CN109112122A - 一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法,属于生物发酵技术领域。本发明提供的方法先在36~38℃条件下发酵培养菌株至OD600=25~30,得到待诱导发酵液;然后将所述待诱导发酵液分阶段降温和添加诱导剂,结合溶氧水平的变化观察菌体适应情况,待溶氧量稳定后,得到最终诱导发酵液,维持发酵状态至发酵结束。按本发明提供的方法对菌体进行诱导,能最大限度地降低诱导剂对菌体的毒害,有效解决菌体对低温和诱导剂的适应性差的问题。发酵结束后菌体OD600不低于100,菌体湿重达到180g/L以上,发酵液中酪氨酸酚裂解酶的表达量大于15g/L。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域,具体涉及一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法。
背景技术
左旋多巴又名3,4-二羟基苯丙氨酸,为白色结晶性粉末,无臭无味,在乙醇、氯仿和丙酮中不溶,在稀酸中易溶。作为一种重要的生物活性物质,左旋多巴是神经递质多巴胺的前体,可以通过血脑屏障,进入脑循环而到达中枢神经系统,在中枢神经脱羧酶的作用下,转化为多巴胺,从而使脑组织中多巴胺含量增加以达到治疗帕金森疾病的作用。左旋多巴是治疗老年帕金森病的首选和最有效药物,除此之外,左旋多巴还具有治疗弱视和心力衰竭的作用,虽然长时间的使用以后会有一些副作用,但目前并没有更好的替代药物出现。
目前市面上的药物或者是植物提取,或者是化学合成,但是均无法保证原料来源,产量远远满足不了市场需求。随着分子生物学及生物技术的迅速发展,利用生物合成左旋多巴已经成为一种很有竞争力、前途光明的方法。生物合成法是通过酪氨酸酚裂解酶催化邻苯二酚、丙酮酸钠和氨水生成左旋多巴。左旋多巴的生产水平受酪氨酸酚裂解酶的影响,所以提高左旋多巴生产量的重点在于提高酪氨酸酚裂解酶的表达量(酶活性)。
在现有的酪氨酸酚裂解酶发酵过程中,常规采取一步降温法结合一次性加入诱导剂的方法提高表达量。比如当发酵过程进行到一定程度时(通常以OD600为指标),将发酵温度(E.coli通常为37℃)降低到某一温度(比如25℃),然后加入一定量的诱导剂(通常为IPTG),保持温度直至发酵结束,最后检测发酵最终的OD600、菌体湿重和表达量。这种方法虽然能在一定程度上提高酪氨酸酚裂解酶的表达量,但由于诱导剂对菌体存在一定毒害作用,所以会导致一定量的菌体死亡;未死亡的菌体代谢活性较低,表现在发酵OD600增长缓慢,菌体湿重较低,酪氨酸酚裂解酶的表达量较低。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的问题,本发明的目的在于解决菌体对低温和诱导剂适应性差的问题,提高酪氨酸酚裂解酶的表达量。
为了实现上述发明目的,本发明提供了一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法,包括如下步骤:
(1)在36~38℃条件下发酵培养菌株至OD600=25~30,得到待诱导发酵液;
(2)将所述待诱导发酵液降温至31~33℃,待溶氧量稳定至25~35%,得到初步诱导发酵液;
(3)将所述初步诱导发酵液降温至25~27℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.065~0.085mmol/L,待溶氧量稳定至25~35%,得到二次诱导发酵液;
(4)将所述二次诱导发酵液降温至19~21℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.14~0.16mmol/L,待溶氧量稳定至25~35%,得到最终诱导发酵液,维持发酵状态至菌株的OD600不增加结束发酵。
优选的,所述步骤(1)中菌株为高效表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌。
优选的,所述步骤(1)中发酵培养包括初期发酵阶段和连续发酵阶段;所述初期发酵阶段包括:将种子液移种至基础培养基中,控制初始发酵条件为:pH=6.8~7.1;150~250rpm;0.8~1.2vvm;0.02~0.04Mpa;DO≥30%;初期发酵至DO值和pH值同时上升,向基础培养基中添加补料培养基,进入连续发酵阶段;所述连续发酵阶段以溶氧为反馈,通过控制补料速率维持DO=25~35%。
优选的,所述基础培养基以水为溶剂,包括如下浓度的组分:酵母膏7~10g/L,蛋白胨9~11g/L,十二水磷酸氢二钠12~16g/L,硫酸钠7~9g/L,氯化钠0.5~1.0g/L,氯化铵3~5g/L,三水磷酸氢二钾9~12g/L,柠檬酸0.4~0.7g/L,七水硫酸镁0.3~0.8g/L和甘油3~7ml/L。
优选的,所述补料培养基以水为溶剂,包括如下浓度的组分:酵母膏10~50g/L,蛋白胨20~60g/L和甘油200~600g/L。
优选的,所述发酵培养以菌体OD600不增加为发酵结束依据,发酵培养的总周期为20~28h。
有益效果:本发明提供了一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法,先在36~38℃条件下发酵培养菌株至OD600=25~30,得到待诱导发酵液;然后将所述待诱导发酵液降温至31~33℃,待溶氧量稳定至25~35%,得到初步诱导发酵液;再将所述初步诱导发酵液降温至25~27℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.065~0.085mmol/L,待溶氧量稳定至25~35%,得到二次诱导发酵液;最后将所述二次诱导发酵液降温至19~21℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.14~0.16mmol/L,待溶氧量稳定至25~35%,得到最终诱导发酵液,维持发酵状态至OD600不增加。本发明以溶氧水平的变化作为划分诱导不同阶段的依据,根据溶氧水平的变化判断反应菌体的代谢适应情况。本发明分三阶段对发酵液中的菌体进行诱导表达,分阶段式降温诱导使菌体逐步适应温度的变化,最终在菌体良好适应的基础上将发酵液的温度降为所需温度;分次加入诱导剂,每次加入量的控制能最大限度的降低对菌体的毒害作用;菌体在逐步适应环境变化的过程中逐步改变代谢途径,能实现酪氨酸酚裂解酶更好地表达。
利用本发明提供的方法对发酵液中的菌体进行诱导,能最大限度地降低低温和诱导剂对菌体的毒害,有效解决菌体对低温和诱导剂的适应性差的问题,最终在菌体良好适应的基础上将发酵液的温度降低为20℃,在不对菌体产生毒害的作用下将诱导剂的添加量提高至0.15mmol/L。按照本发明提供的方法进行发酵,发酵结束后菌体OD600不低于100,菌体湿重达到180g/L以上,发酵液中酪氨酸酚裂解酶的表达量大于15g/L。
附图说明:
图1为本发明实施例1所述发酵培养阶段(诱导表达之前)的溶氧随时间变化曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法,包括如下步骤:
(1)在36~38℃条件下发酵培养菌株至OD600=25~30,得到待诱导发酵液;
(2)将所述待诱导发酵液降温至31~33℃,待溶氧量稳定至25~35%,得到初步诱导发酵液;
(3)将所述初步诱导发酵液降温至25~27℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.065~0.085mmol/L,待溶氧量稳定至25~35%,得到二次诱导发酵液;
(4)将所述二次诱导发酵液降温至19~21℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.14~0.16mmol/L,待溶氧量稳定至25~35%,得到最终诱导发酵液,维持发酵状态至OD600不增加结束发酵。
本发明先发酵培养菌株。在本发明中,所述菌株优选为高效表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌。所述高效表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌为使用基因工程对酪氨酸酚裂解酶(TPL)进行过优化的大肠杆菌基因工程菌,优选为E.coli M15。在本发明的实施例中,所述高效表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌为购买自香港标新特有限公司生产的E.coliM15,具有kan抗性,能催化邻苯二酚、苯酸酮、氨合成左旋多巴。
所述E.coli M15在发酵培养前处于保藏状态,所述保藏的方法优选为:20%甘油-80℃保藏(挑新鲜平板单菌落至5mL LB+kan试管,37℃,220rpm,培养12-16h;40%甘油与LB菌悬液体积比1:1保种),平板或斜面置4℃保藏,最多两周更换一次。
所述E.coliM15在发酵培养前需活化,所述活化的方法优选为:甘油管(含有处于保藏状态的E.coli M15)划LB+kan平板或斜面,37℃,培养12~16h。无菌操作用灭菌接种针从LB-kan平板挑取单菌落接种至摇瓶液体(500ml摇瓶)LB-kan培养基,37℃,220rpm培养12-16h。培养结束OD600值的要求在3-5。
所述E.coli M15在发酵培养前需制成种子液,所述种子液的制备方法优选为:按照2%的接种量从LB-kan摇瓶(含有活化后的E.coli M15)中移取菌液接种至TB种子罐内,37℃,220rpm培养4~h。培养结束OD600值的要求在4-6。所述种子液制备完成后,优选进行革兰氏染色检查,菌体形态为饱满的短杆状为宜。
在本发明中,所述发酵培养包括初期发酵阶段和连续发酵阶段。
所述初期发酵阶段包括将种子液移种至基础培养基中进行初期发酵的步骤。在本发明中,所述基础培养基以水为溶剂,优选包括如下浓度的组分:酵母膏7~10g/L,蛋白胨9~11g/L,十二水磷酸氢二钠12~16g/L,硫酸钠7~9g/L,氯化钠0.5~1.0g/L,氯化铵3~5g/L,三水磷酸氢二钾9~12g/L,柠檬酸0.4~0.7g/L,七水硫酸镁0.3~0.8g/L,甘油3~7ml/L。更优选的,所述基础培养基包括酵母膏8~9g/L,蛋白胨10g/L,十二水磷酸氢二钠14g/L,硫酸钠8g/L,氯化钠0.8g/L,氯化铵4g/L,三水磷酸氢二钾10~11g/L,柠檬酸0.5~0.6g/L,七水硫酸镁0.4~0.7g/L,甘油5ml/L。
在本发明中,所述初期发酵阶段种子液的移种量(接种量)优选为3~5%,更优选为4%。所述初期发酵的初始发酵pH值优选为6.8~7.1,更优选为6.9~7.0;所述初期发酵的转速优选为150~250rpm,更优选为200rpm;所述初期发酵的通气量(空气)优选为0.8~1.2vvm,更优选为1vvm;所述初期发酵的罐压优选为0.02~0.04Mpa,更优选为0.03Mpa。所述初期发酵的初始发酵DO值≥30%,初始发酵DO值通过调节转速、通气量、罐压调节得到。
在本发明中,初期发酵至DO值和pH值同时上升时,向基础培养基中添加补料培养基,进入连续发酵阶段。
在本发明中,所述补料培养基以水为溶剂,优选包括如下浓度的组分:酵母膏10~50g/L,蛋白胨20~60g/L,甘油200~600g/L。更优选的,所述补料培养基包括酵母膏30g/L,蛋白胨40g/L,甘油400g/L。所述补料培养基的添加速率以以溶氧为反馈,通过控制补料速率维持DO=25~35%。所述DO值优选为28~32%,更优选为30%。
本发明先发酵培养高效表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌。所述发酵培养的温度优选为36~38℃,更优选为37℃。当所述发酵培养至OD600=25~30时,得到待诱导发酵液。
本发明分阶段处理待诱导发酵液。本发明先将所述待诱导发酵液第一次降温至31~33℃,得到初步诱导发酵液。在本发明中,所述第一次降温后的温度优选为32℃。本发明实时监测溶氧量变化,随着温度降低,溶氧量呈升高趋势;当温度稳定后,菌体对温度逐渐适应,溶氧会逐渐降低至稳定(温度降低,氧气的溶解度增多,所以溶氧量会升高,菌体适应温度后,会消耗一部分溶氧,所以溶氧会逐渐降低至稳定水平)。在本步骤中,溶氧量稳定后的范围优选为DO=25~35%,更优选为DO=30%。在本发明的实施例中,本步骤溶氧量上升至39~41%后开始降低,待溶氧量稳定在30%时,得到初步诱导发酵液。
本发明将所述初步诱导发酵液第二次降温至25~27℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.065~0.085mmol/L,得到二次诱导发酵液。在本发明中,所述第二次降温后的温度优选为26℃,所述IPTG诱导剂加入后的终浓度优选为0.075mmol/L。本发明实时监测溶氧量变化,随着发酵条件的变化,溶氧量呈升高趋势;当菌体对温度和诱导剂逐渐适应后,溶氧量会逐渐降低至稳定。在本步骤中,溶氧量稳定后的范围优选为DO=25~35%,更优选为DO=30%。在本发明的实施例中,本步骤溶氧量上升至44~46%后开始降低,待溶氧量稳定在30%时,得到二次诱导发酵液。
本发明将所述二次诱导发酵液第三次降温至19~21℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.14~0.16mmol/L,得到最终诱导发酵液。在本发明中,所述第三次降温后的温度优选为20℃,所述IPTG诱导剂加入后的终浓度优选为0.15mmol/L。本发明实时监测溶氧量变化,随着发酵条件的变化,溶氧量呈升高趋势;当菌体对温度和诱导剂逐渐适应后,溶氧量会逐渐降低至稳定。在本步骤中,溶氧量稳定后的范围优选为DO=25~35%,更优选为DO=30%。在本发明的实施例中,本步骤溶氧量上升至48~52%后开始降低,待溶氧量稳定在30%时,得到最终诱导发酵液,维持发酵状态至发酵结束。在本发明中,所述发酵结束的判断依据为OD600不增加。本发明以菌体OD600不增加为发酵结束依据,当OD不增加时,发酵结束,放罐。在本发明中,总发酵周期(发酵罐的运转时间)优选为20~28h,更优选为24h。
本发明提供的诱导表达方法分三阶段进行,最终在菌体良好适应的基础上将发酵液的温度降低至20℃,在不对菌体产生毒害的作用下将诱导剂的加量最终达到诱导所需量0.15mmol/L。按照本发明提供的方法进行发酵,发酵结束后菌体OD600不低于100,菌体湿重达到180g/L以上,发酵液中酪氨酸酚裂解酶的表达量大于15g/L。
下面结合实施例对本发明提供的一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)菌种保藏与活化
(1)菌种:高效表达酪氨酸酚裂解酶(TPL)的大肠杆菌基因工程菌(购买自香港标新特有限公司的E.coliM15),具有kan抗性,可以催化邻苯二酚、丙酮酸、氨合成左旋多巴。
(2)保藏:20%甘油-80℃保藏(挑新鲜平板单菌落至5mL LB+kan试管,37℃,220rpm,培养12-16h;40%甘油与LB菌悬液体积比1:1保种);平板或斜面置4℃保藏,最多两周更换一次。
(3)活化:甘油管划LB+kan平板或斜面,37℃,培养12~16h。
(二)种子与发酵培养
(1)发酵工艺:甘油管→LB平板→LB摇瓶→TB种子培养→发酵培养
(2)活化:无菌操作用灭菌接种针从LB-kan平板挑取单菌落接种至摇瓶液体(500ml摇瓶)LB-kan培养基,37℃,220rpm培养12~16h。培养结束OD600值的要求在3~5。
(3)种子培养:
a.2%接种量从LB-kan摇瓶中移取菌液接种至TB种子罐内,37℃,220rpm培养4~5h。培养结束OD600值的要求在4~6。
b.革兰氏染色检查。菌体形态为饱满的短杆状。
(4)发酵培养:
a.按4%左右的接种量将TB种子液无菌移种至发酵罐中发酵,pH=6.9-7.0,37℃,200rpm,1vvm,罐压0.03Mpa,调节转速、通气量、罐压控制DO≥30%。
b.培养至DO和pH值同时上升,开始补料,控制补料速度保证菌体生长。维持DO在30%左右幅度(幅度低于5%)。
发酵培养阶段的溶氧量变化情况如图1所示,在图1中,溶氧被控制在30%左右浮动。
(三)诱导表达
(1)发酵过程中每小时测一次OD600至OD600=25-30,开始诱导表达,划分为三个阶段:
A阶段:将温度由37℃降温至32℃,其他条件不进行干涉,此时溶氧会上升至40%左右。
B阶段:待菌体适应后溶氧会下降至原有30%左右,此时再次将温度由32℃降至26℃,待温度降至26℃时加入诱导剂IPTG使其在发酵液中的浓度为0.075mmol/L,其他条件不进行干涉,此时溶氧会上升至45%左右。
C阶段:待菌体再次适应后溶氧下降至原有30%左右,此时再次将温度由26℃降至20℃,待温度降至26℃时加入诱导剂IPTG使其在发酵液中的终浓度为0.15mmol/L,其他条件不进行干涉,此时溶氧会上升至50%左右。菌体经过一段时间的适应后会维持原有30%左右的溶氧。一直维持到发酵结束。
此时完成了诱导表达的三个阶段,最终在菌体良好适应的基础上将发酵液的温度降为20℃,在不对菌体产生毒害的作用下将诱导剂的加量最终达到诱导所需量0.15mM。
(2)继续培养,至OD不增加时放罐,总发酵周期在24h左右。低温4℃下离心收集菌体,弃上清,刮取菌体。
(四)发酵结果测定
发酵结束后,测定菌体OD600不低于100,菌体湿重达到180g/L以上,发酵液中酪氨酸酚裂解酶的表达量大于15g/L。
对比例1
与实施例1的区别仅在于步骤(三)诱导表达方法的不同:
发酵过程中每小时测一次OD600,当OD600=25-30时,开始诱导表达,先将温度由37℃降温至25℃,待温度降至25℃时,加入诱导剂IPTG使其在发酵液中的终浓度为0.15mmol/L,其他条件不进行干涉,一直维持到发酵结束。
发酵结束后,测定菌体OD600在60左右,菌体湿重为100g/L,发酵液中酪氨酸酚裂解酶的表达量小于10g/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种酪氨酸酚裂解酶发酵过程中的诱导表达方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)在36~38℃条件下发酵培养菌株至OD600=25~30,得到待诱导发酵液;
(2)将所述待诱导发酵液降温至31~33℃,待溶氧量稳定至25~35%,得到初步诱导发酵液;
(3)将所述初步诱导发酵液降温至25~27℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.065~0.085mmol/L,待溶氧量稳定至25~35%,得到二次诱导发酵液;
(4)将所述二次诱导发酵液降温至19~21℃,加入IPTG诱导剂至终浓度为0.14~0.16mmol/L,待溶氧量稳定至25~35%,得到最终诱导发酵液,维持发酵状态至菌株的OD600不增加结束发酵。
2.根据权利要求1所述的诱导表达方法,其特征在于,所述步骤(1)中菌株为高效表达酪氨酸酚裂解酶的大肠杆菌基因工程菌。
3.根据权利要求1所述的诱导表达方法,其特征在于,所述步骤(1)中发酵培养包括初期发酵阶段和连续发酵阶段;所述初期发酵阶段包括:将种子液移种至基础培养基中,控制初始发酵条件为:pH=6.8~7.1;150~250rpm;0.8~1.2vvm;0.02~0.04Mpa;DO≥30%;初期发酵至DO值和pH值同时上升,向基础培养基中添加补料培养基,进入连续发酵阶段;所述连续发酵阶段以溶氧为反馈,通过控制补料速率维持DO=25~35%。
4.根据权利要求3所述的诱导表达方法,其特征在于,所述基础培养基以水为溶剂,包括如下浓度的组分:酵母膏7~10g/L,蛋白胨9~11g/L,十二水磷酸氢二钠12~16g/L,硫酸钠7~9g/L,氯化钠0.5~1.0g/L,氯化铵3~5g/L,三水磷酸氢二钾9~12g/L,柠檬酸0.4~0.7g/L,七水硫酸镁0.3~0.8g/L和甘油3~7ml/L。
5.根据权利要求4所述的诱导表达方法,其特征在于,所述补料培养基以水为溶剂,包括如下浓度的组分:酵母膏10~50g/L,蛋白胨20~60g/L和甘油200~600g/L。
6.根据权利要求1~5任一项所述的诱导表达方法,其特征在于,以菌体OD600不增加为发酵结束依据,发酵培养的总周期为20~28h。
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