CN101570771A - 一种毕赤酵母基因工程菌发酵生产s-腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由毕赤酵母基因工程菌发酵生产S－腺苷甲硫氨酸的方法，包括将整合了外源表达基因S－腺苷甲硫氨酸合成酶基因的毕赤酵母基因工程菌种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，其特征在于：所述的毕赤酵母基因工程菌种子液接种到发酵培养基中的接种量是5～10(v/v)％；所述的发酵培养中的培养条件是28～32℃，pH3.0～8.0，溶氧水平保持30％～100％；培养至菌体密度为80～120g/L时，向发酵培养基中添加甲醇开始甲醇诱导，甲醇浓度控制在0.3～1.0(w/v)％，同时添加L－甲硫氨酸浓度控制在12.5～100mmol/L和添加硫酸铵控制铵离子浓度在300～600mmol/L。本发明的发酵生产S－腺苷甲硫氨酸的方法在100h发酵时间内积累SAM产量可达到11.6g/L以上，因此，发酵周期短、SAM产量高且操作简便，可用于SAM的大规模生产制备。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种由毕赤酵母(Pichia pastoris)基因工程菌发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的方法。
背景技术
腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)广泛存在于动物、植物体内，是重要的生物中间体。SAM分子式为C15H22N6O5S，分子量为398.44，结晶为固体，易溶于水。SAM有两种构型，R型和S型，在生物体中只有S型SAM有生物活性。在中性和碱性条件下易吸潮导致构型转变为无生物活性的R-SAM。S-SAM在低温、酸性以及干燥的条件下可以长时间保存。生物体内SAM的形成由腺苷甲硫氨酸合成酶(EC 2.5.1.6)催化腺苷三磷酸和甲硫氨酸反应得到。具有活性的(S，S)型主要起转甲基、转硫、转氨丙基作用，体内SAM合成转化和降解主要在肝脏完成。由于SAM在体内广泛而且具有重要的代谢作用，还可通过临床给药治疗抑郁症、关节炎、酒精肝、肝炎、肝功能紊乱等疾患，人们积极开发SAM的商业化产品。在生物体中SAM分子中大多数基团都可以为生物体提供代谢原料或者直接具有生物活性，被认为“全身是宝”，但SAM的不稳定性却限制了应用。由此，人们又通过研制具有生物活性的SAM盐，以提高其稳定性，为SAM的进一步临床应用和药理研究奠定基础。
通常，腺苷甲硫氨酸的制备可以由化学合成、体外酶促合成或从微生物提取。化学法合成SAM由于它的产率低，反应底物L-高半胱氨酸价格昂贵，反应产物又具有(S，S)和(R，S)两种腺苷甲硫氨酸的混旋物等明显缺点，而很少被实际应用。Gantoni等人首先用从肝脏细胞中提取的SAM合成酶催化合成SAM(Gantoni G L.S-adenosyl-L-methionine：A new intermediate formedenzymatically from L-methionine and adenosinetriphosphate.Journal ofBiological Chemistry.1953，204：403-416)。Cross等人从组织和酿酒酵母中分离SAM合成酶合成具有生物活性的SAM(Cross A.，Geresh S.，Celia W.Enzymatic synthesis of S-adenosyl-L-methionine from L-methionine and ATP.Applied Biochemistry and Biotechnology.1983，8：415-451)。随着固定化技术的发展，固定化SAM合成酶被用于SAM的合成。Marthews等人利用基因工程手段将SAM合成酶基因(metK)克隆到大肠杆菌中表达，用该株大肠杆菌产生的SAM合成酶合成SAM(Marthews R G.，Neidhardt F C.Abnormalinduction of heat shock proteins in an Escherichina coli mutant deficient inadenolsylmethionine synthetase activity.The Journal of Bacteriology.1988，170：1582-1588)。体外酶法合成尽管反应产物纯度高，但分离酶的成本太高，所以一般用于合成同位素标记的SAM。而某些微生物可以在细胞内积累SAM，通过对这些微生物的发酵，尤其是在培养基中添加一定量甲硫氨酸的情况下可以获得大量的SAM。因此通过微生物发酵，再从中提取SAM是目前工业生产SAM的主要途径。Schlenk从富含L-甲硫氨酸的面包酵母提取SAM，但产物含量低，分离纯化困难，没有形成可行的生产工艺(Schlenk B F，Depalma D J.The preparation of S-adenosylmethionine.Journal of BiologicalChemistry.1957，229：1051-1056)；Shiozaki从300多株中筛选分离到一株面包酵母(Saccharomyces sake k-6)菌，在10mL培养基发酵产出1.55g/L SAM；进一步优化培养条件后，该菌在10L发酵罐中培养7天后SAM产量高达10.8g/L(Shiozaki S，Shimizu S，Yamada H.Unusual intracellular accumulationof S-adenosyl-L-methionine by microorganisms.Agricultural and BiologicalChemistry.1984，48：2293-2300)。国内也有学者筛选微生物积累SAM。基因工程技术的发展和细胞代谢途径研究的进展，使得有目的地改造细胞成为可能。酿酒酵母细胞内有两种SAM合成酶同功酶即SAM合成酶I和SAM合成酶II，两者的氨基酸同源性高达92％。SAM合成酶I有产物抑制作用，而SAM合成酶II没有抑制作用。李东阳等将克隆得到的酿酒酵母来源的SAM合成酶II基因置于醇氧化酶1(AOX1)启动子调控下，整合到毕赤酵母中高效表达，得到比野生菌细胞内SAM累积量高出30多倍的重组菌(李东阳，于健，田露，吉鑫松，袁中一，利用重组Pichia pastoris生产腺苷甲硫氨酸，生物工程学报，2002，18：295-299)。在优化试管培养条件后，该菌在外加一定量L-甲硫氨酸的培养基中发酵，SAM产量达到1.72g/L。通过改造毕赤酵母细胞代谢途径，增强细胞SAM合成代谢流，达到了高累积SAM的目的。目前发酵放大也SAM大规模、高产量制备的难点。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的毕赤酵母基因工程菌发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的方法存在的产量低的不足，提供一种由毕赤酵母基因工程菌发酵生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的方法，该方法发酵周期短、SAM产量高且操作简便，可用于SAM的大规模生产。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种由毕赤酵母基因工程菌发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，包括将整合了外源表达基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因能够合成S-腺苷甲硫氨酸的毕赤酵母基因工程菌种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养包括菌体生长倍增阶段和甲醇诱导重组蛋白表达阶段，其特征在于：所述的毕赤酵母基因工程菌种子液接种到发酵培养基中的接种量是5～10％(v/v)；所述的发酵培养中的培养条件是28～32℃，pH3.0～8.0，溶氧水平保持30％～100％；培养至菌体密度为80～120g/L时，向发酵培养基中添加甲醇开始甲醇诱导，甲醇浓度控制在0.3～1.0％(w/v)，同时添加L-甲硫氨酸浓度控制在12.5～100mmol/L和添加硫酸铵控制铵离子浓度在300～600mmol/L。
本发明中，将毕赤酵母基因工程菌种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。其中，所述的发酵培养的发酵工艺在本领域常规使用的培养容器中进行，较佳的为搅拌式发酵罐。所述的发酵培养中的培养条件是28～32℃，较佳的是30℃；pH3.0～8.0，较佳的pH5.0；溶氧水平保持30％～100％。为保持溶氧水平30％～100％，在所述的发酵培养的培养过程中，较佳的搅拌速率500～1000rpm，同时通空气量1～3v/v.m。所述的发酵培养包括菌体生长倍增阶段和甲醇诱导重组蛋白表达阶段。较佳的，在所述的菌体生长倍增阶段，当细胞消耗完培养基中初始碳源时，溶氧有一个明显的跃升，进行补料，即流加浓度为30～80％(w/v)甘油或30～60％(w/v)葡萄糖，其中含24mLPTM1/1000g甘油或葡萄糖。至菌种细胞浓度为80～120g/L时结束流加，然后再继续保持60％～100％溶氧水平0.5～2h后，再进行下一步操作。流加结束后溶氧水平有一个大跳跃，说明细胞已经消耗完碳源，再继续保持高溶氧水平是为了使细胞继续代谢残余碳源和碳源代谢产物(乙醇和乙酸等)。其中所述的PTM1以一升计为含有如下组分的水溶液：CuSO4·5H2O 6.0g、KI0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2MoO4·2H2O 0.2g、H3BO30.02g、ZnSO4·7H2O 20g、FeSO4·7H2O 65.0g、CoCl2·6H2O 0.5g、生物素0.2g、H2SO45.0mL。
本发明中，当培养至菌体密度为80～120g/L时，向发酵培养基中添加甲醇开始甲醇诱导，甲醇浓度控制在0.3～1.0％(w/v)，更佳的控制浓度为0.4～0.8％(w/v)。甲醇的流加速率较佳的开始为1ml/L.h，然后以1ml/L.h增加6h，直至达到6ml/L.h。甲醇的加入既作为新的碳源，又作为重组蛋白的诱导源，诱导S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达。具体诱导方式可参见文献StrattonJ，Chiruvolu V，Meagher M.High cell-density fermentation[A].Higgins D R，Cregg J M.Methods in Molecular Biology：Pichia Protocols.Totowa，NJ：Humana Press，1998，103：107-120。在所述的甲醇诱导中，甲醇诱导开始到发酵结束的时间较佳的是16～160h。
本发明中，添加甲醇开始甲醇诱导的同时还添加L-甲硫氨酸浓度控制在12.5～100mmol/L，较佳的控制在40～80mmol/L。所述的甲硫氨酸较佳的为L-甲硫氨酸和/或D，L-甲硫氨酸混合物。真正作为S-腺苷甲硫氨酸合成酶的底物参与反应的只有L-甲硫氨酸，D-甲硫氨酸不参与反应。同时还添加硫酸铵控制铵离子浓度在300～600mmol/L，较佳的控制在400～550mmol/L。铵离子在发酵过程中不仅为细胞生长提供氮源，也为SAM的积累提供原料。
本发明中，所述的发酵培养基可以是本领域常规的毕赤酵母发酵培养基，较佳的是按一升计含有以下组分的培养基：H3PO426.7mL、CaSO40.93g、K2SO418.2g、MgSO4·7H2O 14.9g、KOH 4.13g、甘油或葡萄糖40g、PTM14.35mL，余为水，用氨水调至pH5.0；其中，所述的PTM1按一升计含有以下组分：CuSO4·5H2O 6.0g、KI 0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2MoO4·2H2O 0.2g、H3BO30.02g、ZnSO4·7H2O 20g、FeSO4·7H2O 65.0g、CoCl2·6H2O 0.5g、生物素0.2g、H2SO45.0mL，余为水。培养基配制好后，采用本领域常规使用的方法高温灭菌，较佳的方式为115℃，20min。
本发明中，所述的整合了外源表达基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因能够合成S-腺苷甲硫氨酸的毕赤酵母基因工程菌可以是本领域现有的任何整合了外源表达基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因能够合成S-腺苷甲硫氨酸的毕赤酵母基因工程菌，较佳的为含有表达质粒pPIC3.5K的重组毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)。
本发明中，所述的由毕赤酵母基因工程菌发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的方法较佳的还包括种子培养的步骤，整合了外源表达基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的毕赤酵母基因工程菌种子接种到种子培养基中，进行种子培养。所述的毕赤酵母基因工程菌种子可以是使用本领域常规方法保藏的种子，较佳的是2个月内平板保存的种子或者长期保存的低温冷冻甘油管种子(-20℃～-80℃)。所述的种子培养基可以是本领域常规的液体培养基，如YPD培养基，较佳的是按一升计含有以下组分的培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖或甘油20g，余为水。培养基配制好后，采用本领域常规使用的方法高温灭菌，较佳的方式为115℃，20min。种子培养的接种量较佳的是5～10％(v/v)，培养条件较佳的是28～32℃，pH3.0～8.0，100～250rpm，培养16～20h。种子培养也可以采用二级放大培养。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明中，上述的各技术特征的优选条件可以任意组合，得到较佳的技术方案用于生产S-腺苷甲硫氨酸。
本发明的积极进步效果在于：本发明的发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的方法在100h发酵时间内积累SAM产量可达到11.6g/L以上，发酵时间大大缩短，提高了SAM生产产率。因此，本发明的发酵方法发酵周期短、SAM产量高且操作简便，可用于SAM的大规模生产制备。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中所使用的各种原料，试剂以及设备均为常规市售产品。
实施例中所用的种子：带有S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的毕赤酵母GS115种子是由文献(Zhang J.G.，Wang X.D.，Zhang J.N.，Wei D.Z.Oxygenvectors used for S-adenosylmethionine production in recombinant Pichia pastoriswith sorbitol as supplemental carbon source.Journal of Bioscience andBioengingeering.2008，105：335-340)公开的种子。
实施例1
(1)种子培养
用接种针在长好的斜面上刮取少许菌落接到液体种子培养基中，装瓶量为25mL/250mL，30℃、200rpm摇床培养16小时。种子培养基组成成分为(按1L配制)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，余为水；pH5.0。
(2)发酵培养
将100ml OD600值5的含有种子的种子培养基接种到含发酵培养基的3.7L发酵罐(KLF20003.7L，Bioengineering AG，Switzerland)中，接种量相当于5％(v/v)。发酵培养基(按1L配制)为：H3PO426.7mL、CaSO40.93g、K2SO418.2g、MgSO4·7H2O 14.9g、KOH 4.13g、甘油40g、PTM14.35mL，余为水，用28～30％(w/v)氨水调至pH5.0。其中，PTM1(按1L配制)：CuSO4·5H2O 6.0g、KI0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2MoO4·2H2O 0.2g、H3BO30.02g、ZnSO4·7H2O20g、FeSO4·7H2O 65.0g、CoCl2·6H2O 0.5g、生物素0.2g、H2SO45.0mL，余为水。发酵培养初始条件：30℃，搅拌转速500rpm，pH5.0。培养过程中调节搅拌(500～1,000rpm)和通空气量(1～3v/v.m)保持溶氧30％～100％。发酵罐上的溶氧电极实时检测溶氧水平，当溶氧有一个明显的跃升时，即表明细胞消耗完初始甘油，此时开始流加含有12mL PTM1/L的50％(w/v)甘油，甘油流加速度为30g/L.h，每2h采用分光光度法测定细胞浓度，当菌体浓度为100g/L后结束甘油流加。结束甘油流加后溶氧有一个大跳升，说明细胞已经消耗完甘油。然后保持1h高溶氧水平，使细胞代谢残余甘油和甘油代谢副产物(如乙醇，乙酸等)。继而开始流加甲醇诱导外源蛋白表达，甲醇诱导方式按照Stratton方法，初始甲醇流加速率为1ml/L.h，然后甲醇流加速率以1ml/L.h增加6h，直至甲醇流加速率达到6ml/L.h，使甲醇浓度控制在0.8％(w/v)。同时添加L-甲硫氨酸和硫酸铵，添加L-甲硫氨酸至50mol/L。每8h测定铵离子浓度，添加硫酸铵保持铵离子浓度450mmol/L。甲醇诱导期间添加L-甲硫氨酸和硫酸铵后增大罐压到40kPa。
甲醇诱导后每8h测定发酵液的细胞浓度和SAM含量，SAM含量下降时结束发酵。SAM的测定方法如下：向发酵液加人等体积的20％(w/v)的高氯酸，混匀后冷却至4℃放置8h以上，离心12,000rpm，3min，经孔径为0.22μm的膜过滤，用HPLC(HP1100，Agilent，USA)测定SAM的响应面积，和已知浓度SAM的面积对比，计算SAM的含量。流动相：0.5mmol/L甲酸铵(pH4.0)，流速2.0mL/min，检测波长254nm。直至发酵结束(全发酵时间为99h，诱导时间为47h)，SAM产量为11.63g/L。
实施例2
(1)种子培养
用接种针在长好的斜面上刮取少许菌落接到液体种子培养基中，装瓶量为25ml/250ml，32℃、250rpm摇床培养20小时。种子培养基组成成分为(按1L配制)：酵母粉10g，蛋白胨20g，甘油20g，余为水；pH8.0。
(2)发酵培养
将200ml OD600值10的含有种子的种子培养基接种到含发酵培养基的3.7L发酵罐中，接种量相当于10％(v/v)。发酵培养基(按1L配制)为：H3PO426.7mL、CaSO40.93g、K2SO418.2g、MgSO4·7H2O 14.9g、KOH 4.13g、甘油40g、PTM14.35mL，余为水，用28～30％(w/v)氨水调至pH5.0。其中，PTM1(按1L配制)：CuSO4·5H2O 6.0g、KI0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2MoO4·2H2O0.2g、H3BO30.02g、ZnSO4·7H2O 20g、FeSO4·7H2O 65.0g、CoCl2·6H2O 0.5g、生物素0.2g、H2SO45.0mL，余为水。发酵培养初始条件：32℃，搅拌转速500rpm，pH5.0。培养过程中调节搅拌(500～1,000rpm)和通气量(1～3v/v.m)保持溶氧30％～100％。当溶氧有一个明显的跃升时，开始流加含有12mLPTM1/L的80％(w/v)甘油，甘油流加速度为30g/L.h，每2h测定细胞浓度，当菌体浓度为100g/L后结束甘油流加。结束甘油流加后溶氧有一个大跳升，说明细胞已经消耗完甘油。然后保持1h高溶氧水平，使细胞代谢残余甘油和甘油代谢副产物(如乙醇，乙酸等)。继而开始流加甲醇诱导外源蛋白表达，甲醇诱导方式按照Stratton方法，初始甲醇流加速率为1ml/L.h，然后甲醇流加速率以1ml/L.h增加6h，直至甲醇流加速率达到6ml/L.h，使甲醇浓度控制在0.8％(w/v)。同时添加L-甲硫氨酸和硫酸铵，添加L-甲硫氨酸至50mol/L。每8h测定铵离子浓度，添加硫酸铵保持铵离子浓度450mmol/L。甲醇诱导期间添加L-甲硫氨酸和硫酸铵后增大罐压到50kPa。
甲醇诱导后每8h测定发酵液的细胞浓度和SAM含量，SAM含量下降时结束发酵。SAM的测定方法如如实施例1所述。直至发酵结束(全发酵时间为115h，诱导时间为54h)，SAM产量为12.52g/L。
实施例3
(1)种子培养
用接种针在长好的斜面上刮取少许菌落接到液体种子培养基中，装瓶量为20ml/250ml，28℃、100rpm摇床培养18小时。种子培养基组成成分为(按1L配制)：酵母粉10g，蛋白胨20g，甘油20g，余为水；pH8.0。
(2)发酵培养
将120ml OD600值5的含有种子的种子培养基接种到含发酵培养基的3.7L发酵罐中，接种量相当于6％(v/v)。发酵培养基(按1L配制)为：H3PO426.7mL、CaSO40.93g、K2SO418.2g、MgSO4·7H2O 14.9g、KOH 4.13g、甘油40g、PTM14.35mL，余为水，用28～30％(w/v)氨水调至pH5.0。其中，PTM1(按1L配制)：CuSO4·5H2O 6.0g、KI0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2MoO4·2H2O0.2g、H3BO30.02g、ZnSO4·7H2O 20g、FeSO4·7H2O 65.0g、CoCl2·6H2O 0.5g、生物素0.2g、H2SO45.0mL，余为水。发酵培养初始条件：28℃，搅拌转速500rpm，pH3.0。培养过程中调节搅拌(500～1,000rpm)和通气量(1～3v/v.m)保持溶氧30％～100％。当溶氧有一个明显的跃升时，开始流加含有12mLPTM1/L的30％(w/v)葡萄糖，葡萄糖流加速度为18g/L.h，每2h测定细胞浓度，当菌体浓度为80g/L后结束葡萄糖流加。结束葡萄糖流加后溶氧有一个大跳升，说明细胞已经消耗完葡萄糖。然后保持2h高溶氧水平，使细胞代谢残余葡萄糖和葡萄糖代谢副产物(如乙醇，乙酸等)。继而开始流加甲醇诱导外源蛋白表达，甲醇诱导方式按照Stratton方法，初始甲醇流加速率为1ml/L.h，然后甲醇流加速率以1ml/L.h增加6h，直至甲醇流加速率达到6ml/L.h，甲醇浓度控制在0.3％(w/v)。同时添加L-甲硫氨酸和硫酸铵，添加L-甲硫氨酸至12.5mol/L。每8h测定铵离子浓度，添加硫酸铵保持铵离子浓度300mmol/L。甲醇诱导期间添加L-甲硫氨酸和硫酸铵后增大罐压到60kPa。
甲醇诱导后每8h测定发酵液的细胞浓度和SAM含量，SAM含量下降时结束发酵。SAM的测定方法如实施例1所述。直至发酵结束(全发酵时间为160h，诱导时间为102h)，SAM产量为10.22g/L。
实施例4
(1)种子培养
用接种针在长好的斜面上刮取少许菌落接到液体种子培养基中，装瓶量为20ml/250ml，32℃、250rpm摇床培养20小时。种子培养基组成成分为(按1L配制)：酵母粉10g，蛋白胨20g，甘油20g，余为水；pH8.0。
(2)发酵培养
将180ml OD600值8的含有种子的种子培养基接种到含发酵培养基的3.7L发酵罐中，接种量相当于9％(v/v)。发酵培养基(按1L配制)为：H3PO426.7mL、CaSO40.93g、K2SO418.2g、MgSO4·7H2O 14.9g、KOH 4.13g、甘油40g、PTM14.35mL，余为水，用28～30％(w/v)氨水调至pH5.0。其中，PTM1(按1L配制)：CuSO4·5H2O 6.0g、KI0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2MoO4·2H2O0.2g、H3BO30.02g、ZnSO4·7H2O 20g、FeSO4·7H2O 65.0g、CoCl2·6H2O 0.5g、生物素0.2g、H2SO45.0mL，余为水。发酵培养初始条件：32℃，搅拌转速500rpm，pH8.0。培养过程中调节搅拌(500～1,000rpm)和通气量(1～3v/v.m)保持溶氧30％～100％。当溶氧有一个明显的跃升时，开始流加含有12mLPTM1/L的60％(w/v)葡萄糖，甘油流加速度为54g/L.h，每2h测定细胞浓度，当菌体浓度为120g/L后结束甘油流加。结束甘油流加后溶氧有一个大跳升，说明细胞已经消耗完甘油。然后保持0.5h高溶氧水平，使细胞代谢残余甘油和甘油代谢副产物(如乙醇，乙酸等)。继而开始流加甲醇诱导外源蛋白表达，甲醇诱导方式按照Stratton方法，初始甲醇流加速率为1ml/L.h，然后甲醇流加速率以1ml/L.h增加6h，直至甲醇流加速率达到6ml/L.h，甲醇浓度控制在1.0％(w/v)。同时添加L-甲硫氨酸和硫酸铵，添加L-甲硫氨酸至100mol/L。每2h测定铵离子浓度，添加硫酸铵保持铵离子浓度600mmol/L。甲醇诱导期间添加L-甲硫氨酸和硫酸铵后增大罐压到40kPa。
甲醇诱导后每8h测定发酵液的细胞浓度和SAM含量，SAM含量下降时结束发酵。SAM的测定方法如如实施例1所述。直至发酵结束(全发酵时间为16h，诱导时间为14h)，SAM产量为11.54g/L。
Claims (9)
1、一种由毕赤酵母基因工程菌发酵生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，包括将整合了外源表达基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因能够合成S-腺苷甲硫氨酸的毕赤酵母基因工程菌种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养包括菌体生长倍增阶段和甲醇诱导重组蛋白表达阶段，其特征在于：所述的毕赤酵母基因工程菌种子液接种到发酵培养基中的接种量是5～10％(v/v)；所述的发酵培养中的培养条件是28～32℃，pH3.0～8.0，溶氧水平保持30％～100％；培养至菌体密度为80～120g/L时，向发酵培养基中添加甲醇开始甲醇诱导，甲醇浓度控制在0.3～1.0％(w/v)，同时添加L-甲硫氨酸浓度控制在12.5～100mmol/L和添加硫酸铵控制铵离子浓度在300～600mmol/L。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的发酵培养的培养过程中，搅拌500～1000rpm，同时通氧气量1～3v/v.m。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述的菌体生长倍增阶段，当细胞消耗完培养基中初始碳源时，溶氧有一个明显的跃升，进行补料，即流加浓度为30～80％(w/v)甘油或30～60％(w/v)葡萄糖，其中含24mLPTM1/1000g甘油或葡萄糖；至菌种细胞浓度为目标量时结束流加，然后再继续保持60％～100％溶氧水平0.5～2h后，再进行下一步操作；所述的PTM1以一升计为含有如下组分的水溶液：CuSO4·5H2O 6.0g、KI 0.08g、MnSO4·H2O3.0g、Na2MoO4·2H2O 0.2g、H3BO30.02g、ZnSO4·7H2O 20g、FeSO4·7H2O 65.0g、CoCl2·6H2O 0.5g、生物素0.2g、H2SO45.0mL。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述的甲醇诱导中，甲醇的流加速率开始为1ml/L.h，然后以1ml/L.h增加6h，直至达到6ml/L.h。
5、如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述的甲醇诱导中，甲醇诱导开始到发酵结束的时间是16～160h。
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的发酵培养基是按一升计含有以下组分的培养基：H3PO4 26.7mL、CaSO4 0.93g、K2SO4 18.2g、MgSO4·7H2O 14.9g、KOH 4.13g、甘油或葡萄糖40g、PTM1 4.35mL，余为水，用氨水调至pH5.0；其中，所述的PTM1按一升计含有以下组分：CuSO4·5H2O 6.0g、KI 0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2MoO4·2H2O 0.2g、H3BO30.02g、ZnSO4·7H2O 20g、FeSO4·7H2O 65.0g、CoCl2·6H2O 0.5g、生物素0.2g、H2SO4 5.0mL，余为水。
7、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的整合了外源表达基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因能够合成S-腺苷甲硫氨酸的毕赤酵母基因工程菌为含有表达质粒pPIC3.5K的重组毕赤酵母GS115(Pichia pastorisGS115)。
8、如权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括种子培养的步骤，整合了外源表达基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因能够合成S-腺苷甲硫氨酸的毕赤酵母基因工程菌种子接种到种子培养基中，28～32℃，pH3.0～8.0，100～250rpm，培养16～20h。
9、如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的种子培养基是按一升计含有以下组分的培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖或甘油20g，余为水。
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