CN102550294A

CN102550294A - 一种姬菇菌种的液体发酵培养方法

Info

Publication number: CN102550294A
Application number: CN2012100239013A
Authority: CN
Inventors: 李冠喜; 孟德龙; 温以斌; 华国栋; 刘耀鸿; 刘辉; 王多明
Original assignee: Lianyungang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Hubei Kang peptide Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2012-02-03
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2032-02-03
Also published as: CN102550294B

Abstract

本发明公开了一种姬菇菌种的液体发酵培养方法，包括：（1）取斜面母种接种到装有60~120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21~27℃，90~180rpm振荡培养5~7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5~10%转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；（2）将种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，25℃培养5~6d，即可。该方法生产周期短、菌龄一致、生产成本低、接种简便，液体菌种生长速度明显优于固体传统栽培种，菌种瓶中菌丝生长满瓶时间为16d，时间明显缩短，液体菌种接种的生长速度明显提高75%，完全可以在工厂生产中实际应用。

Description

一种姬菇菌种的液体发酵培养方法

技术领域

本发明属于食用菌培植技术领域，具体涉及一种姬菇菌种的液体发酵培养方法。

背景技术

姬菇(Pleurotus cornucopiae)又叫黄白侧耳、紫孢侧耳、紫孢平菇、姬平菇。姬菇口感好，质地脆嫩，味道鲜美营养价值高，蛋白质含量高于一般蔬菜，含有人体所必需的八种氨基酸，其子实体入药有滋补强壮作用，可治疗多种疾病。姬菇不是分类上的名称，也不是菌种名，而是一种商品名，指采收子实体菌盖直径小于3厘米的一类平菇。姬菇一直使用固体菌种进行生产，但固体菌种具有明显的缺陷，主要表现在生长周期长、菌龄不一致、发菌速度慢、栽培种需用量大、生产成本高等方面，显然不能满足大规模栽培使用需求。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种姬菇菌种的液体发酵培养方法，以满足高效培育姬菇的使用需求。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种姬菇菌种的液体发酵培养方法，包括以下步骤：

(1)取活化的0.5cm²斜面母种接种到装有60～120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21～27℃，90～180rpm振荡培养5～7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5～10％转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；其中，各级摇瓶培养条件相同，液体培养基配方为：碳源，氮源10～20g，KH₂PO₄ 1～3g，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.5g，VB₁ 10mg，水1000mL，pH5～7；碳源为20～30g的可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇或蔗糖；氮源为酵母膏、蛋白胨、玉米粉、氯化铵、硫酸铵或尿素；

(2)将步骤(1)所得的种子液按5％的接种量接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，25℃培养5～6d，即可；其中，发酵培养基配方为：甘露醇30g，酵母膏10g，玉米粉10g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，pH值6.0，水1000mL。

步骤(1)中，碳氮比优选为18～20∶1；碳源优选为果糖或甘露醇，更优选为甘露醇。

步骤(1)中，氮源优选为酵母膏、蛋白胨或氯化铵，更优选为酵母膏。

步骤(1)中，液体培养基优选配方为：30g甘露醇，10g酵母膏，玉米粉10g，2g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，VB₁ 10mg，水1000mL，pH6。

步骤(1)中，优选培养条件：装液量为90mL，控温25℃，150rpm振荡培养5～6d，接种量为5％。

有益效果：与现有的固体培养姬菇菌种方法相比，本发明的姬菇菌种的液体发酵培养方法具有的明显优势包括：生产周期短、菌龄一致、生产成本低、接种简便，液体菌种生长速度明显优于固体传统栽培种，菌种瓶中菌丝生长满瓶时间为16d，时间明显缩短，液体菌种接种的生长速度明显提高75％，完全可以在工厂生产中实际应用，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

附图说明

图1是碳源对菌丝球生长量结果图；

图2是氮源对菌丝球生长量结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的材料和方法为：

试验材料：菌种为姬菇。

按照有机肥料中国人民共和国农业行业标准NY525-2002测定各种原料含碳量和含氮量。

菌丝体生物量测定：将生长良好、无污染的摇瓶培养发酵液，经4层纱布过滤，菌丝球生物量湿重为沥干后取固体物在电子天平上称重，菌丝球生物量干重则是直接过滤烘干称重。

菌球直径测定：取1mL发酵液用水稀释10倍，随机取20个菌球在培养皿中沿固定的直线排成一行，用卡尺测定总长度，重复3次，求其平均值。

菌球密度测定：取1mL均匀的发酵液用水稀释10倍，于培养皿下垫置黑色方格纸计数。

pH值测定：采用型酸度计测定pH值。

还原糖测定：取发酵液上清液按3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖。

菌丝生长速度：固体栽培种或是液体菌种相同接种量接种后，观察菌丝在菌种瓶中萌发，向下生长，直至生长至瓶底的时间，即满瓶时间。

发酵罐参数测定：10L全自动气升式搅拌玻璃发酵罐装液量为6L，以摇瓶试验得出的最佳液体培养基配方配置液体发酵培养基，在发酵罐中经过空消和发酵罐自身蒸汽121℃下灭菌30min，待罐内培养基温度下降至25℃左右，按照5％接种量接种已经活化好的液体菌种种子液，通入无菌空气开始控制培养发酵。按12h为间隔定时无菌取样，其菌丝球生物量、菌丝球密度、菌丝球直径，溶氧浓度和pH值以电极测量。

实施例1

取活化的斜面母种约0.5cm²的小块接种到液体培养基中，于25℃恒温振荡培养得一级摇瓶菌种，再将培养好的一级摇瓶液体菌种转接到各处理的二级液体菌种摇瓶中，依次进行各级培养，若无特殊说明，各级摇瓶培养条件均为：250mL三角瓶装液量100mL，接种量5％(V/V)，摇床转速150r/min，25℃振荡培养5～7d，同样，其余各级液体菌种也是相同的培养方式。姬菇液体菌种的液体培养基配方为：氮源，碳源，KH₂PO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，VB₁ 10mg，水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。用作姬菇斜面培养的PDA通用培养基配方：马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min，。

(1)在液体培养基中，氮源为20g蛋白胨，碳源选择30g的可溶性淀粉(上海佳和生物科技有限公司)、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇和蔗糖分别进行培养。对姬菇液体菌种菌丝球生物量进行分析，结果如图1所示，在所测碳源中，姬菇在甘露醇为碳源的培养基中生长最好，其余依次是果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉，以甘露醇和果糖两个单糖利用率较好，因此，在生产中优选使用甘露醇和果糖。

(2)在液体培养基中，碳源为30g甘露醇，氮源选择20g的酵母膏、蛋白胨、玉米粉、氯化铵、硫酸铵和尿素分别在25℃下摇瓶培养，测定姬菇液体菌丝球生物量，结果如图2所示，姬菇生长最优的氮源是酵母膏，其次是蛋白胨，氯化铵，最后是硫酸铵和尿素，酵母膏不但含有稳定的氮素含量，并且同时提供稳定的有机营养和生长因子类物质。姬菇可能偏向于利用较为复杂的有机营养物质作为自身生长合适的碳氮源，能够提供碳氮源需要的同时并提供必须的生长因子和代谢调控物质等，因此，优选以甘露醇作为姬菇液体培养基的碳源，以酵母膏为最佳氮源。

(3)在液体培养基中，选用甘露醇、酵母膏分别作为碳氮源，磷酸氢二钾，硫酸镁为无机盐，pH自然，采用正交设计L₉(3⁴)进行培养实验，如表1所示，表中，A为甘露醇％(质量百分比)，B为酵母膏％(质量百分比)，C为KH₂PO₄％(质量百分比)，D为MgSO₄·7H₂O％(质量百分比)。

表1 L₉(3⁴)因素表

姬菇液体菌种碳、氮源正交试验，结果如表2所示，四因素中以A因素(甘露醇)极差最大，C因素(KH₂PO₄)的影响最小，最优条件A3D1B3C2：即3％的甘露醇，1％的酵母膏，0.2％的KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O。

表2 姬菇液体菌种各组分正交实验结果

试验组	A	B	C	D	菌丝球干重(g/100Ml)
						1	1	1	1	1	0.665
2	1	2	2	2	0.498
						3	1	3	3	3	0.612
4	2	1	2	3	0.693
						5	2	2	3	1	1.232
6	2	3	1	2	0.978
						7	3	1	3	2	0.882
8	3	2	1	3	0.713
						9	3	3	2	1	1.986
K1	0.592	0.747	0.785	1.294
						K2	0.968	0.814	1.059	0.786
K3	1.194	1.192	0.909	0.673
						R	0.602	0.445	0.274	0.621

(4)以正交试验选择的最佳培养基(30g甘露醇，10g酵母膏，2g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，VB₁ 10mg，水1000mL，pH自然)为基础培养基，添加不同比例(质量百分比)的玉米粉作为增黏剂进行培养，结果如表3所示，玉米粉的添加量为0.5％时，菌丝球较少、直径较大，1％、1.5％、2％添加量时菌丝球大小均一，菌丝球数量较多，而其余3个不同添加量对菌丝生物量的影响基本无差异，故在相同生物量情况下按经济原则选择1％添加量为宜。玉米粉作为一种天然的有机氮源，不仅给菌丝生长提供了氮元素，而且更为重要的是颗粒状玉米粉给液体培养基提供了一定的黏度，提供液体培养过程中的剪切力，不断切断新形成的菌丝，形成新的菌丝球萌发点，使得菌丝球的直径大致在1mm左右而不至于过大，从而促使菌丝球在液体中呈均匀一致，生物量以干重计算，结果显示1％(即10g)玉米粉对菌丝生长最为合适。

表3 玉米粉含量对姬菇菌丝球生物量的影响

至此，得出姬菇液体菌种的优选培养基配方为：30g甘露醇，10g酵母膏，玉米粉10g，2g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，VB₁ 10mg，水1000mL。

(5)选择不同初始pH值，以最佳培养基(30g甘露醇，10g酵母膏，玉米粉10g，2g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，VB₁ 10mg，水1000mL)进行姬菇液体菌种培养，以菌丝球生物量、菌丝球密度、菌丝球直径为标准的实验结果，如表4所示，姬菇菌丝在各个不同初始pH值情况下均能生长，以中性偏酸性为佳，pH值为6、7之间差异较小，但是在长时间培养时酸性pH条件下可以大幅减少真菌等杂菌污染的几率，因而确定pH值为6为最佳初始pH值。

表4 起始pH值对菌丝球生物量干重的影响

初始pH值	菌丝球干重(g/100mL)	菌丝球密度(个/mL)	菌丝球直径(mm)
				4	0.63	263	1.10
5	2.05	316	1.08
				6	2.37	351	1.05
7	2.24	342	1.07
				8	2.01	271	1.01

(6)以最佳培养基(30g甘露醇，10g酵母膏，玉米粉10g，2g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，VB₁ 10mg，水1000mL，pH值为6)进行姬菇液体菌种培养，在不同温度培养，结果如表5所示，在20-28℃之间姬菇菌丝都能正常生长，其中以24、26℃时生长更为活跃，此时菌丝生长最活跃，菌丝生长速度、菌丝球质量均较好；作为液体菌种，菌丝球数量越多且直径越小(小于2mm)，单位体积中萌发点越多，在实际应用时相同接种量，其中含有的菌丝球越多，其菌丝萌发生长速度也越快，充分体现液体菌种生产的优势，这也更适合于实际生产，因此26℃相对而言效果更好。

表5 培养温度对姬菇液体菌种菌丝球生物量干重的影响

培养温度(℃)	菌丝干重(g/100mL)	菌丝球密度(个/mL)	菌丝球直径(mm)
				20	2.31	297	0.91
22	2.64	310	0.92
				24	2.97	337	0.95
26	3.10	352	1.04
				28	2.75	331	1.06

(7)装液量不同，主要影响培养液中的溶解氧水平，装液量过大，液面接触的空气面积小，液体厚度大，单位体积的液体溶氧量越小，在摇瓶振荡培养时，由于不能对三角瓶通入无菌空气，装液量是影响溶氧的一个关键因素。以选择的最佳培养基(30g甘露醇，10g酵母膏，玉米粉10g，2g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，VB₁ 10mg，水1000mL，pH值为6)为基础，进行培养，结果如表6所示，在250mL三角瓶中装液量为90mL时菌丝球生物量及菌丝球密度都为最大值，菌丝球直径也较小，250mL的三角瓶中，装液以90mL为宜，超过反而使单位体积的菌丝球产量下降。

表6 摇瓶装液量对姬菇液体菌种菌丝球生物量干重的影响

装液量(mL)	菌丝干重(g/100mL)	菌丝球密度(个/mL)	菌丝球直径(mm)
				30	2.37	279	0.93
60	2.63	372	0.89
				90	2.97	393	1.06
120	2.78	360	1.01

150	2.16	330	1.12
				180	1.91	302	1.15

(7)以选择的最佳培养基(30g甘露醇，10g酵母膏，玉米粉10g，2g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，VB₁ 10mg，水1000mL，pH值为6)为基础，进行不同转速培养，结果如表7所示，摇床转速150r/min时菌丝球生物量与密度均处于较佳的状态，菌丝在液体中生长需要消耗氧气，随着摇床转速的提高，液面接触空气的面积增大，利于溶氧水平的提高；摇床转速增加，剪切力增加，菌丝不断的被切断，形成新的菌丝球萌发点，从而生长出新的菌丝球；但摇床转速过大，不仅会增加培养液被污染的几率，而且菌丝难以在高速振荡情况下生长出一定直径的菌丝球，影响菌丝球的整体质量，所以摇床转速以150r/min为宜。

表7 摇床转速对菌丝球生物量干重的影响

(8)在培养基(甘露醇30g，酵母膏10g，玉米粉10g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，VB₁ 10mg、水1000mL，pH自然)中接种后培养，食用菌本身产生糖化酶水解淀粉，在第3d后还原糖迅速增大；第4～5d的时候，发酵液中还原糖含量至最高点并开始下降，其中生物生长处于高峰期向稳定期过渡，而发酵至6d时，还原糖处在一个稳定的最低点，与此同时发酵液中菌丝生长量到达最顶点，而到达第7d生物量并无明显变化，且培养时间越长污染几率越大，因此发酵终点在6d。

实施例2

用10L全自动气升搅拌发酵罐，装液量为6L，按5％(v/v)接种量，26℃培养条件下在液体培养最适培养基中(甘露醇30g，酵母膏10g，玉米粉10g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，pH值6.0，水1000mL)，进行液体发酵培养，通过取样分析和记录发酵罐系统监测数据，姬菇液体菌丝在气升式发酵罐中各个生长指标变化结果为：在气升式发酵罐中，随着发酵时间的延长，还原糖含量、菌丝干重、菌丝球密度以及菌丝球直径各个参数指标都有一个逐渐上升并在发酵第6d时，开始有一个下降的趋势；而pH值却是与之相反的态势，呈逐步下降趋势。当发酵到达第7d时，发酵罐中姬菇菌丝球干重、密度以及直径都较第6d有所下降，此时pH值为4.7，接近姬菇生长的最低pH值，通过还原糖含量分析，此时已经处于一个菌体自溶、抑制自身生长时期。由于pH值相对取样分析还原糖含量、菌丝干重、菌丝球密度以及菌丝球直径等比较方便，不会导致发酵罐污染，因此选择测定pH值作为确定发酵终点的方式，当发酵罐中pH值下降至4.8时，姬菇菌丝球活性以及各指标处于最佳时期，发酵达到终点，停止发酵。

实施例3

液体菌种在摇瓶中培养后，直接按5％接种量接种到750mL玻璃菌种瓶装的栽培种培养料(棉籽壳98％、石灰1％、石膏1％、质量百分比，料水质量比1∶1.2，pH值自然)上；固体栽培种按基本覆盖菌种瓶上部。固体栽培料装袋后在121℃下灭菌120min，冷却至28℃时接种，接种标准为固体菌种基本覆盖菌种袋上方，液体菌种则是将菌丝球均匀覆盖上培养料上方。接种后将栽培袋集中在经过消毒处理过的培养室中25℃恒温培养，定期进行翻动培养。比较液体菌种与固体栽培种在栽培料上生长速度，结果为：姬菇固体栽培种在菌种瓶中生长平均满瓶时间为28d，而姬菇液体菌种接种的菌种瓶中菌丝生长满瓶时间为16d，时间明显缩短，液体菌种接种的生长速度明显提高75％，液体菌种中菌丝球分布均匀，菌丝球以及菌丝片段多，在接触的固体料上形成多点同时萌发，并有一部分菌丝球随着液体向下渗透进去，在菌种瓶的不同部位开始萌发生长，因此生长并不是从上至下缓慢进行，而是在菌种瓶的不同高度形成一种齐头并进的态势，故生长速度较固体的快。

Claims

1.一种姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取活化的0.5cm²斜面母种接种到装有60~120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21~27℃，90~180rpm振荡培养5~7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5~10%转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；其中，各级摇瓶培养条件相同，液体培养基配方为：碳源，氮源10~20g，KH₂PO₄ 1~3g，MgSO₄·7H₂O0.5~1.5g，VB₁ 10mg，水1000mL，pH5~7；碳源为20~30g的可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇或蔗糖；氮源为酵母膏、蛋白胨、玉米粉、氯化铵、硫酸铵或尿素；

（2）将步骤（1）所得的种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，25℃培养5~6d，即可；其中，发酵培养基配方为：甘露醇30g，酵母膏10g，玉米粉10g， KH₂PO₄2g， MgSO₄·7H₂O 0.5g，pH值6.0，水1000mL。

2.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于：步骤（1）中，碳氮比为18~20:1。

3.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于：步骤（1）中，碳源为果糖或甘露醇。

4.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于：步骤（1）中，碳源为甘露醇。

5.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于：步骤（1）中，氮源为酵母膏、蛋白胨或氯化铵。

6.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于：步骤（1）中，氮源为酵母膏。

7.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于：步骤（1）中，液体培养基配方为：30g甘露醇，10g酵母膏，玉米粉10g，2g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，VB₁ 10mg，水1000mL，pH 6。

8.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于：步骤（1）中，培养条件：装液量为90mL，控温25℃，150rpm振荡培养5~6d，接种量为5%。