KR102132132B1 - 재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법 - Google Patents

재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법을 제공한다. 우선 피치아 파스토리스 균종액을 멸균된 발효 배지에 접종하여, 14 내지 18 시간 동안 발효 배양한 후, 메탄올을 보충 첨가하여 유도발현을 시작하는 동시에 발효 배지에 피루브산나트륨을 첨가하며, 여기서 피루브산나트륨의 첨가량은 0.01 내지 10 g/L이다.

Description

재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법
본 발명은 생물 발효 기술 분야에 속한 것으로, 재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법에 관한 것이다.
콜라겐은 동물 체내의 중요한 단백질로, 피부, 연골, 혈관 등 조직에 광범위하게 분포되며, 세포 이동, 분화 및 번식에 참여하고, 세포, 조직 및 기관의 정상적인 생리 기능을 유지하는데 중요한 역할을 하며, 식품, 사료, 미용, 화장품 및 의학 등 분야에서 보편적으로 사용된다. 현재, 콜라겐 원료는 주로 산, 염기, 가열 등 물리화학적 방법을 통해, 돼지, 소 등 동물의 피부, 뼈 등 조직을 처리한 후 분리정제하여 얻는다. 그러나, 상기 방법으로 얻은 콜라겐 성분은 복잡하고, 수용성이 좋지 않으며, 동물 조직으로부터 유래되므로 바이러스에 의한 잠복 위험성이 존재하여 의약 분야에서 콜라겐의 응용을 제한한다.
DNA 재조합 기술이 신속하게 발전함에 따라, 각종 숙주 세포는 유전공학 균으로 선택되어 콜라겐을 발현하는데 사용된다. 종래 공법에 비해, 콜라겐의 유전공학 균 발효 공법은 생산 원료를 쉽게 얻고, 친환경적이며, 제품 품질이 안정적인 등 이점을 갖고 있지만, 발효 주기가 길고 생산 효율이 낮은 등 문제도 존재한다. 중국 특허 201010602214.8은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 재조합 인간 콜라겐 생산 방법을 공개하였는데, 여기서 파스퇴르 피치아 파스토리스 C13을 균종으로 사용하고, 재조합 콜라겐 발현량은 5 g/L이며, 발효 주기는 99 시간이고, 발효 수준은 0.051 g/L·h로 발효 주기는 짧지만 단백질 발현량과 발효 수준이 매우 낮다. 중국 특허 201110327865.5는 재조합 인간 콜라겐의 파스퇴르 피치아 파스토리스 유전공학 균을 구축하였는데, 여기서, 유전공학 균은 발효 배양을 거쳐 재조합 인간 콜라겐을 얻었으며, 발효 주기는 136 시간이고, 단백질 발현량은 16 g/L이며, 발효 수준은 0.118 g/L·h로 단백질 발현량은 높아졌지만 발효 주기가 너무 길어 발효 수준이 상대적으로 낮다. 따라서, 발효 시간을 더 단축시키고 단백질 발현량을 향상시키며 나아가 발효 수준을 향상시켜 콜라겐의 산업화 대규모 생산에 유리하게 함으로써, 산업화 생산에 실제적인 응용 가치를 가져다 줄 수 있다.
본 발명은 발효 과정에서 0.01 g/L ~ 10 g/L의 피루브산나트륨(Sodium Pyruvate)을 첨가하여 피치아 파스토리스균의 성장 대사 속도를 조절하고, 발효 주기를 단축시키며, 재조합 인간 콜라겐의 발현량을 향상시키고 나아가 재조합 인간 콜라겐의 생산 수준을 향상시키는 발효 공법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 기술적 해결 수단은 하기와 같다.
재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법은, 피치아 파스토리스 균종액을 멸균된 발효 배지에 접종하여, 14 ~ 18 시간 동안 발효 배양한 후, 메탄올을 보충 첨가하여 유도발현을 시작하는 동시에 발효 배지에 피루브산나트륨을 0.01 ~ 10 g/L의 첨가량으로 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 피치아 파스토리스는 파스퇴르 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)이며, 2011년 6월 29일에 중국 미생물 균종 기탁 관리위원회 일반 미생물 센터에 기탁되었으며, 기탁 번호는 CGMCC 제5021호이고, 중국 특허 201110327865.5에서 충분하게 공개되었다.
바람직하게, 상기 피루브산나트륨의 첨가량은 0.1 g/L ~ 1 g/L이다.
바람직하게, 상기 피루브산나트륨의 첨가 방식은 유가(fed-batch) 방식이다.
본 발명에 따른 피치아 파스토리스 발효 배지는 종래 배합 방법을 사용하였으며, 85 ％의 H3PO4: 6.6 ~ 26.7 mL/L, CaSO4·2H2O: 0.3 ~ 1.175 g/L, K2SO4: 4.5 ~ 18.2 g/L, MgSO4·7H2O: 3.7 ~ 14.9 g/L, KOH: 1.0 ~ 4.13 g/L, 글리세린(Glycerin): 10.0 ~ 40.0 g/L, PTM1용액: 0.435 ~ 4.35 mL/L일 수 있다.
본 발명의 발효 공법에서, 피치아 파스토리스 균종액의 접종량은 8 ~ 12 %이고, 발효 온도는 28 ~ 30 ℃이며, 암모니아수 조절 pH는 5.0 ~ 5.2이고, 용존 산소는 20 % 이상이며, 메탄올 유도 시간은 90 ~ 120시간이다.
선행기술에 비해, 본 발명의 현저한 효과는 하기와 같다. 본 발명은 발효 과정에서, 메탄올 유도 발현 단계에서 피루브산나트륨을 첨가하여 재조합 인간 콜라겐의 생합성 속도를 향상시키며, 연속적 유가 방식을 사용하여 재조합 인간 콜라겐의 생물합성 속도를 더 향상시키고 발효 시간을 단축시킬 수 있으며, 동시에 재조합 인간 콜라겐의 발현량을 증가시켜 발효 수준을 20 % 이상 향상시킴으로써 생산 원가를 절약하고, 특히 재조합 인간 콜라겐의 산업화 대규모 생산에 적합하여 산업화 생산에 매우 큰 실제적인 응용 가치를 가져다 줄 수 있다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서, 사용된 균주는 재조합 인간 콜라겐을 발현하는 피치아 파스토리스이며, 파스퇴르 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)이고, 기탁 번호는 CGMCC 제5021호이며, 기탁일은 2011년 6월 29일이고, 기탁 기관은 중국 미생물 균종 기탁 관리위원회 일반 미생물 센터이다.
본 발명에 따른 PTM1 용액은 인비트로젠(Invitrogen) 회사의 사용 설명서를 참조하였으며, 구체적인 배합 방법은, CuSO4·5H2O: 6.0 g/L, NaI: 0.08 g/L, MnSO4·H2O: 3.0 g/L, NaMoO4·2H2O: 0.2 g/L, H3BO3: 0.02 g/L, CoCl2: 0.5 g/L, ZnCl2: 20.0 g/L, FeSO4·7H2O: 65.0 g/L, 바이오틴(biotin): 0.2 g/L, H2SO4: 5.0 mL/L이고, 0.22 m의 막여과로 여과 및 제균하며 실온에서 저장한다.
이하, 실시예와 첨부된 도면을 결부하여 본 발명에 대해 더 상세하게 설명한다.
실시예 1
발효 배지: 85 ％의 H3PO4: 26.7 mL/L, CaSO4·2H2O: 1.175 g/L, K2SO4: 18.2 g/L, MgSO4·7H2O: 14.9 g/L, KOH: 4.13 g/L, 글리세린: 40.0 g/L, PTM1: 4.35 mL/L.
종자액을 10 %의 접종량에 따라 500 L의 발효 배지가 함유된 1,000 L의 발효 탱크에 첨가한 후, 초기 교반 회전속도가 200 rpm이고, 탱크 압력이 0.05 MPa인 조건에서 용존 산소(DO) > 30 % 되도록 공기 유량과 회전속도를 조절한다. 탄소원이 소진된 후, 용존 산소가 급격히 상승할 때, 50 %의 글리세린을 유가하기 시작하여 균체 습중량이 212 g/L일 때까지 탄소원을 보충하고 글리세린 보충 첨가를 정지시키는데, 이때 발효 배양 시간은 16 시간이다. 글리세린이 소진된 후, 메탄올을 유가하기 시작하여 메탄올 유도 배양 단계에 진입하며, 동시에 피루브산나트륨을 한 번에 첨가하는데, 첨가량은 0.01 g/L이다. 용존 산소(DO) > 20 % 되도록 회전속도, 공기 유량 및 메탄올 유가 속도를 조절하고, 유도 발효 96 시간 후, 발효가 종료되어, 발효액을 수집하고, 원심 분리하여 발효 상청액을 얻은 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거쳐 검출하였다. 최종 결과, 재조합 인간 콜라겐 농도는 16.0 g/L이고, 발효 주기는 112 시간이며, 발효 생산 수준은 0.143 g/L·h으로 대조군에 비해 23.3 % 향상되었다.
실시예 2
발효 배지: 85 ％의 H3PO4: 26.7 mL/L, CaSO4·2H2O: 1.175 g/L, K2SO4: 18.2 g/L, MgSO4·7H2O: 14.9 g/L, KOH: 4.13 g/L, 글리세린: 40.0 g/L, PTM1: 4.35 mL/L.
종자액을 10 %의 접종량에 따라 500 L의 발효 배지가 함유된 1,000 L의 발효 탱크에 첨가한 후, 초기 교반 회전속도가 200 rpm이고, 탱크 압력이 0.05 MPa인 조건에서 용존 산소(DO) > 30 % 되도록 공기 유량과 회전속도를 조절한다. 탄소원이 소진된 후, 용존 산소가 급격히 상승할 때, 50 %의 글리세린을 유가하기 시작하여 균체 습중량이 210 g/L일 때까지 탄소원을 보충하고 글리세린 보충 첨가를 정지시키는데 이때 발효 배양 시간은 16 시간이다. 글리세린이 소진된 후, 메탄올을 유가하기 시작하여 메탄올 유도 배양 단계에 진입하며, 동시에 피루브산나트륨을 한 번에 첨가하는데, 첨가량은 10 g/L이다. 용존 산소(DO) > 20 % 되도록 회전속도, 공기 유량 및 메탄올 유가 속도를 조절하고, 유도 발효 96 시간 후, 발효가 종료되어, 발효액을 수집하고, 원심 분리하여 발효 상청액을 얻은 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거쳐 검출하였다. 최종 결과, 재조합 인간 콜라겐 농도는 16.8 g/L이고, 발효 주기는 112 시간이며, 발효 생산 수준은 0.150 g/L·h으로 대조군에 비해 29.3 % 향상되었다.
실시예 3
발효 배지: 85 ％의 H3PO4: 26.7 mL/L, CaSO4·2H2O: 1.175 g/L, K2SO4: 18.2 g/L, MgSO4·7H2O: 14.9 g/L, KOH: 4.13 g/L, 글리세린: 40.0 g/L, PTM1: 4.35 mL/L.
종자액을 10 %의 접종량에 따라 500 L의 발효 배지가 함유된 1,000 L의 발효 탱크에 첨가한 후, 초기 교반 회전속도가 200 rpm이고, 탱크 압력이 0.05 MPa인 조건에서 용존 산소(DO) > 30 % 되도록 공기 유량과 회전속도를 조절한다. 탄소원이 소진된 후, 용존 산소가 급격히 상승할 때, 50 %의 글리세린을 유가하기 시작하여 균체 습중량이 216 g/L일 때까지 탄소원을 보충하고 글리세린 보충 첨가를 정지시키는데 이때 발효 배양 시간은 17 시간이다. 글리세린이 소진된 후, 메탄올을 유가하기 시작하여 메탄올 유도 배양 단계에 진입하며, 동시에 피루브산나트륨을 한 번에 첨가하는데, 첨가량은 0.1 g/L이다. 용존 산소(DO) > 20 % 되도록 회전속도, 공기 유량 및 메탄올 유가 속도를 조절하고, 유도 발효 96 시간 후, 발효가 종료되어, 발효액을 수집하고, 원심 분리하여 발효 상청액을 얻은 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거쳐 검출하였다. 최종 결과, 재조합 인간 콜라겐 농도는 17.8 g/L이고, 발효 주기는 113 시간이며, 발효 생산 수준은 0.158 g/L·h으로 대조군에 비해 36.2 % 향상되었다.
실시예 4
발효 배지: 85 ％의 H3PO4: 26.7 mL/L, CaSO4·2H2O: 1.175 g/L, K2SO4: 18.2 g/L, MgSO4·7H2O: 14.9 g/L, KOH: 4.13 g/L, 글리세린: 40.0 g/L, PTM1: 4.35 mL/L.
종자액을 10 %의 접종량에 따라 500 L의 발효 배지가 함유된 1,000 L의 발효 탱크에 첨가한 후, 초기 교반 회전속도가 200 rpm이고, 탱크 압력이 0.05 MPa인 조건에서 용존 산소(DO) > 30 % 되도록 공기 유량과 회전속도를 조절한다. 탄소원이 소진된 후, 용존 산소가 급격히 상승할 때, 50 %의 글리세린을 유가하기 시작하여 균체 습중량이 213 g/L일 때까지 탄소원을 보충하고 글리세린 보충 첨가를 정지시키는데 이때 발효 배양 시간은 18 시간이다. 글리세린이 소진된 후, 메탄올을 유가하기 시작하여 메탄올 유도 배양 단계에 진입하며, 동시에 발효가 종료될 때까지 피루브산나트륨 용액을 연속적으로 유가하는데, 전체 첨가량은 0.1 g/L이다. 용존 산소(DO) > 20 % 되도록 회전속도, 공기 유량 및 메탄올 유가 속도를 조절하고, 유도 발효 90 시간 후, 발효가 종료되어, 발효액을 수집하고, 원심 분리하여 발효 상청액을 얻은 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거쳐 검출하였다. 최종 결과, 재조합 인간 콜라겐 농도는 18.2 g/L이고, 발효 주기는 108 시간이며, 발효 생산 수준은 0.169 g/L·h으로 대조군에 비해 45.3 % 향상되었다.
실시예 5
발효 배지: 85 ％의 H3PO4: 26.7 mL/L, CaSO4·2H2O: 1.175 g/L, K2SO4: 18.2 g/L, MgSO4·7H2O: 14.9 g/L, KOH: 4.13 g/L, 글리세린: 40.0 g/L, PTM1: 4.35 mL/L.
종자액을 10 %의 접종량에 따라 500 L의 발효 배지가 함유된 1,000 L의 발효 탱크에 첨가한 후, 초기 교반 회전속도가 200 rpm이고, 탱크 압력이 0.05 MPa인 조건에서 용존 산소(DO) > 30 % 되도록 공기 유량과 회전속도를 조절한다. 탄소원이 소진된 후, 용존 산소가 급격히 상승할 때, 50 %의 글리세린을 유가하기 시작하여 균체 습중량이 212 g/L일 때까지 탄소원을 보충하고 글리세린 보충 첨가를 정지시키는데 이때 발효 배양 시간은 16 시간이다. 글리세린이 소진된 후, 메탄올을 유가하기 시작하여 메탄올 유도 배양 단계에 진입하며, 동시에 발효가 종료될 때까지 피루브산나트륨 용액을 연속적으로 유가하는데, 전체 첨가량은 1 g/L이다. 용존 산소(DO) > 20 % 되도록 회전속도, 공기 유량 및 메탄올 유가 속도를 조절하고, 유도 발효 96 시간 후, 발효가 종료되어, 발효액을 수집하고, 원심 분리하여 발효 상청액을 얻은 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거쳐 검출하였다. 최종 결과, 재조합 인간 콜라겐 농도는 18.0 g/L이고, 발효 주기는 112 시간이며, 발효 생산 수준은 0.161 g/L·h으로 대조군에 비해 38.8 % 향상되었다.
실시예 6
발효 배지: 85 ％의 H3PO4: 26.7 mL/L, CaSO4·2H2O: 1.175 g/L, K2SO4: 18.2 g/L, MgSO4·7H2O: 14.9 g/L, KOH: 4.13 g/L, 글리세린: 40.0 g/L, PTM1: 4.35 mL/L.
종자액을 10 %의 접종량에 따라 500 L의 발효 배지가 함유된 1,000 L의 발효 탱크에 첨가한 후, 초기 교반 회전속도가 200 rpm이고, 탱크 압력이 0.05 MPa인 조건에서 용존 산소(DO) > 30 % 되도록 공기 유량과 회전속도를 조절한다. 탄소원이 소진된 후, 용존 산소가 급격히 상승할 때, 50 %의 글리세린을 유가하기 시작하여 균체 습중량이 210 g/L일 때까지 탄소원을 보충하고 글리세린 보충 첨가를 정지시키는데 이때 발효 배양 시간은 17 시간이다. 글리세린이 소진된 후, 메탄올을 유가하기 시작하여 메탄올 유도 배양 단계에 진입하며, 동시에 피루브산나트륨을 한 번에 첨가하는데, 첨가량은 1 g/L이다. 용존 산소(DO) > 20 % 되도록 회전속도, 공기 유량 및 메탄올 유가 속도를 조절하고, 유도 발효 96 시간 후, 발효가 종료되어, 발효액을 수집하고, 원심 분리하여 발효 상청액을 얻은 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거쳐 검출하였다. 최종 결과, 재조합 인간 콜라겐 농도는 17.5 g/L이고, 발효 주기는 113 시간이며, 발효 생산 수준은 0.155 g/L·h으로 대조군에 비해 33.6 % 향상되었다.
실시예 7
발효 배지: 85 ％의 H3PO4: 6.6 mL/L, CaSO4·2H2O: 0.3 g/L, K2SO4: 4.5 g/L, MgSO4·7H2O: 3.7 g/L, KOH: 1 g/L, 글리세린: 10.0 g/L, PTM1: 0.435 mL/L.
종자액을 10 %의 접종량에 따라 500 L의 발효 배지가 함유된 1,000 L의 발효 탱크에 첨가한 후, 초기 교반 회전속도가 200 rpm이고, 탱크 압력이 0.05 MPa인 조건에서 용존 산소(DO) > 30 % 되도록 공기 유량과 회전속도를 조절한다. 탄소원이 소진된 후, 용존 산소가 급격히 상승할 때, 50 %의 글리세린을 유가하기 시작하여 균체 습중량이 210 g/L일 때까지 탄소원을 보충하고 글리세린 보충 첨가를 정지시키는데 이때 발효 배양 시간은 17 시간이다. 글리세린이 소진된 후, 메탄올을 유가하기 시작하여 메탄올 유도 배양 단계에 진입하며, 동시에 피루브산나트륨을 한 번에 첨가하는데, 첨가량은 1 g/L이다. 용존 산소(DO) > 20 % 되도록 회전속도, 공기 유량 및 메탄올 유가 속도를 조절하고, 유도 발효 96 시간 후, 발효가 종료되어, 발효액을 수집하고, 원심 분리하여 발효 상청액을 얻은 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거쳐 검출하였다. 최종 결과, 재조합 인간 콜라겐 농도는 17.1 g/L이고, 발효 주기는 113 시간이며, 발효 생산 수준은 0.151 g/L·h으로 대조군에 비해 30.2 % 향상되었다.
비교예
발효 배지는 기본 염 배지(basal salt medium, BSM, CN102443057B 참조)이며, 85 ％의 H3PO4: 26.7 mL/L, CaSO4·2H2O: 1.175 g/L, K2SO4: 18.2 g/L, MgSO4·7H2O: 14.9 g/L, KOH: 4.13 g/L, 글리세린: 40.0 g/L, PTM1: 4.35 mL/L.
종자액을 10 %의 접종량에 따라 500 L의 발효 배지가 함유된 1,000 L의 발효 탱크에 첨가한 후, 초기 교반 회전속도가 200 rpm이고, 탱크 압력이 0.05 MPa인 조건에서 용존 산소(DO) > 30 % 되도록 공기 유량과 회전속도를 조절한다. 탄소원이 소진된 후, 용존 산소가 급격히 상승할 때, 50 %의 글리세린을 유가하기 시작하여 균체 습중량이 218 g/L일 때까지 탄소원을 보충하고 글리세린 보충 첨가를 정지시키는데, 이때 발효 배양 시간은 16 시간이다. 글리세린이 소진된 후, 메탄올을 유가하기 시작하여 메탄올 유도 배양 단계에 진입하며, 용존 산소(DO) > 20 % 되도록 회전속도, 탱크 압력, 공기 유량 및 메탄올 유가 속도를 조절하고, 유도 발효 120 시간 후, 발효가 종료되어, 발효액을 수집하고, 원심 분리하여 발효 상청액을 얻은 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 거쳐 검출하였다. 최종 결과, 재조합 인간 콜라겐 농도는 15.8 g/L이고, 발효 주기는 136 시간이며, 발효 생산 수준은 0.116 g/L·h이다.

Claims (6)

  1. 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 균종액을 10 %의 접종량에 따라 500 L의 피치아 파스토리스 발효 배지가 함유된 1,000 L의 발효 탱크에 첨가한 후, 초기 교반 회전속도가 200 rpm이고, 탱크 압력이 0.05 MPa인 조건에서 용존 산소가 30 % 초과가 되도록 공기 유량 및 회전속도를 조절하고, 탄소원이 소진된 후, 용존 산소가 상승할 때, 50 %의 글리세린을 유가(fed-batch)하기 시작하여 균체 습중량이 213 g/L일 때까지 탄소원을 보충하고 글리세린 보충 첨가를 정지시키는데 이때 발효 배양 시간은 18 시간이며, 글리세린이 소진된 후, 메탄올을 유가하기 시작하여 메탄올 유도 배양 단계에 진입하고, 동시에 발효가 종료될 때까지 피루브산나트륨 용액을 연속적으로 유가하는데 이때 전체 첨가량은 0.1 g/L이며, 용존 산소가 20 % 초과가 되도록 회전속도, 공기 유량 및 메탄올 유가 속도를 조절하는 단계를 포함하고, 메탄올 유도시간이 90 시간인, 재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법으로서,
    상기 피치아 파스토리스는 파스퇴르 피치아 파스토리스이고, 기탁 번호는 CGMCC 제5021호이며,
    상기 피치아 파스토리스 발효 배지의 배합 방법은 85 ％의 H3PO4이 26.7 mL/L, CaSO4·2H2O이 1.175 g/L, K2SO4이 18.2 g/L, MgSO4·7H2O이 14.9 g/L, KOH이 4.13 g/L, 글리세린이 40.0 g/L, PTM1 용액이 4.35 mL/L인 것을 특징으로 하는, 재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법.
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