0.02mg/L。
本发明所述OD660nm是指在波长660nm可见光下测定的发酵液的吸光值。
本发明所述种子培养基、发酵培养基的溶剂均为水。
本发明提供的提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法能够刺激细胞呼吸,提高菌种的氧消耗速率,显著提高发酵终点N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
在下述实施例和对比例中:
OD值测定:采用7230G可见分光光度计,在波长660nm可见光下测定吸光值。
按照GB/T5009.7-2008的方法测定还原糖的浓度。
N-乙酰氨基葡萄糖含量测定:高效液相色谱法。
乙酸含量测定:高效液相色谱法。
谷氨酸含量测定:取发酵液离心后的上清液,稀释到残谷氨酸浓度在1g/L以内,用生物传感分析仪测定。
转化率(%)=N-乙酰氨基葡萄糖量/总耗糖量×100%。
实施例1
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法,包括以下步骤:
(1)种子培养
配制种子培养基:葡萄糖15g/L,磷酸氢二钾11g/L,磷酸二氢钾16g/L,酵母浸粉1g/L,苏氨酸0.2g/L,蛋氨酸0.15g/L,硫酸镁0.5g/L,硫酸铵5g/L,硫酸锰0.013mg/L,硫酸铁0.024mg/L,硫酸锌0.047mg/L,氯化钴0.01mg/L。
投入到50L发酵罐中,用浓度为25%(m/m)的氨水调种子培养基pH值至7.3,向种子培养基中通饱和蒸汽至121℃,保温30min;设定种子培养条件:温度37℃,罐压0.05mpa,通风比1:0.5,转速300rpm,pH值6.8-7.3。接入产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养,当种子OD660nm=3.5-5范围区间时,作为种子成熟标准。
(2)发酵培养
配制发酵培养基:葡萄糖5g/L(单消),磷酸氢二钾16g/L,磷酸二氢钾10g/L,酵母浸粉0.3g/L,酵母膏0.1g/L,苏氨酸0.1g/L,蛋氨酸0.15g/L,硫酸镁0.25g/L,硫酸铵3g/L,氯化钾0.1g/L,硫酸锰0.015mg/L,硫酸铁0.35mg/L,硫酸锌0.41mg/L,氯化钴0.02mg/L。
投入到50L发酵罐中,121℃,灭菌30min,降温后设定发酵培养条件:温度37℃,罐压0.03-0.05mpa,通风比1:0.5-1:1,转速300-500rpm,发酵全程用25%(m/m)氨水自控pH值为7.0。将成熟的N-乙酰氨基葡萄糖种子液按照10%(V/V)接种量接种到发酵罐进行培养,发酵过程中通过调节罐压、风量、转速控制溶氧30-40%。
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵培养过程中残糖降至0.5g/L以下时,按照6g/L·h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加55%(m/m)葡萄糖溶液;同时按照0.6g/L·h的流加速率向发酵液中流加15%(m/m)尿素溶液。
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm=30-32区间时,降温至33℃,同时一次性加入0.05mM IPTG进行诱导,此时按照0.2g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10%(m/m)甜菜碱溶液。
根据发酵后期不产N-乙酰氨基葡萄糖或者产N-乙酰氨基葡萄糖较慢来判断发酵终点,发酵培养周期54小时,N-乙酰氨基葡萄糖含量为107g/L,转化率为38.3%,乙酸含量为3.9g/L,谷氨酸含量为5.7g/L。
实施例2
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法,与实施例1的区别仅在于:当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm=30-32区间时,降温至34℃,同时一次性加入0.06mM IPTG进行诱导,此时按照0.3g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10%(m/m)甜菜碱溶液。
发酵培养54h时,N-乙酰氨基葡萄糖含量为110g/L,转化率为40.1%,乙酸含量为1.9g/L,谷氨酸含量为2.1g/L。
实施例3
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法,与实施例1的区别仅在于:当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm=30-32区间时,降温至35℃,同时一次性加入0.07mM IPTG进行诱导,此时按照0.4g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10%(m/m)甜菜碱溶液。
发酵培养54h时,N-乙酰氨基葡萄糖含量为98g/L,转化率为38.5%,乙酸含量为3.2g/L,谷氨酸含量为3.5g/L。
实施例4
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法,与实施例1的区别仅在于:当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm=30-32区间时,降温至35℃,同时一次性加入0.08mM IPTG进行诱导,此时按照0.5g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10%(m/m)甜菜碱溶液。
发酵培养54h时,N-乙酰氨基葡萄糖含量为101g/L,转化率为38.7%,乙酸含量为4.4g/L,谷氨酸含量为4.7g/L。
实施例5
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法,与实施例1的区别仅在于:采用500L发酵罐进行N-乙酰氨基葡萄糖的发酵培养,发酵培养54h时,N-乙酰氨基葡萄糖含量为103g/L,转化率为38.4%,乙酸含量为3.5g/L,谷氨酸含量为4.9g/L。
对比例1
N-乙酰氨基葡萄糖的发酵方法,与实施例1的区别仅在于:IPTG诱导时温度维持37℃不变。发酵培养54h时,N-乙酰氨基葡萄糖含量为80.3g/L,转化率为31.1%,乙酸含量为2.1g/L,谷氨酸含量为2.5g/L。
对比例2
N-乙酰氨基葡萄糖的发酵方法,与实施例1的区别仅在于:IPTG诱导时,不流加甜菜碱溶液。发酵培养54h时,N-乙酰氨基葡萄糖含量为85.7g/L,转化率为36.1%,乙酸含量为1.8g/L,谷氨酸含量为2.7g/L。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (11)
1.一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法,其特征在于,在利用产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行N-乙酰氨基葡萄糖发酵过程中,当发酵液中OD660nm=28-33时向发酵液中流加甜菜碱溶液;所述流加甜菜碱溶液的速率为0.1-0.8g/L·h;
在流加甜菜碱溶液前先加入IPTG;所述IPTG的添加量为0.03mM-0.10mM;添加IPTG时控制N-乙酰氨基葡萄糖发酵液的温度为33-35℃;
还包括当发酵液的残糖含量降至0.5g/L以下时,按照5-8g/L·h的流加速率向发酵液中流加葡萄糖溶液,同时向发酵液中流加尿素溶液;所述尿素溶液的流加速率与葡萄糖溶液的流加速率之比为1:10。
2.根据权利要求1所述的发酵方法,其特征在于,所述甜菜碱溶液的质量浓度为5%-15%。
3.根据权利要求1所述的发酵方法,其特征在于,所述甜菜碱溶液的质量浓度为10%。
4.根据权利要求1所述的发酵方法,其特征在于,所述流加甜菜碱溶液的速率为0.2-0.5g/L·h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的发酵方法,其特征在于,当发酵液中OD660nm=30-32时,流加甜菜碱溶液。
6.根据权利要求1-4任一项所述的发酵方法,其特征在于,所述IPTG的添加量为0.05mM-0.08mM。
7.根据权利要求1所述的发酵方法,其特征在于,所述葡萄糖溶液的质量浓度为50%-60%;和/或,所述尿素溶液的质量浓度为15%-20%。
8.根据权利要求7所述的发酵方法,其特征在于,所述葡萄糖溶液的质量浓度为55%;和/或,所述尿素溶液的质量浓度为15%。
9.根据权利要求1所述的发酵方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)种子培养
配制种子培养基,用浓度为25%的氨水调种子培养基pH值至6.8-7.3,向种子培养基中通饱和蒸汽至121℃,保温30min;设定种子培养条件:温度37℃,罐压0.05mPa,通风比1:0.5,转速300rpm,pH值6.8-7.3;接入产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养,当种子培养基中OD660nm=3.5-5范围区间时,作为种子成熟标准;
所述种子培养基为:葡萄糖15g/L,磷酸氢二钾11g/L,磷酸二氢钾16g/L,酵母浸粉1g/L,苏氨酸0.2g/L,蛋氨酸0.15g/L,硫酸镁0.5g/L,硫酸铵5g/L,硫酸锰0.013mg/L,硫酸铁0.024mg/L,硫酸锌0.047mg/L,氯化钴0.01mg/L;
(2)发酵培养
配制发酵培养基,121℃灭菌30min;降温后设定发酵培养条件:温度37℃,罐压0.03-0.05mPa,通风比1:0.5-1:1,转速300-500rpm,pH值6.9-7.0;将成熟的N-乙酰氨基葡萄糖种子液按照10%接种量接种到发酵罐进行培养,发酵过程中通过调节罐压、风量、转速控制溶氧30-40%;
所述发酵培养基为:葡萄糖5g/L,磷酸氢二钾16g/L,磷酸二氢钾10g/L,酵母浸粉0.3g/L,酵母膏0.1g/L,苏氨酸0.1g/L,蛋氨酸0.15g/L,硫酸镁0.25g/L,硫酸铵3g/L,氯化钾0.1g/L,硫酸锰0.015mg/L,硫酸铁0.35mg/L,硫酸锌0.41mg/L,氯化钴0.02mg/L;
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵培养过程中发酵液残糖降至0.5g/L以下时,按照6g/L·h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加55%葡萄糖溶液;同时按照0.6g/L·h的流加速率向发酵液中流加15%尿素溶液;
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm=30-32区间时,降温至33-35℃,同时一次性加入0.05mM-0.08mM IPTG进行诱导,再按照0.2-0.5g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10%甜菜碱溶液。
10.根据权利要求1-4、7-9任一项所述的发酵方法,其特征在于,发酵时间为52-56小时。
11.根据权利要求1所述的发酵方法,其特征在于,发酵时间为54小时。
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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