CN109680025B - 提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺 - Google Patents

提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺。所述工艺首先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，酵培养，在甲醇诱导培养阶段向发酵培养基中加入0.1～10g/L的柠檬酸铵。本发明在发酵过程中，选取在甲醇诱导表达阶段加入柠檬酸铵，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，发酵时间缩短，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，同时也提高了重组人源胶原蛋白在发酵液中的稳定性，节约了生产成本，特别适用于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来巨大的实际应用价值。

Description

提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵 工艺
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺。
背景技术
胶原蛋白是动物体内一类重要的蛋白质，广泛分布于皮肤、软骨、血管等组织，参与细胞的迁移、分化和繁殖，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能起着重要的作用，在食品、饲料、美容、化妆品、医药等领域应用普遍。目前，胶原蛋白原料主要通过酸、碱、加热等物理化学方法处理如猪、牛等动物皮肤、骨骼等组织后分离纯化获得。但是，上述方法得到的胶原蛋白成分复杂，水溶性差，并且由于来自动物组织，存在病毒隐患，限制了胶原蛋白在医药方面的应用。
随着DNA重组技术的迅速发展，各种宿主细胞被选为基因工程菌用于表达胶原蛋白。与传统工艺相比，胶原蛋白的基因工程菌发酵工艺具有生产原料易得、环保、产品质量稳定等优点，但是也存在着发酵周期较长，生产效率较低等问题。中国专利201010602214.8公开了一种毕赤酵母表达重组类人胶原蛋白的生产方法，采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris C13为菌种，重组胶原蛋白表达量为5g/L，发酵周期99小时，发酵水平为0.051g/L·h，发酵周期虽短，但蛋白表达量和发酵水平过低。中国专利201110327865.5构建了一种重组人源胶原蛋白的巴氏毕赤酵母基因工程菌，基因工程菌经发酵培养得到重组人源胶原蛋白，发酵周期为136小时，蛋白表达量为16g/L，发酵水平为0.118g/L·h，蛋白表达量虽有提高，但是发酵周期过长，发酵水平较低。并且在实际生产中，产物在发酵末期出现降解现象，有的批次甚至会降解至3g/L。因此，需要进一步地缩短发酵时间，提高蛋白表达量，降低目标产物降解速度，进而提高发酵水平，有利于胶原蛋白的工业化大规模生产，为产业化生产带来实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺，通过在发酵过程中加入0.1g/L～10g/L的柠檬酸铵，调节毕赤酵母菌的生长代谢速度，缩短了发酵周期，提高了重组人源胶原蛋白的表达量，降低了目标产物降解速度，进一步提升重组人源胶原蛋白的生产水平。
实现本发明目的的技术方案如下：
提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养，在甲醇诱导培养阶段向发酵培养基中加入柠檬酸铵，其中柠檬酸铵的加入量为0.1～10g/L。
本发明所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5021，并在中国专利201110327865.5中充分公开。
优选地，所述的甲醇诱导培养阶段前的发酵培养时间为14～18小时。
优选地，所述的柠檬酸铵的加入量为2g/L～5g/L。
优选地，所述的柠檬酸铵的加入方式为一次性加入或流加。
本发明所述的毕赤酵母发酵培养基采用现有配方，可以是：85％H3PO4 6.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O 3.7～ 14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油 10.0～40.0g/L，PTM1溶液 0.435～4.35mL/L。
本发明的发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.0～5.2，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
本发明在发酵过程中，选取在甲醇诱导表达阶段加入柠檬酸铵，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，缩短发酵时间，提高表达量，缓解重组人源胶原蛋白的降解，发酵水平最高提升了44.2％，同时又大幅提高了目标产物在发酵液中的稳定性，节约了生产成本，特别适用于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来巨大的实际应用价值。
具体实施方式
在本发明的具体实施例中，采用的菌株为表达重组人源胶原蛋白的毕赤酵母，为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC NO.5021，保藏日期为2011年6月 29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
发酵培养基为基础盐培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L； K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入柠檬酸铵，加入量为0.1g/L。通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平不再升高后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC 检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.3g/L，发酵周期119小时，发酵生产水平为 0.145g/L·h，与对照组相比提高20.8％。为模拟1T罐需要分批提取，罐内10℃保持罐压 8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为11.2g/L，保留了64.7％。模拟后续提取10h 处理，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为9.1g/L，保留了52.6％。
实施例2
发酵培养基为基础盐培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L； K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.0。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入柠檬酸铵，加入量为10g/L。通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平不再升高后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC 检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.9g/L，发酵周期117小时，发酵生产水平为 0.153g/L·h，与对照组相比提高27.5％。为模拟1T罐需要分批提取，罐内10℃保持罐压 8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为14.2g/L，保留了79.3％。模拟后续提取10h 处理，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为11.5g/L，保留了64.2％。
实施例3
发酵培养基为基础盐培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L； K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入柠檬酸铵，加入量为2.0g/L。通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平不再升高后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC 检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.8g/L，发酵周期114小时，发酵生产水平为 0.165g/L·h，与对照组相比提高37.5％。为模拟1T罐需要分批提取，罐内10℃保持罐压 8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为15.7g/L，保留了83.5％。模拟后续提取10h 处理，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为13.1g/L，保留了70.0％。
实施例4
发酵培养基为基础盐培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L； K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加柠檬酸铵溶液至发酵结束，加入量为5.0g/L。通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，发酵末期，每4h 取样检测，诱导发酵至产物水平不再升高后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为20.2g/L，发酵周期117小时，发酵生产水平为0.173g/L·h，与对照组相比提高44.2％。为模拟1T罐需要分批提取，罐内 10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为18.0g/L，保留了89.1％。模拟后续提取10h处理，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为16.5g/L，保留了81.7％。
实施例5
发酵培养基为基础盐培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.0。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加柠檬酸铵溶液至发酵结束，加入量为10.0g/L。通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，发酵末期，每 4h取样检测，诱导发酵至产物水平不再升高后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为19.0g/L，发酵周期118小时，发酵生产水平为0.161g/L·h，与对照组相比提高34.2％。为模拟1T罐需要分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为15.4g/L，保留了81.1％。模拟后续提取10h处理，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为12.9g/L，保留了67.9％。
实施例6
发酵培养基为基础盐培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L； K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.0。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加柠檬酸铵溶液至发酵结束，加入量为0.1g/L。通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，发酵末期，每4h 取样检测，诱导发酵至产物水平不再升高后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为18.1g/L，发酵周期119小时，发酵生产水平为0.152g/L·h，与对照组相比提高26.7％。为模拟1T罐需要分批提取，罐内 10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为12.3g/L，保留了68.0％。模拟后续提取10h处理，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为9.5g/L，保留了52.5％。
实施例7
发酵培养基：85％H3PO4 6.6mL/L；CaSO4·2H2O 0.3g/L；K2SO4 4.5g/L；MgSO4·7H2O3.7g/L；KOH 1g/L；甘油 10.0g/L；PTM1 0.435mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.0。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为210g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为17小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入柠檬酸铵，加入量为0.1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为17.7g/L，发酵周期120小时，发酵生产水平为0.148g/L·h，与对照组相比提高23.3％。为模拟1T 罐需要分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为9.3g/L，保留了52.5％。模拟后续提取10h处理，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为6.6g/L，保留了37.3％。
对比例
发酵培养基为基础盐培养基：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O 1.175g/L； K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10％的接种量加到含有6L发酵培养基的10L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO) ＞20％，发酵末期，每4h取样检测，诱导发酵至产物水平不再升高后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为16.1g/L，发酵周期134小时，发酵生产水平为0.120g/L·h。为模拟1T罐需要分批提取，罐内10℃保持罐压8h后，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为3.2g/L，保留了19.9％。模拟后续提取10h处理，HPLC检测重组人源胶原蛋白浓度为0.5g/L，保留了3.1％。

Claims (7)

1.提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养，甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入柠檬酸铵或同时连续流加柠檬酸铵溶液至发酵结束，其中柠檬酸铵的加入量为0.1~10g/L，所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC No. 5021，所述的甲醇诱导时间为90~120小时。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的甲醇诱导培养阶段前的发酵培养时间为14~18小时。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的柠檬酸铵的加入量为2g/L~5g/L。
4.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的毕赤酵母发酵培养基的组份包括：85% H3PO4 6.6～26.7mL/L，CaSO4•2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4•7H2O 3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油 10.0～40.0g/L，PTM1溶液 0.435~4.35 mL/L。
5.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的毕赤酵母菌种液的接种量为8~12%。
6.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，发酵温度为28~30℃。
7.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，氨水调节pH为5.0~5.2，溶氧不低于20%。
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Denomination of invention: Fermentation process for improving the production level of recombinant human collagen and reducing protein degradation rate

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